КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

10
Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
ÍÎÂÎÑÒÈ ÊËÅÒÎ×ÍÛÕ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÉ
ÊËÅÒÎ×ÍÀß ÁÈÎËÎÃÈß
«Stembrid» - íîâàÿ òåõíîëîãèÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà
âçðîñëîé êëåòêè áåç èñïîëüçîâàíèÿ ýìáðèîíîâ
Òåõíîëîãèÿ ïåðåíîñà ÿäðà ñîìàòè÷åñêîé êëåòêè (SCNT)
ÿâëÿåòñÿ îñíîâíûì ñïîñîáîì ïîëó÷åíèÿ ëèíèé àóòîãåííûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê, ñïåöèôè÷íûõ òîëüêî äëÿ êîíêðåòíîãî ïàöèåíòà [1, 2]. Êðîìå òîãî, SCNT ñëóæèò ïðåêðàñíîé ìîäåëüþ
èçó÷åíèÿ ôåíîìåíà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà âçðîñëîé
êëåòêè. Äî íåäàâíåãî âðåìåíè ñ÷èòàëîñü, ÷òî ó ÷åëîâåêà
ëèøü îâîïëàçìà ÿéöåêëåòêè îáëàäàåò óíèêàëüíîé ñïîñîáíîñòüþ ðåïðîãðàììèðîâàòü ÿäðî âçðîñëîé êëåòêè [1]. Îäíàêî â
íåäàâíèõ ðàáîòàõ áûëî ïîêàçàíî, ÷òî è ýìáðèîíàëüíàÿ ñòâîëîâàÿ êëåòêà (ÝÑÊ) êàê ìûøè [3], òàê è ÷åëîâåêà [4, 5] òàêæå
ñïîñîáíà ðåïðîãðàììèðîâàòü ÿäðî âçðîñëîé êëåòêè ïðè èõ
ñëèÿíèè. Òåì íå ìåíåå, ïîëó÷àåìûå ïðè ýòîì òåòðàïëîèäíûå
ãèáðèäû, ñîäåðæàùèå ÿäðà îáåèõ êëåòîê, âðÿä ëè ñìîãóò ïðèìåíÿòüñÿ ñ ìåäèöèíñêîé öåëüþ, ïîñêîëüêó íåèçâåñòíà èõ
áåçîïàñíîñòü [4].
Ðèñ. 1. «Stembrid» êîëîíèÿ - îêðàñêà
íà TRA-2-39 (L-alkaline phosphatase)
(çåë¸íûé), Oct-4 (êðàñíûé), DAPI (ñèíèé)
Ôîòî ïðåäîñòàâëåíî Í. Ñòðåëü÷åíêî
Èñòîðèÿ ñîçäàíèÿ êëåòî÷íûõ ãèáðèäîâ íàñ÷èòûâàåò áîëåå 30 ëåò.  1974 ãîäó Veomett âïåðâûå âûïîëíèë «ðåêîíñòðóêöèþ» (òåõíîëîãèÿ «recon») êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ
ïóò¸ì ñëèÿíèÿ öèòî- è êàðèîïëàñòîâ [6]. Ïîçäíåå áûëà ïðåäëîæåíà òåõíîëîãèÿ öèòîïëàçìàòè÷åñêèõ ãèáðèäîâ - «cybrid»,
êîãäà ðîäèòåëüñêóþ êëåòêó ïåðåä ñëèÿíèåì ýíóêëåèðîâàëè
[7]. Ñïîñîáíîñòü öèòîïëàñòà ðåïðîãðàììèðîâàòü äîíîðñêîå
ÿäðî áûëà ïîêàçàíà â ðàáîòàõ Howell è Abken [8, 9]. Òàê â
ýêñïåðèìåíòàõ Howell, ïðè ñëèÿíèè ÿäðà çëîêà÷åñòâåííîé è
íîðìàëüíîé êëåòîê, «öèáðèä» òåðÿë ñâîéñòâà îíêîãåííîñòè
[8]. Ïðè ñëèÿíèè íóëèïîòåíòíîé ýìáðèîíàëüíîé êàðöèíîìû
F9 c êëåòêàìè òèìóñà è ðîãîâèöû Atsumi ïîëó÷àë ïëþðèïîòåíòíûå ãèáðèäíûå ëèíèè, èìåþùèå õàðàêòåðèñòèêè çðåëûõ
íåðâíîé, ìûøå÷íîé è õðÿùåâîé òêàíåé [10].
