ТОКСИКОЛОГИЯ 2457

PPBN ID ppbn.v8i4.987
ТОКСИКОЛОГИЯ
2457
OPEN ACCESS
В.Б. ПРОЗОРОВСКИЙ
СанктПетербургская государственная академия ветеринарной
медицины; Черниговская ул., 5, СанктПетербург 198904, Россия
В.Г. СКОПИЧЕВ
Резюме
Карбоксим обладает свойствами
обратимого неконкурентно
конкурентного ингибитора
холинэстеразы, что снижает
скорость фосфорилирования
фермента и защищает его от
необратимой инактивации.
В комплексе с атропином
(в субэффективных дозах —
5 и 5 мг/кг) обеспечивает
повышение эффективности при
профилактике в 6–11 раз — индекс
защиты равен 26,2. При лечебном
применении — 24,9.
Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г.,
Панченкова О.А. Оценка
реактиватора холинэстеразы
карбоксима как средства
профилактики отравлений
фосфорорганическими
ингибиторами холинэстераз. //
Психофармакол. биол. наркол.
2008. Т. 8, № 3–4.
С. 2457–2462
Ключевые слова
фосфорорганические ингибиторы
холинэстераз (ФОИ); профилактика
отравлений; карбоксим как
ингибитор холинэстеразы;
лечебнопрофилактический
антидот ФОИ
© Коллектив авторов, 2008; лицензиат ООО «Архив»
СанктПетербургская государственная академия ветеринарной
медицины; Черниговская ул., 5, СанктПетербург 198904, Россия
О.А. ПАНЧЕНКОВА
СанктПетербургская государственная академия ветеринарной
медицины; Черниговская ул., 5, СанктПетербург 198904, Россия
ОЦЕНКА РЕАКТИВАТОРА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ
КАРБОКСИМА КАК СРЕДСТВА
ПРОФИЛАКТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ
ИНГИБИТОРАМИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ
ВВЕДЕНИЕ
Инсектициды из группы фосфорорганических соединений
(ФОС), ингибиторов холинэстеразы (ХЭ) обладают высокой ток#
сичностью. Во всем мире при производстве, транспортировке,
применения на полях, на животноводческих фермах и в быгу ФОС
вызывают до 3 000 000 отравлений в год [14]. Согласно Между#
народной Конвенции 1993 года боевые отравляющие вещества, в
том числе фосфорорганические (ФОВ), подлежат уничтожению.
Возможность возникновения отравлений в процессе этих работ
не исключена [11]. При террористических актах в Японии с ис#
пользованием зарина (1994 и 1995 гг.) в токийском метро было
отравлено 650 человек [15]. Считается, что в последующем тер#
рористами будут использованы именно ФОВ [16].
Следовательно, в настоящее время не только сохраняется высо#
кая частота отравлений, но и возникла угроза массового пораже#
ния населения токсичными ФОВ. В нашей стране созданы ориги#
нальные высокоэффективные антидотные средства: обратимый
ингибитор ХЭ аминостигмин [7], М#холиноблокатор пентифин и
реактиватор ХЭ карбоксим [3]. На их основе разработаны комп#
лексные антидоты профилактический П#10 и лечебный пелексим,
которые могут применяться при авариях и при аварийных работах
на объектах уничтожения химического оружия [2]. В общей прак#
тике не утратил своего значения и традиционный универсальный
М#холиноблокатор атропин.
После распада СССР в России не было налажено производство
собственного реактиватора ХЭ. По этой причине созданному в
ISSN 1606–8181
ТОКСИКОЛОГИЯ
2458
Институте токсикологии ФМБА, препарату карбок#
сим, который обладает рядом уникальных свойств и
является реактиватором ХЭ нового поколения [12,
13] должно быть уделено особое внимание.
В данной работе изучена антихолинэстеразная
активность карбоксима и перспективность его ис#
пользования совместно с атропином не только как
лечебного, но и как профилактического средства при
отравлении ФОС. Такая модель может явиться ос#
новой для создания необходимого лечебно#профилак#
тического антидота [10].
