Разработка технологии полупроводникового секвенирования ДНК

“Clone Torrent”
Разработка технологии
полупроводникового секвенирования ДНК
В России разработка технологий NGS (next generation sequencing) до недавних
пор считалась невыполнимой задачей из-за отсутствия опыта проведения подобных
прикладных работ и ограниченных финансовых возможностей. Кардинальным
образом ситуация изменилась после появления в 2011 году достаточно простой
технологии полупроводникового секвенирования, разработанной компанией
Ion Torrent.
Основной задачей проекта является объединение и координация действий
специалистов различного профиля, необходимых для разработки четырёх основных
элементов технологии полупроводникового секвенирования.
Элементы полупроводниковой технологии
Полупроводниковый секвенатор состоит из двух основных систем –
электронной, обеспечивающей цифровую обработку сигналов (ЦОС) pH-сенсорного
чипа, и жидкостной, подающей в проточную ячейку чипа растворы реагентов.
Основными расходными реагентами служат растворы особо чистых дезоксинуклеозидтрифосфатов. Немаловажным элементом данной технологии является
подготовка ДНК к секвенированию.
Основные элементы технологии полупроводникового секвенирования ДНК
Подготовка ДНК
Расходные реагенты
pH-сенсорный чип
Система ЦОС
Система подачи растворов
Компьютер и программное обеспечение
Элементы полупроводниковой технологии NGS можно разделить на две
основные группы. Первая требует привлечения к разработкам специалистов в
области химии, биохимии и молекулярной генетики, разбирающихся в методах
подготовки ДНК к секвенированию и в технологиях синтеза и очистки расходных
реагентов. Для разработки второй группы элементов – систем цифровой обработки
сигналов и подачи растворов – требуются специалисты, хорошо ориентирующиеся
в микроэлектронике, схемотехнике, микрофлюидике и т.п..
Для обработки массивов получаемой генетической информации на первых
порах можно использовать свободно распространяемое и/или коммерческое
программное обеспечение некоторых разработчиков (CLC Genomics Workbench,
MUMmerGPU, Velvet, EDENA, ELAND и т.п.), а также доступные on-line ресурсы
Интернета (www.dnanexus.com, https://www.omixon.com, www.usegalaxy.org,
www.samsunggenome.com и т.п.).
Наиболее сложной задачей является разработка пятого элемента технологии pH-сенсорного чипа.
Пятый элемент
Технология полупроводникового секвенирования ДНК основана на
регистрации изменения pH миллионами микросенсоров, образующих основание
проточной ячейки сенсорного чипа. Линейка чипов, поставляемых компанией Ion
Torrent, сейчас включает три варианта:
• Ion 314 (1,5 Mp - 99$);
• Ion 316 (7,2 Mp - 500$);
• Ion 318 (11,2 Mp – проходят апробацию, цена ещё не определена).
Объёмы считываемой информации напрямую зависят от разрешения чипов
(количества микросенсоров), которое сейчас измеряется миллионами. У чипов
следующего поколения (Ion 320?) этот показатель должен приблизиться к 100 Mp.
Дальнейшее наращивание производительности таких чипов потребует
использования субмикронных микросенсоров (или нанометровых наносенсоров).
Подобная миниатюризация может оказаться недостижимой, поскольку будет
сопровождаться уменьшением количества образующихся при секвенировании
протонов и увеличением диффузионных потерь. Но наносенсорные чипы могут
регистрировать изменения суммарного отрицательного заряда небольших (100…200
нм) ДНК-наноболлов. При этом диффузионные потери отсутствуют. Такой подход
уже давно используется в некоторых ДНК-сенсорах, что позволяет обойти
патентную защиту pH-сенсорного секвенирования, распространяющуюся на страны
Евросоюза и США (но не на Россию и другие страны БРИКС).
Разработка отечественных pH-сенсорных чипов и «наночипов» может
растянуться на несколько лет, поэтому на первых порах желательно
ориентироваться на использование доступных чипов серии Ion 31x. При этом
первоочередной задачей является разработка системы считывания с них
информации и цифровой обработки сигналов.
