На правах рукописи ДАНИЛОВ Александр Викторович
реклама
На правах рукописи ДАНИЛОВ Александр Викторович СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОЗЖЕЧКА КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ АЛКОГОЛЯ И ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ 03.00.13 – Физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2009 Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Лобанов Сергей Александрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич кандидат биологических наук, доцент Хисматуллина Зухра Рашидовна Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Защита диссертации состоится « 23 » октября 2009 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинский государственный педагогический университет» (454080, г. Челябинск, пр. им. В.И. Ленина, д.69, ауд.116) С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» Автореферат разослан «_16_» __сентября_ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент Н.В. Ефимова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Внешние факторы оказывают на организм самые разнообразные влияния. В одних случаях они могут способствовать развитию адаптивных механизмов, если не превышают границ физиологической нормы для данного организма. В других случаях они способствуют формированию механизма полома и ведут к нарушению, как структуры, так и функции клеток (Флеров М.А. и др., 2003-2004; Сибиряк С.В. и др., 2006; Фархутдинов Т.Р., 2006; Makaluso A. et al., 2004; Kroemeg G. et al., 2006). Резкое изменение условий внешней среды, несущее угрозу организму, как было выявлено исследованиями А.И. Вайдо и др. (2001), Б.Т. Величковского (2001), Н.А. Фомина (2003), J.H. Freeman et al. (2000), S. Bao et al. (2002) запускает сложную адаптивную реакцию. Основной регуляторной системой последней является гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система, деятельность которой, в конечном итоге, и перестраивает активность вегетативных систем организма таким образом, что сдвиг гомеостаза устраняется или заблаговременно прекращается. В этой адаптивной перестройке активно участвует и нервная система. В центральной нервной системе происходят изменения клеточного обмена, в частности, повышается метаболизм важнейших биологических макромолекул - РНК и белков. После ликвидации нарушений гомеостаза метаболизм макромолекул в нервных структурах, участвующих в процессе адаптации, все еще остается измененным (Мошонкина Т.Р. и др., 2002; Соколова Н.Е. и др., 2002; Отеллин В.А., 2002-2006; Heaton M.B., 2002). Повторное воздействие стресс-фактора приводит к развитию адаптации. Исследованиями Т.И. Барановой (2004), A. Makaluso et al. (2004), G. Kroemeg et al. (2006) было доказано, что сдвиги в метаболизме РНК и белков биологически целесообразны и способствуют более эффективному развитию физиологической адаптации. Это касается, в основном, формирования индивидуальных адаптационных реакций организма на факторы внешней среды. Мозжечок, как и нервная система в целом, обладают огромными клеточными и функциональными резервами. Общепринятым является представление о том, что только малый процент нейронов мозжечка постоянно находится в активном функциональном состоянии. Исследования С.В. Соловьева и С.П. Герасина (2000), А.И. Вайдо (2001), D.O. Clegg (2000) показали, что большая часть нервных клеток и клеток глии являются как бы запасными. Структурная и функциональная активность этих клеток существенно возрастает при действии различных экстремальных факторов. Е.А. Макий (1992), С. Гилберт (1995), В.П. Фёдоров и др. (1999), С.А. Лобанов и др. (2005-2006), И.А. Герасимова (2005) при этом подчеркивают, что, так называемые «малоактивные» клетки, могут замещать выбывающие, поддерживая соответствующие нервные связи и функциональные состояния этих участков мозга на оптимальном уровне. Нервные клетки не размножаются, являясь наиболее дифференцированными в организме (Дегтяренко А.М., 1992; Кравцова А.И., 1996; Соколова Н.Е., 2002; Attwell P.J. et al, 2002; Ohyama T. et al, 2001). Они функционируют в течение всей жизни, обеспечивая адаптивную, морфофизиологическую деятельность организма. Внешние влияния постоянно оказывают воздействия на нервную систему, адаптируют ее к изменяющимся условиям среды. Н.А. Дюжикова и др. (2001), 3 Л.А.Калашникова (2001), Т.Ф. Емелёва (2005-2006), J.F. Medina (2000) при этом выделяют ведущую роль как самой нервной системы, так и мозжечка, обеспечивающих регулирующее влияние не только на отдельные органы и системы, но и на весь организм. Необычные факторы окружающей среды (алкоголь, физическая нагрузка), способные оказывать неблагоприятное влияние на организм, являются экстремальными факторами. По длительности воздействия на организм эти факторы могут быть различными. В одних случаях организм компенсирует их действие за счет имеющихся резервов, в других они требуют адаптационной перестройки. Анализ данных литературы как отечественных, так и зарубежных исследователей, позволяет отметить, что в морфологии и физиологии нервной системы остается много нерешенных вопросов. Остаются до конца неясными многие ультраструктурные механизмы ответных реакций, а также субклеточные аспекты различной деятельности мозжечка. До конца остаётся не изучена структурно-функциональная активность нейронов и клеток глии мозжечка и их синаптических структур, как в течение жизни, так и в зависимости от физиологических состояний. Не установлены механизмы образования новых ультраструктурных связей в нервной системе и активации существующих. Остаются не полностью выяснены многие ультраструктурные механизмы адаптации нейронов и клеток глии мозжечка к новым функциональным состояниям, в том числе изменениям внутренней и внешней среды. Целью нашей работы явилось выявление особенностей структурнофункциональных изменений мозжечка экспериментальных животных при действии алкоголя и гипердинамии, как факторов экстремального воздействия на организм. Задачи исследования: 1. Установить морфофункциональные изменения мозжечка крыс при длительном действии алкоголя. 