Коррекция окислительного стресса мозга с помощью природных

На правах рукописи
СТЕПАНОВА Мария Сергеевна
«Коррекция
окислительного стресса мозга с помощью
природных и синтетических антиоксидантов»
03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Москва
2009
2
Работа выполнена в лаборатории клинической и экспериментальной
нейрохимии Научного Центра неврологии РАМН
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор
Болдырев Александр Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Муронец Владимир Израилевич
кандидат биологических наук
Казей Василий Игоревич
Ведущая организация:
институт биохимии
им А.Н. Баха РАН
Защита состоится «
»
2009 г. в
ч.
мин. на
заседании диссертационного учёного совета Д.213.203.13. при Российском
университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая, д.8, Аграрный факультет РУДН, аудитория
.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке
Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул.
Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан «
»
2009 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета Д.213.203.13.,
доктор биологических наук
профессор
_____________________ Лукашева Е.В.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК)
выполняют в организме разнообразные функции, связанные с регуляцией
процессов
пролиферации,
дифференцировки,
клеточной
адгезии,
свертывания крови, апоптоза, а также защитой организма от чужеродных
агентов. Они служат вторичными мессенджерами в многочисленных
сигнальных каскадах, инициированных гормонами, цитокинами, факторами
роста, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке.
Метаболиты кислорода – его активные формы (такие как супероксид
радикал, гидроксид-радикал, оксид азота, перекись водорода), а также
липидные гидроперекиси могут реагировать с различными клеточными
компонентами, что приводит к нарушению клеточных функций. Для
предотвращения повреждений в организме существует многоступенчатая
система антиоксидантной защиты, включающая как специальные ферменты,
так и неферментативные антиоксиданты. В нормальных условиях
антиоксидантная система (АОС) способна контролировать и предотвращать
негативные последствия действия кислородных радикалов. Однако при
избыточном образовании радикалов или нарушении работы антиоксидантной
системы возникает дисбаланс между продукцией и нейтрализацией
оксидантов. Такое состояние, сопровождающееся усилением деструктивных
процессов в тканях, называют окислительным стрессом (ОС).
Свободнорадикальное
повреждение
клеточных
компонентов
вовлечено в патогенез многих заболеваний и патологических процессов,
таких как ишемическое и реперфузионное повреждение тканей,
воспалительные процессы, рак, сосудистые нарушения, атеросклероз,
нейродегенеративные заболевания, а также в процессы адаптации и старения
(всего более 100) (Halliwell and Gutteridge, 1999).
Для исследования механизмов окислительного стресса при различных
заболеваниях применяются методы моделирования этого состояния как in
vitro, так и in vivo. В экспериментальных моделях in vivo используют
животных с направленно модифицированным генотипом или вызывают
состояние окислительного стресса с помощью радикал-продуцирующих
агентов и нейротоксинов. Разработка новых моделей, более точно
имитирущих свободнорадикальные патологии у человека, является
актуальной проблемой, в частности, для таких состояний, как инсульт и
нейродегенеративные заболевания.
Для подавления окислительного стресса все чаще используются
синтетические антиоксиданты, применение которых нарушает сигнальную
роль АФК и ухудшает адаптационные возможности организма. В связи с
этим, актуальным является систематическое исследование природных
протекторов. Анализ воздействия этих соединений на организм в условиях
окислительного стресса является весьма важной задачей. Природные
антиоксиданты могут играть существенную роль в предотвращении
заболеваний, связанных с окислительным повреждением, а изучение
4
механизмов работы антиоксидантной системы создает возможность для
разработки новой стратегии профилактики и лечения этих заболеваний.
Цель исследования: изучение механизмов действия природных
протекторов карнозина и N-ацетиласпартилглутамата (NAAG) и их
сравнение с синтетическим лекарственным препаратом мексидолом (2этил,6-метил,3-оксипиридина сукцинат) на комбинированных моделях
окислительного стресса.
В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие
задачи:
1) характеристика последствий пренатальной гипоксии на
клеточном уровне и на уровне целого организма; 2) разработка
комбинированных
моделей
окислительного
стресса
(вызываемого
модификацией энергетического обмена и/или нарушением мозгового
кровообращения), позволяющих оценить влияние окислительного стресса на
неврологические и биохимические характеристики организма исследуемых
животных; 3) сравнительный анализ протекторного действия карнозина,
мексидола и NAAG в используемых моделях окислительного стресса.
Положения,
выносимые
на
защиту.
Разработаны
экспериментальные модели окислительного стресса мозга, создаваемые
комбинацией ишемического (гипоксического) повреждения и действия
нейротоксина 3-НПК. По ряду параметров такие комбинированные модели
окислительного стресса в большей степени приближены к ситуациям,
возникающим при нейродегенеративных заболеваниях человека. Показано,
что карнозин, мексидол и NAAG оказывают защитное действие на мозг
экспериментальных животных в условиях окислительного стресса. При этом
карнозин и мексидол в одинаковой степени предотвращают развитие
окислительных повреждений в мозге и эффективны во всех использованных
моделях, в то время как NAAG не полностью предотвращал снижение
антиоксидантной активности и развитие окислительных повреждений в мозге
и был неэффективен в моделях с использованием 3-НПК.
Научная новизна
и практическая значимость работы.
Разработаны
комбинированные
модели
окислительного
стресса,
позволяющие выявить и сопоставить неврологическую симптоматику с
возникшими метаболическими нарушениями. В диссертации представлены
доказательства эффективности карнозина, как модулятора функции нейронов
головного мозга, проявляющего свою активность независимо от природы
окислительного стресса на различных моделях in vitro и in vivo. Обоснована
целесообразность
использования
карнозина
и
мексидола
как
дополнительного терапевтического средства при стандартной лекарственной
терапии пациентов в условиях окислительного стресса.
Апробация
диссертации.
Результаты
исследований
были
представлены на научной экологической конференции в РУДН 18-19 мая
2004 г. «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (Москва,
2004); на Х Международном Симпозиуме по фармакологии церебральной
ишемии (Марбург, Германия 2004); Научной конференции "Нейрохимия:
фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005); Международной
конференции "Neuroscience 2005" (Вашингтон, 2005); XIII Международной
5
конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные
технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф,
Крым, Украина, 2005); на Международном Конгрессе «Молекулярные
основы неврологических и психиатрических заболеваний» (Мартин,
Словакия, 2006); на конференции «Структурные функциональные
нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и
пластичности мозга» (Москва, 2007); на III Евро-азиатской конференции,
посвященной влиянию отходов производства на здоровье человека (Стамбул,
Турция, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в
том числе 8 статей в журналах по списку ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена
на _____ страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора
литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения
результатов, выводов и списка литературы.