Система цифровой обработки сигналов
pH-сенсорным покрытием у одноразовых чипов серии Ion 31x служит
устойчивый в водных средах субмикронный слой Ta2O5. Торгующая ими компания
не афиширует данную особенность плёнок пятиокиси тантала, позволяющую
значительно удешевить секвенирование ДНК за счёт многократного использования
pH-сенсорных чипов.
Для многоразового использования желательно разработать способы
регенерации чипов, а для этого необходима система ЦОС с программным
обеспечением, позволяющим визуально оценивать состояние микросенсорных
массивов и получать статистические данные о качестве и количестве
работоспособных ячеек чипа. Если данная система предназначена только для
контроля регенерации чипов, то её основные технические характеристики (частота
кадров и разрядность АЦП) могут быть довольно скромными. Основной проблемой
в этом случае будет незнание параметров интерфейса, соединяющего ЦОСустройство с чипами.
2
Отсутствие необходимой техдокументации на чипы для большинства
зарубежных разработчиков является неразрешимой проблемой. Для российских
специалистов это тоже проблема, но неразрешимой она не является.
Более совершенная ЦОС-система, предназначенная для встраивания в
секвенатор, по своим техническим характеристикам не должна уступать
электронной подсистеме PGM, т.е. должна обеспечивать максимальную частоту
считывания кадров и разрядность АЦП. PGM проводит сканирование чипа Ion 314
(~1,5 Mp; 1152х1280) с кадровой частотой 60 fps (Frames Per Second). Для Ion 316
(~7,2 Mp; 2640х2736) этот показатель ниже в 4 раза (15 fps).
Таким образом, разработку устройства цифровой обработки сигнала можно
разделить на два этапа. На первом основной задачей будет анализ устройства чипов,
а также разработка интерфейса и системы ЦОС, предназначенной для оценки их
качества после регенерации. Потенциальными потребителями такого устройства
являются все обладатели секвенаторов PGM, количество которых к концу 2011 года
превысит тысячу (в России ~20 шт.) и будет быстро увеличиваться.
На втором этапе основной задачей станет разработка ЦОС-системы,
предназначенной для комплектования полупроводниковых секвенаторов нового
поколения. Стоимость их эксплуатации должна быть значительно уменьшена
благодаря многократному использованию регенерируемых pH-сенсорных чипов и
многократному использованию расходных реагентов, прокачиваемых системой
подачи растворов через проточные ячейки чипов.
Система подачи растворов
У PGM система подачи реагентов в проточную ячейку пневматическая.
Прокачку растворов обеспечивает повышенное давление в ёмкостях с реагентами и
пневматические микроклапаны. Это требует подключения баллона со сжатым
аргоном и делает её излишне громоздкой. Более компактная система подачи
растворов может состоять из микронасоса и селекторных клапанов (многоходовых
кранов), применяемых преимущественно в жидкостных хроматографах.
Селекторные клапаны
Компания
Наименование
Кат. №
Agilent Technologies
Agilent 1100
G1160A
Valco Instruments Co. Inc.
PPS/E2
C25Z-3188EMH
Baxa
MicroMacro™
H938 69 3
Внешний вид
Основными компонентами селекторных клапанов являются ротор и статор,
обеспечивающие переключение потоков жидкости между каналами. Приводом
служит управляемый компьютером шаговый двигатель. Стоимость зависит от
комплектации, назначения и условий эксплуатации, и может превышать 5 тыс.$
(Agilent 1100). Заменяемая клапанная головка может стоить меньше 500$ (C25Z3188D - Valco Instruments Co. Inc.,). Самый дешёвый вариант – одноразовые
селекторы компании Baxa (MicroMacro™). Они поставляются в упаковках по 10 шт.
3
и стоят значительно меньше, но рассчитаны на работу с миллилитровыми объёмами,
а объёмы проточных ячеек у pH-сенсорных чипов измеряются микролитрами
(Ion 314 ~ 7 мкл; Ion 316 ~ 30 мкл).
На первых порах в системе подачи растворов можно использовать готовые
селекторные клапаны, предназначенные для систем жидкостной хроматографии, но
вряд ли их характеристики идеально подойдут для секвенатора. Отсюда следует
необходимость разработки специальных селекторных микроклапанов или
заменяющих их микрофлюидных устройств.