2. Изучить морфофункциональные особенности мозжечка экспериментальных животных при 90 суточной гипердинамии. 3. Оценить гистологические, гистохимические, ультраструктурные и морфометрические особенности мозжечка крыс при сочетанном действии алкоголя и гипердинамии. Научная новизна. Проведена сравнительная оценка структурнофункционального состояния клеток и динамики гликозаминогликанов мозжечка крыс при действии алкоголя и гипердинамии. Установлены общие закономерности и особенности динамики и содержания сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов в мозжечке экспериментальных крыс в хроническом эксперименте, по сравнению с контролем. К особенностям изменения содержания и соотношения сульфатированных и несульфатированных форм гликозаминогликанов, в условиях действия алкоголя и гипердинамии, относится неравномерное их возрастание, с преобладанием гиалуроновой кислоты. Показана тесная взаимосвязь содержания сульфатированных и несульфатированных классов гликозаминогликанов с ультраструктурными изменениями клетки. В экспериментах на белых крысах обнаружено, что активация 4 энергосинтетического аппарата клетки является типовым процессом адаптации в первые 7 суток и дезадаптации с 30 по 90 сутки при сочетанном действии алкоголя и гипердинамии. Функциональная активность комплекса Гольджи, эндоплазматического ретикулума и митохондрий коррелирует с динамикой сульфатированных и несульфатированных форм гликозаминогликанов межклеточного матрикса в условиях сочетанного применения алкоголя и гипердинамии. Прослеживается прямая взаимосвязь между увеличением объёма и интенсивности энергосинтетических структур клетки с повышением содержания гликозаминогликанов в межклеточном матриксе в первые 30 суток эксперимента, к 90 суткам прослеживается обратная взаимосвязь. Установлена взаимосвязь между возрастанием содержания несульфатированных гликозаминогликанов, и увеличением объёма эндоплазматического ретикулума при раздельном действии алкоголя и гипердинамии. Сочетанное воздействие этих факторов приводит к фазному изменению несульфатированных гликозаминогликанов, которое коррелирует с ультраструктурной динамикой клетки. Впервые выявлена взаимосвязь, в условиях сочетанного действия алкоголя и гипердинамии, роста содержания несульфатированных гликозаминогликанов с опережающим увеличением объёма комплекса Гольджи. Теоретическая и практическая значимость работы. В работе получены новые теоретические знания о стресс-реакции и адаптивных клеточных реакциях при воздействии алкоголя и гипердинамии на мозжечок, которые вносят вклад в развитие теоретических знаний по физиологии клетки при действии различных факторов среды. Выявленные особенности реакции нейронов и клеток глии мозжечка на алкоголь и гипердинамию, как по отдельности, так и сочетано, расширяют представления о адаптивных свойствах высокодифференцированных тканей. Результаты диссертационной работы включены в курсы лекционных и лабораторных занятий по дисциплине «Физиология физического воспитания и спорта» факультета физической культуры Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы; курсы лекционных и практических занятий по дисциплине «Вопросы частной физиологии ЦНС» кафедры нормальной физиологии Башкирского государственного медицинского университета; курсы лекционных и практических занятий по дисциплине «Влияние факторов среды на организм» кафедры общей гигиены с экологией, с курсом гигиенических дисциплин Башкирского государственного медицинского университета; курсы лекционных и лабораторных занятий по дисциплине «Нервная система» Башкирского государственного аграрного университета. Основные положения, выносимые на защиту: 1. В нейронах и клетках глии мозжечка прослеживаются ультраструктурные и функциональные изменения внутриклеточных элементов, которые характеризуются изменением объёма и состоянием их матрикса в условиях действия алкоголя и гипердинамии. 2. В межклеточном матриксе изменяется содержание и соотношение сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов при действии 5 алкоголя и гипердинамии. 3. Компенсаторно-приспособительные и адаптивные механизмы мозжечка носят фазный характер и зависят от действующих факторов. Длительное и сочетанное использование алкоголя и гипердинамии приводит к формированию деструктивных проявлений. Апробация работы. Основные результаты исследования и материалы диссертации опубликованы и доложены на Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), VII Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), Международной научно-практической конференции «Биологические науки в XXI веке: Проблемы и тенденции развития» (Бирск, 2005), юбилейной научно-практической конференции «Физическая культура и спорт в XX веке: опыт, современный подход, проблемы и перспективы» (Стерлитамак, 2006), межвузовской научной конференции аспирантов и молодых учёных «Молодёжь, образование, наука» (Уфа, 2006), на Всероссийской научнопрактической конференции «Совершенствование системы профессиональной подготовки и повышения квалификации кадров в области физической культуры и спорта» (Ижевск, 2006), региональной научно-практической конференции «Современные проблемы обучения и воспитания физической культуре в условиях модернизации общего образования» (Уфа, 2007). Диссертация апробирована на совместном межкафедральном совещании Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы, Башкирского государственного медицинского университета, Башкирского государственного аграрного университета, состоявшемся 15 апреля 2009 года. