Применение ДНК-маркёров в селекции пшеницы на иммунитет

АГРОНОМИЯ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
6. Органолептическая оценка качества выпеченного хлеба в зависимости от норм высева
и сроков подкормки азотом яровой мягкой пшеницы сорта Белянка (2007–2008 гг.)
Фактор
№ варианта
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
А – норма высева,
млн всх. семян
на 1 га
3,5
4,0
4,5
(контроль)
5,0
В – подкормки
в фазу
Органолептическая
оценка качества
выпеченного хлеба,
балл
Пористость
мякиша
хлеба, %
Влажность
хлеба, %
Кислотность
хлеба,
ед.к.
б/у
кущения
налива
б/у
кущения
налива
б/у (контроль)
кущения
налива
б/у
кущения
налива
4,0
4,3
4,5
4,1
4,4
4,5
4,4
4,4
4,5
3,9
4,7
4,2
83,1
83,9
80,7
80,7
81,1
79,8
78,4
79,1
82,8
79,8
80,3
82,7
43,4
43,5
43,4
43,3
43,5
43,3
43,1
43,2
43,5
43,1
42,8
42,8
2,50
2,14
2,36
2,63
2,99
2,77
2,29
2,36
2,33
2,11
2,53
2,50
а для второго – не менее 67,0%. Как видно по
данным таблицы, пористость хлеба, выпеченного из изучаемых сортов яровой пшеницы, во
всех вариантах отвечала требованиям высшего
сорта.
Влажность хлеба по ГОСТу Р 52462–2005
составляет 39,0–46,0%.
Наш хлеб отвечает требованиям стандарта
(влажность ниже 46,0%).
Под кислотностью (градусом кислотности)
понимают объём хлеба в см3 раствора молярной
концентрации 1 моль/дм3 гидроокиси натрия
или гидроокиси калия, необходимый для нейтрализации кислот, содержащихся в 100 г изделия
(ГОСТ 5670). Кислотность мякиша хлеба должна
быть в пределах 2,5–3,5 ед.к. В наших опытах
кислотность соответствовала ГОСТу.
В результате азотных подкормок качество
хлеба улучшается, особенно при некорневых
подкормках в фазу налива зерна, об этом сви-
детельствуют более высокие оценочные баллы
(табл. 6).
Лучшим при органолептической оценке качества выпеченного хлеба по всем показателям был
хлеб из муки сорта Белянка при контрольной
норме высева 4,5 млн всхожих семян на 1 га.
Хлеб с такими органолептическими показателями относится к хлебу хорошего качества.
Таким образом, проведённые исследования
показали, что пористость мякиша хлеба при
норме высева 3,5 млн всх. семян на 1 га при
подкормке в фазу кущения и б/у. Наименьшая
влажность хлеба при норме высева 5,0 млн всх.
семян на 1 га. Кислотность хлеба вартирует от
2,11 до 2,99%.
Литература
1. Беркутова Н.С. Методы оценки и формирование качества
зерна. М.: Агропромиздат, 1991. 206 с.
2. Козьмина Н.П. Зерно. М.: Колос, 1969. 368 с.
3. Николаев Н.А., Яичкин В.Н., Гулянов Ю.А. и др. Практикум
по технологии переработки продукции растениеводства.
Оренбург: ОГАУ, 2004. 116 с.
Применение ДНК-маркёров в селекции
пшеницы на иммунитет
Н.А. Николаев, соискатель, М. В. Сычёва, к.б.н.,
Л.И. Краснова, д.с.-х.н., профессор, Оренбургский ГАУ
условиям, лучший по продуктивности и засухоустойчивости сорт селекции ОГАУ, отнесён
к ценной пшенице, включён в Госреестр РФ
и допущен к использованию в Оренбургской
области с 2006 г.
Селекция пшеницы в ОГАУ ведётся по нескольким направлениям, одно из них – селекция
на устойчивость к грибным болезням. Эффективность данного направления возросла благодаря развитию ДНК-технологии, позволяющей
по-новому создавать резистентные генотипы
пшеницы, когда оценка и отбор селекционного материала осуществляется непосредственно
В Оренбургском ГАУ проводится селекционная работа с озимой мягкой пшеницей, сорта
Оренбургская 105 и Пионерская 32 (с потенциальной урожайностью не ниже 7 т/га) пользуются
коммерческим спросом в Оренбургской области.
