РОДИОНОВА Наталья Николаевна РОЛЬ БЕЛКОВ АКСО

На правах рукописи
РОДИОНОВА Наталья Николаевна
РОЛЬ БЕЛКОВ АКСО-ГЛИАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА В
РЕГУЛЯЦИИ СТРУКТУРЫ И ВЯЗКОСТИ МИЕЛИНА
НЕРВНОГО ВОЛОКНА
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Специальность
03.01.02 – биофизика
Москва – 2010
Работа
выполнена
на
кафедре
Биофизики
Биологического
факультета
Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор
Г.В. Максимов
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
А.А. Каменский
кандидат химических наук, с.н.с.
С.И. Шрам
Ведущая организация
Биологический
факультет
Мордовского
государственного
университета
им. Н.П. Огарева (г. Саранск)
Защита состоится “
2010 г. в
”
ч.
мин. на заседании
диссертационного совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического
факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские Горы, МГУ, биологический факультет,
кафедра биофизики, “Новая” аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета
Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Автореферат разослан «
»
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
кандидат биологических наук,
2010 г.
М.Г. Страховская
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
Известно,
миелиновым
что
нервным
проведение
волокном
ритмического
(МНВ)
возбуждения
сопровождается
(РВ)
комплексом
изменений как мембранных белков и липидов, так и аксоплазмы [Watanabe et
al. 1973; Левин 1976; Cohen, Lesher 1986]. При
РВ нервного волокна
выявлена переориентация микрофилламентов, связанных с внутренней
поверхностью мембраны, увеличение площади перехвата Ранвье, а так же
увеличение объема периаксонального пространства [Шалатонин et al. 1973;
Розенгарт 1974; Сотников 1976; Tasaki, Iwasa 1980].
В состоянии покоя в аксолемме нервного волокна происходят
процессы, обеспечивающие готовность к проведению РВ (например, работа
К+-каналов
и
Na+,K+-АТФазы).
В
аксоне
обнаружены
регулярные
низкоамплитудные изменения мембранного потенциала, которые при
увеличении внутриклеточного рН) трансформируются в потенциал действия
(ПД) [Tasaki 1982]. Механизм подобных перестроек в нерве в состоянии
покоя практически не изучен. Возможно, что в их основе лежит изменение
содержания Са2+ и Н+ в плазматических мембранах или примембранных
участках, приводящее к изменению мембранного потенциала и вязкости
аксолеммы [Tasaki 1982; Максимов 1997].
Особый интерес вызывают исследования структуры и вязкости
миелина МНВ, которая зависит от упорядоченности жирнокислотных
остатков (ЖК-остатков) фосфолипидов (ФЛ), поверхностного заряда, уровня
“связанной” (малоподвижной) воды, как при РВ, так и в состоянии покоя
[Finean 1956; Левин 1976; Bush et al. 1980; Максимов 1997]. Существенную
роль в изменениях вязкости и структуры миелина нервного волокна могут
выполнять белки аксо-глиального комплекса (Рис. 1).
1
ядро Шванновской
клетки
сома Шванновской
клетки
паранодальные петли
Na,KАТФаза
насечка Шмидта-Лантермана
микровилли
миелин
Na,KАТФаза
Na,KАТФаза
аксон
цитоскелет
межперехватный сегмент
перехват Ранвье
Рис. 1 Схематическое изображение структуры миелинового нервного волокна. Отмечены
белки
аксо-глиального
комплекса:
+
структурные
+
белки
+
кружки),
(серые
ион-
+
транспортирующие системы (Na -канал, K -каналы, Na ,K -АТФаза).
1.2 Цели исследования
Цель работы заключалась в исследовании роли белков аксо-глиального
комплекса в изменениях вязкости и структуры миелина нервного волокна.
Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить изменения ПД, упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, уровня
“связанной” воды миелина при гидролизе пептидных связей белков аксоглиального комплекса миелинового нерва (действие проназы Е).
2. Изучить изменения ПД, упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, количества
мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды миелина при
изменении
конформации
экстраклеточных
участков
белков
аксо-
глиального комплекса миелинового нерва (действие блокатора белковых
SH-групп (пХМБ)).
3. Изучить изменения упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, количества
мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды миелина нервного
волокна при блокировании активности К+-каналов и АТФаз.
2
4. Изучить изменения ПД, упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, количества
мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды миелина нервного
волокна при действии оксида азота (NO).