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 публикации – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 61 рисунком и фотографиями, 10 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы – 2-е главы, 2-х глав описания материалов и методов исследования, 3-х глав описания результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя: 140 отечественных и 135 зарубежных авторов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Мозжечок в норме исследовался на материале 13 интактных крыс породы Вистар (таблица 1) с массой тела от 180 до 210 г для выявления структурных особенностей. Эксперименты проводились на 78 белых крысах породы Вистар с массой от 180 до 210 г. в осенне-зимний период в дневное время в течение 90 суток (таблица 2). Они содержались в стандартных условиях вивария (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г., Приказ Минздрава СССР № 1509 от 30 декабря 1983 г.). Было проведено три серии опытов: 6 1. В первой серии крысам вводили алкоголь интраперитонеально (26 крыс). 2. Во второй серии – крысы находились в условиях гипердинамии (25 крыс). 3. В третьей серии – крысы находились в условиях сочетанного действия алкоголя и гипердинамии (27 крыс). Алкоголь вводился ежедневно в виде 20% раствора из расчёта 1 г/кг массы тела животного (Лужников Е.А.,1994) интраперитонеально в течение 90 суток. Гипердинамия моделировалась содержанием крыс в небольших клетках с ограниченным пространством расположенных в тред-бане (бегущая дорожка). Движение бегущей дорожки осуществлялось с постоянной скоростью в дневное время суток в течение 8 часов, с перерывами на отдых через каждые 2 часа (на 15-20 минут). Сочетанное влияние алкоголя и гипердинамии проводилось на крысах в состоянии алкогольного «опьянения» и содержащихся в небольших клетках с ограниченным пространством расположенных в тред-бане (бегущая дорожка). В течение первых двух недель крысы находились под ежедневным наблюдением, затем через каждые 2 - 3 суток. В каждой экспериментальной группе было по 5 - 7 крыс. Из эксперимента животные выводились на 3, 7, 14, 30 и 90 сутки (передозировкой наркоза). Морфофункциональные и ультраструктурные исследования проводились с помощью гистологических методов - окрашиванием препаратов гематоксилин эозином, гистохимических методов - окрашиванием стандартных гистологических срезов метиленовой и толуидиновым синим. Проводилась дифференцировка разных классов ГАГ окрашиванием альциановым синим при разных рН и молярностях (MgCL2) с последующим метилированием и ферментативным контролем. Затем исследовались на анализаторе фореограмм АФ-2 и проводился полуколичественный анализ (таблица 2). Изучение кровеносных сосудов микроциркуляторного русла осуществлялось при окрашивании препаратов гематоксилин - эозином, импрегнацией азотно-кислым серебром по В.В. Куприянову, с помощью электронной микроскопии. Экспериментальный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере при рН 7,2 - 7,6. Для трансмиссионной электронной микроскопии материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, при рН 7,2 - 7,4 с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия (OsO4) в течение одного часа, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрацией от 50 - до 96% и ацетоне. Материал заливали смолой ЭПОН - 812. Ультратонкие срезы готовились на ультратоме LKB - III и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Экспериментальный материал исследовался на электронном микроскопе ЭМВ - 100 БР или JEM – 100S, при ускоряющем напряжении 75 кВ и 90 кВ. Результаты экспериментальных данных обрабатывались статистически и графически в операционной среде WINDOWS ХР, системе электронных таблиц EХCEL ХР в составе интегрированной офисной системы, включающей редактор текста WORD ХР. 7 Таблица 1 Сводные данные по материалу и методике исследований Методы Объект исследования исследования Количество крыс (n=13) Мозжечок Препараты Макро- и микропрепарирование 13 Окрашивание гематоксилин – эозином 13 147 Импрегнация азотно-кислым серебром 6 56 Гистохимическое исследование (окрашивание альциановым синим) Гистохимическое исследование (окрашивание толуидиновым синим) Гистохимическое исследование (окрашивание метиленовой синью) Трансмиссионная электронная микроскопия Итого 13 297 8 198 8 131 5 17 13 846 Таблица 2 Сводные данные по материалу и методике исследований Методы Объект исследования исследования Количество крыс (n=78) Алкого Гиперки Алкоголь и ль незия гиперкинезия Макро - и микропрепарирование 26 25 27 Окрашивание гематоксилин - эозином 26/124 25/158 27/143 Импрегнация азотно-кислым серебром Гистохимическое исследование (окрашивание альциановым синим) 10/74 11/76 11/81 26/287 25/317 27/281 Гистохимическое исследование (окрашивание толуидиновым синим) 26/142 25/133 27/157 Гистохимическое исследование (окрашивание метиленовой синью) 23/127 21/114 25/143 7/13 7/13 9/19 26/767 25/811 27/824 Трансмиссионная микроскопия Итого электронная 8 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфофизиологические изменения мозжечка крыс при действии алкоголя Комплексные морфологические исследования позволили выявить, что мозжечок имеет сложное строение. В ткани мозжечка различаются клеточные элементы и межклеточный матрикс. Среди нейронов мозжечка наблюдаются корзинчатые клетки, клетки Пуркинье, клетки-зерна, клетки Гольджи. Гистологические исследования показывают неравномерность расположения клеточных элементов в коре мозжечка и позволяют выделить с учетом структурнофункциональных особенностей несколько слоев: молекулярный, ганглиозный и гранулярный слои. Электронно-микроскопически нейроны мозжечка крыс имели относительно светлое ядро, хорошо выраженную гранулярную эндоплазматическую сеть, а также обилие полисом. В цитоплазме нейронов выявляются скопления базофильного вещества, в виде крупных неоднородных образований, разделенных светлыми участками цитоплазмы. Клетки глии мозжечка были представлены астроцитами и олигодендроцитами. Гистохимические исследования гликозаминогликанов показывают неравномерность их распределения и разное соотношение в слоях мозжечка (рис. 1). Гистохимические и электронно-микроскопические исследования показывают, что в просвете цистерн ЭПР и везикул выявляется специфический секрет