Выбор ферментов для гидролиза растительного сырья

СОЗДАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ
КОМПЛЕКСОВ Д
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ САХАРОВ
ИЗ НЕКРАХМАЛЬНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО
С
СЫРЬЯ
Аркадий П.Синицын
Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова
Институт биохимии им.А.Н.Баха
им А Н Баха РАН
Конгресс «Биомасса: топливо и энергия - 2011»
12-13
12
13 апреля 2011, Москва
Концепция биофабрики (CLIB2020)
Биохимический синтез как альтернатива
нефтехимическому синтезу
Бензин
Gasoline
Продукты
нефтехимичес-кого
синтеза Petrochemicals
Ethanol
Биотопливо
Ethanol
Продукты
р ду
биохимического
синтеза Biochemicals
US Energy Independence and Security Act of 2007
В США необходимо увеличить объем биотоплива 2-го
2 го поколения из
(геми)целлюлозы :
0,1
0
1 млрд галлонов (0,45
(0 45 млрд литров) в 2010 г.
г до 16 млрд галлонов
(72 млрд литров) в 2022 г.
Биомасса
-Кукурузные
стебли
-Пшеничная
солома
-Быстрорастущие
растения
Предобработка
(hemi-)cellulosic sugars
С6-С5 сахара
C5 and C6
Ферментативный гидролиз
Топливо и химикаты
Бутанол
Этанол
Ферментация
Основные цели:
 Получить
у
глюкозу
у и другие
ру
сахара,
р , биотопливо (этанол & бутанол) и другие
полезные продукты из возобновляемой
растительной биомассы и
лигноцеллюлозного сырья с помощью
принципов, методов и подходов биобио
катализа, т.е с помощью применения
ферментов и микроорганизмов
 Альтернатива – получение сахаров с
помощью кислотного гидролиза
Стратегия достижения цели
 Идентификация видов возобновляемого сырья,
характерных для определенных регионов, его
доступности и цены
р метода
д предварительной
р д р
обработки
р
 Выбор
растительного сырья
 Создание экономически оправданного
биотехнологического процесса конверсии
возобновляемого сырья в ферментируемые
сахара, био-топливо и другие полезные
продукты
 Достижение полной утилизации сырья,
получение широкого спектра продуктов с
высокой
й добавленной
б
й стоимостью, реализация
принципа биофабрики
Предварительная обработка приводит к разрушению
кристаллической структуры целлюлозы и/или
разрушению (удалению) лигнина
Выбор ферментов для гидролиза растительного сырья
Спиртовая
барда
Зерновая
шелуха
Кукурузные
стебли
Солома
Древесина
Предобработка
р д р
Стебли
тростника
(багасса)
Сельскохоз.
отходы
Выбор ферментов для гидролиза
EG
CBH
β-G
Ксиланазы
Дополнит.
ферменты
Высокий выход сбраживаемых сахаров (C5 и C6)
Механизм ферментативного гидролиза
целлюлозы
After Teeri 1997
ЦЕЛЛЮЛОЗА
Частично
деградированная
ЦЕЛЛЮЛОЗА
Эндоглюканазы
(EG)
ЦЕЛЛОБИОЗА
Целлобиогидролазы
(CBH)
ГЛЮКОЗА
ß-Глюкозидазы
(ß G)
(ß-G)
Механизм ферментативного гидролиза
ксилана
Ксиланаза
β-ксилозидаза
α-глюкуронидаза
Ara—
A
Ac—
A
Ara—
A
Ara—
A
Glc
cA—
Ac—
A
Ara—
A
Ac—
A
α-арабиназа
FerA—A
Ara—
ферулоил-эстераза
Ara—
A
FerA—A
F
Ara—
Glc
cA—
Ara—
A
Ara—
A
Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—Xyl—
ацетилксилан-эстераза
Трехмерные модели ферментов,
гидролизующих растительное сырья
Целлобиогидролаза 1
Целлобиогидролаза 2
Активный центр
Эндо-глюканаза 2
Ксиланаза
Направление развития компаний – производителей
ферментов для конверсии растительной биомассы
Компания
Продукт
Специфичность
• Novozymes
•Celluclast 1.5L
•Novozyme 188
•Cellic Htec
•Cellic Ctec 2
•Целлюлазы, 1-е поколение
•Целлобиаза
•Гемицеллюлазы
•Целлюлазы, 2-е поколение +
целлобиаза + ксиланаза
• Genecor / Danisco
(DuPont)
•Spezyme CP
•Accellerase 1500
•Accellerase Duet
•Целлюлазы, 1-е поколение
•Целлюлазы, 2-е поколение
•Целлюлазы, 2-е поколение +
целлобиаза + ксиланаза
• DSM, ABEnzymes
• Iogen
I
Corporation
C
ti
• Dyadic Inc.