Сорт Оренбургская 105, с 2005 г. включённый в
Госреестр РФ и допущенный к использованию
в Оренбургской области, характеризуется повышенной зимо- и морозостойкостью и натурой
зерна. Пионерская 32 – адаптивный к местным
54
АГРОНОМИЯ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
Материалы и методика исследований. Материалом для исследований служили сортообразцы
рабочей коллекции озимой и яровой пшеницы,
которые в условиях эпифитотии (2007 г.) проявили полевую устойчивость к бурой ржавчине на
учебно-опытном поле ОГАУ.
Молекулярные анализы проводили в лаборатории кафедры микробиологии и заразных
болезней Оренбургского ГАУ; использовали
освоенные на данный момент ДНК-маркёры,
сцепленные с генами Lr10, Lr21, Lr24, Lr37;
ДНК-маркёры были синтезированы в ЗАО
«Синтол» (Москва) (табл. 1).
Выделение геномной ДНК проводили по
СТАВ-методу из четырёхдневных проростков,
пророщенных в чашках Петри на увлажнённой
фильтровальной бумаге, или из свежих листьев
растения.
Амплификацию проводили в термоциклёре
«Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Реакционная смесь включала ДНК растений (1 мкл),
специфические праймеры (по 1 мкл), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер, фермент
Taq-полимеразу, хлорид магния. Реакционную
смесь доводили до 15 мкл водой без нуклеаз.
ПЦР для выявления генов Lr10 и Lr37,
кодирующих устойчивость к бурой ржавчине,
проводили по протоколам: 1 цикл – 94°C,
3 мин.; 35 циклов – 94°C, 45 с., 57°C, 45 с., 72°C,
30 с.; 3 мин. при 72°C и 1 цикл – 94°C, 10 мин.;
35 циклов – 94°C, 1 мин., 65°C, 1 мин., 72°C,
2 мин.; 10 мин. при 72°C соответственно. Протокол амплификации генов Lr21 и Lr24 содержал
денатурацию при 94°C в течение 4 мин., затем
40 циклов, включающих 1 мин. при 92°C, 1 мин.
при 56°C для Lr21 и при 60°C для Lr24, 2 мин.
при 72°C, после чего проведение элонгации в
течение 5 мин. при 72°C.
Продукты амплификации генов анализировали путём электрофоретического разделения в
горизонтальном 1- или 2-процентном агарозном
геле, содержащем бромистый этидий. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете.
В качестве маркёров молекулярного веса использовали GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler
100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительное заключение о наличии гена делали при
по генотипу, определённому с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мировые
достижения в этой области, опубликованные в
базах данных сети Интернет и научных изданиях,
позволили нам начать работу по использованию
молекулярных маркёров в селекции пшеницы.
Проведённая в учебно-опытном поле ОГАУ
в 2007 г. полевая оценка на естественном инфекционном фоне в период эпифитотийного
развития бурой листовой ржавчины показала,
что все сорта озимой пшеницы, допущенные к
использованию в Оренбургской области, были
поражены болезнью [1], поэтому объектом нашей
работы в первую очередь стали Lr (leaf rust)-гены,
детерминирующие устойчивость к местной популяции возбудителя бурой листовой ржавчины
Puccinia recondita. Хотя возбудитель вызывает
эпифитотии в регионе не каждый год, тем не
менее создание сортов, устойчивых к бурой
ржавчине, – наиболее экономичный и экологически безопасный метод.
По имеющимся в литературе сведениям известно более 50 генов устойчивости к бурой
ржавчине во всём мире, из них более чем к 25
разработаны молекулярные маркёры. Многие
из них по причине изменчивости патогена
преодолены большинством рас бурой ржавчины
на территории России, другие – продолжают
эффективно защищать генотип сорта самостоятельно или в мульгенной комбинации.
Эффективные генетические детерминанты
устойчивости к Puccinia recondita по регионам
РФ указаны Всероссийским НИИ фитопатологии [2]. По Уральскому региону рекомендовано
использовать в селекции следующие гены: Lr9,
Lr19, Lr24, Lr29, Lr36, Lr38.
Поскольку собственные Lr-гены мягкой
пшеницы почти потеряли резистентность, их
источником в последнее время является генофонд дикорастущих сородичей пшеницы или
исходный материал, созданный с его участием [3].
Цель настоящей работы: выявить наличие
известных эффективных для данной зоны генов
устойчивости к бурой ржавчине у образцов рабочей коллекции пшеницы и использовать их в
селекции на повышение иммунитета местного
агроэкотипа мягкой пшеницы.