реводили в расчетный (фактический) с учетом кон#
куренции с ацетилхолином. добавляемым в инкуба#
ционную смесь [11]. Для фосфакола определяли би#
молекулярную константу ингибирования — К2 до и
после воздействия на фермент карбоксимом. В опы#
тах in vitro использовали цельную гемолизирован#
ную кровь. Активность фермента оценивали в про#
центах по отношению к контролю, принятому за
100 % . Фосфакол и карбоксим синтезированы в Ин#
ституте токсикологии ФМБА. Прочие препараты
фабричного производства.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Токсикологические исследования
В первой серии опытов оценивали величину дозы
карбоксима, необходимой для профилактики гибели
50 % животных (ПД50) при отравлении фосфаколом
в дозе 2ЛД50. Карбоксим вводили внутрибрюшинно
в комплексе с атропином (в дозе 5 мг/кг подпорого#
вой по эффективности) за 15 мин до фосфакола.
Во второй серии определяли показатели индек#
са защиты и индекса гарантированной защиты по
сдвигу кривой доза–эффект фосфакола после вве#
дения атропина, карбоксима и их сочетаний в раз#
ных дозах.
Опыты выполнены на белых беспородных мышах
самцах массой тела 16–22 г, получаемых из Инсти#
тута цитологии РАН. Мышей содержали на стандар#
тном рационе при неограниченном доступе к воде.
Растворы препаратов вводили в объеме 0,1 мл/10 г
массы животных. Дозы варьировали изменением
концентрации веществ. Средние эффективные дозы
определяли табличным методом |8|, с использовани#
ем в каждом опыте 8–12 животных.
Биохимические исследования
Анти#ХЭ активность карбоксима оценивали в
опытах in vitro с использованием очищенной ХЭ
эритроцитов человека с активностью 3,6 ЕД/мг. При#
менен метод непрерывного потенциометрическго тит#
рования ацетата, образующегося при гидролизе аце#
тилхолина, раствором КОН на автотитраторе ТТТ#1
с титрографом фирмы «КасНотегг» (Дания) в усло#
виях постоянства рН = 7,4, концентрации субстра#
та ацетилхолина иодида = 2 × 10–3М и температуры
37,0°. Определяли скорость гидролиза в разные от#
резки времени и вычисляли концентрации карбок#
сима и других обратимых ингибиторов, необходимых
для торможения активности ХЭ на 50 % — I50. Эм#
пирический показатель, определяемый в опыте, пе#
Психофармакология и биологическая наркология /
ТОМ
8/
В предварительных опытах методом пробитов
с расчетом по способу наименьших квадратов [4], оп#
ределяли средние летальные дозы отдельных препа#
ратов веществ (ЛД50 ± m, мг/кг) и в части случаев
вычисляли показатель наклона кривой —
ПН = σ : ЛД50. Получены следующие величины:
атропин — 250,0 ± 38,8, ПН = 0,8, карбоксим —
159,3 ± 47,6, ПН = 0,8, галантамин —16,7 ± 0,2,
аминостигмин — 0,23 ± 0,09 и оксазил 4,50 ± 0, 11.
Профилактическая эффективность карбоксима
при отравлении армином по показателю ПД50 и ко#
эффициенту эффективности оценена в сопоставле#
нии с прочими обратимыми ингибиторами ХЭ в
табл. 1.
Согласно данным, полученным ранее [5], окса#
зил является аллостерическим ингибитором ХЭ, ко#
торый снижает ее сродство к ФОС. Именно это об#
стоятельство лежит в основе его высокой защитной
эффективности. Однако оксазил совсем не проника#
ет через гематоэнцефалический барьер. По строе#
нию молекулы карбоксим сходен с оксазилом , одна#
ко он выгодно отличатся от оксазила тем, что он лучше
проникает в мозг [12]. В то же время он, очевидно,
имеет сходство с оксазилом как аллостерический
ингибитор ХЭ, а именно потому эффективен в ма#
лых дозах. Такое свойство обеспечивает ему преиму#
щество перед прочими обратимыми ингибиторами.