Работа иллюстрирована 32 рисунками и 13 таблицами. Список
литературы включает 211 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.Модель пренатальной гипоксии. В опытах использовано
потомство, полученное от 15 самок (119 животных). Гипоксической
гипоксии подвергали самок крыс на 10 день беременности, создавая в
барокамере разрежение, соответствующее подъему на высоту 12 000 м над
уровнем моря. Животных выдерживали в условиях гипоксии вплоть до
остановки дыхания (180-240 с). Животные получали в постгипоксическом
периоде карнозин (100 мг/кг в день в составе питьевой воды ежедневно);
мексидол (100 мг/кг в день в составе питьевой воды ежедневно); NAAG (по 2
мг/кг интраперитонеально дважды - спустя 1 час и 3 часа после
гипоксического эпизода).
В физиологических экспериментах крыс в возрасте 22 дней
тестировали в «открытом поле», а в возрасте 30 дней проверяли обучаемость
животных с помощью Т-образного лабиринта. В Т-образном лабиринте
животных обучали находить пищу ежедневно в течение 10 дней (с 30 по 40
день жизни), после чего проводили 2 тестирования на запоминание (в
период между 13-15 и 35-38 днями от начала обучения).
В биохимических экспериментах оценивали антиоксидантную
устойчивость мембран мозга, используя тест Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции. Измерение хемилюминесценции гомогенатов мозга
проводили на люминометре LKB 1251 (Швеция), оценивая следующие
показатели: h (mV) – уровень предобразованных гидроперекисей, τ (c) – лагпериод (характеризует устойчивость ткани к окислению), а также скорость
окисления липидного материала (Федорова и соавт., 1998).
В опытах на нейронах использовали полученную из мозжечка
первичную (недифференцированную) культуру гранулярных клеток,
исследуя их резистентность к окислительному стрессу, вызываемому
6
перекисью водорода (20 мМ) или NMDA (N-метил-D-аспартата, 100-500
мкМ).
Моделирование окислительного стресса на суспензии нейронов in
vitro. Исследование окислительного стресса на суспензии нейронов мозжечка
9-12 дневных крыс, проводили на проточном цитометре EPICS XL фирмы
Beckman Coulter (США). Для регистрации изменения уровня свободных
радикалов в клетках использовали карбокси-2,7-дихлордигидрофлуоресцеин
диацетат (СDCF-DA, 100 мкМ). Количество мертвых клеток в нейрональной
суспензии измеряли в присутствии иодида пропидия (PI). В каждой пробе
подвергали анализу 10 000 клеток, повторяя измерения в 3-4 параллельных
пробах.
Часть экспериментов (измерение хемилюминесценции гомогенатов
мозга крыс и обучение в Т-образном лабиринте ) была выполнена совместно
с Добротворской И.С.
2.Модель гипобарической гипоксии, отягощенной нарушением
энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3нитропропионата (3-НПК). В работе использовали 90 половозрелых крыс
самцов линии Wistar. В первой серии экспериментов 3-НПК в дозе 30 мг/кг
вводили крысам внутрибрюшинно в течение 6 дней после гипоксии. Во
второй серии экспериментов после 5-дневного введения 3-НПК на 6 сутки от
начала введения, животных подвергали гипобарической гипоксии (см. раздел
1, Материалы и методы). Сразу после восстановления дыхания
гипоксических животных случайным образом разделяли на группы (по 10-12
животных) и вводили им интраперитонеально (однократно) карнозин (100
мг/кг массы тела), мексидол (50 мг/кг), мексидол совместно с карнозином (в
тех же дозах) или физиологический раствор.
В течение всего эксперимента ежедневно проводили регистрацию веса
животных и оценку развития неврологических нарушений, вызванных
действием 3-НПК с помощью 5-балльной шкалы оценки неврологических
симптомов (Beal, 1994; Guyot et al, 1997, Федорова и соавт., 2002). На 7-е
сутки животных декапитировали и использовали серое вещество головного
мозга для выделения митохондриальной фракции, проводимого методом
дифференциального центрифугирования. В митохондриальной фракции
определяли активности супероксиддисмутазы (СОД), моноаминоксидазы В
(МАО В) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Активность супероксиддисмутазы
определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия
при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления
ксантина ксантиноксидазой. За единицу активности СОД принимали
количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления
нитросинего тетразолия в условиях проведения реакции (Mishra, Fridovich,
1972). Активность МАО В определяли, используя в качестве субстрата
бензиламин (Gallant et al, 2000). Активность СДГ определяли по скорости
восстановления
2,6-дихлорфенолиндофенола
в
присутствии
феназинметасульфата при ферментативном окислении сукцината натрия
(Кривченкова, 1977).
7
3.Модель ишемии, отягощенной нарушением энергетического
метаболизма в результате действия нейротоксина 3-нитропроприоната
(3-НПК). Моделирование 3-сосудистой глобальной ишемии головного
мозга (Pulsinelli, Brierley, 1979; Fedorova et al, 2002) осуществлялось в два
этапа: на первый день проводили пережигание левой позвоночной артерии,
на второй день создавали 15-минутную окклюзию обеих сонных артерий с
последующей 5-дневной реперфузией. Забой животных проводили на 7 день
эксперимента. В течение 5-ти дней реперфузии животные получали 3-НПК,
30 мг/кг , i.p. ежедневно. Карнозин вводили (100 мг/кг, i.p.) по следующей
схеме: в начале реперфузии (в течение 1 мин), через 4, 8 и 24 часа после
операции, далее – ежедневно, 1 раз в сутки в течение 3 дней. NAAG (5 мг/кг,
i.p.) вводили животным за 30 мин до ишемии и на следующие сутки после
операции.
Неврологическую симптоматику животных оценивали по 5-балльной
шкале признаков (Beal, 1994; Guyot et al, 1997, Федорова и соавт., 2002) сразу
после выхода животных из наркоза, и затем через 4, 8 и 24 часа и далее
ежедневно в течение всего периода реперфузии. В митохондриальной
фракции серого вещества больших полушарий головного мозга проводили
измерение активности супероксиддисмутазы (СОД), моноаминооксидазы В
(МАО В) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ). В гомогенате мозга в условиях
Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции
измеряли
уровень
2+предобразованных липоперекисей (h), скорость Fe -индуцированного
окисления (v) и лаг-период (τ), характеризующий общую окислительную
резистентность образцов (Fedorova et al, 1999).
Статистическую обработку данных проводили по критерию КрускалаУоллиса, с последующим анализом с помощью критерия Данна.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика модели пренатальной гипоксии. Животные,
перенесшие пренатальный гипоксический эпизод, в первые дни жизни
отличались пониженной массой тела и были менее подвижны по сравнению с
интактной группой. Нейроны, выделенные из мозга животных, перенесших
гипоксию, отличались повышенным уровнем флуоресценции DCF, что
свидетельствует о повышенном уровне свободнорадикальных процессов в
мозге этих животных. Для оценки устойчивости мозга животных к
окислительному стрессу, нейроны, изолированные из мозжечка 12-дневных
животных подвергали действию перекиси водорода, что приводило к резкому
возрастанию уровня свободных радикалов (рис. 1А). Нейроны гипоксической
группы животных были более чувствительны к воздействию перекиси
водорода. При воздействии перекиси водорода наблюдалось также
увеличение количества мертвых клеток (рис. 1Б).