1. Праймеры, используемые для идентификации Lr-генов
Ген
Праймеры
название
Lr10
F12245 / Lr10-6r2
Lr21
Lr21
Lr24
J09
Lr37
VENTRIUP / LN2
нуклеотидная последовательность
F: GTGTAATGCATGCAGGTTCC
R: AGGTGTGAGTGAGTTATGTT
F: GTACTATTGTACATCCAGCTTCAAC
R: CTTGCTAGCAGTTCTAATTCTACTC
F: TCTAGTCTGTACATGGGGGC
R: TGGCACATGAACTCCATACG
F: AGGGGCTACTGACCAAGGCT
R: TGCAGCTACAGCAGT ATGTACACA AAA
55
Размер продукта
реакции, п.н.
Литературный
источник
227
[6]
375
[3]
310
[4]
262
[5]
АГРОНОМИЯ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
С использованием маркёра VENTRIUP / LN2
к гену Lr37 [5] характерный фрагмент размером
262 п.н. идентифицирован у сортообразцов озимой пшеницы Hussar (Англия), Renan (Франция).
Ген Lr37 интрогрессирован в мягкую пшеницу на
хромосому 2AS от эгилопса (Aegilops ventricosa),
имеет сцепление с генами устойчивости к жёлтой
(Yr17) и стеблевой (Sr38) ржавчине.
Практический интерес в селекции на иммунитет представляет коллекция интрогрессивных
линий яровой мягкой пшеницы с чужеродным
генетическим материалом видов Aegilops speltoides,
Aegilops triuncialis, Triticum kiharae, созданная
методом отдалённой гибридизации И.Ф. Лапочкиной в Московском НИИСХ. Ценность этой
коллекции состоит в том, что её линии, как доноры, имеют широкую генетическую основу по
генам устойчивости к бурой ржавчине. В результате ПЦР-анализа образцов коллекции, кроме
упомянутых Lr24 и Lr37, идентифицированы
гены Lr10 и Lr21 (табл. 2).
Для идентификации гена Lr10 использовали
маркёр F12245 / Lr10-6r2 [6], амплифицированный фрагмент размером 227 п.н. был обнаружен
у пяти интрогрессивных линий коллекции. Ген
Lr10 является собственным геном мягкой пшеницы (Triticum aestivum).
При идентификации гена Lr21 амплифицировался фрагмент размером 375 п.н. [3]. Он
выявлен у шести интрогрессивных линий коллекции. Ген Lr21 интрогрессирован в пшеницу
из Aegilops taushii.
Образцы с чужеродным генетическим материалом Aegilops speltoides 90/00i и 129/00i обладают комбинацией из трёх генов устойчивости,
один из которых (Lr24) является высокоэффективным; образец 113/00i-4 – также с тремя
Lr-генами, в том числе с геном возрастной
устойчивости Lr37.
С целью переноса в коммерческие сорта генов
устойчивости, эффективно работающих в условиях данного эколого-географического региона,
проведено скрещивание сорта Пионерская 32
с линией Лютесценс 660 – донором гена Lr24.
Далее проведены беккроссные скрещивания
(рис. 2) с целью увеличения в гибридном генотипе адаптивного наследственного материала
сорта Пионерская 32 и уменьшения доли нас-
1000 ɩɧ
750 ɩɧ
500 ɩɧ
250 ɩɧ
Ɉɛɪɚɡɟɰ ʋ
8
7
6
5
4
3
2
1
Рис. 1 – Детекция гена Lr24, кодирующего резистентность к
бурой ржавчине: дорожка 1 – маркёр молекулярного веса (GeneRuler 1 kbp DNA Ladder (Fermentas,
Литва)); образцы 2, 3 – специфический продукт
реакции 310 п.н.
обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определённой массы, которую
устанавливали по линейке молекулярных масс.
Для документирования полученных результатов
гелевые пластины фотографировали (рис. 1).
Результаты исследований. При проведении
ПЦР-анализа с использованием молекулярного
маркёра J09 к гену Lr24 [4] соответствующий
фрагмент амплификации размером 310 п.н.
выявлен у сортообразцов: 177 Р2 (Краснодар),
Norkan, Siouxland 89 (США), Белянка (Саратов),
Лавина (Владимир), Лютесценс 660 (Краснодар).
Молекулярные маркёры к гену Lr24 не обнаружены в следующих сортообразцах: 193 Р3, Хазарка (Краснодар), Bersy, Bourbon (Нидерланды),
Brigadier (Франция), Charmany, Dowel, F.S. 401,
McNair 1587, Nelson, TAM 107, TAM 108, TAM
200 (США), Бирюза, Тулайковская 10 (Самара),
Лютесценс 321 (Воронеж), Мироновская 28,
Мироновская 31 (Украина).