5. Изучить изменения ПД, упорядоченности ЖК-остатков ФЛ и количества
мембраносвязанного Са2+ миелина нервного волокна при действии белка
внешней мембраны спирохеты Borrelia burgdorferi (OspA).
6. Исследовать изменения морфологии миелинового нервного волокна и
структуры миелина (показателя преломления миелина) в покое и при
изменении свойств белков аксо-глиального комплекса.
1.3 Научная новизна работы
Впервые обнаружено, что изменение вязкости миелина в МНВ может
осуществляться как за счет белков аксо-глиального комплекса, так и за счет
активности K+-каналов и NO. В состоянии покоя активность K+-каналов,
локализованные под миелином и перераспределение NO может регулировать
упорядоченность ЖК-остатков ФЛ, количество мембраносвязанного Са2+ и
уровень “связанной” воды миелина.
1.4 Научно-практическая ценность работы
Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли белков
аксо-глиального комплекса (структура, конформация, функция) в изменении
упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, количества мембраносвязанного Са2+ и
уровня “связанной” воды миелина, а также структуры миелинового нервного
волокна
и
могут
быть
использованы
при
разработке
новых
фармакологических средств для периферической нервной системы (NO,
белок OspA).
3
1.5 Апробация работы
Результаты
работы
были
представлены
на
всероссийских
научных
конференциях студентов-физиков и молодых ученых ВНКСФ-10 (Москва,
2004) и ВНКСФ-11 (Екатеринбург, 2005), международных конференциях
молодых ученых “Ломоносов” (Москва, 2004, 2005, 2007), международной
научной
конференции
памяти
проф.
М.В.
Гусева
“Физиология
микроорганизмов в природных и эксперементальных системах” (Москва,
2006), 9-ой международней летней школе по биофизике “Supramolecular
structure and function” (Ровинь, 2006), 3-ей международной научнопрактической школе-конференции МЕДБИОТЕК “Актуальные вопросы
инновационной деятельности в биологии и медицине” (Москва, 2006),
международном симпозиуме “Modern Spectroscopy Methods in Studying
Structure and Function of Biopolymers in Biology and Medicine” (Дубна, 2007),
6-ом Европейском биофизическом конгрессе (Лондон, 2007), международной
школе Физиологического общества “Molecular physiology of membrane
transport and cell excitability” (Яремче, 2007).
1.6 Публикации
По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в
отечественных и зарубежных журналах.
1.7 Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на ___ страницах машинописного текста;
состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и
обсуждения,
заключения,
иллюстрирована
___
выводов
рисунками.
и
Список
источника.
4
списка
литературы.
литературы
Работа
включает
___
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во
введении
обоснована
актуальность
темы
диссертации,
сформулированы цель и основные задачи работы, отражены научная новизна
и практическая значимость работы.
В главе 1 представлен обзор литературы, в котором отражены
основные подходы к исследованию вязкости миелина и аксолеммы и
изучению морфологии и структуры МНВ.
В
главе
2
изложены
основные
экспериментальные
методики,
используемые в работе.
Объектами исследования служили седалищные нервы и изолированные
нервные волокна травяной лягушки Rana temporaria.
В работе использовали следующие методы:
- ПД нерва исследовали методом внеклеточного отведения мембранного
потенциала [Тасаки, 1957, Кольс, 1979];
- Содержание
Са2+
мембраносвязанного
в
МНВ
изучали
методом
флуоресцентной микроскопии с использованием хлортетрациклина (ХТЦ)
[Caswell, Hutchison 1971]; локализацию белка OspA (выделен из внешней
мембраны спирохеты Borrelia burgdorferi sensu stricto) в МНВ исследовали,
используя белки, меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) [Фримель
1987];
локализацию
митохондрий
в
нервном
волокне
изучали
с
использованием зонда родамин 123 [Toescu, Verkhratsky 2000];
- Упорядоченность ЖК-остатков ФЛ миелина МНВ исследовали методом
электронного парамагнитного резонанса с использованием спинового
зонда 16-доксилстеариновой кислоты (16-ДС) [Кузнецов 1976; Анциферова
и др. 1977] и методом спектроскопии комбинационного рассеяния [Соловьев
и др., 1985; Maksimov et al., 1991];
- Уровень “связанной” воды в нервном волокне изучали методом ЯМРспиновое эхо [Фаррар, Беккер 1973; Аксенов 2004];
5
- Фосфолипидный состав нерва определяли с помощью метода тонкослойной
хроматографии, а жирнокислотный состав фосфолипидов - с помощью
метода газожидкостной хроматографии [Девяткин и др. 2006];
-
Определение
активности
супероксиддисмутазы
проводилось
по
ингибированию аутоокисления адреналина [Сирота 1999], активности
каталазы – по методу Чевари и др. [Чевари и др. 1991], содержание
небелковых ферментов – по методу [Sedlak, Lindsay 1968];
- Структуру
миелина
исследовали,
с
помощью
метода
лазерной
интерференционной микроскопии [Andreev et al., 2003]. Для анализа данных
использовали
метод
вейвлет-
и
двойного
вейвлет-преобразования
[Sosnovtseva et al., 2004].