Результаты оценки комплекса карбоксима и ат#
ропина в разных дозах по эффективности при про#
филактическом и лечебном введении мышам за
15 мин внутрибрюшинно до подкожного введения
фосфакола приведены в табл. 2.
Показатели наклона (ПН) кривых возрастают в
опытах по сравнению с контролем в 2,5–5,5 раза,
следовательно, сравнительная оценка эффективно#
сти противоядий только по ИЗ некорректна. Судя
по индексу гарантированной защиты — ИГЗ [9], ат#
ВЫПУСК
3–4 / 2008
ISSN 1606–8181
ТОКСИКОЛОГИЯ
Таблица 1
Эффективность обратимых ингибиторов холинэстеразы и карбоксима как средства профилактики отравления,
при их внутрибрюшинном введении совместно с атропином (в фиксированной дозе 5 мг/кг) за 30 до подкожного
введения белым мышам фосфакола. ED ± m; N = 8–12
50
,
/
50
,
/
16,7 ± 0,20
1,93 ± 0,720
8,65
0,23 ± 0,09
0,02 ± 0,012
11,5
4,50 ± 0,11
0,015 ± 0,003
300,0
159,3 ± 47,6,
1,59 ± 0,7
100,0
Примечание: ЛД 50 — средняя летальная доза; ПД 50 — профилактическая доза, предупреждающая гибель
50 % животных; ЛД 50 : ПД 50 — показатель эффективности.
Таблица 2
Оценка защитного эффекта атропина, карбоксима в условиях их раздельного и совместного профилактического
(за 15 мин) и лечебного # (через 1 мин) внутрибрюшинного применения при отравлении белых мышей фосфаколом
подкожно. Число животных в группе 8–10; ЛД50 ± т мг/кг
,
10
+
50
/
15
+
/
/
±m
0,71 ± 0,21
0,2
–
1,79 ± 0,29
0,4
2,5
0,81/1,24 = 0,6
3,34 ± 0,49
0,5
4,7
1,60/1,24 = 1,3
5
/ +
5
/
20,0 ± 5,5
0,9
28,2
2,35/1,24 = 1,9
5
/ #+
5 / #
17,7 ± 6,7
1,1
24,9
2,10/1,24 = 1,7
Примечание: ПН — показатель наклона = σ : ЛД 50 = (m v N): ЛД 50 ; ИЗ — индекс защиты = ЛД 50 опыта:
ЛД 50 контроля; ИГЗ — индекс гарантированной защиты = ЛД 1 опыта: ЛД 99 контроля. # — препараты
вводили лечебно.
Таблица 3
Сравнительная антихолинэстеразная активность карбоксима с оксазилом и галантамином в присутствии
ацетилхолина (I50+АХ) и без него (I50#АХ) с характеристикой степени конкурентности ингибиторов
I50+ax c AX
I50–ax
10–6
1,7
6,2
I50–ax : I50+ax
10–7
35,4
12,7
8,0 10–10
8,0
10–6 ± 0,2
Психофармакология и биологическая наркология /
10–10
1,0
10–6 ± 0,1
3,2
8,0
2,5
ТОМ
8/
ВЫПУСК
3–4 / 2008
ISSN 1606–8181
2459
ТОКСИКОЛОГИЯ
2460
ропин в дозе 10 мг/кг практически не эффективен —
ИГЗ < 1. Эффективность карбоксима не велика. Его
ИГЗ больше 1 всего на 1/3. В случае использова#
ния комплекса атропин + карбоксим, взятых в не#
эффективных, попросту недействующих, дозах, при
профилактике отравлений установлены ИЗ в 6–11
раз превосходящий эффективность того и другого
вещества, взятых в 2–3 раза больших дозах по от#
дельности. Более того, несмотря на существенное
увеличение наклона кривой, ИГЗ комплекса при про#
филактике в 3,2 раза превосходит ИГЗ атропина и
в 1,5 карбоксима.
