МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
ЗВЯГИНА Анастасия Сергеевна
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ
СИСТЕМЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ
ВОЗДЕЙСТВИИ ГЕРБИЦИДОВ
Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель
доктор биологических наук,
профессор Цаценко Л. В.
Краснодар – 2015
1
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................. 4
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................... 10
1.1 Репродуктивная система и особенности развития мужского гаметофита озимой мягкой пшеницы ......................................................... 10
1.2 Пыльцевой анализ репродуктивной системы озимой мягкой
пшеницы ................................................................................................... 15
1.3 Действие гербицидов на функционирование мужского гаметофита озимой мягкой пшеницы и других культур ................................... 20
1.4 Биологическое тестирование в системе генетического мониторинга ......................................................................................................... 24
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ
ИССЛЕДОВАНИЙ ....................................................................................... 30
2.1 Почвенно-климатические условия проведения опытов ................... 30
2.2 Условия проведения исследований ................................................... 35
2.3 Характеристика материала исследования ......................................... 38
2.4 Методика пыльцевого анализа ......................................................... 40
2.5 Оценка фитотоксичности почвы в системе генетического мониторинга ...................................................................................................... 46
ГЛАВА 3 БИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВЫ НА ОСТАТОЧНОЕ КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕВСХОДОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ
С ПОМОЩЬЮ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ ..................................................... 52
3.1 Сила роста семян тест-культур ......................................................... 53
3.2 Всхожесть семян тест-культур ........................................................ 57
3.3 Определение длины осевых органов проростков тест-культур ..... 67
3.4 Фитоиндикация загрязнения почвы с помощью ряски малой
Lemna minor L. .......................................................................................... 73
ГЛАВА
4
СКРИНИНГ
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
ПЫЛЬЦЫ
И
СОСТОЯНИЕ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА У СЕЛЬСКОХОЗЯЙ2
СТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ........................................................................... 78
4.1 Анализ состояния пыльцы линий гербицидоустойчивого подсолнечника, обработанного послевсходовым гербицидом Евро- 79
Лайтнинг ...................................................................................................
4.2 Пыльцевой анализ у растений озимой мягкой пшеницы ................. 81
ГЛАВА 5 АНАЛИЗ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ОЗИМОЙ
МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ................................................................................. 86
5.1 Формирование элементов продуктивности озимой мягкой пшеницы с учетом действия послевсходовых гербицидов .......................... 86
5.2 Подходы к исследованию потомства озимой мягкой пшеницы
сорта Таня на действие послевсходовых гербицидов Пума Супер 75
и Секатор Турбо ....................................................................................... 91
ВЫВОДЫ ..................................................................................................... 97
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИКИ ........................................................ 100
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ...................................... 101
ПРИЛОЖЕНИЯ ............................................................................................ 121
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В последнее время становится актуальным
вопрос сохранения генетического потенциала продуктивности сельскохозяйственных растений. Усиление антропогенной нагрузки в аграрном секторе, в частности гербицидная нагрузка, может привести к дестабилизации
генофонда и необратимым последствиям его деградации, поэтому значимость цитогенетических исследований постоянно возрастает.
Существуют направления исследований, отображающиеся в публикациях, где применяются различные критерии оценки последствий гербицидной обработки на экосистему в целом. Краснодарский край относится к
тем регионам, которые уязвимы к антропогенным факторам, где сельскохозяйственные растения постоянно испытывают интенсивный груз деятельности человека.
Исходя из имеющейся информации изучение всестороннего комплекса воздействий на геном растений представляет практический интерес.
Репродуктивная система каждого вида растений индивидуальна и
включает характеристики репродуктивных органов, являющихся важнейшим элементом биологии растений. У мягкой пшеницы особенность заключается в том, что она является аллогексаплоидом, т. е. включает три
генома, которые расширяют норму реакции растений на негативные действия биотических и абиотических факторов среды. В нашей работе мы
рассматриваем действие гербицидов, как абиотического фактора, на репродуктивную систему через состояние мужского гаметофита.
Для
понимания данного процесса анализ изучения влияния по-
слевсходовых гербицидов на репродуктивную систему будет проводиться
на двух культурах: подсолнечнике и пшенице. Учитывая, что растения в
ценозе связаны в целом не только друг с другом, но и с почвой, не мало
важное значение имеет анализ почвенной среды.