В главе 3 изложены основные результаты, полученные в работе.
В части I представлены результаты, характеризующие роль состояния
белков аксо-глиального комплекса (структура, конформация и активность К+каналов и Na+,K+-АТФазы) в изменении вязкости миелина МНВ. Известно,
что вязкость липидного бислоя
остатков
жирных
кислот
миелина зависит от упорядоченности
(ЖК-остатков)
фосфолипидов,
содержания
мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды [Bush et al. 1980; Legge
et al. 1982; Геннис 1997]. Мы исследовали изменения выбранных параметров
при действии проназы Е, парахлормеркурибензоата (ПХМБ), а также
тетраэтиламмония (ТЭА) и оуабаина.
Известно, что инкубация с проназой изменяет активность нейронов,
деполяризуя аксолемму и увеличивая частоту РВ [Hermann et al. 1997;
Hermann, Bulloch 1998], а также вызывает демиелинизацию нервного волокна
[Roper, Schwarz 1989; Carratu et al. 1998]. Нами обнаружено, что изменение
структуры экстраклеточных участков белков аксо-глиального комплекса за
счет гидролиза пептидных связей при инкубации МНВ в растворе Рингера с
проназой Е снижает амплитуду ПД и увеличивает скорость проведения
ПД (Рис. 2). Выявленные изменения РВ МНВ сопровождаются обратимым
6
изменением упорядоченности ЖК-остатков ФЛ миелина: увеличением
времени вращательной корреляции спиновой метки (16-доксилстеарат) (Рис.
3 а, д) и изменением конформации каротиноидов миелина (Рис. 3 б, д).
Вероятно, изменение упорядоченности ЖК-остатков ФЛ обусловлено
уменьшением вклада колебаний С-Н связей при двойных С=С связях в ЖКостатках (Рис. 3 в, д) и увеличением отношения “ножничных” к
“крутильным” колебаниям метиленовых групп ЖК-остатков (Рис. 3 г, д).
Установлено, что изменение структуры экстраклеточных участков белков
аксо-глиального комплекса за счет гидролиза пептидных связей при
инкубации МНВ в растворе проназы Е увеличивает содержание “связанной”
проназа Е, 3 мг/мл
контроль
1,4
1,3
Скоростьпроведения
проведения
ПД,
Скорость
ПД,
отн.
отн.
ед.ед.
Амплитуда ПД,
Амплитуда
ПД, отн.
отн.ед.
ед.
воды миелина МНВ (Рис. 3 е).
1,2
1,1
1,0
0,9
*
0,8
0,7
0,6
*
*
0,5
0,4
0,3
-5
а
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45
50
1,6
проназа Е, 3 мг/мл
контроль
1,5
1,4
*
1,3
*
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
-5
Время,
Время,мин
мин.
б
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Время,
мин
Время,
мин
Рис. 2 Динамика изменения амплитуды (а) и скорости проведения ПД (б) при инкубации
нервного волокна в растворе проназы Е (3 мг/мл).
7
*
*
1,00
0,99
0,98
0,97
0,96
б
0,95
4
6
8
10
12
14
16
18
I1524
1151, ,отн.
I1524
/I/I1151
отн.ед.ед.
1,02
1,01
Контроль
Проназа Е
1,12
1,10
1,08
*
1,06
*
1,04
1,02
1,00
0,98
0,96
0
0,84
8,5
0,82
8,0
0,80
0,78
*
0,76
0,74
0,72
0,70
0,68
4
6
8
10
12
14
*
7,5
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
0,0
0
1270/1300
Контроль Проназа Е
5 мин
в
2
Время,
Время,мин
мин
1445 1300
I1270
, отн.
ед.
I1270/I/I1300
отн. ед.
1300
Время,
мин
Время,
мин
I1445I /I1300
/I , ,отн.
отн. ед.
ед.
Время вращательной
Время
вращательной
корреляциии
корреляции
16-ДС,
отн. ед.
16-ДС, отн. ед.