Результаты оценки анти#ХЭ активности карбок#
сима в сравнении с типичными обратимыми инги#
биторами разного типа взаимодействия с фермен#
том приведены в табл. 3.
Сходство с оксазилом послужило основанием оп#
ределения влияния карбоксима на фосфорилирова#
ние ХЭ фосфаколом. Карбоксим вводили в инкуба#
ционную смесь за 15 мин до фосфакола и через
30 мин определяли величину К2 . Результаты оценки
влияния карбоксима на фосфорилирование приве#
дены в табл. 4
Аллостерический защитный эффект карбоксима,
таким образом, не вызывает сомнений. Долю учас#
тия конкурентной защиты фермента при данной
постановке опытов уточнить не представлялось воз#
можным.
В целом можно заключить, что приведенные ма#
териалы являются достаточным основанием, для ре#
комендации применения карбоксима не только как
средства лечения, но и как средства профилактики
отравлений ФОС. Испытанный на мышах комплекс
атропин + карбоксим является моделью для созда#
ния более эффективного лечебно#профилактическо#
го антидота ФОС, который необходим для оказании
помощи при массовых поражений высокотоксичны#
ми ФОС.
В опытах in vivo определяли снижение активнос#
ти холинэстеразы крови мышей после введения раз#
дельно армина и карбоксима и их последовательного
введения в разное время. Эффект оценивали путем
Таблица 4
Константы ингибирования фосфакола при взаимодействием с ацетилхолинэстеразой без карбоксима (контроль —
К20), в опытах после воздействия карбоксима (К2i) и их относительное изменение к контролю
2
0(
i
(106 ×
)
–1
×
–1
)
2
0
/
2,8
1
10–5
1,2
1,3
2
–5
0,8
3,5
–5
0,5
5,6
5
2i
10
10
Таблица 5
Снижение активности ХЭ крови мышей в %. Карбоксим вводили мышам внутримышечно в дозе 20 мг/кг, армин —
подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли через 15 мин после введения карбоксима (контроль)
и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М ± m; n = 6–7)
15
(
(
)
)
+
15
45
11,3 ± 3,1
72,3 ± 1,9
70,9 ± 5,3
70,6 ± 7,1
29,5 ± 3,3
46,1 ± 9,9
48,8 ± 3,2
Примечание: карбоксим вводили мышам внутримышечно в дозе 20 мг/кг, армин — подкожно в дозе DL 50 .
Активность фермента определяли через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин
Психофармакология и биологическая наркология /
ТОМ
8/
ВЫПУСК
3–4 / 2008
ISSN 1606–8181
ТОКСИКОЛОГИЯ
Таблица 6
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении
карбоксима (20 мг/кг в/м) и хлорофоса (п/к в дозе DL99). М ± m, n = 5)
,
15
+
+
+
+
+
+
60
7,2 ± 6,3
10,1 ± 2,8
11,5 ± 4,2
79,3 ± 2,8
82,6 ± 9,4
89,4 ± 8,1
60
51,3 ± 16,6
59,4 ± 12,1
60,1 ± 9,7
30
20,6 ± 7,3
31,5 ± 7,8
30,7 ± 10,8
10,1 ± 2,8
10,1 ± 2,8
10,1 ± 2,8
10,1 ± 2,8
10,1 ± 2,8
10,1 ± 2,8
+
+
30
15
сравнения с контролем (в процентах). Результаты
приведены в табл. 5
Согласно данным таблицы во всех случаях опыт
абсолютно достоверно отличен от контроля. Экст#
ренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффек#
тивней лечения. Возможно, что в первом случае име#
ет значение не только защита ХЭ, но и феномен
реактивации, значимость которого очевидна при пос#
ледующем введении карбоксима.
Аналогичные опыты выполнены с использование
вместо армина типичного инсектицида хлорофоса.
Результаты приведены в табл. 6.