4
Пшеница – наиболее распространенный хлебный злак на земном
шаре и является ведущей культурой Краснодарского края, которая занимает лидирующее положение в аграрном секторе. Имеющиеся работы по генетической оценки действия гербицидов на репродуктивную систему растений не дают полного представления о комплексном воздействии этого
поллютанта. В нашей работе была предпринята попытка комплексного
анализа факторов воздействия на растения и почвы в агроценозе на примере подсолнечника и озимой мягкой пшеницы. За основу был взят пыльцевой анализ, который характеризуется экспрессивностью и точностью.
Цели и задачи исследований. Цель наших исследований – изучение функционирования репродуктивной системы сельскохозяйственных
растений на примере подсолнечника и озимой мягкой пшеницы при воздействии послевсходовых гербицидов Пума Супер 75, Секатор Турбо и
Евро-Лайтнинг.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:
1. подобрать растительные тест-системы и определить критерии
оценки токсического воздействия послевсходовых гербицидов на анализируемые объекты;
2. провести биологическое тестирование почвы, направленное на
выявление остаточных количеств препарата в почве;
3. изучить закономерности роста и развития осевых органов проростков тест-культур при действии послевсходовых гербицидов;
4. провести цитологический анализ фертильности пыльцевых зерен
сельскохозяйственных растений с целью выявления устойчивости генотипов к послевсходовым гербицидам;
5. проанализировать зависимости действия послевсходовых гербицидов на репродуктивную систему пшеницы
по элементам структуры
урожая;
6. разработать методологию оценки
адаптивных и урожайных
свойств растений озимой мягкой пшеницы при воздействии послевсходо5
вых гербицидов, а также дать их экологическое обоснование для селекционной практики.
Научная новизна работы. Впервые проведена комплексная оценка
действия послевсходовых гербицидов Пума Супер 7 и Секатор Турбо в посевах озимой мягкой пшеницы сорта Таня и линий подсолнечника, устойчивого к гербициду Евро-Лайтнинг по состоянию репродуктивной системы
высших растений.
Установлены основные подходы к оценке токсичного загрязнения
почвы послевсходовыми гербицидами на основе биотестирования с использованием высших растений в разных биологических состояниях.
Впервые проведено биотестирование образцов почвы в лабораторных условиях в устройствах с постоянным поддержанием микроклимата.
Выявлены основные критерии селекционной оценки генотипов подсолнечника и озимой пшеницы, подвергшихся обработке послевсходовыми
гербицидами, с использованием пыльцевого анализа.
Впервые показаны информативные
характеристики пыльцевого
зерна при оценке действия послевсходовых гербицидов на репродуктивную систему подсолнечника и озимой мягкой пшеницы.
Установлены информативные и сопряженные с цитологическими
показатели продуктивности растений озимой мягкой пшеницы на основе
четырех критериев: длина колоса, число колосков, масса колоса, число зерен с колоса.
Впервые разработаны оценка действия послевсходовых гербицидов
на репродуктивную систему высших растений с использованием моделей
для биологических исследований.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
полученные в ходе исследований могут применяться при оценке репродуктивного потенциала озимой пшеницы в технологиях с применением послевсходовых гербицидов и могут использоваться при разработке программ
по созданию гербицидоустойчивых линий подсолнечника в системе чистого
6
поля. Оценка почвы на загрязнение послевсходовыми гербицидами позволит применять две тест-системы на основе высших растения для получения
полной картины действия токсикантов в агроценозе.
Разработанные в ходе работы биологические модели для биотестирования почвы и сушки индивидуальных растений имеют многофункциональное значение и широкий спектр применения.
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры
генетики, селекции и семеноводства ФГБУО ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» при чтении курсов: «Цитология», «Генетический мониторинг», «Биологическое тестирование почвы».
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Оценка фитотоксичности почвы после применения послевсходовых гербицидов проводится на основе двух тест-объектов относящихся к
высшим растениям, в двух состояниях: семена и взрослое растение.