Èññëåäîâàòåëè èç Reproductive Genetic Institute (Chicago,
IL, USA) ïîä ðóêîâîäñòâîì Þðèÿ Âåðëèíñêîãî âïåðâûå èñïîëüçîâàëè òåõíîëîãèþ «cybrid» äëÿ ïîëó÷åíèÿ àóòîãåííûõ
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ:
1. Jeanisch R., Eggan K., Humpherys D. et al. Nuclear cloning, stem cells, and
genomic reprogramming. Cloning Stem Cells 2002; 4: 389-96.
2. Hwang W.S., Lee B.C., Lee C.K., Kang S.K. Cloned human embryonic stem
cells for tissue repair and transplantation. Stem Cell Reviews 2005; 2: 99-110.
3. Tada M., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic
cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology 2001; 11: 1553–8.
4. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of
spermatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005;
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 2(4), 2006
ñòâîëîâûõ êëåòîê ïóò¸ì ñëèÿíèÿ âçðîñëîé êëåòêè ñ ýíóêëåèðîâàííîé ÝÑÊ. Íà äàííóþ òåõíîëîãèþ áûëè îôîðìëåíû
çàÿâêè íà ïàòåíò (20040259249 è 20030032180). Äëÿ
ñëèÿíèÿ èñïîëüçîâàëè öèòîïëàñòû íîðìàëüíûõ ÝÑÊ è ôèáðîáëàñòû, ëèìôîöèòû ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè è ìîíîíóêëåàðíûå êëåòêè ïóïîâèííîé êðîâè ÷åëîâåêà. Íà ïîëó÷åííûõ
êîëîíèÿõ èçó÷àëè ýêñïðåññèþ ìàðê¸ðîâ ïëþðèïîòåíòíîñòè
ÝÑÊ - TRA-2–39 è Oct-4.
×àñòîòà ñëèÿíèÿ çàâèñåëà îò âèäà êëåòîê è ðåæèìà ïðîöåäóðû. Îïòèìèçàöèÿ êîíöåíòðàöèè òàêèõ àãåíòîâ ñëèÿíèÿ
êàê ÄÌÑÎ è ïîëèýòèëåíãëèêîëü ïðèâîäèëà ê ÷àñòîòå ôîðìèðîâàíèÿ ãåòåðîêàðèîíîâ â 12.8% ñ ôèáðîáëàñòàìè è â 18.4%
ñ ëèìôîöèòàìè. Ïîñêîëüêó â ýêñïåðèìåíòå èñïîëüçîâàëè
«æåíñêèå» (46XX) ÝÑÊ è «ìóæñêèå» (46XY) ñîìàòè÷åñêèå
êëåòêè, òî ôîðìèðîâàíèå ñòàáèëüíûõ ãåòåðîêàðèîíîâ ïîäòâåðæäàëè FISH-àíàëèçîì íà Y-õðîìîñîìó. Êëåòêè ñybrid-êîëîíèé ìèòîòè÷åñêè äåëèëèñü, èìåëè òèïè÷íóþ ìîðôîëîãèþ
ÝÑÊ, õàðàêòåðèçîâàëèñü ñòàáèëüíûì êàðèîòèïîì 46XY è âûñîêèì óðîâíåì ýêñïðåññèè TRA-2–39 è Oct-4. Êðîìå òîãî,
êëåòêè êîëîíèé ýêñïðåññèðîâàëè è äðóãèå ìàðê¸ðû ïëþðèïîòåíòíîñòè ÝÑÊ - SSEA3, SSEA4, TRA-1–60 è TRA-1–80.
Òàêèì îáðàçîì èññëåäîâàòåëè ïðåäñòàâèëè ïåðâûå
î÷åâèäíûå äîêàçàòåëüñòâà ïîëíîé çàìåíû ÿäðà ÝÑÊ ÿäðîì ñîìàòè÷åñêîé çðåëîé êëåòêè ïðè èõ ñëèÿíèè. Ïîëó÷åíû ïåðâè÷íûå äàííûå, ÷òî öèòîïëàçìà ÝÑÊ ñïîñîáíà ðåïðîãðàììèðîâàòü ÿäðî âçðîñëîé êëåòêè ÷åëîâåêà ïðè åãî
çàìåíå. Èíòåðåñíî, ÷òî â àíàëîãè÷íîì ýêñïåðèìåíòå ñ êëåòêàìè ìûøè, áûëà ïîëó÷åíà òîëüêî îäíà êîëîíèÿ ñ ýêñïðåññèåé Oct-4 [11]. Áîëåå òîãî, â íåäàâíåé ðàáîòå ÿïîíñêèõ àâòîðîâ ïîêàçàíî, ÷òî ñëèÿíèå êàðäèîìèîöèòîâ ìûøè ñ ÝÑÊ
ïðèâîäèò ê ôîðìèðîâàíèþ ãèáðèäîâ ñ õàðàêòåðèñòèêàìè
îáåèõ êëåòîê [12]. Àâòîðû ðàáîòû íå îïèñûâàþò âûäåëåíèå îòäåëüíûõ ÷èñòûõ «stembrid» ëèíèé, ÷òî íàðÿäó ñ in vivo
ýêñïåðèìåíòàìè áûëî áû ÷¸òêèì äîêàçàòåëüñòâîì æèçíåñïîñîáíîñòè è ïåðñïåêòèâíîñòè ðàçðàáîòàííîé òåõíîëîãèè.
