Шубина Виктория Сергеевна

На правах рукописи
Шубина Виктория Сергеевна
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ДОФАМИНА С ЖИВЫМИ КЛЕТКАМИ
Биофизика 03.00.02
Физиология 03.00.13
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук.
г. Пущино
2009
Работа выполнена в Пущинском государственном университете и в Учреждении Российской
академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор
Мошков Дмитрий Алексеевич,
доктор биологических наук
Павлик Любовь Леоновна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Буданцев Аркадий Юстианович
доктор биологических наук, профессор
Мурашев Аркадий Николаевич
Ведущая организация:
Институт биофизики клетки РАН
Защита состоится « 28 » октября 2009 г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите
докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук
Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290,
Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:
142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат разослан «___» _________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат физико-математических наук
Ланина Надежда Федоровна
1
Актуальность проблемы.
Дофамин по химической структуре относится к биогенным аминам, конкретно к
катехоламинам. Как гормон, выделяемый эндокринными железами и другими тканями,
дофамин оказывает сложное и многогранное гуморальное регулирующее воздействие на
организм в целом либо на определённые органы и системы-мишени (Goldstein et. al., 1995;
Missale et al., 1998; Mezey et. al., 1998, 1999). Поэтому гормональные нарушения носят
системный и комплексный характер, их вред проявляется на организменном уровне. В
центральной нервной системе дофамин, играя роль нейротрансмиттера и нейромодулятора,
участвует в контроле двигательной активности (Clark et al., 1991; Furmidge et al., 1991;
Pereda et al., 1992, 1994), эмоций (Nieoullon, Coquerel, 2003; Salqado-Pineda et al., 2005),
нормального поведения (Toates, 1998; Ikemoto, Panksepp, 1999; Ahn, Salamone et. al., 2003;
Phillips, 2007). Нарушение функционирования дофаминергической системы в мозге приводит
к развитию различных патологических состояний, таких как наркомания, паркинсонизм,
шизофрения, сумеречные состояния и некоторые другие (Угрюмов, 2007, Nestler, 2004).
Согласно классической и общепринятой точки зрения, широко освещенной и интенсивно
исследуемой в настоящее время, мишенью действия дофамина считаются специфические
рецепторы, расположенные на плазматической мембране нейрона (Раевский 1976; Missale et
al., 1998; Шабанов, 2004). Лигандные взаимодействия нейротрансмиттера с ними влечет за
собой изменение баланса ионов в цитоплазме, приводящее к активации клетки. Согласно
другой точке зрения нейротрансмиттеры, в частности, дофамин, способны в дополнение к их
взаимодействию с рецепторами влиять на клетку трофическим образом, минуя рецепторы.
Предполагается, например, что, растворяясь в липидах плазматической мембраны, они могут
изменять ее физико-химические свойства, в том числе влиять на лигандные и канальные
характеристики встроенных в нее рецепторов (Cantor, 2003; Milutinovic et al., 2007).
Взаимодействуя с некоторыми цитозольными белками, такими как αβ-пептид, α-синуклеин
или актин, катехоламины могут вызывать изменения функциональной активности клеток,
влияющей на их жизнеспособность (Павлик и др., 2004; Li et al., 2004). Гипотеза о
трофическом взаимодействии дофамина с определенными субстратами клетки пока
разработана крайне слабо, большинство ее аспектов лишь теоретически обозначено, все они
требуют экспериментальной проверки и подтверждения с привлечением комплексных
подходов, использующих применение различных методов и разных объектов исследований.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное
морфофункциональное исследование влияния дофамина на живые клетки и на
искусственные модельные системы для определения клеточной мишени действия
нейротрансмиттера. Были поставлены следующие задачи: 1. Изучить морфофункциональные
эффекты аппликации на маутнеровские нейроны золотой рыбки дофамина и определить его
внутриклеточные мишени. 2. Изучить биофизическими методами поведение дофамина в
модельных системах, в частности, его взаимодействие с выделенным глобулярным (Г-)
актином, влияние на плоскую билипидную мембрану, способность воздействовать на
агрегатное состояние актина, предварительно заключенного в тонкостенные липосомные
везикулы. 3. Изучить взаимодействие дофамина с культивируемыми фибробластоподобными
клетками линии BHK-21, определить его эффект на выживаемость и ультраструктуру клеток,
а также выявить внутриклеточную локализацию с помощью цитохимической реакции
Фалька для выявления катехоламинов.
Научная новизна. Впервые поставлен вопрос о трофическом действии дофамина на живую
клетку и получены комплексные экспериментальные доказательства того, что в качестве
основной клеточной мишени дофамина выступает цитозольный актин. Об этом
свидетельствуют следующие установленные фундаментальные факты. При аппликации на
живой нейрон дофамин вызывает гипертрофию синаптических специализированных
контактов, построенных из филаментозного (Ф-) актина. Такой же эффект оказывает на
нейроны аппликация дигидропиримидинтиона, производного дофамина, обладающего таким
же, как и дофамин, полимеризующим эффектом на Г-актин. При этом есть основание
2
считать, что дигидропиримидинтион, по-видимому, не обладает сродством к дофаминовым
рецепторам и переносчикам из-за того, что его наиболее важные для взаимодействия с
рецепторами функциональные группы (OH и NH2) максимально заблокированы, а также
стерически затруднены. Блокада дофаминовых рецепторов не предотвращает вызванную
дофамином полимеризацию актина. При взаимодействии in vitro с дофамином Г-актин
превращается в Ф-актин. Впервые показано, что дофамин проникает через искусственную
фосфолипидную мембрану, в принципе не имеющую ни рецепторов, ни переносчиков,
причем в концентрации, способной вызвать полимеризацию актина по другую сторону
мембраны. Впервые с помощью цитохимической реакции Фалька, параллельного
ультраструктурного анализа и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ) определено, что дофамин способен проникать в живую клетку и полимеризовать
цитозольный актин, встраиваясь в структуру формируемых нитей.