При разработке системы подачи растворов необходимо минимизировать их
расход и устранить возможность перекрёстного загрязнения. Необходимо также
предусмотреть возможность многократного использования реагентов, т.е. они
должны циркулировать по замкнутому контуру или собираться на выходе из
проточной ячейки. Это позволит значительно уменьшить расход особо чистых
дезоксинуклеозидтрифосфатов и удешевить секвенирование ДНК.
Расходные реагенты
Основной причиной ошибок в полупроводниковом секвенировании является
наличие примесей посторонних дНТФ в препаратах индивидуальных
дезоксинуклеозидтрифосфатов. Поэтому чистота реагентов является одним из
главных факторов, определяющих длину чтения и качество получаемой
информации. В 2012 году компания Ion Torrent обещает увеличить длину
секвенирования фрагментов ДНК с нынешних 100…200 п.о. до 400 п.о., и, судя по
достижениям пиросеквенирования, позволяющего читать до 1000 п.о., это вполне
реально. Затраты на реагенты при повышении степени очистки и увеличении длины
чтения будут возрастать. Отсюда следует необходимость разработки экономичной и
эффективной технологии их очистки и контроля качества.
Особо чистые дНТФ для полупроводникового секвенирования получают
ферментативным синтезом из особо чистых дезоксинуклеотидов. Исходные
нуклеотиды очищают от примесей четырёхкратной хроматографической очисткой
на колонках с ионообменными и гидрофобными сорбентами. Тем не менее, по
качеству они явно уступают препаратам, используемым для пиросеквенирования.
Различие может быть обусловлено системой контроля качества дНТФ,
применяемой компанией 454 Life Science. Логично предположить, что при
проведении такого контроля используются те же реакции, что и при
пиросеквенировании, т.е. биолюминесцентное определение следовых количеств
пирофосфата.
Чувствительность этой реакции очень высока и позволяет обнаруживать не
только следовые количества посторонних дНТФ, но и ошибки ДНК-полимеразы.
Поэтому данный подход применим ещё и для сравнительной оценки качества ДНКполимераз, позволяющей выбрать наиболее подходящий для полупроводникового
секвенирования фермент.
Таким образом, при разработке технологии производства расходных реагентов
- особо чистых дНТФ и ДНК-полимеразы - особое внимание следует уделить
разработке биолюминесцентной системы контроля их качества.
4
Подготовка ДНК к секвенированию
Стоимость расходных материалов и реагентов, рассчитанная для одного
запуска полупроводникового секвенатора, составляет не менее 350$. В этой сумме
расходы на чип Ion 314 (99$) и растворы дНТФ (75$) примерно равны расходам на
приготовление библиотеки фрагментов ДНК (50$) и получение клонов ДНК на
макросферных носителях (125$). Многократное использование чипов и реагентных
растворов приведёт к кардинальному изменению этого соотношения, но заметно
уменьшить стоимость секвенирования без удешевления пробоподготовки не
удастся. Ещё весомее вклад пробоподготовки при проведении вариантов
секвенирования, для которых необходимы специальные наборы.
Каталожный перечень наборов для подготовки ДНК к полупроводниковому
секвенированию уже сейчас довольно обширен и продолжает быстро расширяться.
Наименование
Кат.№
Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit (10 reactions)
Ion Plus Fragment Library Kit (10 reactions)
Ion Total RNA-Seq Kit (12 reactions)
Ion Total RNA-Seq Kit (48 reactions)
Ion AmpliSeq™ Cancer Panel Kit
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kit 100 kb-500 kb (96 enrichments)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kit 500 kb - 2 Mb (96 enrichments)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kit 2 Mb - 10 Mb (96 enrichments)
Ion Xpress™ Barcode Adaptors 1-16 (10 sets of 16 libraries)
Ion Xpress™ Template Kit (10 reactions)
Ion OneTouch™ Template Kit (10 reactions)
Ion Control Materials 200 Kit
Ion Sphere™ Quality Control Kit
Ion Library Quantitation Kit
4471269
4471252
4466666
4468200
4472395
A14230
A14229
A14228
4471250
4469001
4468660
4471249
4468656
4468802
В списках этих наборов можно запутаться, поэтому лучше рассматривать
основные стадии пробоподготовки, для проведения которых они предназначены:
• очистка ДНК;
• фрагментация;
• «полировка» двунитевых концов;
• пришивка адапторов;
• предварительная амплификация;
• выделение ампликонов заданной длины;
• определение концентрации ДНК;
• получение клонов отдельных молекул ДНК на микросферных носителях при
помощи эмульсионной ПЦР;
• фракционирование микросфер (выделение иммобилизованных клонов ДНК);
• перевод двунитевой ДНК в однонитевую форму;
• добавление праймера и ДНК-полимеразы;
• заполнение микросферами лунок основания проточной ячейки.