Áóäóùèå èññëåäîâàíèÿ ïî-âèäèìîìó áóäóò íàïðàâëåíû íà
óâåëè÷åíèå ÷àñòîòû ñëèÿíèÿ, âûäåëåíèå ÷èñòûõ stembridëèíèé ñ äåìîíñòðàöèåé èõ ïëþðèïîòåíòíîñòè è äîêàçàòåëüñòâà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà âçðîñëîé êëåòêè áîëüøèì
íàáîðîì ìåòîäîâ.
Ó÷àñòíèêè ðàáîòû: Í. Ñòðåëü÷åíêî, Â. Êóõàðåíêî, À. Øêóìàòîâ, Î. Âåðëèíñêèé, À. Êóëèåâ, Þ. Âåðëèíñêèé.
309: 1369–73.
5. Yu J., Vodyanik M.A., He P. et al. Human embryonic stem cells reprogram
myeloid precursors following cell-cell fusion. Stem Cells 2006; 24(1): 168-76
6. Veomett G., Prescott D.M., Shay J.W., Porter K.R. Reconstruction of
mammalian cells from nuclear and cytoplasmic components separated by
treatment with cytochalasin B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1974; 71: 1999–2002.
7. Wallace D.C., Bunn C.L., Eisenstadt J.M. Cytoplasmic transfer of
chloramphenicol resistance in human tissue culture cells. J. Cell Biol. 1975; 67:
174–88.
Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
8. Howell A.N., Sager R. Tumorigenicity and its suppression in cybrids of mouse
and Chinese hamster cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978; 75: 2358–62.
9. Abken H., Jungfer H., Albert W.H., Willecke K. Immortalization of human
lymphocytes by fusion with cytoplasts of transformed mouse L cells. J. Cell Biol.
1986; 103: 795–805.
10. Atsumi T., Shirayoshi Y., Takeichi M., Okada T.S. Nullipotent
teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with
11
somatic cells. Differentiation 1982; 23: 83–6.
11. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic
cells. Stem Cells 2004; 22: 941–9.
12. Takei S., Yamamoto M., Cui L. et al. Phenotype-specific cells with
proliferative potential are produced by polyethylene glycol-induced fusion of mouse
embryonic stem cells with fetal cardiomyocytes. Cell Transplant. 2005; 14(9):
701-8.
Ïîäãîòîâèë À.Â. Áåðñåíåâ
ïî ìàòåðèàëàì Reprod. BioMed Online 2006; 12 (1): 107–11
Ëå÷åíèå ñåðïîâèäíî-êëåòî÷íîé àíåìèè êîìáèíàöèåé
ìåòîäîâ ãåííîé òåðàïèè è ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè
ßâëåíèå ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè (RNA interference) áûëî
îòêðûòî â õîäå ýêñïåðèìåíòîâ ïî ïîäàâëåíèþ ýêñïðåññèè
ãåíîâ ïðè ïîìîùè àíòèñìûñëîâîé ÐÍÊ ó C. elegans. Òåðìèí
«ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ» (iRNA) äëÿ ôåíîìåíà ñïåöèôè÷åñêîãî ïîäàâëåíèÿ ýêñïðåññèè ãåíîâ ïðè ââåäåíèè äâóõöåïî÷å÷íîé ÐÍÊ áûë ïðåäëîæåí Andrew Fire â 1998 ãîäó [1,
2]. ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ ïðåäïîëàãàåò ñïåöèôè÷åñêîå íàðóøåíèå ýêñïðåññèè òîëüêî òåõ ãåíîâ, êîòîðûå îáëàäàþò
äîñòàòî÷íî áîëüøîé ñòåïåíüþ ãîìîëîãèè ñ ââåäåííîé äâóõöåïî÷å÷íîé ÐÍÊ) (ðèñ.).
ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ óæå øèðîêî èçó÷àåòñÿ ñ òåðàïåâòè÷åñêîé öåëüþ, íàïðèìåð, äëÿ ïîäàâëåíèÿ ýêñïðåññèè âèðóñíûõ ãåíîâ, îíêîãåíîâ èëè ñïåöèôè÷åñêèõ ãåíîâ, âûçûâàþùèõ çàáîëåâàíèÿ [3]. Äîñòîèíñòâà ýòîãî ìåòîäà – âûñîêàÿ
ñïåöèôè÷íîñòü (ïîäàâëÿåòñÿ ýêñïðåññèÿ òîëüêî òîãî ãåíà,
íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðîãî ïîëíîñòüþ ñîîòâåòñòâóåò íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ââîäèìîé
äâóõöåïî÷å÷íîé ÐÍÊ); âûñîêàÿ ýôôåêòèâíîñòü (ýêñïðåññèÿ
ãåíà ïîäàâëÿåòñÿ áîëåå ÷åì íà 90%, íåñêîëüêî äåñÿòêîâ
ìîëåêóë äâóíèòåâîé ÐÍÊ ìîãóò ïðèâåñòè ê äåãðàäàöèè íåñêîëüêèõ òûñÿ÷ ìîëåêóë ÐÍÊ-ìèøåíè).
Ïîêà òåðàïåâòè÷åñêîå èñïîëüçîâàíèå ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè îãðàíè÷åíî, âî-ïåðâûõ, æåñòêèìè óñëîâèÿìè âûáîðà
ãåíà, ðàáîòó êîòîðîãî íàäî ïîäàâèòü, âî-âòîðûõ, èíäóêöèåé
îòâåòà èììóííîé ñèñòåìû íà ýêçîãåííóþ ÐÍÊ, êîòîðàÿ ìîæåò ïðèâåñòè ê ïîëíîìó ïîäàâëåíèþ ñèíòåçà áåëêà è àïîïòîçó [4, 5]. Ðåãóëÿöèÿ ñèíòåçà siRNA â îïðåäåëåííîå âðåìÿ
è â îïðåäåëåííûõ êëåòêàõ ïîçâîëèò ìèíèìèçèðîâàòü âîçìîæíîå ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè.
Ïðèìåíåíèå ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè â êëåòî÷íîé òåðàïèè òðåáóåò òî÷íîãî, âûñîêîñïåöèôè÷íîãî îïðåäåëåíèÿ ãåíà, èãðàþùåãî ãëàâíóþ ðîëü â ðàçâèòèè çàáîëåâàíèÿ, òàê êàê
ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ çàñòàâëÿåò ýòîò ãåí «çàìîë÷àòü».
Ó÷åíûå èç Sloan-Kettering Institute (New York, NY, USA)
âïåðâûå ïîêàçàëè âîçìîæíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè âìåñòå ñ òðàíñãåíåçîì ïðè ëå÷åíèè ñåðïîâèäíîêëåòî÷íîé àíåìèè (ÑÊÀ).
Ïðè÷èíà ÑÊÀ çàêëþ÷àåòñÿ â îäíîíóêëåîòèäíîé çàìåíå
óðàöèëà íà àäåíèí, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ñèíòåçèðóåòñÿ öåïü
ìîëåêóëû ãëîáèíà ñ ãëþòàìèíîì, âìåñòî âàëèíà. Çàìåíà
îäíîé àìèíîêèñëîòû îêàçûâàåòñÿ äîñòàòî÷íîé, ÷òîáû èçìåíèòü ôóíêöèîíàëüíûå ñâîéñòâà ãåìîãëîáèíà (ïîíèæåííàÿ ðàñòâîðèìîñòü, ïîâûøåííàÿ ïîëèìåðèçàöèÿ). Ïðè ýòîì
ãåìîãëîáèí óæå íå ìîæåò âûïîëíÿòü êèñëîðîäàêöåïòîðíóþ
ôóíêöèþ è êðèñòàëëèçóåòñÿ ïðè íåäîñòàòêå êèñëîðîäà, à
ýðèòðîöèòû ïðèîáðåòàþò ñåðïîâèäíóþ ôîðìó, ñêëåèâàþòñÿ,
òðîìáèðóþò êàïèëëÿðû è ò. ä. Ìóòàíòíûé ãåí ïîëó÷èë íàçâàíèå βs, â îòëè÷èå îò íîðìàëüíîãî β-ãëîáèíà.
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 2(4), 2006