а
Контроль
Проназа Е
1,03
Каротиноид
Контроль
г
Спиновый зонд
2,2
Проназа Е
5 мин
5 мин
*
1/Т
1/T
, отн.ед.ед.
2, отн.
2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
д
е
Контроль Проназа Е
5 мин
Рис. 3 Изменение времени вращательной корреляции 16-ДС (а), соотношения
полос
I1524/I1151 в спектре РКР каротиноидов нерва (б), соотношения полос I1270/I1300 в спектре
КР липидов нерва (в), соотношения полос I1145/I1300 в спектре КР липидов нерва (г),
времени спин-спиновой релаксации ядер протонов
(Т2), (е), при инкубации МНВ с
проназой Е (3 мг/мл). д - схематическое изображение фосфолипидного бислоя с
встроенной молекулой спинового зонда (16-доксилстерат) и молекулой каротиноида. На
схеме отмечены метиленовые группы и С-Н связи при ненасыщенных связях в ацильных
цепях липидов.
8
Известно, что конформация ряда белков и формирование белковых
олигомерных комплексов зависит от числа SH-групп [Финкельштейн,
Птицын 2005]. SH-реагенты блокируют проведение ПД, а при РВ
наблюдается увеличение числа SH-групп в мембранных белках МНВ [Ungar,
Romano 1958; Батырева и др. 1975]. Максимальные изменения содержания
SH-групп при РВ МНВ обнаружены в белках с молекулярной массой 60 кДа,
локализованных как вдоль экстраклеточной поверхности аксолеммы, так и в
участках, прилегающих к ее цитоплазматической стороне [Батырева и др.
1975]. Для изменения конформации белков аксо-глиального комплекса мы
использовали
блокатор
пара-хлормеркурибензоат
SH-групп
(пХМБ),
который препятствует образованию S-S мостиков между остатками цистеина
молекулы белка или между соседними молекулами белков. Установлено, что
изменение конформации экстраклеточных участков белков аксо-глиального
комплекса при блокировании SH-групп при инкубации МНВ с пХМБ
уменьшает амплитуду ПД и увеличивает скорость проведения ПД (Рис. 4 а,
б). Изменения амплитуды и скорости проведения ПД МНВ сопровождаются
обратимым уменьшением количества мембраносвязанного Са2+ (рис. 4 в) и
“связанной” воды (Рис. 4 г), но упорядоченность ЖК-остатков ФЛ миелина
остается неизменной (Рис. 4 д).
Итак, мы обнаружили, что изменение структуры (но не конформации)
белков аксо-глиального комплекса приводит к изменению упорядоченности
ЖК-остатков ФЛ и уровня “связанной” воды миелина.
9
1,25
1,2
1,20
1,1
0,9
1,10
*
0,8
1,05
0,7
1,00
*
0,6
0,5
0,95
0,90
0,4
0,3
0
10
20
30
40
50
60
0,85
70
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
ХТЦ,
отн.
ХТЦ,
отн.
ед.ед.
пХМБ
1,0
1,00
0,8
ед.
2, отн.
1/T2,1/Т
отн.
ед.
1,05
0,95
0,90
0,85
0,80
0,75
-10
-5
0
5
Время,мин
мин
Время,
I1524/I1151, отн. ед.
I1524/I1151, отн. ед.
10
15
г
10
20
30
40
Время,
мин
Время,
мин
50
60
*
0,6
0,4
0,2
0,0
Контроль
пХМБ,
контроль пХМБ, 40 мин
40 мин
Рис. 4 Влияние совместной
контроль
пХМБ
1,08
инкубации МНВ в растворе Рингера с
1,06
пХМБ (10-4 М) на амплитуду (а) и
1,04
скорость проведения ПД (б) нервом,
1,02
количество мембрано-связанного Са2+
1,00
(в), время спин-спиновой релаксации
0,98
ядер протонов (Т2), (г), изменение
0,96
6
д
0
б
Время, мин
Время,
мин
1,10
в
*
1,15
1,0
а
контроль
пХМБ
Скорость проведения ПД,
Скорость проведения
ПД,
отн. ед.
отн.ед.
Амплитуда ПД, отн. ед.
Амплитуда ПД, отн. ед.
контроль
пХМБ
1,3
8
10
12
14
Время,
Время,мин
мин
16
18
отношения полос I1524/I1151 в спектре
20
РКР каротиноидов нерва (д). Время
внесения вещества – 0 минут.
10
В следующей серии экспериментов мы исследовали роль K+-каналов,
Na+,K+–АТФазы, NO и сорбции белков в регуляции вязкости миелина МНВ.