2. Основным критерием селекционной оценки генотипов подсолнечника и озимой пшеницы, подвергшихся обработке послевсходовыми
гербицидами, являются фертильность и однородность пыльцы.
3. Цитологические показатели пыльцы растений сопряжены с показателями продуктивности растений озимой мягкой пшеницы, а именно:
длиной колоса, числом колосков, числом зерен, массой колоса, массой зерен, числом недоразвитых колосков, числом недоразвитых зерен, массой
1000 зерен.
4. Наследование негативного действия послевсходовых гербицидов
на репродуктивную систему озимой мягкой пшеницы и продуктивность
растения изучится в поколении.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях и конкурсах: Всероссийская
научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов
«Научное обеспечение агропромышленного
комплекса» (г. Краснодар,
2011, 2012, 2013); Международная научно-практическая конференция
7
«Наука и образование в XXI веке» (г. Москва, 2013), Международная
научно-практическая конференция «Вклад ВОГиС в решение проблем инновационного развития России (г. Краснодар, 2011), Научно-практическая
конференция преподавателей по итогам НИР за 2012 и 2013 год
(г. Краснодар, 2013, 2014), VI съезд Вавиловского общества генетиков и
селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы.
Экологическая генетика (г. Ростов-на-Дону, 2014).
По итогам конкурса для обучения в Международной летней школе
«Биотехнология в сельском хозяйстве (AgroBioTech)», г. Москва, 2012 автор награждена грантом». Является победителем Всероссийского конкурса
на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений МСХ РФ по направлению «биологические
науки», Орел, 2013. По итогам конкурса награждена дипломом победителя
и дипломом лауреата премии по поддержке талантливой молодежи, установленной Указом Президента Российской Федерации от 6 апреля 2006 г.
№ 325 «О мерах государственной поддержки талантливой молодежи».
В Государственном реестре изобретений Российской Федерации зарегистрировано четыре патента на полезную модель, получено три свидетельства о государственной регистрации базы данных.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в т. ч. 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 120 страницах
машинописного текста. Иллюстративный материал представлен в 30 таблицах и на 23 рисунках. Состоит из: введения, пяти глав с описанием современного состояния проблемы на основании источников литературы,
описанием исходного материала и методов, используемых при решении
поставленных задач, экспериментальных результатов и их обсуждения,
выводов, рекомендаций для селекционной практики. Список литературы
8
включает 174 источника, в том числе 19 на иностранном языке и 2 приложения.
Личный вклад автора. В соответствии с индивидуальным планом
научно-исследовательской работы автор провела полевые и лабораторных
исследования. В полевых условиях соискатель организовала закладку,
уход и уборку полевого опыта. Оценка образцов растений по изучаемым
признакам осуществлялась в лаборатории кафедры генетики, селекции и
семеноводства. Интерпретировала экспериментально полученные данные,
сделала выводы, предложения производству.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., профессору Л. В. Цаценко за постоянную помощь, внимание, поддержку, за ценные советы при обсуждении полученных результатов и содействие в выполнении данной работы, оказываемых на всех этапах выполнения диссертационной работы.
9
ГЛАВА 1
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Репродуктивная система и особенности развития мужского
гаметофита озимой мягкой пшеницы
Озимая пшеница представлена двумя видами: Triticum aestivum L. –
пшеница мягкая и Triticum durum Desf. – пшеница твердая, относящимися
к семейству Мятликовые (Роасеае) [Куперман Ф. М., 1983; Тюпаков Э. Ф.,
Бровкина Т. Я., 2008]. Пшеница это типичный самоопылитель, хотя возможно и перекрестное опыление. У большинства видов цветение закрытое.
Цветение – переломный момент в жизни растений, переход от вегетативного роста к генеративному развитию. Для образования цветков необходимо накопление в растении питательных веществ и фитогормонов, в
т. ч. регулирующих макро- и микроспорогенез [Поддубная-Арнольди В. А., 1964; Батыгина Т. Б., 1974; Бажина Е. В. и др., 2007].
Начало цветения особей данного вида зависит от условий. Прямой
солнечный свет, сухость, накопление сахаров стимулирует цветение, затенение, избыток азота – тормозит [Куприянова Л. А., Алешина Л. А., 1972].