представленный в виде мелкозернистого, а в некоторых участках и хлопьевидного материала. Разные отделы комплекса Гольджи характеризуются неодинаковой синтетической интенсивностью, что проявляется содержанием в просвете его структурных элементов неоднородного по электронной плотности содержимого. Митохондрии обнаруживаются в умеренном количестве, в основном они достаточно мелкие, хотя встречаются отдельные сильно набухшие органеллы. На электронных микрофотографиях прослеживается структурно-функциональное взаимодействие между нейроном и олигодендроглией. В нейронах мозжечка и клетках глии прослеживается достаточно высокая структурно-функциональная активность органелл, показателем чего является обилие полисом и рибосом: на площади 1 мкм2 насчитывается около 181 рибосомы (рис. 2). Кровеносные сосуды, формирующие микроциркуляторное русло мозжечка представлены всеми его звеньями, которые формируют мелкопетлистые сети, как на поверхности мозжечка, так и в глубине его ткани. Таким образом, морфофункциональные особенности нейронов коры мозжечка у животных характеризуют активную роль их клеточных мембран в процессах метаболизма, а возможно, и в осуществлении специфической функции нервной клетки. Наши гистохимические и электронно-микроскопические данные о распределении гликозаминогликанов в мозжечке, его клетках и отдельных ультраструктурах нейронов показывают, что они наблюдаются не только в межклеточном матриксе, но также на мембранах эндоплазматического ретикулума и органеллах пластинчатого комплекса, митохондриях и клеточных мембранах. Такая же высокая функциональная активность гликозаминогликанов отмечается в мембранах эндотелия капилляров мозжечка. 9 После введения алкоголя у части животных наблюдалось снижение двигательной активности, у другой части она оставалась практически без изменений. На следующие дни после употребления алкоголя крысы были агрессивны и с повышенной двигательной активностью. Чаще всего крысы собирались в группы, тесно прижавшись, друг к другу. По мере увеличения сроков эксперимента у части животных появилась пассивность. Употребление пищи крысами снизилось. В этой экспериментальной группе животных новорожденные крысята появились только у 2 самок. Из 11 новорожденных крысят в течение месяца выжило только 7. Комплексные морфофункциональные исследования показывают, что к 3-7 суткам эксперимента гистологическая картина мозжечка практически не отличается от картины наблюдаемой в контрольной группе. Электронно микроскопически клеточная мембрана нейронов мозжечка без каких-либо видимых изменений. Ядра содержат небольшое количество неравномерно распределенного хроматина. В мембранах ядер отмечается наличие крипт. Кровеносные сосуды микроциркуляторного русла мозжечка были представлены всеми звеньями. Наблюдалась дилатация сосудов. Стенки капилляров отечны и утолщены. В цитоплазме эндотелиальных клеток выявляются пиноцитозные пузырьки. В нейронах Пуркинье присутствуют первичные лизосомы, рядом в виде групп выявляются митохондрии. Канальцы эндоплазматического ретикулума умеренно расширены и содержат на мембранах рибосомы. В гиалоплазме наблюдаются гетерогенные цитогранулы располагающиеся около митохондрий. Нейрофиламеты несколько утолщены, контуры их слегка размыты. Митохондрии округлой или овальной формы. У части этих органелл отмечаются разрывы внутренней мембраны. Матрикс большинства митохондрий плотный, но в отдельных органеллах наблюдается его пятнистое просветление. Гистохимические исследования показывают, что содержание и соотношение разных классов гликозаминогликанов в мозжечке крыс изменяется при действии алкоголя (рис. 3). Морфометрические исследования показывают особенности динамики соотношения внутриклеточных структур в нейронах мозжечка при действии алкоголя (рис. 4). К 14-30 суткам эксперимента было выявлено, что действие алкоголя приводит к изменению структуры и функции клеток мозжечка. Нейроны в этот период имеют в основном округлую или овальную форму и с ними контактируют клетки глии. Объем клеток увеличен. Ядра нейронов содержат диспергированный хроматин. Ядрышко локализуется в центральной части ядра. Цитоплазматический матрикс этих нейронов был светлее по сравнению с матриксом клеток контрольной группы. Плазмалемма нейронов мозжечка имела размытые контуры, хотя сохраняла первоначальную ультраструктуру. У некоторых нейронов мозжечка клеточная мембрана четко не выявлялась на более значительных участках. Рибосомы и полисомы были фиксированы на мембранах канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума и рассеяны в гиалоплазме в виде полисом разных размеров. Гранулярный эндоплазматический ретикулум представлен густо разветвленной сетью расширенных канальцев. Просвет канальцев заполнен мелкозернистым, реже - тонковолокнистым содержимым с повышенной 10 электронной плотностью по сравнению с окружающей гиалоплазмой. Комплекс Гольджи подковообразной формы с выраженной цис- и трансповерхностями. Количество везикул в этих клетках существенно увеличивается по сравнению с контрольной группой. Особенно заметно возрастает число мелких окаймленных везикул, связь которых как с канальцами гранулярного эндоплазматического ретикулума, так и с цистернами цис- поверхности комплекса Гольджи выявлялись часто. Митохондрии принимают округлую или бобовидную форму с набухшим и просветленным матриксом, их кристы укорачиваются, подвергаются деструкции. Количество митохондрий уменьшается. В цитоплазме нейронов выявляются тонкие микротрубочки, расположенные в виде небольших групп, или по отдельности, в основном около мембранных структур. Нейрофибриллы встречались в виде небольших пучков вблизи плазмалеммы и были ориентированы вдоль ее поверхности. Лизосомы имели повышенную электронную плотность по сравнению с цитоплазмой и были представлены первичными лизосомами. Включения в этих клетках выявлялись в виде единичных осмиофильных образований. Гранул гликогена не выявлено. Морфометрический анализ позволил выявить существенные изменения объёма ультраструктурных элементов нейронов (рис. 4). К 60-90 суткам эксперимента на гистологических препаратах мозжечка выявляются явления разрыхления и просветления межклеточного матрикса. Эти явления характеризовались выраженной гетерогенностью ткани мозжечка, что в большей степени прослеживалось вокруг нейронов и в особенности около клеток Пуркинье. Кровеносные сосуды микроциркуляторного русла с явлениями дилатации и выраженным периваскулярным отеком. Гистохимические исследования гликозаминогликанов мозжечка показали, что содержание и соотношение их разных классов существенно отличается от более ранних сроков эксперимента (рис. 3). В клетках происходят заметные изменения ядра (уменьшение объема и деформации). Усиливается конденсация хроматина, как вдоль ядерной мембраны, так и в центре ядра. Наблюдается тенденция к децентрализации и разрыхлению ядрышек. Плазмалемма на значительных участках клеточной поверхности не выявляется. Комплекс Гольджи локализован в небольшом объеме цитоплазмы и был сжат гипертрофированным гранулярным эндоплазматическим ретикулумом. В нейронах мозжечка уменьшено число везикул и вакуолей. По сравнению с гиалоплазмой электронная плотность содержимого просвета канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума снижена. Количество митохондрий в нейронах и клетках глии снижено, уменьшен их объем, повышена электронная плотность матрикса, уплотнены кристы. В этот период редко встречаются везикулы, микротрубочки, первичные лизосомы, довольно часто встречаются скопления микрофиламентов и вторичные лизосомы. В клетках иногда выявляются небольшие скопления гранул гликогена и липидные капли. Проведенные морфометрические исследования и их анализ показали, что соотношение объема ультраструктурных элементов клетки существенно изменяется (рис. 4). Исходя, из полученных данных можно заключить, 11 что для нейронов мозжечка характерна интенсификация специфической секреторной функции, осуществляемой гранулярным эндоплазматическим ретикулумом и комплексом Гольджи и активизация митохондрий. Таким образом, воздействие алкоголя вызывает изменения в нейронах и клетках глии мозжечка. В мозжечке крыс в ранние сроки прослеживаются явления адаптации, в поздние - дезадаптации. У части клеток наблюдались ультраструктурные признаки экстрацеллюлярного обмена. В более поздние сроки для нейронов и клеток глии были характерны нарушения соотношения синтеза и выведения высокомолекулярных соединений, а также ингибирование синтеза и секреции специфических продуктов, связанных с функционированием комплекса Гольджи. В целом можно отметить, что клетки снижают свою функциональную и секреторную активность. Морфофункциональные изменения мозжечка при гипердинамии Животные данной группы первоначально отличались агрессивностью, иногда повышенной двигательной активностью. Чаще всего они собирались в группы, тесно прижавшись, друг к другу. По мере увеличения сроков эксперимента у части животных появилась пассивность. От употребления пищи и воды крысы не отказывались. В течение первых 3-7-х суток эксперимента гистологическая картина мозжечка крыс и ультраструктурные реакции у большинства нейронов коры мозжечка крыс характеризовались более заметной реакцией и выраженной активацией. Ультраструктурно выявляется, что ткань мозжечка представлена клетками разной формы и величины, расположенными довольно плотно и контактирующими между собой при помощи многочисленных цитоплазматических выростов. Ядра этих клеток занимают более половины объема, имеют овальную форму и слегка инвагинированы. Хроматин располагается пристеночно, образуя мелкие компактные скопления между многочисленными ядерными порами. Локусы конденсации хроматина встречаются также в центральной зоне ядра. Ядрышки были разной формы и величины. Структура ядрышек варьирует по степени плотности и сегрегации гранулярного и фибриллярного компонентов. Наружная ядерная мембрана местами отслаивается от внутренней, иногда прослеживается переход перинуклеарной щели в канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума. Цитоплазматический матрикс этих клеток отличается повышенной электронной плотностью. Клеточная мембрана нейронов прослеживается не на всей поверхности клетки. Гистохимически выявлено, что в этих местах наблюдается окрашивание за счет протеогликанов входящих в состав гликокаликса. Рибосомальный аппарат представлен в основном многочисленными полисомами, свободно расположенными в цитоплазме. Небольшое число рибосом и полисом фиксировано на мембранах канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума. Гранулярный эндоплазматический ретикулум представлен единичными фрагментами овальных, узких или коротких профилей канальцев, заполненных мелкозернистым веществом с высокой электронной плотностью. Комплекс Гольджи занимает небольшой объем цитоплазмы и поэтому далеко не всегда обнаруживается на ультратонких срезах клетки. Везикулы в клетках мозжечка немногочисленны. Среди них прослеживаются гладкоконтурные и 12 окаймленные везикулы. Митохондрии в цитоплазме располагаются неравномерно, чаще они образуют скопления у основания отростков. Характерны молодые митохондрии с вытянутой палочкообразной формой. Микротрубочки встречаются редко и располагаются в основном на периферии клетки и в отростках, так же, как и филаменты. Кровеносные сосуды микроциркуляторного русла характеризуются явлениями артериальной гиперемии. Гистохимические исследования криостатных срезов окрашенных альциановым синим с последующей денситометрией показывают изменения содержания и соотношения разных классов гликозаминогликанов (рис. 5). Морфометрические исследования структурных элементов нейронов показали изменения их соотношения и объёма (рис. 6). К 14-30 суткам эксперимента гистологические и гистохимические исследования показывают изменения тинкториальных свойств ткани мозжечка. В нейронах и клетках глии мозжечка прослеживаются различные