ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА липидов мембран миелинового нервного волокна при проведении возбуждения»

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА
на диссертационную работу Бибинейшвили Елены Зурабовны «Изменение состояния
липидов мембран миелинового нервного волокна при проведении возбуждения»,
представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.01.02 – «биофизика»
Мембраны клеток играют чрезвычайно важную роль в процессах поддержания
жизнедеятельности и функционирования нервных волокон. От них, во многом, зависит
обмен веществ с внеклеточной средой, ионная проницаемость и поддержание
мембранного потенциала. Участие липидов в ионном обмене, а также в регуляции
состояний белков, особенно важны при возбуждении нервного волокна. Несмотря на то,
что исследования проводимости нервного волокна имеют длительную историю, роль
мембран в этом процессе, особенно с учетом специфики различных областей нервного
волокна,
остается
еще
не
достаточно
изученной.
Важными
свойствами,
характеризующими состояние мембран, являются поверхностный заряд и конформация
гидрофобной области мембранного слоя. В настоящее время остается открытым вопрос,
каким образом возбуждение нерва приводит к изменению этих свойств. Нарушения
структуры и функции мембран нервных клеток и нервных волокон часто наблюдаются
при тяжелых заболеваниях центральной и периферической нервных систем. Так недавно
были обнаружены изменения в уровне холестерина при болезнях Альцгеймера и
Паркинсона. В этой связи представляется совершенно очевидной важность исследований
различных свойств мембран нервного волокна при его возбуждении в норме и в условиях,
моделирующих патологии, связанные с нарушениями уровня холестерина. Таким
образом, тема диссертационной работы Бибинейшвили Е.З., безусловно, является
актуальной и своевременной.
Диссертационная работа Бибинейшвили Е.З. построена по традиционному плану и
состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Цели и задачи»,
«Материалы и Методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение»,
«Выводы», и «Список литературы». Она изложена на 172 страницах, содержит 60
рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 266 цитируемых научных работ.
Обзор литературы составляет около одной трети текста диссертации, посвящен
анализу и детальному обсуждению различных аспектов строения и функционирования
нервного волокна, включая и роли мембран в поддержании структуры и регуляции
проводимости нервным волокном. Обзор отражает современные представления в данной
области знаний, изложен в классическом научном стиле и, в тоже время, в доступной даже
для неспециалистов форме.
Вторая глава представляет собой перечень целей и задач. Сформулированная цель
работы хорошо согласуется с темой диссертационной работы, а приведенный перечень
задач предусматривает успешное достижение поставленной цели.
В третьей главе приводятся сведения об объектах и методах исследования. В этой
главе описаны основные принципы методов, ход экспериментов, особенности обработки
результатов, применяемый для анализа данных математический аппарат. Впечатляет
использованный
автором широкий
спектр
современных
биофизических методов
исследования, включающий методы комбинационного рассеяния, флуоресцентную и
лазерную интерференционную микроскопии, ЭПР. Материалы этой главы позволяют
сделать вывод о высоком методическом уровне работы и применении комплексного
подхода к решению поставленных задач.
Глава
«Результаты» разбита на четыре части.
Первая часть посвящена
исследованию некоторых свойств липидного бислоя мембран, цитоплазмы и морфологии
миелинового нервного волокна при проведении серии потенциалов действия. Установлено
что, после проведения серии потенциалов действия упорядоченность липидов мембран в
миелине возрастает, а в перехвате Ранвье - снижается. Показано, что при возбуждении
нерва в области перехвата Ранвье наблюдается вхождение Са2+ по потенциалчувствительным каналам внутрь клеток, тогда как в миелине происходит его десорбция с
мембран в наружную среду. При этом диаметр аксона и всего волокна не изменяются.
Вторая часть Результатов посвящена исследованию некоторых свойств липидного
бислоя мембран, цитоплазмы и морфологии миелинового нервного волокна после
обработки его холестерин-экстрагирующим агентом - метил-β-циклодекстрином (МБЦ).
Показано, что обработка волокна МБЦ приводит к уменьшению упорядоченности
липидов миелина, что дает основание сделать вывод о том, что экстракция происходит
именно из этого компартмента. Уменьшение упорядоченности липидов подтверждается
также с помощью ЭПР. Установлена десорбция Са2+ с мембран миелина и зафиксирован
короткий всплеск цитоплазматического Са2+. Были также зарегистрированы небольшие
изменения диаметра аксона и всего волокна, а также увеличение показателя преломления
миелина.
Третья часть Результатов посвящена исследованию некоторых свойств липидного
бислоя мембран, цитоплазмы и проводимости обедненного холестерином невного волокна
в условиях проведения серии потенциалов действия. Показано, что амплитуда
2
потенциалов действия в препаратах, обработанных МБЦ, начинает уменьшаться после 40минутной стимуляции. Также в таких препаратах наблюдается снижение степени
упорядоченности липидов миелина в перехвате Ранвье. Кроме того, уровень мембранного
Са2+ увеличивается не только в перехвате Ранвье, но и в миелине. Таким образом,
показано влияние холестерина на состояние мембран нервного волокна в процессе
проведения возбуждения.