8
60
45
*#
Н2О2 20 мМ 20
мин
40
% мертвых клеток
% интенсивно окрашенных по DCF
контроль
70
50
40
30
*
#
*
20
контроль
Н2О2 20 мМ 20 мин
35
#
#
30
25
*
20
15
10
10
5
0
0
интактные
гипоксия
А
интактные
гипоксия
Б
Рис. 1. Увеличение процента клеток с повышенным уровнем АФК (А)
и количества мертвых клеток (Б) при воздействии перекиси водорода (20 мМ
в течение 20 мин) на нейроны. «*» соответствует достоверному отличию от
контроля; «#» соответствует достоверному отличию от группы интактных животных.
Рис. 2. Увеличение процента
клеток с повышенным уровнем АФК
при воздействии NMDA (500 мкМ в
течение 60 мин) на нейроны
(обозначения как на рис. 1).
% интенсивно окрашенных по DCF
Инкубация клеток с агонистом ионотропных глутаматных рецепторов
NMDA также вызывала значительный прирост уровня АФК (рис. 2).
25
*#
контроль
20
NMDA 500 мкМ 60 мин
15
10
5
#
*
0
интактные
гипоксия
Таким образом, в нервных клетках мозга, формировавшегося в
условиях окислительного стресса, вызванного перенесенным гипоксическим
эпизодом, наблюдался повышенный уровень АФК, и, вследствие этого,
снижалась устойчивость к воздействию специфических и неспецифических
индукторов окислительного стресса. Мы предположили, что это связано с
истощением антиоксидантной защиты в тканях мозга.
При анализе устойчивости тканей мозга к окислению мы обнаружили,
что в мозге животных гипоксической группы существенно увеличивается
уровень предобразованных гидроперекисей, возрастает скорость окисления и
резко уменьшался лаг-период окисления, характеризующий общую
9
антиоксидантную активность тканей мозга, по сравнению с контрольными
параметрами (таблица 1).
Полученные результаты указывают на системные изменения
биохимических параметров мозга потомства, перенесшего пренатальную
гипоксию, выражающиеся в существенном ослаблении эндогенной системы
антиоксидантной защиты и приводящую к усиленной гибели нейронов в
условиях индуцированного стресса.
Таблица
1.
Характеристика
Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции гомогенатов серого вещества мозга различных
групп животных.
Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции
Группы
Предобразован-ные
Скорость
Лаг- период,
животных
гидроперекиси, отн.
окисления,
с
ед.
отн.ед.
контроль (n=7)
129,3 ± 35,5
102,9 ± 16,8
5,05 ± 0,78
гипоксия (n=7)
252,7 ± 72,5*
77,1 ± 16,3*
6,92 ± 0,53*
Примечание: * - достоверное отличие от контрольной группы (р<0,05).
При тестировании в «открытом поле» у животных «гипоксической»
группы наблюдался повышенный уровень двигательной активности и
пониженная исследовательская активность по сравнению с интактными
животными. Подобные нарушения поведения могут быть связаны с
нарушением баланса медиаторов (дофамина, серотонина и норадреналина) в
мозге (Граф и соавт., 2008; Perrin et al, 2004).
В нашем исследовании в течение первых 10 дней обучения в Тобразном лабиринте различий между животными не наблюдалось (рис. 3).
Среднее число успешных попыток
10,00
интактные
9,00
гипоксия
8,00
7,00
6,00
5,00
*
*
4,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
13
14
15
35
36
День обучения
Рис. 3. Обучение животных в Т-образном лабиринте (* - достоверное
отличие от контрольной группы).
10
4
280
3,5
270
3
260
2,5
250
2
240
1,5
вес, г
Неврологические
нарушения в баллах
Однако при тестировании памяти животных после 2-дневного (на 13-й
день) и 20-дневного перерыва (на 35-й день) в обучении обнаруживалось, что
число успешных попыток в лабиринте у животных «гипоксической» группы
значительно уменьшалось.
Таким образом, гипоксический эпизод в период внутриутробного
развития приводит к нарушениям в нервной системе животных,
проявляющимся как на клеточном уровне (накопление гидроперекисей,
усиление чувствительности к окислительному повреждению, увеличение
смертности нейронов), так и в нарушении памяти и поведения животных.
Модель гипобарической гипоксии, осложненной введением 3нитропроприоната.
Исследование
гипоксических/ишемических
повреждений мозга крыс осложняется тем, что после гипоксического эпизода
у животных, как правило, не выявляется неврологической симптоматики, что
делает невозможным сравнение метаболических и неврологических
нарушений. Применяемое нами гипоксическое воздействие также само по
себе не выявляло неврологической симптоматики, хотя и приводило к
некоторому уменьшению двигательной активности животных. При этом
перенесенный гипоксический эпизод не вызывал изменения активности и
измеряемых ферментов (МАО В, СОД, СДГ). Для того чтобы оценить эффект
противогипоксических препаратов как на поведение, так и на биохимические
изменения, возникающие в результате окислительных повреждений мозга,
мы предложили модель, сочетающую гипоксию с действием
митохондриального
токсина
3-НПК,
усиливающего
состояние
окислительного стресса в мозге. Комбинация гипоксии с действием 3-НПК
приводила не только к более выраженным нарушениям двигательной
активности, но и к выявлению характерной неврологической симптоматики
(рис. 4). При этом наблюдалась потеря веса животными, достигающая к 6
дню опыта около 8%, а также снижение двигательной (в 3,5 раза) и
исследовательской (в 10 раз) активности животных.
230
баллы
1
220
вес
0,5
210
0
200
1
2
3
4
5
6
День
опыта
Рис. 4. Изменение неврологической симптоматики и массы тела при
введении 3-НПК.
11
Схожие симптомы наблюдались и при введении животным 3-НПК без
гипоксического воздействия, что сопровождалось 4-кратным снижением
СДГ, однако изменения активности митохондриальных ферментов МАО В и
СОД при действии 3-НПК не наблюдалось, как и при пренатальной
гипоксии.
Неврологическая
симптоматика, баллы
Характеристика ишемии, осложненной введением 3-НПК.
Глобальная ишемия в наших экспериментах сама по себе не вызывала
проявлений неврологической симптоматики, и по внешнему виду
ишемические животные не отличались от подвергшихся «ложной операции»
(ЛО).
Для выявления неврологического дефицита мы применили
комбинацию 3-НПК и экспериментальной ишемии головного мозга, что
позволило
выявить
выраженную
неврологическую
симптоматику,
коррелирующую со значительными метаболическими сдвигами. Характерно,
что типичные неврологические нарушения (нарушение позы, ригидность
мышц задних конечностей и хвоста, парезы сначала задних, а потом и
передних конечностей, ротационные движения, снижение двигательной
активности, потеря веса), начинали выявляться на 3 день после начала
введения 3-НПК и усиливались со временем (рис. 5).
4,0
*
ЛО+3НПК
3-НПК
3,0
*
ишемия+3-НПК
2,0
1,0
0,0
1
2
3
4
5
День введения 3-НПК
Рис. 5. Неврологическая симптоматика в исследуемых группах (* достоверное отличие от групп 3-НПК, ЛО+3-НПК).