ядерноцитоплазматические взаимоотношения. Адаптация к нагрузке сопровождается резким увеличением ядра в размерах, а также его фрагментацией со значительными инвагинациями. В ядерной мембране выявляются открывшиеся поры. В цитоплазме клеток Пуркинье и нейронов зернистого слоя хорошо выражена гранулярная цитоплазматическая сеть с рибосомами. В цитоплазме клеток встречаются полисомы, занимающие значительный объем. Морфометрический анализ показывает, что на площади цитоплазмы в 1 мкм2 содержится около 230 рибосом. Пластинчатый комплекс увеличивается в количестве, его цистерны узкие, и лишь крупные везикулы расширены. Реакция митохондрий проявляется в увеличении их количества, конденсации матрикса, расширении и уплотнении крист. Часть их находилась в процессе деления. К 30 суткам эксперимента в ткани мозжечка сохраняются изменения тинкториальных свойств. Вокруг клеток Пуркинье прослеживаются участки просветления. Некоторые участки ткани мозжечка имеют мозаичный характер. В этот период в клетках Пуркинье и нейронах зернистого слоя мозжечка тельца Ниссля представлены в виде широких, лежащих почти параллельно цистернам эндоплазматического ретикулума, которые разделены практически одинаковыми промежутками. На электроннограммах эти цистерны сообщаются друг с другом посредством анастомозов. В стенках многих цистерн имеются поры. Наружная поверхность мембран, ограничивающих цистерны эндоплазматического ретикулума, усеяна рибосомами, которые располагаются рядами, петлями, спиралями или группами. Более детальное изучение этих мембран показывает, что рибосомы распределены по их поверхности неравномерно. 13 40 35 30 ГАГ Г (%) 25 20 15 10 5 0 ГК А 19,3 Б 33 3,2 В 25,5 Х-4-С 26,2 38 8,7 30,4 Х-6-С 20,8 31 1,5 27,6 Г-С 9,5 12 2,8 11,3 слои Ри ис. 1. Соотношени ие гликоззаминогликанов (Г ГАГ) в мозжечке м крыс в норме. А моолекулярн ный (нарружный) слой, Б - гангл лиозный (ганглион нарный) слой, В зеернистый (грануляррный) слоой. 35 30 25 (%) 20 15 10 5 0 Мит. А 3,4 3 Б 21,7 В 15 5,3 КГ 1,9 24,7 27 7,6 ЭПР 3 3,8 30,9 29 9,1 с слои мозжечка Ри ис. 2. Соотноше С ние площади вн нутриклетточных структур с ронах кры ыс в нейр моозжечка в норме. А – молеекулярны ый слой, Б – гангллиозный сслой, В – зернисты ый сллой. 14 50 45 40 35 ГАГ Г (%) 30 25 20 15 10 5 0 ГК К 27,5 3 32 2,6 7 41,3 14 45,5 30 4 49,3 90 45,7 Х-4-С 17,8 21 1,3 25,5 23,8 2 20,5 21,1 Х-6-С 15,4 18 8,2 20,6 21,2 2 20,6 23,9 Г-С 8,7 7 7,7 8,1 9,7 9,5 10,5 сутки Ри ис. 3. Сооотношени ие гликозааминогликанов в мозжечке м крыс при и действи ии алкоголля. К – контролль 4 45 4 40 3 35 3 30 (%) 2 25 2 20 1 15 1 10 5 0 Мит. М К 11,5 3 14,5 7 15,6 14 14,2 30 13,4 90 11,3 КГ К 17,4 24,2 33,5 37,7 35,2 18,8 Э ЭПР 21,4 22,6 29,9 34,6 39,9 42,1 сутки Ри ис. 4. Соотноше С ние площади вн нутриклетточных структур с в нейр ронах кры ыс моозжечка при п дейсттвии алкогголя. К – контрольь. 15 40 35 30 25 Г ГАГ (%) 20 15 10 5 0 ГК К 27 7,5 3 33,2 2 7 38,5 14 39,3 30 39,8 90 37,7 Х-4-С 7,8 17 23,5 5 24,7 29,8 32,1 32,6 Х-6-С 15 5,4 19,8 8 17,2 21,4 21,7 21,9 Г-С 8,7 8,8 9,7 7,5 6,3 12,3 сутки Ри ис. 5. Сооотношени ие гликозааминогли иканов в мозжечке м крыс при и гиперди инамии. К – коонтроль. 40 35 30 (%)) 25 20 15 10 5 0 К 11,5 3 13,1 7 15,4 14 21,4 3 30 19 9,2 90 14,5 КГ 17,4 18,8 21,2 24,3 35 5,5 19,2 ЭПР 21,4 29,6 32,8 32,7 35 5,4 22,3 Мит. сутки Ри ис. 6. Соотноше С ние площади вн нутриклетточных структур с в нейр ронах кры ыс моозжечка при п гиперрдинамии. К – конттроль. 16 40 35 30 ГАГ (%) 25 20 15 10 5 0 ГК К 27,,5 3 33,3 7 38,7 14 31,2 30 21,6 90 0 33,,8 Х-4-С 17,,8 19,5 21,4 21,6 15,8 19,,5 Х-6-С 15,,4 14,6 15,8 15,5 12,7 10,,1 Г-С 8,7 7 7,8 8,3 8,7 5,6 5,5 5 сутки и Ри ис. 7. Сооотношен ние гликкозаминоггликанов в мозж жечке кры ыс при сочетанно с ом деействии аллкоголя и гиперди инамии. К – контро оль. 30 25 (%) 20 15 10 5 0 К 11,5 3 10,7 7 12,7 14 14,6 30 12,5 9 90 10 0,7 КГ 17,4 23,8 18,8 19,1 18,7 15 5,4 ЭПР 21,4 25,4 28,3 25,6 22,9 18 8,3 Мит. суткки ис. 8. Соотноше С ние площади вн нутриклетточных структур с в нейр ронах кры ыс Ри моозжечка при п сочеттанном действии аллкоголя и гипердинамии. К - контрол ль 17 В нейронах можно проследить хорошо видимую непрерывную связь между гранулярной и агранулярной формами эндоплазматического ретикулума. Рибосомы располагаются также и свободно в цитоплазматическом матриксе между цистернами эндоплазматического ретикулума. В цитоплазме нейронов располагаются мультивезикулярные тельца. Эти сферические образования окружены элементарной мембраной. Они содержат различные количества небольших округлых или эллипсоидных пузырьков, а также разные включения. Матрикс этих телец имел разную электронную плотность по отношению к цитоплазме нейронов - от светлого до темного. К 60-90 суткам в ткани мозжечка сохранялись изменения тинкториальных свойств. В ганглиозном слое прослеживалось уменьшение количества клеток Пуркинье. В молекулярном слое выявляется участки просветления межклеточного матрикса и явления перицеллюлярного отёка. В этот период наблюдаются явления не только артериальной гиперемии, но и венозной. Кровеносные капилляры были полнокровны, неравномерно расширены и отёчны. Среди кровеносных сосудов микроциркуляторного русла отмечаются явления дилатации. В этот период в цитоплазме нейронов прослеживалось развитие деструктивных процессов. Они проявлялись в образовании миелиноподобных фигур, очень мелких липидных тел и вакуолизацией цитоплазмы нейронов. Эти процессы сопровождались образованием мелких лизосом, повышенной электронной плотности. На гистологических препаратах видно, что вокруг клеток зернистого слоя происходят изменения межклеточного матрикса, приобретающие мозаичный характер. Клетки зернистого слоя в некоторых участках начинают мигрировать в межклеточный матрикс молекулярного слоя. Содержание клеток Пуркинье значительно уменьшается. На гистологических препаратах видно, что клетки Пуркинье имеют нечёткий контур, вокруг