особенности апоптоза кардиомиоцитов плода в условиях острой

2014, том 17, №2 (66)
ТА В Р И Ч Е С К И Й М Е Д И К О - Б И ОЛ О Г И Ч Е С К И Й В Е С Т Н И К
УДК 616.127-005.4:616.15-018.5-091.818
©
И.В. Заднипряный, О.C. Третьякова, Т.П. Сатаева, 2014.
ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА КАРДИОМИОЦИТОВ ПЛОДА
В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ АНТЕНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ
И.В. Заднипряный*, О.C. Третьякова**, Т.П. Сатаева***
* Кафедра анатомии человека (зав. кафедрой – проф. Пикалюк В.И.);
** Кафедра социальной медицины и экономики здравоохранения (зав.кафедрой– проф. Третьякова О.С.);
*** Кафедра биологии (зав. каф. – д.м.н. Кутя С.А.), Государственное у чреждение «Крымский государственный
медицинский университет имени С. И. Георгиевского», г. Симферополь, бул. Ленина 5/7.
FETAL CARDIOMYOCYTE APOPTOSIS IN TERMS OF ACUTE ANTENATAL HYPOXIA
I.V. Zadnipryany, O.S. Tretyakova, T.P. Sataieva
SUMMARY
The phenomenon of apoptosis is caused by different factors that lead to cell death, including hypoxia. To
investigate the immunohistochemical markers of apoptosis in acute hypoxia at the antenatal period, we studied
paraffin blocks of the left ventricular myocardium of six fetuses with a gestation term of27 to 30 weeks who died
out of premature detachment of the placenta. As the primary monoclonal antibodies, bcl-2 (clone IgG1 Monoclonal
[Bcl-2/100], LSBio), CD95 (Fas) Ab-3 (clone GM30, Thermo Scientific), caspase-3 Human Caspase-3 (clone
3CSP03, Thermo Scientific) were used. It was found that the transmission signal is sent to the apoptotic
cardiomyocytes via the CD95 (APO-1/Fas)-receptor and the effector enzymes of the caspase cascade after
depletion of the protective system of the mitochondrial protein bcl-2.
ОСОБЛИВОСТІ АПОПТОЗУ КАРДІОМІОЦИТІВ ПЛОДА В УМОВАХ ГОСТРОЇ АНТЕНАТАЛЬНОЇ
ГІПОКСІЇ
І.В. Задніпряний, О.С. Трет’якова, Т.П. Сатаєва
РЕЗЮМЕ
Феномен апоптозу є результатом дії різних факторів, що призводять до загибелі клітини, в тому
числі і гіпоксії. Для дослідження імуногістохімічних маркерів апоптозу при гострій гіпоксії в антенатальному
періоді був вивчені парафінові блоки лівого шлуночка міокарда 6 плодів терміном гестації 27-30 тижнів,
загиблих в результаті передчасного відшарування плаценти. Як первинних використовувалися
моноклональні антитіла до bcl-2 (клон IgG1 Monoclonal [Bcl-2/100], LSBio), CD95 (Fas) Ab-3 (клон GM30,
Thermo Scientific), каспаза-3 Human Caspase-3 (клон 3CSP03 , Thermo Scientific). Було виявлено, що
передача апоптогенного сигналу до кардіоміоцитів здійснюється через CD95 (APO-1/Fas)-рецептор і
ефекторні ферменти каспазного каскаду при виснаженні захисної системи мітохондріальних білків bcl-2.
Ключевые слова: апоптоз, новорожденные, миокард, гипоксия.
водит к активации каспазы-8 и способствует инициации начальной стадии Fas-индуцированного апоптоза, называющейся индукторной. Фаза развития
апоптоза (эффекторная) обусловлена активацией
каспазы-1. Каспаза-1 повышает проницаемость митохондриальной мембраны, что сопровождается
выделением в цитоплазму целого ряда апоптогенных факторов, в том числе цитохрома С. Эти факторы в комплексе или самостоятельно приводят к активации каспазы-3, что влечет за собой активацию
дальнейшей цепочки каспаз и эндонуклеаз и приводит к деградации ДНК [5, 6, 10] .
Митохондриальные механизмы апоптоза также
привлекают пристальное внимание исследователей.
