ПРОГРАММИРУЕМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ ПРИ ОБЩЕЙ

№ 1 - 2011 г.
14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006.68:612.57-091.818]-092.9
ПРОГРАММИРУЕМАЯ КЛЕТОЧНАЯ
ГИБЕЛЬ ПРИ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕМИИ У
КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ
WALKER 256
А.В. Ефремов1, Е. В. Овсянко1, П.М. Ларионов2, Ю.В. Пахомова1, Я.У. Овсянко1
1
ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»
(г. Новосибирск)
2
ГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина
Ростмедтехнологии» (г. Новосибирск)
Проведено иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков
семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bax и Bad) в клетках карциносаркомы Walker 256,
имплантированных в мышцу бедра в дозе 1 × 106 клеток крысам-самцам линии Wistar
при воздействии общей гипертермией. Полученные данные свидетельствуют о том, что
одним из решающих моментов в запуске апоптоза клеток карциносаркомы Walker 256
является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2. При воздействии общей гипертермии
наблюдалась выраженная индукция апоптоза.
Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, апоптоз, Bcl-2, Bax, Bad, общая
гипертермия
Ефремов Анатолий Васильевич – доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАМН, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической
патофизиологии
ГОУ
ВПО
«Новосибирский
государственный
медицинский
университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-39-78
Овсянко Елена Владимировна – кандидат медицинских наук, доцент кафедры
анатомии, гистологии и биологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный
медицинский университет», e-mail: [email protected]
Ларионов Петр Михайлович – доктор медицинских наук, профессор ГУ
«Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина
Ростмедтехнологии», e-mail: [email protected]
Пахомова Юлия Вячеславовна – доктор медицинских наук, профессор кафедры
патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский
государственный медицинский университет», телефон рабочий: (383) 225-39-78
Овсянко Ясит Умеровна – кандидат медицинских наук, старший преподаватель
кафедры анатомии человека ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский
университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-15-24
Введение. Одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение
равновесия между процессами пролиферации клеток и апоптозом. В повреждении
регуляции апоптоза, приводящем к развитию опухолевых заболеваний, одно из
центральных мест связано с экспрессией одного из основных звеньев в регуляции
программированной гибели клетки – белков семейства Bcl-2. Эти белки играют важную
роль в регуляции внутреннего (митохондриального) пути апоптоза. К ним относятся как
индукторы, так и ингибиторы апоптоза. В настоящей работе изучена методом
иммуногистохимии экспрессия генов белков семейства Bcl-2 в опухолевой ткани у крыс
линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 в динамике после воздействия
общей гипертермией.
Материал и методы исследования. В эксперименте использовали крыс-самцов
линии Wistar массой 180–200 г. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker 256,
поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и
генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы
Walker 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 1 × 106 клеток в 0,1 мл
изотонического раствора NaCl. Через 5 суток с момента перевивки опухоли животных
разделяли на 2 группы: 1-я группа – контроль со «спонтанным» развитием опухоли (n =
7); 2-я группа – при воздействии общей гипертермией (ОГ) (n = 14). ОГ животных
производилась в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования
общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [1]. Уровень ОГ, при котором
прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5 °С (стадия теплового
удара). Опухолевую ткань для иммуногистохимического исследования брали в
следующие сроки: 1-й группы – после 5-х суток с момента перевивки опухоли; 2-й – на 7е и 14-е сутки с момента прогревания животных. Иммуногистохимическое исследование
уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 выполняли на парафиновых срезах опухолевой
ткани толщиной до 5 мкм с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [3].
Использовали антитела Bax (поликлональный) к домену, играющему важную роль в
образовании гомо- и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2, а
также к Bcl-2 и Ваd (моноклональные). Морфометрическое исследование изучали на
фотографических снимках, сделанных при помощи моторизованного микроскопа M200
(Zeiss) и камерой AxioCam HRc (Zeiss) с конечным увеличением ×630. Подсчет
осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision – Release 4.7.1. (Zeiss).
Полученные в экспериментах цифровые данные обрабатывали с использованием
общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М),
ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий
средних величин (р) на основании t – критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 %
(p < 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные результаты представлены в таблице.
Величины показателей уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 у крыс линии
Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей
гипертермией (M ± m)
Группы
1 группа
2 группа,
ОГ
Сутки
5-е
7-е
14-е
Bcl-2, %
19,86 ± 1,52
13,06 ± 1,48 *
8,91 ± 1,41*
Bax, %
19,13 ± 2,05
71,52 ± 4,49 *
33,47 ± 1,59 *
Bad, %
32,59 ± 1,81
68,06 ± 3,58 *
70,58 ± 1,95 *
Примечание: 1-я группа – контроль со «спонтанным» развитием опухоли; 2-я
группа – при воздействии общей гипертермией (ОГ); * – р < 0,05 по сравнению с
показателями в контрольной группе со «спонтанным» развитием опухоли
При сравнительной оценке экспрессии белков семейства Bcl-2 при «спонтанном»
развитии опухоли не было выявлено достоверных различий между величинами
показателей Bcl-2 и Bax. Уровень показателя экспрессии Bad был достоверно выше
соответствующих величин показателей Bcl-2 и Bax в 1,64 и 1,7 раза соответственно. Один
из
механизмов
апоптоза
связан
с
изменением
степени
фосфорилирования/дефосфорилирования белка-индуктора Bad. Bad дефосфорилируется,
образуются гетеродимеры Bcl-2/Bad, и запускается процесс апоптоза за счет
высвобождения митохондриальных факторов, при этом в конечном итоге происходит
активация каспазы-9. Возможно, апоптоз является фактором, сдерживающий рост
опухоли на ранних стадиях развития. По наблюдениям I. D. Bowen, S. M. Bowen [4] в
молодых опухолях на начальных стадиях развития происходит активация апоптоза, но с
увеличением массы опухоли апоптоз резко падает и сохраняется на относительно
стабильном уровне.