них наблюдаются участки просветления. Таким образом, в нейронах мозжечка крыс прослеживаются явления адаптации и дезадаптации связанные с повышенной физической нагрузкой. Процессы адаптации мозжечка к разным физиологическим состояниям на субклеточном уровне протекают в нейронах коры мозжечка неодинаково. Высокая структурно-функциональная активность нейронов коры находится в непосредственной связи с функциональной деятельностью мозжечка, его возбудимостью. Адаптация к необычному ритму жизни (в связи с ежедневным бегом крыс на дорожке) сопряжена с деструкцией ультраструктур нейронов. Приспособительные компенсаторные реакции связаны с процессами репаративной и физиологической регенерации, темп которой также усиливается. Регуляторные механизмы нейрона, обеспечивая усиление метаболизма, соответственно повышают его затраты энергии. Морфофизиологические изменения мозжечка крыс при сочетанном действии алкоголя и гипердинамии Экспериментальные животные при сочетанном воздействии алкоголя и гипердинамии плохо употребляли пищу и воду. Крысы были возбуждены и хаотично перемещались по клетке. При сочетанном применении алкоголя и гипердинамии уже на 3 сутки в ткани мозжечка наблюдались изменения тинкториальных свойств. Прослеживается дилатация кровеносных сосудов. В нейронах и клетках глии мозжечка прослежены 18 гипертрофия, гиперплазия митохондрий и других органелл. В этот период выделяются две группы нейронов: с минимальными повреждениями и с выраженными деструктивными изменениями органелл. Гистохимические исследования показали изменения содержания и соотношения сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов (рис. 7). Ультраструктурно в ядрах имеется диспергированный хроматин. Цитоплазматический матрикс просветлён. Клеточная мембрана в некоторых участках нейрона имела размытые контуры, а местами вообще не выявлялась. В цитоплазме нейронов располагались свободные рибосомы и фиксированные на мембранных канальцах гранулярного эндоплазматического ретикуллума. Гранулярный эндоплазматический ретикуллум в виде разветвлённой сети канальцев с мелкозернистым и тонковолокнистым компонентом повышенной электронной плотности. Комплекс Гольджи представлен везикулярным, ламилярным и вакуолярным компонентом. Он имел подковообразную форму. Возрастает количество различных везикул. Среди митохондрий наблюдались структуры, имеющие просветлённый матрикс, слабую осмиофильность мембран и увеличенный объём. Они принимали округлую или бобовидную форму. В цитоплазме нейронов встречались первичные лизосомы. Морфометрические исследования показывают изменения содержания и соотношения внутриклеточных ультраструктур (рис. 8). К 7 суткам мозаичность тинкториальных изменений мозжечка подтверждается как гистологическими, так и гистохимическими исследованиями. Ультраструктурно в нейронах выявляются ядра и ядрышки крупных размеров. Увеличивается инвагинация ядерной оболочки, открываются поры и образуются сублеммальные пространства. Структурно-функциональная активность нейронов коры высокая, особенно аппаратов протеинового синтеза и энергетического. Морфометрически в цитоплазме нейронов мозжечка на 1 мкм2 содержится около 243 ± 21 рибосома. В нейронах мозжечка отмечается фрагментация митохондрий. Повышение энергетических затрат вызывает разбухание митохондрии с деструкцией ее внутренней мембраны. К 14 суткам в молекулярном слое выявляются слабоокрашенные участки и наблюдаются единичные клетки-зёрна, мигрировавшие из зернистого слоя. Клетки Пуркинье имеют нечёткие и размытые контуры. Ядра и цитоплазма с плохо различимыми границами. Между клетками Пуркинье располагаются клетки, мигрировавшие из зернистого слоя. На 30 сутки в нейронах наблюдались явления функционального напряжения органелл, местами деструкция и гипертрофия пластинчатого комплекса, тигролиз микроучастков эндоплазматической сети и развитием лизосом. Морфофункциональная гетерогенность митохондрий нарастала, выявлялись деструктивные изменения. Содержание вещества Ниссля в нейронах мозжечка снижалось. Митохондрии были в состоянии набухания. Они почти полностью утрачивают кристы или имеют межкристную вакуолизацию. Митохондрии занимают намного меньшую площадь, чем в контроле. В цитоплазме в 1 мкм2 имеется около 175 рибосом. На 60-90 сутки сохранялись явления структурной и функциональной дезадаптации. Внутренняя мембрана митохондрий в этот период сохраняет 19 размытый характер. В цитоплазме этих нейронов эндоплазматический ретикулум был представлен дилатированными канальцами и вакуолизированными цистернами. Таким образом, сочетанное действие алкоголя и гипердинамии способствует развитию гипоксии. Снижение функциональной активности нейронов и клеток глии в мозжечке можно рассматривать как защитный механизм, а гибель нейронов уже как следствие истощения внутриклеточных резервов. При хронической гипердинамии прослеживались явления дилатации кровеносных сосудов мозжечка. Структурный полиморфизм нейронов приобретал качественно новые особенности. На гистологических препаратах и на полутонких срезах на фоне отека прослеживалось увеличение содержания клеток глии. Электронно-микроскопически выявляется выраженный морфофункциональный полиморфизм нейронов, различавшихся не только размерами, но и глубиной ультраструктурной перестройки. ВЫВОДЫ 1. При действии алкоголя на ткань мозжечка прослеживаются изменения микроциркуляторного русла в виде дилатации и периваскулярного отёка, изменения биохимизма клеток в виде увеличения содержания несульфатированных гликозаминогликанов. Ультраструктурные и морфометрические данные показывают увеличение количества митохондрий к концу первой недели. Выявлено первоначальное увеличение комплекса Гольджи к 14 суткам с последующим снижением. Эндоплазматический ретикулум увеличивался до 90 суток. 