Цветение на одном колосе протекает не одновременно. Обычно оно
начинается с цветков, находящихся несколько ниже средины колоса, и
идет поочередно к вышерасположенным и к нижерасположенным колоскам колоса, верхние и нижние колоски отцветают последними [Батыгина
Т. Б, 1962; Морозова З. А., 1983].
Продуктивность цветков зависит от срока их цветения. Как правило,
наиболее крупное зерно формируется в цветках первых сроков цветения
[Albooghobaish N., Zarinkamar F., 2011].
Соцветие – сложный колос, который состоит из стержня колоса и
колосков. Стержень колоса коленчатый, состоит из члеников, в местах их
сочленения образуются выступы, на которых располагаются колоски. Ко10
лосок состоит из двух колосковых чешуи, в которых располагаются цветки. Количество цветков в колоске 2 – 5, количество зерен – 2 – 3 [Батыгина
Т. Б, 1974; Голубинский И. Н., 1974].
Колосок состоит из двух цветковых чешуи – наружной (нижней) и
внутренней (верхней), более мягкой, чем колосковые. У остистых сортов
наружная цветковая чешуя несет ость. Колосковая чешуя имеет киль, колосковый (килевой) зубец и плечо. Между цветковыми чешуями находится
пестик с верхней завязью и двухлопастным перистым рыльцем, три тычинки и две бесцветные пленочки (лодикуле), способствующие при набухании
раскрытию цветка. Длина колосьев – 7 – 13 см, количество колосков в колосе – 12–24 [Куперман Ф. М., 1983; Челак В. Р., 1991].
Пыльца развивается в пыльниках тычинок. Пыльцевое зерно – это
специализированная структура, которая включает спермии, или мужские
гаметы цветковых растений. Слово «пыльца» (pollen) введено шведским
ученым – ботаником Линнеем в 1760 г., которое означает сухость и сыпучесть. Пыльцевое зерно состоит из двух или трех клеток, объединенных в
одно целое [Нокс Р. Б., 1985; Куприянова Л. А., Алешина Л. А., 1972].
Совокупность мужских генеративных органов в цветке называется
андроцеем. Формирование микроспор – микроспорогенез – происходит в
пыльниках тычинок – микроспорангиях. Образовавшиеся микроспоры затем проходят следующий цикл развития – гаметогенез, в результате которого в цветке формируется мужской гаметофит – пыльца [ПоддубнаяАрнольди В. А., 1964; Цаценко Л. В. и др, 2012].
Количество пыльцы в пыльнике различных культур варьирует от
нескольких десятков до нескольких миллионов, например у кукурузы
1,5 млн. шт., а количество пыльцы у пшеницы составляет – 3000 – 5000 шт.
[Тер-Аванесян Д. В., 1949; Геодакян В. А., 1978; Chang M. X., Neuffer M.
G., 1989; Очнев А. С., 2006; Рудая Н. А., 2010].
Развитие пыльцевых зерен в пыльнике, начинается с момента заложения бугорков тычинок в конусе нарастания цветочной почки, которые
11
дают начало двум образованиям. Из нижней части его развивается тычиночная нить, из верхней – пыльник [Бессонова В. П., 1992; Билич Г. и
др.,1999; Батыгина Т. Б. и др., 2010].
Тычиночная нить развивается из меристемы и состоит из эпидермиса и тонкостенной рыхлой паренхимы, в середине ее проходит сосудистый
пучок из кольчатых и спиральных сосудов ксилемы [Ali M. A. et al, 1998;
Adachi Y. et al, 2009]. Элементы флоэмы слабо выражены или отсутствуют.
Нити тычинок могут срастаться основаниями, или по всей длине нити, образуя тычиночную колонку, как у тыквенных и мальвовых. У некоторых
семейств срастаются не нити, а сами пыльники, образуя при этом пыльниковую трубку, а тычиночные нити остаются свободными (сложноцветные).
Тычиночная нить делится на короткую (сидячие пыльники) и длинную,
которая эластичная как, например, у ветроопыляемых злаков,
иногда
встречаются случаи, когда нити отсутствуют или совсем не развиваются
[Эрдтман Г., 1956; Куприянов П. Г., 1989; Батыгина Т. Б., 1994].