Многие этапы пробоподготовки можно заменить более рациональными
приёмами и упростить, ускорить и удешевить их проведение. Например, для
выделения и первичной очистки ДНК вполне пригодны отечественные наборы,
используемые в ПЦР-диагностике (10…50 руб. за пробу). Для быстрого получения
библиотек фрагментов ДНК, содержащих концевые адапторы, можно использовать
разработанную ещё в прошлом веке ПЦР-фрагментацию (PCR-фрагментация ДНК /
Л.А.Железная и др. // Биохимия. – 1999. – Т.64, вып.4. - с.447-453). Выделение
5
ампликонов заданной длины также не является проблемой и не требует
специальных наборов. То же относится и к определению концентрации ДНК перед
проведением эмульсионной ПЦР (проведение Real-Time PCR).
Сложнее будет подобрать (или синтезировать) микросферные носители
требуемого диаметра (2…2,5 мкм), хорошо вписывающиеся в pH-сенсорные лунки
чипов (Ø 3 мкм). Особенно если учесть, что на поверхности микросфер должны быть
иммобилизованы праймеры. Кроме того, необходимо будет отработать проведение
эмульсионной ПЦР и очистку синтезированных клонов ДНК, иммобилизованных на
микросферных носителях. Задачи далеко не простые, но вполне разрешимые.
Разработка методов подготовки ДНК к секвенированию и освоение
производства необходимых для этого наборов реагентов позволит значительно
уменьшить стоимость полупроводникового секвенирования.
Сумма технологий
Разработка элементов технологии полупроводникового секвенирования
позволяет решить две основные задачи. Первая – замещение импорта чрезмерно
дорогих расходных материалов и реагентов, необходимых для работы секвенаторов
PGM в России. Второй задачей является создание отечественного секвенатора,
отличающегося от американского аналога низкой стоимостью и высокой
экономичностью эксплуатации. Последнее отличие обеспечивается многократным
использованием чипов и реагентов.
Для решения первой задачи проекта каждый из элементов технологии может
разрабатываться независимо от других, но решение второй задачи на завершающей
стадии выполнения НИОКР потребует координации действий всех разработчиков и
объединения их усилий головным исполнителем проекта – Пущинским научным
центром Российской академии наук.
Соисполнители проекта
№
п/п
Наименование работы
1
Разработка методов подготовки ДНК к
секвенированию.
Разработка методов получения особо чистых
дезоксинуклеозидтрифосфатов, предназначенных
для полупроводникового секвенирования ДНК
Разработка системы цифровой обработки сигналов
для pH-сенсорных чипов Ion 314
Разработка системы подачи реагентов для
полупроводникового секвенатора
2
3
4
Исполнитель
ИТЭБ РАН
ФИБХ РАН
ООО "Микроэлектронные
системы и технологии"
ИБП РАН
Тема НИОКР: «Разработка технологии полупроводникового секвенирования ДНК»
Головной исполнитель: Пущинский научный центр Российской академии наук
Цена контракта: 120 млн. руб.
Срок выполнения работы:
начало работ - с даты заключения государственного контракта;
срок окончания работ - 30 ноября 2013 г.
6
Источник финансирования:
Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072013 годы» (мероприятие 2.2).
Основание:
Информационное сообщение Минобрнауки России
http://www.fcpir.ru/catalog.aspx?CatalogId=411
7