Как следует из полученных результатов, эффект
карбоксима абсолютно достоверен при введении за
30 минут, одновременно и через 15 мин. Одновре#
менное и лечебное применение активней ранней (за
30 мин) профилактики. Профилактика и лечение
отравлений хлорофосом эффективней, чем отравле#
ние армином.
Выявляются еще некоторые особенности:
лечебное применение эффективней, чем профи#
лактическое. Однако это может быть связано с тем,
что в данном случае использована хотя и ранняя (за
30 мин), но не экстренная профилактика (за 15 мин)
как в опытах с армином. Очевидно, что время профи#
лактики имеет очень существенно значение. Способ#
ность реактиваторов ХЭ потенцировать эффект хо#
линоблокаторов, в частности атропина, была
неоднократно показана ранее. Однако во всех случа#
ях, как атропин, так и реактиваторы ХЭ, были ис#
пользованы в дозах, при использовании которых они
были эффективны при раздельном введении, и дозы
Психофармакология и биологическая наркология /
ТОМ
8/
эти были близки к токсическим. В опытах В.Б. Про#
зоровского [6] при профилактике отравления фос#
факолом атропин в дозе 1/8 ЛД50 (ИЗ = 3,9) в соче#
тании с токсогонином в такой же дозе (ИЗ = 10 0)
при совместном применении обеспечивали типич#
ное потенцирование — ИЗ = 30. В данной работе
оба препарата в не эффективных дозах обеспечива#
ют такой же защитный эффект — феномен сверх#
потенцирования типичный для аллостерического вза#
имодействия.
ВЫВОДЫ
1. Атропин и карбоксим в рекомендованных для
мышей дозах (10 и 15 мг/кг в/б) относительно мало
эффективны как средства профилактики отравления
мышей фосфаколом — ИЗ равны 2,6 и 4,7 и не обес#
печивают гарантированной профилактики во всем
диапазоне доз фосфакола: ИГЗ равны соответствен#
но 0,6 и 1,3.
2. Комплекс атропин + карбоксим в неэффектив#
ных дозах (5 + 5 мг/кг) при профилактическом вве#
дении обеспечивают при отравлении мышей фосфа#
колом ИЗ = 28,2 и ИГЗ = 1,9, а при лечебном —
ИЗ = 24, 9 и ИГЗ — 1,7.
3. В опытах in vitro карбоксим тормозит актив#
ность очищенной ацетилхолинэстеразы на 50 % в
концентрации 2,5 × 10–6М, являясь ее преимуще#
ственно неконкурентным ингибитором. Именно это
свойство обеспечивает проявление защитного эф#
фекта карбоксима в дозе 1/100 от ЛД50, что отличает
ВЫПУСК
3–4 / 2008
ISSN 1606–8181
2461
ТОКСИКОЛОГИЯ
его от прочих реактиваторов и обратимых ингибито#
ров ХЭ.
2462
ЛИТЕРАТУРА
1. Глухан Е.Н., Сметанин А.В., Казаков П.В. и др.
Вероятностная оценка риска как показатель эко
логической безопасности на примере объекта по
уничтожению химического оружия.. // Рос. хим. ж.
(Ж. Рос. хим. обва им. Д.И. Менделеева. 2007. Т. 51,
№ 2. С. 52–54.
2. Куценко С.А., Прозоровский В.Б., Федонюк В.П.,
Пути создания эффективны средств профилакти
ки и неотложной терапии поражений фосфорорга
ническими отравляющими веществами при авариях
на объектах по хранению и уничтожению химичес
кого оружия. // Рос. хим. ж. (Ж. хим. обва им. Д.И.
Менделева. 1994. Т. 38, № 2. С. 90–93
3. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипоренко СП.,
Антидоты фосфорорганических отравляющих ве
ществ. // Рос. хим. ж. (Ж. хим. обва им. Д.И. Менде
леева). 2004. Т. 48, № 2. С. 110–116.
4. Прозоровский В.Б. О выборе показателя вынос
ливости при токсикологических исследованиях. //
Фармакол. и токсикол. 1967. Т. 30, № 2. С. 240–243
5. Прозоровский В.Б. Донкопий В.Д., Суслова И.М.