При воздействии ОГ на протяжении всего эксперимента резко возрастал уровень
экспрессии промоторов апоптоза Bax и Bad, инициирующих программируемую
клеточную смерть в присутствии ингибиторов каспаз. Выявлено, что показатель уровня
экспрессии Bad как на 7-е, так и на 14-е сутки эксперимента был выше уровня величины
того же показателя группы контрольных животных со «спонтанным» развитием опухоли в
2,08 и 2,16 раза соответственно.
Экспрессия уровня проапоптогенного белка Bax была также выше
соответствующего показателя уровня контроля в большей степени на 7-е сутки в 3,74 и
1,74 раза соответственно. Высвобождение этих белков происходит при повышении
проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax.
Отношение Bcl-2 и Bax находится в состоянии постоянного динамического равновесия,
образуя гомо- и гетеродимеры, что завершается апоптозом клетки [5]. Ранее нами было
обнаружено при воздействии ОГ на крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой
Walker 256 повышенное на 14-е сутки содержание ТБК-активных продуктов, уровня
диеновых конъюгатов, а также увеличение активности лизосомных ферментов
(арилсульфатазы А- и N-ацетил-ß,D-глюкозаминидазы) в сыворотке крови,
свидетельствующие о стимуляции окислительного стресса, индуцирующие гибель клеток
Walker 256 путем апоптоза [2]. Важно отметить, что уровень экспрессии протоонкогена
Bcl-2 при воздействии ОГ на протяжение всего эксперимента достоверно ниже
соответствующего показателя контроля у животных со «спонтанным» развитием опухоли
в большей степени на 14-е сутки эксперимента в 1,52 и 2,23 раза соответственно.
Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что
члены семейства белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в
динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами. Показано, что решающим
моментом в запуске апоптоза карциносаркомы выраженная индукция апоптоза
наблюдалась при воздействии общей гипертермии.
Список литературы
1. Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А. и др. Патент 2165105 Российская
Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких
лабораторных животных / опубл. 2001. Бюл. № 10.
2. Пупышев А. Б., Федина Р. Г., Мичурина С. В., Овсянко Е. В. [и др.] // Вопр.
онкологии. – 2009. – Т. 55, № 2. – С. 221–223.
3. Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия : методич. рекомендации / В.
Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, Н. А. Максимова. – Спб., 2002. – 36 с.
4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M.
Bowen. – London : Champman and hall, 1990.
5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway – Bcl-2 and Bcl-X(L)
function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol. Chem. –
1996. – Vol. 271. – P. 4573–4576.
PROGRAMMED CELL DECAY IN
GENERAL HYPERTHERMIC RATS WITH
CARCINO - SARCOMA WALKER 256
A.V. Efremov1, E.V. Ovsyanko1, P.M. Larionov2, Y.V. Pakhomova1, Y.U. Ovsyanko1
1
SEI HPE «Novosibirsk State Medical University»
SI «Novosibirsk SRI of Blood Circulation Pathology named after
academician E.N. Meshalkin Rosmedtechnology» (c. Novosibirsk)
2
The Bcl-2 ( Bcl-2, Bax and Bad) proteins‘ expression level immunehistochemical research is
carried out in carcino-sarcoma cells Walker 256, implanted into Wistar mail-rats muscular thigh
cells in the dosage of 1 x 10`6, under general hyperthermia. The given data observe the Bcl-2
proteins heterodimerization being one of the decisive moments in Walker 256 carcino- sarcoma
cells start of apopthosis. The marked apopthosis induction was observed under general
hyperthermia.
Keywords: carcino-sarcoma Walker 256, apopthosis, Bcl-2 Bcl-2, Bax, Bad, general
hyperthermia
About authors:
Efremov Anatoliy Vasilyevich – doctor of medical sciences, professor, correspondent member
RAMS, head of pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE
«Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78
Ovsyanko Elena Vladimirovna – medical sciences candidate, assistant professor at anatomy,
histology and biology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», e-mail:
[email protected]
Larionov Petr Mikhailovich – doctor of medical sciences, professor SI «Novosibirsk SRI of
Blood Circulation Pathology named after E.N. Meshalkin Rosmedtechnology», e-mail:
[email protected]
Pakhomova Yulia Viacheslavovna – doctor of medical sciences, professor at pathological
physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical
University», office telephone 8(383) 225-39-78
Ovsyanko Yasit Umerovna – medical sciences candidate, senior teacher at human anatomy
department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone: 8(383) 225-1524
List of the Literature:
1. Efremov A.V., Pakhomova Y.V., Pakhomov E.A. [et. al]. Licence 2165105 of Russian
Federation. Experimental modeling way of general hyperthermia in little laboratory
animals / published in 2001. Bulletin № 10.
2. Pupyshev A.B., Fedina R.G., Michurina S.V., Ovsyanko E.V. [et.al] // Oncology
Questions. - 2009. - V. 55, № 2. P. 221-223.
3. Ellinidy V.N. Practical immunehistochemistry: methodical recommendations / V.N.
Ellinidy, N.V. Anikieva, N.A. Maksimova. - Spb., 2002. - 36p.
4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen.
– London : Champman and hall, 1990.
5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway – Bcl-2 and Bcl-X(L)
function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol.
Chem. – 1996. – Vol. 271. – P. 4573–4576.