Известно, что блокатор К+-каналов - ТЭА изменяет свойства ПД нервных
клеток и нервных волокон [Armstrong, Binstock 1965; Bostock et al. 1981; Holz
et al. 1986; Barrett et al. 1988; Gao, Ziskind-Conhaim 1998; McIntyre et al.
2002]. В МНВ ТЭА блокирует активность К+-каналов как в области
перехвата Ранвье, так и под миелином (в юкстапаранодальной области).
Нами показано, что блокирование К+-каналов приводит к увеличению
упорядоченности ЖК-остатков ФЛ миелина (рис. 5 а), снижению количества
Контроль
ТЭА
1,10
1,06
*
*
*
1,06
ТЭА
1,04
1,02
ХТЦ, отн. ед.
1,08
Интенсивность флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
ХТЦ, отн.
ед.
ед.
1524/I/I
1151, отн.
II1524
1151, отн. ед.
мембраносвязанного Са2+ (рис. 5 б) и уменьшению уровня “связанной” воды
1,04
1,02
1,00
0,98
0,96
0,94
0,92
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22
Время,
мин
Время,
мин
а
б
1,00
0,98
0,96
0,94
0,92
0,90
-10
-5
0
5
10
Время, мин
15
20
Время, мин
1,0
Рис. 5 Изменение упорядоченности ЖК-
2
1/T2, отн.
ед.
1/Т , отн. ед.
1,1
*
0,9
остатков ФЛ (а), количества
мембраносвязанного Са2+ (б) и уровня
“связанной” воды (в) миелина при
0,8
совместной инкубации МНВ с
0,7
в
0,0
тетраэтиламмонием (ТЭА, 10-2 М). Время
Контроль
ТЭА,
15 мин
внесения вещества – 0 минут.
11
(Рис.
в)
5
миелина.
Выявленные
изменения
обусловлены
именно
инактивацией К+-каналов: действие блокатора Na+,K+-АТФазы оуабаина не
изменяло
упорядоченность
ЖК-остатков
ФЛ
и
содержание
мембраносвязанного Са2+ в миелине.
Известно, что NO регулирует аксо-глиальные взаимодействия МНВ
[Atkins et al. 1999] и, соответственно, может изменить вязкость миелина.
Установлено, что NO вызывает снижение амплитуды и скорости проведения
I1524
/I1151
, отн.
I1524
/I1151
, отн.
ед. ед.
контроль
НП
*
1,04
Интенсивность флуоресценции
ХТЦ, отн. ед.
ХТЦ, отн. ед.
*
1,05
Интенсивность флуоресценции
ПД нерва, увеличивает упорядоченность ЖК-остатков ФЛ (Рис. 6 а),
1,03
1,02
1,01
1,00
0,99
0,98
0,97
0,96
0,95
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Время, мин
мин
Время,
а
б
(1) НП
(2) ТЭА+НП
НП
1,06
1,04
(2)
1,02
1,00
0,98
0,96
0,94
0,92
0,90
0,88
0,86
-10
(1)
-5
0
5
10
15
20
25
30
Время, мин
1,1
1,0
0,8
Рис. 6 Изменение упорядоченности ЖК-
*
остатков ФЛ (а), количества мембрано-
1/T2, отн. ед.
1/Т2, отн. ед.
0,9
0,7
связанного Са2+ (б) и уменьшение уровня
0,6
0,5
“связанной” воды (в) миелина при
0,4
0,3
действии донора NO (нитропруссид
0,2
натрия, НП, 10-3 М). На б: (1) инкубация
0,1
0,0
нервного волокна с NO, (2) инкубация
Контроль NO, 60 мин
нервного волокна, предварительно
в
обработанного ТЭА, с NO
12
снижает количество мембраносвязанного Са2+ (Рис. 6 б) и уровень
“связанной” воды (Рис. 6 в) миелина. Отметим, что блокирование К+каналов, нивелирует изменения количества мембраносвязанного Са2+ при
действии NO (Рис. 6 б). Вероятно, NO вызывает изменение упорядоченности
ЖК-остатков ФЛ миелина не только посредством нитрозилирования SHгрупп белков и активации ПОЛ, но и за счет изменения количества
Контроль
OspA (0,05 мг/мл)
1,15
1,10
1,05
1,00
*
0,95
0,90
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Время, мин
Время,
мин
Контроль
OspA (0,05 мг/мл)
1,10
1,08
1,06
1,04
1,02
*
*
1,00
0,98
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Время,
мин
Время, мин
б
ед. ед.