По результатам хемилюминесцентного анализа Fe2+-индуцированного
окисления гомогенатов мозга ложнооперированные животные, получавшие
3-НПК, по исследуемым параметрам достоверно не отличались от интактных
и ложнооперированных (таблица 2). В то же время, в мозге животных,
подвергшихся ишемии и ишемии в сочетании с 3-НПК наблюдался
повышенный уровень предобразованных гидроперекисей, уменьшение лагпериода окисления и значительное увеличение скорости перекисного
окисления по сравнению с интактными и ложнооперированными
животными. При этом у группы животных, подвергшихся ишемии в
12
сочетании с 3-НПК, эти изменения были более выражены, что отражает
сочетанное действие 3-НПК и ишемии на развитие окислительного стресса,
проявляющееся и в более выраженной неврологической симптоматике
животных этой группы (рис. 5).
Таблица 2. Параметры Fe2+-индуцированного окисления в
гомогенатах мозга экспериментальных животных.
Группы животных
Параметры Fe-индуцированного окисления
Предобразованные
Лаг-период, Скорость
гидроперекиси,
с
окисления
отн. ед.
ед/мин
Интакные
161±28
122± 16
103± 4
Ложнооперированные
167±30
116± 10
94± 3
Ложнооперированные
201± 32
115± 7
98± 2
+3-НПК
Ишемия
248 ±12 *
83± 10 *
152± 7*
Ишемия+3-НПК
272 ±29 *
86± 9 *
175± 2*
Примечание: *- соответствует достоверному отличию от групп интактные, ЛО и
ЛО+3-НПК.
Сукцинатдегидрогеназная активность в митохондриальной фракции
мозга оставалась неизменной при ложной операции (по сравнению с этим
параметром у интактных животных), но значительно возрастала в условиях
ишемии после 5 дней реперфузии (таблица 3). Во всех группах, получавших
3-НПК, наблюдалось 4-кратное необратимое подавление СДГ, что приводило
к развитию энергетического дефицита и повреждению нейронов стриатума и
развитию характерной неврологической симптоматики.
Таблица 3. Активность МАО В, СОД и СДГ в различных группах
экспериментальных животных.
Группы животных
Активность исследуемых ферментов
СОД
СДГ
МАО В,
нмоль
ед/мг белка в нмоль СцNa /мг
бензальдегида
час
белка в час
/мг белка в
час
Интакные
293±9
56,6± 1,5
41± 2,9
Ложнооперированные
317±9
60,7± 1,3*
39± 1,1
3-НПК
262±11
56,4±1,0
12±1,6*
Ложнооперированные+3299± 12
62,0± 2,1*
11± 1,5*
НПК
Ишемия
363 ±19 *#
62,8± 1,6*
65± 2,7*
Ишемия+3-НПК
351 ±13*#
74,9± 1,3*#
12± 0,8*
Примечание: * - соответствует достоверному отличию от группы интактных
животных; # - cоответствует достоверному отличию от групп ЛО, ЛО+3-НПК, 3-НПК.
13
Рис. 6. Увеличение доли
клеток с повышенной продукцией
АФК при воздействии перекиси
водорода (20 мМ в течение 20
мин) на нейроны. * - соответствует
достоверному отличию от контроля; # соответствует достоверному отличию от
группы интактных животных; $ соответствует достоверному отличию от
других групп.
% интенсивно окрашенных по DCF
Введение 3-НПК не приводило к изменению активности СОД, ложная
операция, ишемическое воздействие, вызывало незначительное повышение
активности СОД, в то время как сочетание ишемии и 3-НПК существенно
увеличивало активность этого фермента, хотя это не приводило к защите
мозга от накопления липидных перекисей. В литературе неоднократно
отмечалось
повышение
активности
как
цитозольной,
так
и
митохондриальной СОД в ответ на введение 3-НПК (Fu et al, 1995; Binienda,
Ali, 2001; McCracken et al, 2001). Однако, судя по смертности животных,
такого рода мобилизационный ответ животных оказывается в условиях
эксперимента недостаточным.
Ишемическое воздействие вызывало увеличение активности МАО В
(на 15% по сравнению с ложнооперированными животными), в то время как
3-НПК достоверно не влияла на активность этого фермента. Известно, что
активация МАО В в период реперфузии (Гукасян и соавт., 2000) может
способствовать интенсификации перекисного окисления липидов, так как
при окислении ей субстратов образуется перекись водорода (Maragos et al,
1999). Активацию МАО В связывают с повышенным уровнем внеклеточного
дофамина при ишемии в результате нарушения обратного захвата дофамина
и гибели дофаминергических нейронов (Гукасян и соавт., 2000). Показано,
что 3-НПК также нарушает обратный захват дофамина и может
способствовать повышению МАО В (Maragos et al, 2002).
Таким образом, в модели сочетающей воздействие ишемии с 3-НПК,
наблюдалось повышение активности ферментов МАО В и СОД, что
свидетельствует о большей интенсивности процессов окислительного
повреждения в мозге, чем в моделях пренатальной гипоксии и гипоксии,
отягощенной 3-НПК.
Оценка действия N-ацетиласпартилглутамата в условиях
окислительного стресса.
Пренатальная гипоксия. У животных, подвергшихся пренатальной
гипоксии и получавших NAAG, в отличие от животных «гипоксической»
группы, не было обнаружено внешних отличий от интактных животных и
отставания в весе. Доля нейронов с повышенной флуоресценцией в нейронах
мозжечка этих животных, как исходно, так и при воздействии перекиси была
довольно высокой по сравнению с интактной группой, но ниже, чем в
гипоксической группе (рис. 6).
70
*$
60
контроль
Н2О2 20 мМ 20 мин
*
50
#$
40
*
30
*
*$
#
20
10
0
интактные
гипоксия
гипоксия+НААГ
14
Введение NAAG приводило к снижению скорости окисления и
уровня предобразованных гидроперекисей, повышенных в результате
воздействия гипоксии, однако лаг-период окисления в этой группе оставался
сниженным.
Сниженный
уровень
антиоксидантной
активности
свидетельствует о том, что хотя NAAG и смог предотвратить негативные
последствия гипоксии, связанные с экзайтотоксической гибелью нейронов,
он при этом не смог полностью предотвратить развитие окислительных
повреждений и истощения антиоксидантной системы в организме (таблица
4).
Таблица
4.
Характеристика
Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции гомогенатов мозга
и активность СОД в
митохондриальной фракции различных групп животных.
Параметры Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции
Активность
Группы
ПредобразоMn-СОД,
Скорость
животных
ванные
Лаг-период,
ед/мг белка
окисления,
гидроперекиси,
с
отн. ед.
отн. ед.
Интактные (n=7) 3,96 ± 0,56
129,3 ± 35,5
102,9 ± 16,8 5,05 ± 0,78
Гипоксия (n=7)
3,87 ± 077
252,7 ± 72,5* 77,1 ± 16,3* 6,92 ± 0,53*
Гипоксия+NAAG
4,10 ± 0,57 186,6 ± 54,9 # 93,3 ± 17,2 5,18±0,22 #
(n=6)
Примечание: * - достоверное отличие (p<0,05) от группы интактных животных, # достоверное отличие (p<0,05) от группы гипоксия.