Внутри митохондрий содержится ряд белков (цитохром С, эндонуклеаза G и др.), попадание которых в
цитоплазму приводит к запуску апоптоза [3, 9]. Для
предупреждения необоснованной индукции «мито-
Несмотря на быстрый рост числа публикаций о
роли апоптоза при заболеваниях сердца остаются не
вполне ясными вопросы участия программируемой
клеточной гибели и механизмов ее регуляции в процессе развития миокарда [1, 3, 7, 9]. Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки, в том числе и
гипоксии [2, 10]. Основные механизмы индукции
апоптоза можно условно разделить на 3 группы в
зависимости от «точки приложения» фактора, индуцирующего развитие апоптоза: мембранные, митохондриальные и ядерные [6, 8].
Мембранные или рецепторопосредованные факторы включают реализацию апоптогенного сигнала
через специальные рецепторы, например, Fas-рецептор ( Fas-R)), С-концевой внутриклеточный домен
которых способен инициировать этапы развития
апоптоза [6]. Связывание Fas с лигандом Fas-L при54
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
хондриального» апоптоза существует система белков, обеспечивающих контроль за выходом из митохондрий проапоптических факторов. Эта система
представлена белками семейства bcl-2 [4, 12]. Bcl-2
белки осуществляют также регуляцию образования
митохондриальных пор временной проницаемости,
предотвращая выход цитохрома С и других указанных факторов через каналы из интермитохондриального пространства. Деградация bcl-2 приводит к
попаданию в цитоплазму цитохрома С, который способствует олигомеризации цитозольного белка –
апоптоз-активирующего фактора (Аpaf) [10, 11, 13].
Таким образом, выявление и анализ апоптоза в
ткани миокарда в условиях острой интранатальной
гипоксии являются достаточно актуальными.
Целью исследования явилось выявление апоптоза кардиомиоцитов в условиях острой антенатальной гипоксии у человека.
зуализации последнего поколения Envision (Dako).
Вторичные антитела, которые содержали большое
количество молекул пероксидазы хрена наносили на
срезы и инкубировали во влажных камерах в течение 30 минут с промыванием в Трис-буферном растворе через каждый этап в течение 10 минут. Идентификация реакции проводилась благодаря нанесению хромогена (DAB (Dako)) под контролем микроскопа в течение от 20 секунд до 3 минут с проявлением в виде темно-коричневой расцветки специфических структур в зависимости от маркера. Для
дифференцирования структур тканей срезы дополнительно окрашивали гематоксилином Майера в
течение 1-3 минут [5].
Исследования микропрепаратов проводили на
специализированном компьютерном комплексе
MICRO-C4-2200 (микроскоп Olympus CX-31 с
объективами:Plan 4х /-, Plan 10х х/0,25, Plan 40х х/
0,65, /0,17, цифровой фотоаппарат Olympus С 5050Z,
персональный компьютер и принтер) для получения,
обработки, архивирования и печати цифровых микрофотографических изображений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования иммуногистохимических маркеров апоптоза при острой гипоксии в антенатальном периоде был изучены парафиновые блоки левого желудочка миокарда 6 плодов сроком гестации
27-30 недель, погибших в результате преждевременной отслойки плаценты.
Образцы миокарда фиксировали в нейтральном
забуференном формалине со стандартной проводкой и заливкой в парафин.
На ротационном микротоме Microm-325
(Microm Corp., Германия) получали серийные срезы из различных отделов левого желудочка толщиной 5 мкм. Срезы наносили на специальные адгезивные предметные стекла SuperfrostPlus, потом
депарафинизировали в соответствии с принятыми
стандартами [5]. Для проведения тепловой индукции эпитопного (антигенного) оборота (Huer - heat
induction of epitope retrieval), в результате которого
возобновлялись антигенные свойства ткани, использовали нагревание в 1M готовом цитратном буфере
(Thermo Scientific, США). c рH=6,0 в автоклаве (8
минут при температуре +121°С) с симметричным
расположением стекол в кювете.
Затем проводили инкубацию срезов с первичными антителами во влажных камерах при температуре 23 – 25°С в течение 60 минут с использованием в качестве растворителя специального раствора antibody diluent (Dako). В качестве первичных
использовались моноклональные антитела к bcl-2
(клон IgG1 Monoclonal [Bcl-2/100], LSBio), CD95
(Fas) Ab-3 (клон GM30, Thermo Scientific), каспазе3 Human Caspase-3 (клон 3CSP03, Thermo Scientific)
в разведении 1:100, 1:30, 1:200 соответственно. Для
каждого маркера выполнялись контрольные исследования с целью исключения ложнопозитивных или
ложнонегативных результатов.