I1524
1151, отн.
I1524
/I/I1151
, отн.
Интенсивностьфлуоресценции
флуоресценции
Интенсивность
ХТЦ,отн.
отн.ед.
ед.
ХТЦ,
а
в
Скорость проведения ПД,
отн. ед. ПД, отн. ед.
Скорость проведения
Амплитуда
отн.
Амплитуда
ПД, ПД,
отн. ед.
ед.
мембраносвязанного Са2+, активируя К+-каналы.
1,8
1,10
OspA
1,6
1,05
1,4
1,2
1,00
1,0
0,95
0,8
0,6
0,90
0,4
0,85
0,2
0,80
-2
0
2
4
6
8
0,0
10 12 14 16 18 20
Время, мин
мин.
Время,
г
Контроль
контроль
10
OspA,
мин
10 мин
40
OspA,
мин
40 мин
Рис. 7 Изменения амплитуды (а) и скорости проведения ПД (б) нерва, количества
мембраносвязанного Са2+ (в), соотношения полос I1524/I1151 спектра РКР каротиноидов
нерва (г) при инкубации МНВ
с OspA
(0,05 мг/мл). Время внесения вещества –
0 минут.
13
Установлено, что сорбция белков (белок OspA) в аксо-глиальном
комплексе МНВ приводит к снижению амплитуды (Рис. 7 а) и скорости
проведения ПД (Рис. 7 б), уменьшению количества мембраносвязанного Са2+
(Рис. 7 в), но не сопровождается изменением упорядоченности ЖК-остатков
ФЛ миелина (Рис. 7 г). Одновременно изменяется диаметр нервного волокна
в области перехвата Ранвье, но не в межперехватном сегменте МНВ.
Итак установлено, что модификация структуры и конформации
экстраклеточных участков белков аксо-глиального комплекса, активность К+каналов, а также перераспределение NO
вызывает не только изменение
свойств ПД нервного волокна, но и вязкости миелина (упорядоченность ЖКостатков ФЛ, количество мембраносвязанного Са2+, уровень “связанной”
воды).
Для того, чтобы выявить зависимость между изменениями вязкости
миелина и структуры МНВ в работе впервые использовался неинвазивный
метод
лазерной
интерференционной
микроскопии,
позволяющий
параллельно регистрировать изменения как структуры, так и морфологии
миелина МНВ (часть II). Мы исследовали изменение распределения
оптической разности хода (ОРХ) лучей в МНВ при инкубации нерва с
проназой Е, пХМБ и ТЭА. Величина ОРХ в данной точке сложного объекта
зависит от показателя преломления каждой из структур объекта и от
геометрической высоты объекта в данной точке (то есть от морфологии
объекта). Нами установлено, что минимальные значения ОРХ в МНВ
достигаются в перехвате Ранвье, а максимальные – в насечках ШмидтаЛантермана (Рис. 8 а, б, в).
Установлено, что изменение структуры экстраклеточных участков
белков проназой Е сопровождается измененим морфологии нервного
волокна: увеличивается протяженность перехвата Ранвье и меняется
локализация насечек Шмидта-Лантермана (рис. 8 в). Нами обнаружено
14
нШ-Л
а
б
н Ш -Л
н Ш -Л
ПР
ПР
200 нм
ОРХ, нм
200 нм
(1 )
К онтроль
(2 )
П р о н а за Е (3 м г /м л ), 1 0 м и н
ПР
200 нм
П р о н а з а Е (3 м г /м л ) , 2 5 м и н
(3 )
0
в
20
40
60
80
С к а н -л и н и я , м к м
Скан-линия, мкм
100
120
Рис. 8 Изображение миелинового нервного волокна, полученное с помощью световой
микроскопии (а) и лазерной интерференционной микроскопии (б). На (б) черной линией
отмечена скан-линия, вдоль которой исследовали распределение ОРХ при инкубации
волокна с проназой Е (в). (1) – контроль, (2) – инкубация нервного волокна с проназой Е в
течении 10 мин, (3) – инкубация нервного волокна с проназой Е в течении 25 мин. ПР перехват Ранвье, МПС – межперехватный сегмент, нШ-Л – насечка Шмидта-Лантермана.
15
уменьшение ОРХ в аксоне и микровилли в перехвате Ранвье (рис. 9 а) и
увеличение ОРХ в аксоне в межперехватном сегменте (рис. 9 б). Отметим,
что изменение диаметра нервного волокна в перехвате Ранвье и в
межперехватном сегменте, а также диаметра аксона в межперехватном
сегменте и ОРХ в миелине не выявлены (Рис. 9).