Ишемия, отягощенная 3-НПК. Неврологическая симптоматика в
группе крыс, получавших NAAG, была достоверно выше, чем в группе
животных, перенесших ишемию, отягощенную 3-НПК (таблица 5)..
Таблица 5. Активность МАО В и СОД в митохондриальной
фракции мозга различных экспериментальных групп.
Группы животных
Mn-СОД,
MAO B, нмоль/мг Неврологическая
ед/мг белка
белка в час
симптоматика,
баллы
ложнооперированные
11,1±2,6
290±29
0
(n=10)
ишемия+3-НПК
13,4±2,2
318±14
1,7±0,2
(n=12)
ишемия+
3-НПК+NAAG
9,8±2,1*
343±48 #
2,7±0,5*
( n=8)
Примечание: * - достоверное отличие (p<0,05) от группы ишемия+3-НПК, # достоверное отличие (p<0,05) от группы ложнооперированные.
В группе животных, получавших NAAG, активность Mn-СОД была
достоверно ниже по отношению к группе ишемия+3-НПК, что, возможно,
15
Рис. 7. Увеличение
доли клеток с повышенной
продукцией
АФК
при
воздействии
перекиси
водорода (20 мМ в течение 20
мин) на нейроны.. * соответствует
достоверному
отличию от контроля; # соответствует
достоверному
отличию от группы интактных
животных;
$
соответствует
достоверному отличию от других
групп.
% интенсивно окрашенных
DCF
свидетельствует о подавлении этого фермента на уровне экспрессии генов в
результате действия АФК (Дубинина, 2006). Активность МАО В при этом
была достоверно выше, чем в контрольной группе, но не отличалась от
активности в группе ишемия +3-НПК (таблица 5).
Проведенные исследования позволяют заключить, что несмотря на
имеющиеся литературные данные, описывающие нейропротекторные
свойства NAAG при ишемии (Cai et al, 2002), его двукратное введение (до и
на следующие сутки после ишемии) вызывало ухудшение неврологической
симптоматики экспериментальных животных. Возможное объяснение такого
эффекта может заключаться в том, что NAAG способен нарушать
гематоэнцефалический барьер стриатума, что было показано в литературе
(Pliss et al, 2002). Он также может гидролизоваться под действием фермента
NAAG-пептидазы с образованием глутамата, который, как известно,
обладает выраженным экзайтоксическим действием (Thomas et al, 2000).
Повышение активности МАО В в этих условиях (см. таблицу 5) может быть
следствием роста уровня дофамина из-за гибели дофаминергических
нейронов и нарушения обратного захвата дофамина под действием 3-НПК
(Maragos et al, 2002). Дофамин усиливает экзайтотоксическое действие
глутамата (Chapman et al, 1989; Filloux, Wamsley, 1991), усугубляя
окислительный стресс в тканях мозга, что приводит к дальнейшей гибели
нейронов и усилению неврологической симптоматики.
Таким образом, сложность проявлений эффектов NAAG может
привести к нежелательным последствиям с усилением неврологической
симтоматики и препятствовать возможному положительному эффекту NAAG
на мозг. Это делает проблематичным рекомендацию этого природного
дипептида в качестве протектора мозга от окислительного стресса.
Применение мексидола для коррекции окислительного стресса.
Пренатальная гипоксия. У животных, подвергшихся пренатальной
гипоксии и получавших мексидол, в отличие от «гипоксической» группы, не
было отмечено отставания в весе и внешних отличий от группы интактных
животных. Доля нейронов с повышенной флуоресценцией DCF у этих
животных, не отличалась от доли таких нейронов в интактной группе (рис.
7).
контроль
70
*$
60
Н2О2 20 мМ
20 мин
50
#$
40
30
*
*
*$
*
20
10
0
интактные
гипоксия
гипоксия+мексидол
16
Перекись водорода приводила к возрастанию процента клеток с
повышенной флуоресценцией DCF, однако не столь сильному, как в
гипоксической группе.
При проведении хемилюминесцентного анализа гомогенатов мозга
животных, получавших мексидол, было показано снижение уровня
гидроперекисей, вызванное гипоксией, достоверное увеличение латентного
периода и снижение скорости окисления. Влияния на активность Mn-СОД в
данном эксперименте не наблюдалось (таблица 6).
Таблица
6.
Характеристика
Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции гомогенатов мозга
и активность СОД в
митохондриальной фракции различных групп животных.
Группы
животных
Интактные (n=7)
Гипоксия (n=7)
Гипоксия+
мексидол (n=6)
Активность
Mn-СОД,
ед/мг белка
3,96 ± 0,56
3,87 ± 077
3,68 ± 0,34
Параметры Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции
ПредобразоСкорость
ванные
Лаг-период,
окисления,
гидроперекиси
с
отн.ед.
, отн. ед.
129,3 ± 35,5
102,9 ± 16,8 5,05 ± 0,78
252,7 ± 72,5* 77,1 ± 16,3* 6,92 ±0,53*
119,2 ± 24,4#
100,0 ±8,0#
6,11±0,90#
Примечание: * - достоверное отличие от интакной группы (р<0,05), # достоверное отличие от группы гипоксия (р<0,05).
Гипоксия, отягощенная 3-НПК. На следующие сутки после введения
мексидола животным, перенесшим гипоксию, отягощенную введением 3НПК, уровень неврологической симптоматики у этих животных снизился на
22%. Наблюдалась также тенденция к восстановлению двигательной и
исследовательской активности. У животных, получавших мексидол, не было
отмечено увеличения активности МАО В и СОД, хотя у них и наблюдалось
улучшение неврологической симптоматики и восстановление двигательной и
исследовательской активности. При этом при сочетанном воздействии
карнозина и мексидола усиления эффекта не наблюдалось. Поскольку
дополнительного эффекта от совместного применения препаратов не
наблюдалось, можно предполагать, что они обладают, по крайней мере,
частично, сходным механизмом действия.
Применение карнозина для коррекции окислительного стресса.
Пренатальная гипоксия. Животные, подвергшиеся пренатальной
гипоксии и получавшие карнозин, в постнатальном периоде внешне и по
массе тела не отличались от группы интактных животных. В нейронах,
выделенных из мозжечка этих животных, доля нейронов, в которых
наблюдалась повышенная флуоресценция DCF, а также доля мертвых клеток,
была значительно ниже, чем в гипоксической группе (рис. 8А).
17
* - соответствует достоверному
отличию
от
контроля;
#
соответствует достоверному отличию
от группы интактных животных; $
соответствует достоверному отличию
от других групп.