Следующий этап имуногистохимического исследования проводили с использованием системы ви-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярные процессы апоптоза запускаются
в цитозоле, на мембранах, но реализуются только в
ядре за счет репрессии генов и необратимого процесса межнуклеосомной фрагментации ДНК. В зависимости от стимулов, инициирующих апоптоз,
можно выделить два главных внутриклеточных
апоптозных сигнальных каскада: путь через рецепторы и митохондриальный путь [9]. Наличие связи
между апоптозом и физиологией митохондрий следует из присутствия белков семейства Bcl-2 в митохондриальных мембранах [5, 8].
Интенсивность иммуноокрашивания миокарда
плодов при антенатальной гипоксии была разной.
Наиболее выраженная экспрессия белка bcl-2 отмечалась в кардиомиоцитах и эндотелиоцитах в зонах
интестициального отека и кровоизлияний, что отражало напряженность противоапоптотических факторов защиты в местах наибольшей гипоксии клеток (рис.1). Слабая экспрессия bcl-2 в ряде таких
зон расценивалась как реакция истощения защитных механизмов.
В зонах левого желудочка, где кардиомиоциты
сохраняли относительно нормальное строение, экспрессия bcl-2 была мозаичной и слабо выраженной.
В роли внешних проапоптотических факторов
в миокарде левого желудочка участвуют внеклеточные лиганды, которые связываются с мембранными “рецепторами смерти” CD95(APO-1/Fas) и
запускают программированную гибель клеток [9,
12]. Рецепторы CD95(APO-1/Fas) экспрессировались на мембранах кардиомиоцитов практически
во всех зонах миокарда левого желудочка, где наблюдались участки выраженной деструкции кардиомиоцитов и интерстициального отека (рис. 2).
55
2014, том 17, №2 (66)
ТА В Р И Ч Е С К И Й М Е Д И К О - Б И ОЛ О Г И Ч Е С К И Й В Е С Т Н И К
Рис.1. Миокард плода. Срок гестации 24 недели. Иммунопозитивно окрашенные эндотелиоциты и
кардиомиоциты на bcl-2. Иммунопозитивное окрашивание Invision. Приближение: Zoom 213.
Объектив: Plan С 100 х/1.25Oil
Рис.2. Миокард плода. Срок гестации 24 недели. Иммунопозитивно окрашенные кардиомиоциты
на CD95 (APO-1/Fas). Иммунопозитивное окрашивание Invision. Приближение: Zoom 213. Объектив:
Plan С 100х/1.25Oil /
бинации с фактором Apaf-1 и прокаспазой-9 образует каспазу-9, активирующую каспазу-3 [9]. Было
выявлено, что каспаза-3 экспрессировалась мозаично в некоторых эндотелиоцитах, а также в группах
соседних клеток (по 3-4 кардиомиоцита), в которых
дополнительно определялась деградация ядра за
Одним из главных эффекторов апоптоза является каспаза-3, которая может активироваться при нарушение целостности митохондриальной мембраны
после истощения защитной системы bcl-2, что наблюдалось в данном исследовании. При этом из
митохондрий выходит цитохром С, который в ком56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
счет активации каспазой-3 эндонуклеазы (рис. 3).
При этом активация каспазы-3 была характерна для
участков миокарда с выраженным интерстициальным
отеком без локальных кровоизлияний и инфильтратов.
Рис.3. Миокард плода. Срок гестации 24 недели. Иммунопозитивно окрашенные кардиомиоциты
на каспазу-3.Иммунопозитивное окрашивание Invision. Приближение: Zoom 213. Объектив: Plan С
100х/1.25Oil
Таким образом, острая гипоксия является мощным апоптогенным фактором для кардиомиоцитов
плода, поскольку это мощный триггер изменения
экспрессии многих генов. К этим тригеррам относятся активные метаболиты кислорода, концентрация внутриклеточного Са2+, нарушение формирования Са2+-каналов и Са2+ гомеостаза и т. д . [3].
В основе морфологических изменений при программируемой клеточной гибели лежат определенные молекулярно-биологические механизмы. Было
выявлено, что кардиомиоциты плода экспрессируют различные комбинации Bcl-2 и каспазы-3, но в
некоторых зонах миокарда имелись кардиомиоциты без указанных выше апоптотических маркеров.