Взаимодействие обратимых ингибиторов с катали
тическими центрами и аллостерическими участка
ми холинэстераз. // Бюл. эксперим. биологии и мед.
1976. Т. 82, № 8. C. 553–556.
6. Прозоровский В.Б. Изучение взаимодействия ат
ропина, токсогонина и фосфакола. // Фармакол. и
токсикол. 1984. Т. 48, № 2. С. 33–37.
7. Прозоровский В.Б. Павлова Л.В. Суслова И.М.
Фармакологическая характеристика нового анти
холинэстеразного средства аминостигмина. // Эк
сперим. и клин. фармакол. 1992. Т. 55, № 1.
С. 13–16.
8. Прозоровский В.Б. Табличный экспрессметод
определения эффективных мер воздействия на
биологические объекты. // Токсикол. вестн. 1998.
№ 1. С. 3.
9. Прозоровский В.Б. Индекс гарантированной за
щиты — новый показатель эфективности антидо
тов. // Токсикол. вестн. 1999. № 4. С. 10–13.
10. Прозоровский В.Б. Лечебнопрофилактический
антидот ФОВ.. // Актуальные вопросы профилакти
ки и терапии интоксикаций. (Научн. тр. / Научн.
практ. мед. центр «Нейрон» и НИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ
военной мед). СПб.: Астрон, 2005. С/Мб .
11. Тонкопий В.Д., Саватеев Н.В., Бресткин А.П. Об
определении активности холинэстераз в тканях жи
вотных после воздействия обратимых ингибиторов. //
Докл. АН СССР. 1972. Т. 207, № 3. C. 736–738
12. Eyer P. The role of oximes in the management of
organophosphorus pesticide poisoning. // Toxicol. Rev.
2003. Vol. 22, N 3. P. 165–90.
13. Nechiporenko S.P., Zatsepin E.P. A Study to
establish an efficient means for delivering antidotal
therapy at nerve agent destruction facillies. // J. Toxicol.
Clin. Toxicol. 2003. Vol. 41, № 5. P. 723.
14. Newmark J. Therapy for nerve agent poisoning. //
Arch. Neurol. 2004. Vol. 61, N 5. P. 649–52.
15. Okudera H. Clinical features on nerve gas terrorism
in Matsumoto. // J. Clin. Neurosci. 2002. Vol. 9, N 1.
P. 17–21.
16. Wiener S.W., Hoffman R.S. Nerve agents: a
comprehensive review. // J. Intensive Care Med. 2004.
Vol. 19, N 1. P. 22–37.
Prozorovskii VB, Skopichev VG, Panchenkova OA. The
Evaluation of Reactivator of Acetylcholine Esterase Carboxim as
a Drug for Prevention from Poisoning with Phosphororganic
Inhibitors of Acetylcholine Esterase.
Psychopharmacol Biol Narcol. 2008; 8(3–4): 2457–2462
St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine,
St. Petersburg 198904.
SUMMARY: Carboxim possesses the properties of inreversible
reversible inhibitor of acetylcholine esterase, reducing the velocity
of phosphorilation for the enzyme and defending it from
inreversible inactivation. Carboxim in use with atropine (in
subeffective doses 5 + 5 mg/kg) increases the defense from
phosphororganic inhibitors of acetylcholine esterase in 6–11–
fold when used as preventive (defense index equal 26.2) or
curative (defense index equal 24.9) agent.
KEY WORDS: phosphororganic inhibitors of acetylcholine
esterase; prevention from poisoning; carboxim; antidotes of
phosphororganic inhibitors of acetylcholine esterase
Correspondence to: Valery B. Prozorovskii
St. Petersburg, Russia
email: [email protected]
Психофармакология и биологическая наркология /
Epub 2009 Jan 25. In Russian © PPBN
http://www.psychopharmacology.ru/index.php/PPBN/article/view/987
http://www.elibrary.ru
ТОМ
8/
ВЫПУСК
3–4 / 2008
ISSN 1606–8181