контроль
% интенсивно окрашенных по DCF
Рис. 8. Увеличение доли
клеток
с
повышенной
продукцией
АФК
(А)
и
увеличение
доли
мертвых
клеток (Б) при воздействии
перекиси водорода (20 мМ в
течение 20 мин) на нейроны;
Н2О2 20 мМ 20 мин
70
*$
60
50
*
30
*$
*
20
#
10
0
интактные
45
гипоксия
контроль
#
35
гипоксия+карнозин
Н2О2 20 мМ 20 мин
40
% мертвых клеток
*
#$
40
#
30
*
25
20
15
10
5
0
интактные
гипоксия
гипоксия+карнозин
При воздействии перекиси водорода процент клеток с повышенной
флуоресценцией в нейронах этих животных был значительно ниже, чем в
гипоксической группе, однако все же выше, чем в интактной группе. Под
действием карнозина наблюдалась также тенденция к повышению Mn-СОД
(таблица 7).
Таблица
7.
Характеристика
Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции гомогенатов мозга
и активность СОД в
митохондриальной фракции различных групп животных.
Параметры Fe2+-индуцированной
хемилюминесценции
Активность
Группы
ПредобразоMn-СОД,
Скорость
животных
ванные
ед/мг белка
Лаг-период, с окисления,
гидроперекиси
отн.ед.
отн. ед.
Интактные (n=7) 3,96 ± 0,56 129,3 ± 35,5
102,9 ± 16,8 5,05 ± 0,78
Гипоксия (n=7)
3,87 ± 077 252,7 ± 72,5* 77,1 ± 16,3* 6,92± 0,53*
Гипоксия+
4,17 ± 0,26 115,1 ± 36,5# 100,4±13,5# 4,66±0,29#
карнозин (n=7)
Примечание: * - достоверное отличие от интактной группы (р<0,05), # достоверное отличие от группы гипоксия (р<0,05).
18
С помощью хемилюминесцентного анализа было показано, что
карнозин предотвращал увеличение гидроперекисей в тканях, вызванное
гипоксией, достоверно увеличивал лаг-период и снижал скорость окисления.
Применение карнозина вызвало заметное улучшение процессов
памяти у животных, перенесших гипоксию. У этих животных, в отличие от
животных гипоксической группы, не наблюдалось ухудшения результатов по
поиску пищи в Т-образном лабиринте после перерыва в обучении (рис. 9).
контроль
гипоксия
гипоксия+карнозин
10,00
Число успешных попыток
9,00
8,00
*
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
10 день
13 день
35 день
Рис. 9. Результаты обучения крыс в Т-образном лабиринте.
Гипоксия, отягощенная 3-НПК. На следующие сутки после введения
карнозина животным, перенесшим гипоксию, отягощенную введением 3НПК, уровень неврологической симптоматики у этих животных снизился на
17%. В то же время в контрольной группе, улучшения симптоматики не
наблюдалось (рис. 10).
В группе, получавшей карнозин, наблюдалась также тенденция к
восстановлению двигательной и исследовательской активности.
Под влиянием карнозина выявляется повышение уровня МАО В и
СОД по сравнению с тем, что было найдено у контрольных животных
(таблица 8). Эти ферменты играют важную роль в адаптации мозга к
гипоксическому воздействию, известно, что СОД является основным
ферментом антиоксидантной защиты в мозге, а МАО В регулирует баланс
катехоламинов (Гукасян и соавт., 2000;Powell, Jackson, 2003). Способность
карнозина предотвращать снижение активности МАО В была отмечена ранее
в условиях ишемии при предварительном введении карнозина (Gallant et al,
2000; Стволинский, Доброта, 2000). Кроме того, при действии карнозина в
условиях гипоксии или индуцированной кровопотере отмечалось отчетливое
повышение активности Cu/Zn-изоформы СОД (Русаков, Долгих, 1992;
Стволинский и соавт., 2003).
19
до введения препарата
после введения препарата
Группа
P<0.032
гипоксия+3НПК+карнозин+мексидол
P<0.054
гипоксия+3НПК+мексидол
P<0.062
гипоксия+3НПК+карнозин
гипоксия+3-НПК
0
1
2
3
4
5
Неврологические нарушения в баллах
Рис. 10. Изменение неврологической симптоматики животных на следующие
сутки после гипоксического эпизода и введения исследуемых препаратов.
Таким образом, при терапевтическом применении карнозина
повышение активности митохондриальной СОД (а также МАО В)
коррелировало с улучшением неврологической симптоматики и
восстановлением двигательной активности животных.
Таблица 8. Влияние исследуемых препаратов на активность
митохондриальных ферментов мозга крыс, подвергшихся воздействию
гипоксии и 3-НПК.
Исследуемые
СДГ
МАО В
СОД
группы
животных
ммоль/мг
нмоль/мг
ед/мг
белка в мин % белка в час %
белка
%
Интактные
животные (n=11)
3-НПК+гипоксия
(n=8)
3-НПК+гипоксия +
карнозин (n=10)
3-НПК+гипоксия
+карнозин+
24,1 ± 1,2
100
66 ± 8
100
5,8 ± 0,5
100
6,3 ± 1,0*
26
60 ± 8
91
6,2 ± 0,5
108
5,4 ± 0,7*
22
82 ± 7*#
124
4,1 ± 0,5*
17
81 ± 6*#
122
7,2 ±0,6*# 125
6,3 ± 0,4
109
мексидол (n=10)
Примечание: * - соответствует достоверному отличию (p<0,05) от группы
интактных животных, # - соответствует достоверному отличию (p<0,05) от группы 3НПК+гипоксия.
20
40
35
Cмертность, %
30
25
20
15
10
5
*
Неврологические нарушения,
баллы
В тех опытах, где карнозин вводили в течение 6 дней одновременно с
3-НПК, он не только повышал активность СОД, но и способствовал (на 75%)
снижению смертности животных (Степанова с соавт., 2005). Таким образом,
можно сделать вывод, что улучшение состояния животных под влиянием
карнозина связано с его способностью не только нейтрализовать свободные
радикалы и их производные, но и регулировать активность некоторых
ферментов, существенных для функции мозга.
Применение карнозина совместно с мексидолом не приводило к
дополнительному улучшению неврологической симптоматики, двигательной
и исследовательской активности или изменению активности МАО В (рис. 10,
таблица 8). Однако активность СОД в группе, получавшей оба препарата, не
была повышена в отличие от группы получавшей только карнозин.
Возможно, это связано с антиоксидантным действием мексидола, в
результате чего повышения СОД под действием карнозина не произошло.
Полученные результаты свидетельствуют о эффективности карнозина и
мексидола в условиях однократного терапевтического введения.
Ишемия, отягощенная 3-НПК. Неврологическая симптоматика и
смертность в группе животных, перенесших ишемию, отягощенную 3-НПК и
получавших карнозин, была ниже, чем в других группах, подвергшихся
ишемическому воздействию или действию 3-НПК (рис. 11).
4,0
ЛО+3НПК
*
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
3-НПК
ишемия+3-НПК
*
ишемия+3НПК+карнозин
1,0
0,5
0,0
1
0
2
3
4
5
День введения 3-НПК
А
Б
Рис. 11. Смертность (А) и неврологическая симптоматика (Б) в различных
группах. * соответствует достоверному отличию (p<0,05) от других исследованных
групп.