Четвертая часть Результатов посвящена исследованию состояния липидного бислоя
мембран, цитоплазмы и морфологии миелинового нервного волокна при действии
агентов, вызывающих демиелинизацию нервного волокна. Показано, что демиелинизация
волокна лизолецитином не приводит к заметному изменению упорядоченности липидов,
но вызывает десорбцию Са2+ миелина и его кратковременное повышение в цитоплазме.
При этом амплитуда потенциалов действия достоверно не изменялась, что может
указывать на специфичность наблюдаемых эффектов МБЦ, именно через его влияние на
уровень холестерина в структурах нервного волокна.
В главе Заключение автор суммирует полученные им результаты, которые
позволили ему сформулировать приведенные в работе Выводы.
В целом объем проделанной автором экспериментальной работы впечатляет своим
объемом, который значительно превосходит требования, предъявляемые к кандидатским
диссертациям. Результаты экспериментов выглядят убедительными, статистическая
обработка данных – безупречна, а сделанные автором выводы не вызывают никаких
сомнений.
Диссертация
Бибинейшвили Е.З.
построена
логично,
достоверность
результатов и обоснованность выводов не вызывает сомнений.
Несмотря на несомненные достоинства работы, перечисленные выше, при
прочтении диссертации возник ряд замечаний, в основном рекомендательного характера.
1.
Моделирование процессов патологического снижения концентрации холестерина в
нервном волокне и его демиенилизации. В работе было бы желательно определить
содержание холестерина в препаратах нервных волокнах, используемых в экспериментах,
до и после обработки метил-β-циклодекстрином. Также весьма продуктивным было бы
применение подходов, позволяющих регулировать уровень холестерина у животных,
используемых для получения препаратов нервных волокон, например с помощью
соответствующих диет, и с применением ингибиторов синтеза холестерина. Весьма
уместно было бы привести дополнительные данные, объективно демонстрирующие
развитие процесса демиенилизации нервного волокна под действием лизолецитина,
например, результаты электронной микроскопии.
3
2.
Некорректное использование некоторых терминов. Для описания некоторых свойств
нейронов и структур нервного волокна, полученные с применением
лазерной
интерференционной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеивания, в
работе используются следующие термины: «структура цитоплазмы», «структура и
морфология цитоплазмы», «состояние липидного бислоя», «состояния липидного бислоя
мембран и цитоплазмы», «структура миелина». Однако полученные с использованием
данных подходов результаты хотя и являются весьма информативными, но все же не дают
прямых данных как о структуре и морфологии клетки в целом, так и отдельных ее
составляющих. Поэтому применение более конкретных терминов было бы более
уместным.
3.
Формулирование выводов. Наряду с детальным перечислением всех основных
результатов, полученных автором, необходимо было бы дать и более обобщающие
формулировки, в которых следовало бы отразить те новые знания об исследуемых
явлениях, которые были добыты автором в результате выполнения работы. В выводах не
отражены результаты исследований влияния демиелинизации нервного волокна на
состояние липидного бислоя, распределение Са2+ и электрическую проводимость
нервного волокна.
4.
Стиль написания и оформление текста. В некоторых местах текста диссертации
встречается чрезмерное употребление введенных автором сокращений, до 7-8 в одном
предложении, что существенно затрудняет восприятие материала. Не единообразно
оформлены начала абзацев в тексте диссертации. Имеются немногочисленные опечатки и
орфографические ошибки. В Списке литературы после написания инициалов авторов и
сокращенных названий журналов отсутствуют точки.
4. Оформление рисунков. На рис. 4.1. не обозначены оси ординат. На некоторых рисунках
(4.11, 4.12, 4.22-4.24, 4.37, 4.38) приведено не очень удачное название оси ординат –
«значение параметра». При указании достоверности различий между сравниваемыми
выборками следовало бы отметить различия, удовлетворяющие более строгим, чем
p<0,05, критериям; общепринято применять следующие: p<0,01, p<0,001.
Однако имеющиеся в работе отдельные недостатки не носят принципиального
характера и никак не влияют на общую высокую оценку проделанной диссертантом
работы в целом.
Основное содержание работы достаточно полно отражено в автореферате
диссертации. К замечаниям можно отнести наличие некоторых опечаток и неудачное
оформление некоторых рисунков.
4
5
Сведенья об оппоненте
Станислав Иванович Шрам
Кандидат химических наук по специальности 03.00.04 – «биохимия»
Основное место работы:
заведующий Сектором нейрофармакологии, старший научный сотрудник
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт
молекулярной генетики Российской академии наук.
123182, г. Москва, площадь академика И.В. Курчатова, д.2
Тел. (905) 700-89-74
Е-mail: shram@img.ras.ru
Основные публикации по теме диссертации:
1. 2. Efremov Yu.M., Dzyubenko E.V., Bagrov D.V., Maksimov G.V., Shram S.I., Shaitan K.V.