2. Гипердинамия приводит к активации белоксинтезирующих структур клетки уже в первые сутки. Гистохимически прослеживается увеличение содержания сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов. Электронно-микроскопические данные и морфометрия внутриклеточных структур показывает увеличение объёма комплекса Гольджи практически в 2 раза, а эндоплазматического ретикулума в 1,5 раза. Наибольшая активность митохондрий наблюдается к 14 суткам. 3. При сочетанном действии алкоголя и гипердинамии прослеживаются явления артериальной и венозной гиперемии, дилатации и периваскулярного отёка. В мозжечке увеличилось содержание несульфатированных гликозаминогликанов к 7 и 90 суткам. Наибольшая активность митохондрий наблюдалась к 14 суткам. Объём эндоплазматического ретикулума возрастал уже к 3 суткам, комплекс Гольджи увеличивался в объёме к 7 суткам. 4. При действии факторов среды (алкоголя, гипердинамии) по отдельности в течение 90 суток в нейронном компоненте коры мозжечка преобладают физиологические и адаптационные формы морфологической изменчивости, а при сочетанном воздействии исследуемых факторов в этот же срок эксперимента (на 90 сутки) − деструктивные процессы. Выраженность морфологических изменений исследуемых структур мозжечка определяется продолжительностью, видом и характером воздействия. 5. При длительном сочетанном воздействии негативных внешних факторов характерно появление гетеротопий и многорядного расположения нейронов ганглиозного слоя мозжечка, возрастающих по мере увеличения продолжительности воздействия. Прослеживается функциональная взаимосвязь между 20 ультраструктурой нейронов, содержанием и соотношением разных классов гликозаминогликанов и данными морфометрических исследований. 6. Результаты качественного анализа содержания гликозаминогликанов позволяют заключить следующее, что концентрация этих реакционно-способных соединений уже при 7-ми суточном воздействии факторов внешней среды несколько повышена, что свидетельствует о функциональном напряжении нейронов с незначительным уровнем деструкции. Компенсаторно-приспособительные реакции, развивающиеся при 14 суточном воздействии, несколько нивелируют деструктивные процессы, активируя репаративные механизмы, что отражается на снижении содержания гликозаминогликанов. Наименьшая концентрация этих соединений отмечается при 90 суточном воздействии, что характеризует высокий уровень деструктивных процессов, который возрастает по мере увеличения сроков исследования. Практические рекомендации 1. Результаты экспериментальных исследований могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах биологии, анатомии, гистологии, физиологии, патологической анатомии, психологии биологических и медицинских вузов. 2. Гистохимические исследования с целью изучения разных классов гликозаминогликанов и их динамики можно рекомендовать для оценки биохимического и функционального состояния мозжечка. 3. Комплексные ультраструктурные и морфометрические методы исследования могут быть использованы для оценки структурного и функционального состояния синтетического и энергообразующего аппарата клеток. 4. Полученные данные могут быть использованы при подготовке монографий, справочников, учебных пособий и методических рекомендаций. Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Лобанов С.А. Морфофункциональные изменения митохондрий при стрессе / С.А. Лобанов, А.В. Данилов, Е.В. Данилов, С.К. Асаева, Г.Ф. Арсланова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - № 12. – т. 144. - C. 699-702 2. Лобанов С.А. Влияние гипердинамии на ультраструктуру и метаболизм мозжечка у крыс / С.А. Лобанов, А.Ю. Костарев, В.Ю. Корнаухов, А.В. Данилов, Е.В. Данилов, Т.З. Хасанов // Вестник ЧГПУ. - 2009. - № 4. - C. 308-320 Другие публикации 3. Лобанов С.А. Мозжечок и внешние факторы: монография / С.А. Лобанов, А.В. Данилов. – Уфа, Вагант, 2009. - 132 с., 61 ил., 10 табл. 4. Емелёва Т.Ф. Патоморфологические изменения мозжечка при действии негативных факторов / Т.Ф. Емелёва, А.В.Данилов, Е.В. Данилов, С.К. Асаева // Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции «Биологические науки в XXI веке: проблемы и тенденции развития».- Часть II.Бирск.: Бирск. гос. соц.-пед. акад., 2005. – С.152-157 5. Лобанов С.А. Морфофункциональные особенности мозжечка при действии алкоголя / С.А. Лобанов, Т.Ф. Емелёва, Е.В., Данилов, А.В.Данилов, С.К. Асаева, Г.Ф. Арсланова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции 21 «Совершенствование системы профессиональной подготовки и повышения квалификации кадров в области физической культуры и спорта». – Ижевск: Издательский дом «Удмуртский университет». - 2006. - С. 146-148 6. Лобанов С.А. Мозжечок и внешние факторы / С.А. Лобанов, Т.Ф. Емелёва, А.В. Данилов, Е.В. Данилов, С.К. Асаева, Г.Ф. Арсланова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - № 1. - C. 75-78 7. Лобанов С.А. Патоморфология митохондрий при стрессе / С.А. Лобанов, А.В. Данилов, Е.В. Данилов, С.К. Асаева, Г.Ф. Арсланова, Т.Ф. Емелёва // Вестник БГПУ им. М. Акмуллы. - 2007. - № 1. - C. 44-50 8. Лобанов С.А. Ультраструктурные особенности вещества Ниссля / С.А. Лобанов, А.В. Данилов, Е.В. Данилов, Г.Ф. Арсланова, С.К. Асаева, Т.Ф. Емелёва // Вестник БГПУ им. М. Акмуллы. - 2007. - № 2. - C. 56-63 9. Данилов А.В. Патоморфологические изменения мозжечка при действии алкоголя и гипердинамии / А.В. Данилов // Вестник БГПУ им. М. Акмуллы. - 2008. - № 1. - C. 169-186 10. Лобанов С.А. Особенности влияния алкоголя на ультраструктуру клеток мозжечка / С.А. Лобанов, А.В. Данилов // Проблемные вопросы физиологии и психологии: межвузовский научный сборник. Уфа: РИЦ БашИФК, 2008. – С. 88-93 11. Лобанов С.А. Роль гипердинамии как стрессового фактора / С.А. Лобанов, А.В. Данилов // Проблемные вопросы физиологии и психологии: межвузовский научный сборник. Уфа: РИЦ БашИФК, 2008. - С. 92-96 22 Лицензия на издательскую деятельность Б 84821 от 03.11.2000 г. ИПК БГПУ 450000, г.Уфа, ул. Октябрьской революции, 3а подписано в печать 08.09.09 г. Формат 60х84/16 Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,5 Тираж 100. Заказ № 383 23