Существует два основных пути реализации апоптоза: рецептор-опосредованный (рецепторный) и внутриклеточный (митохондриальный), которые имеют
точку пересечения. Авторы данной статьи считают,
что в миокарде значительный вклад даёт именно
внутриклеточный механизм запуска гибели клеток.
Ведущую роль при этом играют митохондриальные факторы, в частности, цитохром-С. Регуляция
апоптоза во II стадии (эффекторной) осуществляется преимущественно белками семейства Всl-2. Соотношение белков Всl-2 агонистов и антагонистов
апоптоза определяет способность клетки отвечать
на апоптотические сигналы [7].
В ходе реализации митохондриального пути запуска апоптоза происходит изменение баланса про-
и антиапоптозных белков Bcl-2 белков в сторону
проапоптозных, что приводит к высвобождению
факторов апоптоза из митохондрий и последующей
активации каспазвы-3, что было исследовано авторами [10].
Существуют, однако, и каспазо-независимые
пути реализации программы гибели клеток при нарушении целостности наружной митохондриальной
мембраны. Таким образом, механизмы апоптоза
кардиомиоцитов требуют дальнейшего изучения.
ВЫВОДЫ
1. Острая антенатальная гипоксия является индуктором апоптоза кардиомиоцитов.
2. Передача апоптогенного сигнала к кардиомиоцитам осуществляется через CD95 (APO-1/Fas)рецептор и эффекторные ферменты каспазного каскада при истощении защитной системы митохондриальных белков bcl-2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Жижина Г.П. Роль апоптоза в нормальном
онтогенезе, патогенезе и старении // Клинич. геронтология. 2002. - № 4. - С. 3—10.
2. Заднипряный И.В., Сатаева Т.П. Морфофункциональные изменения при перинатальной гипоксии и возможные пути их коррекции / И.В. Заднипряный, Т.П. Сатаева // Таврический медикобиологический вестник. – 2013. – Т.16, №1, Ч.2
(61). – С. 252-257.
57
2014, том 17, №2 (66)
ТА В Р И Ч Е С К И Й М Е Д И К О - Б И ОЛ О Г И Ч Е С К И Й В Е С Т Н И К
3.Залесский В.Н. Апоптический и аутофагический пути гибели клетки при гипертрофии и ремоделировании миокарда / В.Н. Залесский, JI.A. Стаднюк, Н.В. Великая // Журнал АМН Украины. - 2003.
- Т.9, № 4. - С.699-712.
4 Семенов В.Н. Апоптоз и его роль в патогенезе
критических состояний / В.Н. Семенов, И.Н. Пасечник // Вест.интенсивной терапии.-2004. -№1. -С.3-7.
5. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова
Н.А.: Практическая иммуногистоцитохимия Методиче-. ., 2002. .ские рекомендации СПб. - С 202.
6. GargS., NarulaJ., ChandrashekharY. Apoptosis and
heartfailure: clinical relevance and therapeutic target // J.
ofMolecular and Cellular Cardiology. —2005. —V. 38.
—P. 73-79.
7.Jддttelд M. Programmed cell death: many ways
for cells to die decently // Ann. Med. — 2002. — Vol.
34, No6. — P. 480-488.
8. Narula J, Kolodgie FD, Virmani R. Apoptosis
and car-diomyopathy // Curr Opin Cardiol. – 2000. №15. – Р.183–188.
9. Reeve JL, Duffy AM, O’Brien T, Samali A. Don’t
lose heart - therapeutic value of apoptosis prevention in
the treatment of cardiovascular disease // J Cell Mol
Med. – 2005. - №9. – Р.609–622.
10. Regula K.M., Kirshenbaum L.A. Apoptosis of
ventricular myocytes: a means to an end // J. of
Molecular and Cellular Cardiology. -2005.- V. 38.
- P.3—13.
11. Rodriguez M, Lucchesi BR, Schaper J.
Apoptosis in myocardial infarction // Ann Med. – 2002.
- №34. –Р.470–479.
12. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and
biochemical hallmarks of apoptosis // Cardiovasc Res.
— 2000. — Vol. 45, No3. — P. 528-537.
13.Takemura G, Fujiwara H. Role of apoptosis in
remodeling after myocardial infarction // Pharmacol
Ther. – 2004. – №104. – Р.1–16.
58