ОРХ
в
аксоне
и
Вероятно,
изменения
микровилли вызваны перераспределением показателя
преломления в данных компартментах нервного волокна за счет перестройки
цитоскелета. Установлено, что изменение конформации белков аксоглиального комплекса с помощью пХМБ и блокирование К+-каналов с
помощью
ТЭА
не
сопровождались
изменением
морфологии
и
перераспределением показателя преломления нервного волокна. Таким
образом, только гидролиз белков аксо-глиального комплекса вызывет
изменение структуры аксоплазмы и цитоплазмы микровилли.
Итак, модификация белков аксо-глиального комплекса (структуры и
конформации белков, активность К+-каналов и действие NO) приводит к
изменениям свойств ПД нервного волокна (амплитуды и скорости
проведения ПД), которые сопровождаются изменениями вязкости миелина
(упорядоченность ЖК-остатков ФЛ, количество мембраносвязанного Са2+,
уровень “связанной” воды). Изменения структуры белков аксо-глиального
комплекса, по–видимому, могут регулировать вязкость миелина и при РВ
МНВ. Вероятно, в состоянии покоя МНВ K+-каналы, локализованные под
миелином могут регулировать не только уровень мембранного потенциала,
но и вязкость миелина (упорядоченность ЖК-остатков ФЛ, количество
мембраносвязанного Са2+, уровень “связанной” воды).
16
Значение параметра, отн. ед.
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,0
*
*
0,5
0,0
а
диаметр
МНВ
ОРХ в
длина ПР
микровилли
ОРХ в
аксоне
Значение параметра, отн. ед.
межперехватный сегмент
б
*
контроль
пХМБ
проназа
ТЭА
перехват Ранвье
1,4
1,2
контроль
пХМБ
проназа
ТЭА
*
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
диаметр
МНВ
диаметр
аксона
ОРХ в
миелине
ОРХ в
аксоне
Диаметр МНВ в МПС
Длина ПР
в
Диаметр аксона в МПС
Диаметр МНВ в ПР
Рис. 9 Изменение морфологии миелинового нервного волокна в области перехвата Ранвье
(диаметр, ОРХ аксон и ОХР микровилли, длина перехвата) (а) и области межперехватного
сегмента (диаметр волокна и аксона, ОРХ в миелине и аксоне) (б) при действии проназы
Е, пХМБ и ТЭА. Значения нормированы на контрольные значения. в – схематическое
изображение нервного волокна: МНВ – миелиновое нервное волокно, ПР – перехват
Ранвье, МПС – межперехватный сегмент.
17
3. ВЫВОДЫ
1. Гидролиз
пептидных
связей
белков
аксо-глиального
комплекса
(проназа Е) вызывает не только уменьшение амплитуды и увеличение
скорости проведения ПД, увеличение упорядоченности ЖК-остатков ФЛ
и уровня связанной воды миелина нервного волокна, но также изменяет
морфологию нервного волокна и структуру миелина.
2. Изменение конформации белков аксо-глиального комплекса миелинового
нервного волокна (действие пХМБ) вызывает уменьшение амплитуды и
увеличение
скорости
проведения
ПД,
уменьшение
количества
мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды, но не влияет на
упорядоченность ЖК-остатков ФЛ миелина и морфологию нервного
волокна.
3. Блокирование К+-каналов (но не Na+,K+-АТФазы) нервного волокна
вызывает увеличение упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, уменьшение
количества
мембраносвязанного Са2+
и
уровня “связанной” воды
миелина, но не меняет морфологию нервного волокна.
4. Действие NO приводит к снижению амплитуды и скорости проведения
ПД, увеличению упорядоченности ЖК-остатков ФЛ, уменьшению
количества мембраносвязанного Са2+ и уровня “связанной” воды миелина
нервного волокна.
5. Специфическое связывание белка OspA в аксо-глиальном комплексе
снижает амплитуду и скорость проведения ПД, уровень мембраносвязанного Са2+, но не влияет на упорядоченность ЖК-остатков ФЛ
миелина нервного волокна.
6. В состоянии покоя выявлены регулярные изменения коэффициента
преломления цитоплазмы и мембран аксо-глиального комплекса, частоты
которых зависят от компартмента миелинового нервного волокна.
18
4. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
1. Родионова Н.Н. (Сальникова). Исследование демиелинизации нервного
волокна при инфекционных процессах. Десятая Всероссийская Научная
Конференция Студентов-Физиков и Молодых Ученых. Сборник тезисов.