Лаг-период
окисления,
характеризующий
уровень
общей
антиоксидантной активности, был в группе животных, получавших
карнозин, достоверно больше, а скорость окисления и уровень
предобразованных гидроперекисей ниже, чем в группе, подвергшейся
воздействию ишемии и 3-НПК. Животные, подвергшиеся воздействию
ишемии и 3-НПК и получавшие карнозин, достоверно не отличались от
интактных животных по исследуемым параметрам, хотя в этой группе
21
наблюдался несколько более
гидроперекисей (таблица 9).
высокий
уровень
предобразованных
Таблица 9. Параметры Fe2+-индуцированного окисления в
гомогенатах мозга экспериментальных животных.
Группы
Параметры Fe-индуцированного окисления
Предобразованные
Лаг-период, с
Скорость
гидроперекиси, отн. ед
окисления
ед/мин
Интакные
161±28
122± 16
103± 4
Ишемия+3-НПК
272 ±29 *
86± 9 *
175± 2 *
Ишемия+3-НПК
200 ±20
120 ±7 #
91± 4 #
+карнозин
Примечание: * - достоверное отличие от интактной группы (р<0,05), # достоверное отличие от группы ишемия+3-НПК (р<0,05).
В группе животных, получавших карнозин, активность МАО В и СОД
не отличалась от активности этих ферментов в интактной и
«ложнооперированной» группах животных (рис. 12). При этом активность
СДГ в группе, получавшей карнозин, продолжала оставаться сниженной, так
как ингибирование этого фермента 3-НПК было необратимым.
450
90,0
интактные
ЛО
70,0
*
ед/мг белка
*
*
3-НПК
50,0
ЛО+3-НПК
40,0
30,0
20,0
ишемия
ишемия+3-НПК
А
350
300
250
ишемия+3НПК+карнозин
*# *#
интактные
ЛО
3-НПК
ЛО+3-НПК
200
ишемия
150
100
50
10,0
0,0
нмол ь Б А на мг бел ка в час
80,0
60,0
400
*#
0
ишемия+3-НПК
ишемия+3НПК+карнозин
Б
Рис. 12. Изменение МАО В (А) и СОД (Б) в митохондриальной фракции
мозга у животных различных групп *- соответствует достоверному отличию от
группы интактных животных; # -cоответствует достоверному отличию от групп ЛО,
ЛО+3-НПК, 3-НПК.
Эти
данные
свидетельствуют,
что
карнозин
эффективно
восстанавливает устойчивость тканей мозга к окислению, истощенную в
условиях совместного влияния экспериментальной ишемии и 3-НПК. При
этом карнозин резко уменьшает смертность животных, нормализует уровень
липидных гидроперекисей, несмотря на то, что он не в состоянии
препятствовать необратимому ингибированию СДГ 3-нитропропионатом.
Вероятно, общий антиоксидантный статус тканей мозга повышается
достаточно успешно, так что активации СОД не требуется, и ее уровень не
возрастает. Возможно, что в группе животных, получавших карнозин,
22
повышение общего антиоксидантного статуса тканей мозга происходит
вследствие снижения активности МАО В по сравнению с группой «ишемия +
3-НПК».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе описаны комплексные модели окислительного
стресса, сочетающие гипоксическое/ишемическое воздействие с нарушением
энергетического обмена, что позволило выявить и сопоставить
неврологические и биохимические нарушения у животных. Кроме того,
охарактеризована модель пренатальной гипоксии, после которой у животных
проявляются нарушения на клеточном уровне (накопление гидроперекисей,
снижение антиоксидантной активности, усиление чувствительности к
NMDA, увеличение смертности нейронов, дисбаланс медиаторов, нарушение
формирования нервной системы), которые приводят к нарушению поведения
и ухудшению когнитивных способностей животных.
Таким образом, в данной работе эффективность препаратов
оценивалась на различных моделях комбинированного окислительного
стресса, позволяющих выявить и оценить изменения как на клеточном
уровне, так и на уровне всего организма.
Природный антиоксидант карнозин и синтетический антиоксидант
мексидол были наиболее эффективны в условиях всех используемых
моделей. При этом была выявлена не только антиоксидантная компонента
эффекта карнозина, но и его регуляторное воздействие на активность
ферментов супероксиддисмутазы и моноаминооксидазы В. Нейропептид
NAAG, эффективно защищающий мозг от повреждений при гипоксии и
ишемии (Cai et al, 2002), вызывал ухудшение неврологической симптоматики
при совместном действии этих факторов с 3-НПК. Эти данные указывают,
что при нейродегенеративных заболеваниях это вещество следует применять
с определенной осторожностью.
23
ВЫВОДЫ
1.
Разработана комплексная модель окислительного стресса,
сочетающая гипоксическое воздействие с вызванным введением 3-НПК
нарушением энергетического обмена в мозге крыс, что позволило выявить и
сопоставить как неврологические, так и биохимические нарушения у
животных.
2. На модели пренатальной гипоксии у крыс выявлен дефицит
антиоксидантной системы на клеточном уровне и нарушения на уровне
поведения и обучения животных.
3. На модели пренатальной гипоксии показан протекторный эффект
карнозина, мексидола и NAAG, выражающийся в повышении устойчивости
изолированных нейронов и тканей мозга к окислительному повреждению.
Протекторный эффект карнозина показан на уровне поведения и
когнитивных способностей животных.
4. На модели гипоксии, отягощенной введением 3-НПК, показан
протекторный эффект при терапевтическом введении карнозина и мексидола
как совместно, так и по отдельности.
5. На модели окислительного стресса мозга, сочетающей
ишемическое воздействие с нарушением энергетического обмена, показан
протекторный эффект карнозина, заключающийся в уменьшении
интенсивности неврологической симптоматики и смертности животных,
нормализации уровня липидных гидроперекисей, активности МАО В и СОД.
6. На модели ишемии, отягощенной введением 3-НПК, введение
NAAG
вызывает
уcиление
неврологической
симптоматики
экспериментальных животных.
24
СПИСОК СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Степанова М. С., Беляев М.С., Стволинский С. Л. Действие
карнозина на крыс при гипоксии, отягощенной 3-нитропропионатом.//
Нейрохимия, 2005, T.22, №3, с. 202-206.
2. Степанова М.С., Куликов А. В., Маклецова М. Г., Федорова Т. Н.,
С., Болдырев А.А. Характеристика окислительного стресса, вызванного
пренатальной гипоксией.// Новые информационные технологии в
медицине, биологии, фармакологии и экологии, Украина, Крым, ЯлтаГурзуф, 31мая-9 июня 2006, с. 405.
3. Федорова Т. Н., Маклецова М. Г., Куликов А. В., Степанова М. С.,
Болдырев А.А. Карнозин защищает от окислительного стресса,
вызванного пренатальной гипоксией.// ДАН, 2006, Т.48, №1, с.1-4
4. Стволинский С.Л., Федорова Т.Н., Беляев М.С., Степанова М.С.,
Булыгина Е.Р., Тюлина О.В., Болдырев А.А. Карнозин: новейшая
история давно известного вещества. // Бюлл. МОИП, 2007, Т.112, 107123.