Россия
• ПО «Сиббиофарм»
С бб ф
• МГУ, ИНБИ, ИБФМ
Переход от целлюлаз 1-го поколения к целлюлазам
2
2-го
поколения и комбинированным
б
ф
ферментным
препаратам
•Целловиридин
Ц
•Лабораторные
ферментные
препараты
ре ара
•Целлюлазы,
Ц
1
1-е поколение
•Целлюлазы, 2-е поколение
•Целлобиаза
•Целлюлазы 2
•Целлюлазы,
2-е
е поколение +
целлобиаза + ксиланаза
Способы получения высокоэффективных
ферментных комплексов
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Выбор штамма-продуцента для промышленного производства
П
Поиск
микроорганизмов и ферментов
ф
с уникальными свойствами
й
(активных при высоких или низких значениях рН и температуры)
Поиск (создание) ферментов с высокой удельной активностью
Поиск ((создание)) ферментов
ф р
с низкой адсорбционной
р
способностью на
лигнине
Поиск новых ферментов с уникальными свойствами (например,
ферментов-энхансеров)
Создание
д
ферментных
ф р
комплексов с качественным и количественным
составом, наиболее адаптированным к различным видам растительного
сырья
Молекулярный дизайн, использование методов генной и белковой
инженерии для увеличения удельной активности и стабильности
ферментов
Создание с помошью методов молекулярной генетики штаммовпродуцентов ферментных комплексов с заданными составом
Оптимизация
ц у
условий применения
р
ферментных
ф р
комплексов
Оптимизация условий производства ферментов
Цель: 5-10-кратное увеличение активности ферментного комплекса
5-кратное сокращение издержек производства
Штаммы продуценты ферментов для
гидролиза растительного сырья
•Novozymes
N
Trichoderma,
T
i h d
Aspergillus,
A
ill
Humicola, Chetomium spp., другие
•Genencor / Danisco (DuPont)
Trichoderma sp., другие
•DSM
Talaromyces sp.
•ABEnzymes
ABE
• Iogen Corporation
Ti h d
Trichoderma
sp.
•Dyadic
Dyadic Inc
Inc.
Crysosporium sp
sp.
Россия
• ПО «Сиббиофарм»
• МГУ, ИНБИ, ИБФМ
Trichoderma sp.
sp
Penicillium sp.
Процессы производства этанола из лигноцеллюлозного сырья
SSF - одновременное осахаривание и сбраживание
SHF - р
раздельный
д
гидролиз
др
и сбраживание
р
CBP - консолидированный биопроцесс гидролиза и сбраживания
Роль различия в удельной активности ферментных
комплексов (гидролиз пихты, обработанной паровым
взрывом целлюлазами разных продцентов))
10 FPU / 1 г субстрата, [S] = 5%, рН 5, 50оС
90.0
Penicillium
80.0
Convers
sion, %
70.0
60.0
TR2
UBC1
Пихта
UBC2
Trichoderma
50.0
40.0
TR1
30.0
20 0
20.0
10.0
0.0
0
20
40
Time (hrs)
60
80
Изменение состава ферментных
комплексов – от 1-го к 2-му поколению
Разные ферменты
1-е поколение
1.6
2-е поколение
1
0.9
1.4
0.8
1.2
0.7
0.6
A 2 80
A280
1
0.8
0.5
0.4
0.6
0.3
04
0.4
0.2
0.2
0.1
0
0
20
40
60
t, min
80
100
120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
V, ml
Белковый «фингерпринт» двух ферментных комплексов
90
Молекулярный дизайн, использование методов генной и
белковой инженерии для увеличения удельной активности
ферментов
Петля 1
Петля 2
Петля 3
Целлобиогидролаза I
Trichoderma sp.
х1.5-2 раза увеличение
осахаривающей
cпособности
фермента
Открытие новых ферментов
• Об
Обнаружены ф
ферменты – энхансеры
(enhansers, EgIV Trichoderma, GH61)
• Эти
Э ф
ферменты не обладают
б
ярко
выраженным гидролитическим
действием но способствую увеличению
действием,
эффективности действия
гидролитических ферментов (boosting
effect), х2
окислительно
• Энхансеры могут иметь окислительновосстановительную природу
Поиск ферментов не подверженных влиянию
лигнина Вероятный механизм воздействия лигнина
лигнина.
на ферменты
Адсорбция
ферментов
на лигнине
Лигнин
Физический
блокинг
целлюлозы
Д
Денатурация
ур
ферментов
Ингибирование
ферментов
Влияние условий процесса на эффективность ферментативного
гидролиза растительного сырья. Положительное влияние ПАВ
Глу
убина ги
идроли
иза, %
Сырье – делигнифицированные стебли кукурузы, 50 г/л,, 72 ч, рН 5, 50°С.
100
B221-151
+ F10
Фермент
1
80
Фермент
2
TW-307
+ F10
60
B221-151
+ F10
Фермент
1
++Неонол
ПАВ
40
Фермент
2+
TW-307
TW
307 + F10
Неонол
+ ПАВ
20
0
0
5
10
Белок, мг/г субстрата
15
Достигнутые результаты
(субъективное мнение)
• Цель: 5-10-кратное увеличение
ферментного
р
комплекса
активности ф
– 2-кратное увеличение
• 5
5-кратное
кратное сокращение издержек
производства
–?
Спасибо за внимание!
+7(495) 939-5966
apsinitsyn@gmail.com
www.enzyme.chem.msu.ru/cellulas/