Екатеринбург-Москва, 2004, cс. 856-857,
2. Родионова Н.Н. (Сальникова). Инфицирование – причина патологии
нервной клетки. Тезисы докладов XI международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2004”, секция
“Биология”. М., 2004., сс. 138-139,
3. Родионова Н.Н. (Сальникова). Воздействие белка OspA на состояние и
функционирование нервного волокна. Одиннадцатая Всероссийская
Научная Конференция Студентов-Физиков и Молодых Ученых. Сборник
тезисов. Екатеринбург, сс. 422-423,
4. Родионова Н.Н. (Сальникова). Использование спектроскопии КР для
исследования микровязкости аксолеммы. Тезисы докладов XI
международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
“Ломоносов-2005”, секция “Биология”, М., 2005, с.191,
5. Родионова Н.Н. (Сальникова). Изменение микровязкости аксолеммы при
действии Borrelia burgdorferi sensu stricto на нерв. Сборник студенческих
работ Биотехнология – охране окружающей среды. М., 2005, сс. 430-432,
6. Родионова Н.Н. (Сальникова), Браже Н.А., Браже А.Р., Харитоненков
И.Г., Максимов Г.В.. Влияние белков спирохеты Borrelia burgdorferi
sensu stricto на возбудимость миелинового нерва. Международная научная
конференция памяти проф. М.В. Гусева “Физиология микроорганизмов в
природных и эксперементальных системах”, материалы конференции. М.,
МГУ, 2006, сс. 35-36,
7. Natalia Rodionova (Salnikova), Nadezda Brazhe, Alexey Brazhe, Georgy
Maksimov. Application of laser interference microscopy to the study of the
nerve fibre demyelination. Ninth international summer school on biophysics:
Supramolecular structure and function. Rovinj, Croatia, 2006, p. 158,
8. Родионова Н.Н., Браже Н.А., Браже А.Р., Максимов Г.В.. Использование
лазерной интерференционной микроскопии в изучении демиелинизации
нервного волокна. Третья международная научно-практическая школаконференция МЕДБИОТЕК “Актуальные вопросы инновационной
деятельности в биологии и медицине”. М., ОАО “Авиаиздат”, 2006, с. 8081, сс. 175-176,
19
9. Родионова Н.Н, Браже Н.А., Браже А.Р., Харитоненков И.Г., Максимов
Г.В. Влияние белков спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato на
возбудимость миелинового нерва. Бюллетени эксперементальной
биологии и медицины, 2007, Т. 143, № 1, сс. 36-39,
10.Родионова Н.Н.. Регуляция взаимодействий аксона и Шванновской клетки
в миелиновом нерве. Тезисы докладов международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2007”, секция
“Биология”, М., 2007, с.14,
11.Rodionova N.N., Brazhe N.A., Maksimov G.V. The proteins role in regulation
of interaction between axon and Shwann cell in the peripheral nerve.
International symposium “Modern Spectroscopy Methods in Studying Structure
and Function of Biopolymers in Biology and Medicine”. Book of Abstracts.
Dubna, 2007, p. 40,
12.Rodionova N.N., Brazhe N.A., Maksimov G.V.. The proteins role in regulation
of interaction between axon and Shwann cell in the myelinated nerve fibre. Eur
Biophys J, 2007, 36, Suppl 1, S166,
13.Rodionova N.N., Brazhe N.A., E.V. Derinskaya, O.V.Kozlova, G.V.
Maksimov, V.V.Revin. A role of Ranvier’s node axolemma proteins in
formation of a nervous excitation. International Workshop of The Physiological
Society “Molecular physiology of membrane transport and cell excitability”,
Yaremche, Ukraine, 2007, Programm, p. 30,
14.Brazhe A.R., Brazhe N.A., Rodionova N.N., Yusipovich A.I., Ignatyev P.S.,
Maksimov G.V., Mosekilde E., Sosnovtseva O.V.. Non-Invasive Study of
Nerve Fibres Using Laser Interference Microscopy. 2008, Philos Transact A
Math Phys Eng Sci., 366(1880), pp. 3463-81,
15.Родионова Н.Н., Браже Н.А., Деринская Е.В., Козлова О.В., Браже А.Р.,
Чурин А.А., Ревин В.В, Максимов Г.В., Рубин А.Б.. Изучение белоклипидных взаимодействий в мембранах миелинового нервного волокна
при действии оксида азота. 2009, Биологические мембраны, Т. 26, № 3, сс.
217-223.
20