Atomic Force Microscopy Study of the Arrangement and Mechanical Properties of Astrocytic
Cytoskeleton in Growth Medium. Acta Naturae. 2011. V.3. №3(10). P.94-100.
2. Лимборская С.А., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Мясоедов Н.Ф., Шрам С.И., Силачев
Д.Н., Агапова Т.Ю., Агниуллин Я.В. ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА МОЗГА И ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В
ГИППОКАМПЕ И ЛОБНОЙ КОРЕ КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕМАКСА, Молекулярная
генетика ,микробиология и вирусология, 2008.-N 3.-С.28-31
3. Коломин Т.А., Агапова Т.Ю., Агниуллин Я.В., Шрам С.И., Шадрина М.И., Сломинский
П.А., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО
ПРОФИЛЯ ГИППОКАМПА В ОТВЕТ НА ВВЕДЕНИЕ АНАЛОГА ТАФТЦИНА
СЕЛАНКА, Журнал высшей нервной деятельности им.И.П.Павлова, 2013.-N 3.-С.365-374
4. Лимборская С.А., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Мясоедов Н.Ф., Шрам С.И., Силачев
Д.Н., Агапова Т.Ю., Агниуллин Я.В. ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА МОЗГА И ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В
ГИППОКАМПЕ И ЛОБНОЙ КОРЕ КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕМАКСА, Молекулярная
генетика ,микробиология и вирусология, 2008.-N 3.-С.28-31
5. Романова Г.А., Силачев Д.Н., Шакова Ф.М., Квашенникова Ю.Н., Викторов И.В., Шрам
С.И., Мясоедов Н.Ф. НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЕ И АНТИАМНЕСТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
СЕМАКСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНФАРКТЕ КОРЫ
ГОЛОВНОГО МОЗГА, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006.-N 12.С.618-621
6. Маслов В.Ю., Веселовский М.С., Москалюк А.О., Мясоедов Н.Ф., Шрам С.И., Федулова
С.А. Протекторное действие пептида пролин-глицин-пролина на электрофизиологические
свойства культивируемых нейронов гиппокампа при ексайтотоксическом повреждении //
Физиологический журнал. 2014. Т. 60. № 2. С. 3-11.
6
7
8
9
10
11
12
13
Сведения об оппоненте
Александр Михайлович Сурин
Доктор биологических наук по специальности 14.03.03 – «патологическая
физиология»
Основное место работы:
Лаборатория патологии ионного транспорта и внутриклеточной
сигнализации Федерального государственного бюджетного учреждения
«Научно исследовательский институт общей патологии и
патофизиологии», зав. лаборатории 125315, г. Москва, ул.
Балтийская, д.8
Тел. (845) 297-04-44
Е-mail: surin_am@yahoo.com
Основные публикации по теме диссертации:
1. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И., Пинелис В.Г.
Флуоресцентно-микроскопические измерения [АТФ] в цитозоле культивируемых
нейронов при токсическом действии глутамата. МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
“РЕЦЕПТОРЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ” Пущино, 24-26 мая
2.
3.
4.
5.
6.
7.
2013г. Сборник статей , Т.2 стр. 718-723.
10. Surin AM, Bolshakov AP, Mikhailova MM, Sorokina EG, Senilova YE, Pinelis VG,
Khodorov BI. (2006). Arachidonic acid enhances intracellular [Ca2+]i increase and mitochondrial
depolarization induced by glutamate in cerebellar granule cells. Biochemistry (Rus). 71(8): 864870.
B. Khodorov, T. Storozhevykh, A. Surin, E. Sorokina, A. Yuravichus, A. Borodin, N. Vinskaya,
L. Khaspekhov, and V. Pinelis. (2001). Mitochondrial depolarization play a dominant role in the
mechanism of perturbation of calcium homeostasis caused by glutamate in cultured cerebellar
granule cells. Biological Membranes (Rus), 18 : 421-432.
Duchen M.R., Surin A.M. (2002). On the role of mitochondria and calcium in glutamateinduced
neurotoxicity in hippocampal neurons in culture. Biological Membranes (Rus), 19 : 97-109.
13. Kolikova J, Afzalov R, Surin A, Lehesjoki AE, Khiroug L. (2011) Deficient mitochondrial
Ca(2+) buffering in the Cln8(mnd) mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis. Cell Calcium.
50(6): 491-501.
18. АA.M. Surin, Zobova S.N., V.G. Pinelis, B.I. Khodorov. Role of mitochondrial NADH in the
glutamate-induced delayed Ca2+ deregulation in cerebellar granule neurons. Society for
Neuroscience 38th Annual Meeting, Washington DC, November 15-18, 2008, Abstract 51.19
19. А.M. Surin, V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, B. I. Khodorov. Evidence for pore opening in
mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain
neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции»,
17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330
14