5. Добротворская И.С., Степанова М.С., Маклецова М.Г., Федорова
Т.Н. Антиоксидантная коррекция окислительных повреждений мозга
крыс, перенесших пренатальную гипоксию.// Вестник РУДН, 2007, №3, с
13-18.
6. Маклецова М.Г., Степанова М.С., Куликов А.В., Федорова Т.Н.,
Болдырев А.А. Карнозин повышает пластичность нервной системы у
крыс, перенесших пренатальную гипоксию. // «Структурные
функциональные нейрохимические и иммунохимические закономерности
асимметрии и пластичности мозга», Институт мозга, Москва 18-20
октября 2007, c. 380-383.
7. Козина Л.С., Арутюнян А.В., Стволинский С.Л., Степанова М.С.,
Маклецова М.Г., Хавинсон В.Х.. Регуляторные пептиды защищают
нейроны мозга от гипоксии в экспериментах in vivo // ДАН, 2008, Т.418,
№3, с. 419-422.
8. Куликов А.В., Ржанинова А.А., Гольдштейн Д.В., Степанова М.С.,
Стволинский С.Л., Худоерков, Воронков Д.Н., Болдырев А.А.
Применение мультипотентных стволовых клеток жировой ткани
человека для компенсации неврологического дефицита у крыс,
вызванного введением 3-нитропропионовой кислоты.// Клеточные
технологии в биологии и медицине, 2008, Т.2, c. 83-89.
9. Федорова Т.Н., Багыева Г.Х., Степанова М.С., Добротворская И.С.,
Иванова-Смоленская И.А., Полевая Е.В., Болдырев А.А.,
Иллариошкин С.Н. Карнозин повышает эффективность лекарственной
терапии при болезни Паркинсона.// Неврологический вестник, 2009, Т.
XLI, вып. 1, с 24-29.
10.Boldyrev A., Fedorova T., Stepanova M., Dobrotvorskaya I., Kozlova E.,
G. Bagueva, Boldanova N. Ivanova-Smolenskaya I., Illarioshkin S.
Carnosine increases effeciency of DOPA therapy of Parkinson’s disease.//
Rejuvenation Research, 2008, V. 11 (4), 821-827
25
Список опубликованных тезисов
1. Степанова М.С., Беляев М.С. Защитное действие карнозина в условиях
гипоксической и химической гипоксии // М., Изд-во РУДН, Актуальные
проблемы экологии и природопользования (материалы научной
экологической конференции в РУДН 18-19 мая 2004), 2004, Вып. 6., Ч.1.,
с.18-21.
2. Stepanova M.S. Belyaev M.S Protective effect of carnosine on rats under
combination of hypoxic and chemical hypoxia // in materials of the 10th
International Symposium on Pharmacology of Cerebral Ischemia (Marburg,
Germany 2004), p. 67.
3. Степанова М.С., Беляев М.С., Стволинский С.Л. Действие карнозина
при гипоксической гипоксии, отягощенной действием 3-нитропропионата
// в мат. Научной конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и
прикладные аспекты», Москва, ИБХ, 14-16 марта 2005, с.199.
4. Kulikov A., Stepanova M. Analysis of the 3-nitropropionic acid induced
neurotoxicity in the brain of rats and senescence accelerated mice prone
(SAMP). // J. Neurochem., 2005, V. 94 (Suppl.2), p. 226 (P-408).
5. Boldyrev A.A., Stepanova M., Kulikov A., Belyaev M., Stvolinsky S.,
Fedorova T. Senescence accelerated mice, SAM as a model of
neurodegeneration.// 21 Ann. Rep. SAM Studies, 2006, 7, 27-28, pp. 65.
6. Dobrotvorskaya I. S., Stepanova M. S., Fedorova T. N., Makletsova M. G.
and Boldyrev A. A. Antioxidant correction of prenatal hypoxia in rats// in
matherials of International congress “Molecular basis of neurological and
psychiatric disorders”, September 6-10, 2006, Martin, Slovak Republic, p. 33.
7. Stepanova M. S., Fedorova T. N., Makletsova M .G., and Boldyrev A. A.
The consequences of oxidative stress induced by prenatal hypoxia on rat brain.
// in matherials of International congress “Molecular basis of neurological and
psychiatric disorders”, September 6-10, 2006, Martin, Slovak Republic, p.97.
8. Boldyrev A., Fedorova T., Stvolinsky S., Stepanova M., Dobrotvorskaya I.,
Kozlova E., Bagueva G., Ivanova-Smolenskaya I., Illarioshkin S. Carnosine
increases efficiency of L-DOPA therapy of parkinsonics Parkinsonism and
related disorders, the XVII WFN World congress on Parkinson’s disease and
related disorders, Amsterdam, 9-13 December 2007.
9. Boldyrev A., Stepanova M., Dobrotvorskaya I., Carpenter D. Melatonin and
carnosine protect neuronal cells from excitotoxic effect of NMDA. // The 3rd
euro-asian conference on hazardous waste and human health. March 27-30,
2008, Istambul-Turkey.
26
Краткая аннотация диссертационной работы М.С. Степановой
«Коррекция окислительного стресса мозга с помощью природных и
синтетических антиоксидантов».
Работа посвящена характеристике комбинированных моделей
окислительного стресса крыс и оценке протекторного эффекта карнозина,
мексидола и N-ацетиласпартилглутамата. Использовались комбинированные
модели окислительного стресса, сочетающие гипоксическое/ишемическое
воздействие с нарушением энергетического обмена, что позволило выявить и
сопоставить биохимические и неврологические нарушения у животных.
Показана эффективность природного антиоксиданта карнозина и
синтетического антиоксиданта мексидола на различных экспериментальных
моделях. При этом была выявлена не только антиоксидантное действие
карнозина, но и его регуляторное воздействие на активность ферментов
супероксиддисмутазы и моноаминооксидазы В. Нейропептид NAAG
защищал мозг от повреждений при гипоксии, но вызывал усиление
неврологической симптоматики и смертности при совместном действии с 3нитропропионатом.
Summary of Ph.D. Thesis by Stepanova M. entitled “Brain oxidative
stress correction by means of natural and synthetic antioxidants”
Doctorate thesis is dedicated to characterization of brain oxidative stress
complex models on rats and evaluation of protective effect of carnosine, mexidol
and N-acetyl-aspartylglutamate.
The combination of hypoxic/ischemic exposure with energy
metabolism impairment allowed revealing and estimating biochemical and
neurological disorders of experimental animals. The efficacy of natural antioxidant
carnosine and synthetic antioxidant mexidol in different models was shown. In
addition,
not
only
the
antioxidative
effect of carnosine but also a modulation of enzymes activities
(monoaminooxidase B and superoxidedismutase) by carnosine was
revealed. The neuropeptide NAAG protected brain from hypoxic damage,
but amplified neurological symptoms and mortality in conjunction with
3-nitropropionic acid action.