Известно, что ген Lr24 получен в результате
транслокации хромосомного сегмента пырея
удлинённого (Agropyron elongatum) на хромосому
3D мягкой пшеницы. Этот ген остаётся в числе
эффективных в Европе и России. Полевая оценка
на опытном поле ОГАУ в 2007 г. в условиях эпифитотии бурой ржавчины сортообразцов озимой
пшеницы, имеющих ген Lr24, подтвердила его
высокую эффективность [1].
2. Идентифицированные гены устойчивости Lr у интрогрессивных
образцов различного происхождения
Интрогрессивные образцы
90/00i
102/00i
113/00i-1
113/00i-4
120/00i
121/00i
129/00i
Происхождение образцов
Родина × Aegilops speltoides
Родина × Aegilops speltoides
Родина ×Aegilops triuncialis
Родина × Aegilops triuncialis
Родина × Triticum kiharae
Родина × Aegilops triuncialis
Phlb × Aegilops speltoides × Родина
56
Идентифицируемые гены
Lr10, Lr21, Lr24
Lr21
Lr10, Lr 21
Lr10, Lr21, Lr37
Lr10, Lr37
Lr21
Lr10, Lr21, Lr24
АГРОНОМИЯ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО
А × В → АВ × А → ААВ × А → АААВ × А → ААААВ
Примечание: А – Пионерская 32, В – Лютесценс 660.
Рис. 2 – Схема скрещивания
3. Результаты идентификации гена Lr24 из свежих листьев беккроссированных
растений с использованием маркёра J09
№ образца
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
Комбинация скрещивания
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
ВС2 (Пионерская 32 × Лют 660)
Результаты
амплификации
№ делянки
и растения, 2012 г.
+
+
+
–
–
+
+
+
–
+
–
–
–
–
–
–
–
154-1
154-2
154-3
156-1
156-2
164-1
164-2
164-3
167-1
167-2
167-3
172-1
172-2
172-3
279-1
279-2
279-3
Примечание: «+» и «–» означают присутствие / отсутствие продукта реакции размером 310 п.н.
ледственности донора, как малоприспособленного к местным условиям произрастания, имеющего низкие хозяйственно ценные признаки и
свойства.
После первого насыщения применили ПЦРанализ. С его помощью находили растения,
в генотипе которых присутствовал ген Lr24.
Отобранные растения использовали для второго
насыщения наследственным материалом сорта
Пионерская 32.
Аналогично провели третье насыщение
(табл. 3), после которого, как известно, доля
реккурентной родительской формы (Пионерская 32) в потомстве должна составлять 93,75%.
Планируется после 3-го беккросса перевести ген
из гетерозиготного состояния в гомозиготное
путём самоопыления, после чего из гибридной
популяции отобрать константные формы, устойчивые к бурой ржавчине.
Выводы. Методом ПЦР-анализа выявлены
сортообразцы рабочей коллекции пшеницы
как потенциальные доноры известных Lr-генов.
Осуществлён перенос эффективного для данной
зоны гена Lr24 в коммерческий сорт Пионерская 32. Гены возрастной устойчивости Lr21 и
Lr37 вовлечены в селекционный процесс для повышения иммунитета у новых сортов пшеницы.
Проведённые нами первые исследования по
применению молекулярных маркёров в селекции пшеницы на иммунитет показали, что их
использование может существенно повысить
эффективность работы селекционера.
Литература
1. Николаев Н.А. Полевая оценка сортообразцов озимой
пшеницы по устойчивости к бурой ржавчине // Известия
Оренбургского государственного аграрного университета.
2011. № 4. С. 52–54.
2. Коваленко Е.Д., Жемчужина А.И., Крятева Н.Н. Иммуногенетические методы создания болезнеустойчивых сортов
зерновых культур. 1. Генетическая структура популяций
возбудителя бурой ржавчины пшеницы // Агро ХХI. 2000.
№ 4. С. 14–15.
3. Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И. и
др. Использование фитопатологического и молекулярногенетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с
чужеродным генетическим материалом // Генетика растений.
2007. Т. 43. № 8. С. 1058–1064.
4. Schachermayr G., Messmer M., Feuillet C. u dr. Identification of
molecular markers linked to the Agropyron elongatum – derived
leaf rust resistance gene Lr24 in wheat // Theor. Appl. Genet.
1995. № 90. С. 982–990.
5. Marker Assisted Selection in Wheat URL: http://maswheat.
ucdavis.edu
6. Schachermayr G., Feuillet C., Keller B. Molecular markers
for the detection of the wheat leaf rust resistance gene Lr10 in
diverse genetic backgrounds // Molecular Breeding. 1997. № 3.
С. 65–74.
57