Размер пыльцевых зерен очень сильно варьирует, но у большинства
растений не превышает 50 мкм. [Голубинский И. Н., 1974; Ибрагимова Э. Э., 2009]. Известно, что у некоторых культур размер пыльцевого зерна строго индивидуален в зависимости от генотипа. Диаметр пыльцевых
зерен у томата культурного (Lycopersicon esculentum Mill.) варьирует от
21,3 до 23,9 мкм [Жученко А. А., 1973], а пшеницы 25,1 – 73,1 мкм в длину, 23,2 – 64,2 мкм в ширину [Тер-Аванесян Д. В., 1949; Курманов Р.Г.,
Морозова З. А., 2009].
В цитологических исследованиях установлено, что форма пыльцевого зерна у пшеницы бывает экваториально-1-поровой, яйцевидной, широкояйцевидной, эллипсоидальной и шаровидной, а в очертании овальные,
широкоовальные, эллиптические и округлые [Кашин А. С., 1999; Дубровский М. Л. и др., 2011].
Каждое зерно покрыто сложно устроенной оболочкой – спородермой, состоящей из двух слоев – внутреннего (интины) и наружного (экзи12
ны). Экзина содержит уникальный биополимер – спорополленин. Благодаря его невероятной химической устойчивости пыльца не разрушается даже
при кипячении в растворах концентрированных кислот и щелочей
[Геодакян В. А., 1978; Круглова А. Е., 2011].
Температура для прорастания пыльцы пшеницы варьирует от 4 до
20 °С, наиболее оптимальные 20 – 25°С при влажности 80 – 90 %, , тогда
как при жаркой и сухой погоде пыльца пересыхает и теряет свою жизнеспособность [Голубинский И. Н., 1974; Батыгина Т. Б., 1974; Гилберт С.,
1994].
По данным ряда авторов, установлено, что в состав пыльцы входят
углеводы (34%), каратиноиды, их доля составляет от 0,7 до 0,212 мг на 100
гр. сухой пыльцы. В ней так же содержатся витамины, минералы, в общей
сложности находятся 28 элементов, и являются стимуляторами физиологических процессов в любом живом организме [Куприянова Л. А., Алешина
Л. А., 1972; Круглова А. Е., 2009; Цаценко Л. В., 2012].
У пыльцевого зерна имеются на спородерме апертуры, которые
имеют различную форму и структуру. Различают: поры, борозды, бородки,
щели или просто утонченные, нечетко очерченные участки экзины. Апертуры бывают простые и сложные. Наличие различных апертур позволяет
идентифицировать пыльцевые зерна при проведении пыльцевого анализа
[Сладков А.Н., 1967; Батыгина Т. Б., Круглова H.H., 2009].
Основная функция мужского гаметофита (пыльцевого зерна) состоит в доставке мужских гамет (спермиев) к зародышевому мешку, где и
осуществляется двойное оплодотворение [Круглова Н. Н., 2001; Левина Р. И.,1981].
Последовательность событий, происходящих после опыления и
приводящих к успешному оплодотворению, включает в себя попадание
жизнеспособного пыльцевого зерна на поверхность рыльца, его гидратацию и прорастание, проникновение пыльцевой трубки в ткани рыльца,
рост пыльцевой трубки в проводниковых тканях столбика, проникновение
13
пыльцевой трубки в зародышевый мешок, и в заключение, слияние гамет в
процессе двойного оплодотворения [Куприянов П.Г., 1989;Батыгина Т. Б.,
1994; Lord Е. М., 2003].
Установить реакции растений на действие различных факторов
окружающей среды позволяет определить критические периоды на определенных этапах онтогенеза. Следует заметить, что любые факторы среды
в наибольшей степени влияют на развитие генеративных органов (пестик,
тычинка), и при неблагоприятных условиях данный процесс нарушается,
что может привести к снижению продуктивности растений и отразиться на
урожае [Батыгина Т. Б., 1987].
Снижение урожая зерна, связано с развитием аномальных пыльцевых зерен, зависит и от длительности действия неблагоприятных факторов,
а именно высокие температуры, засуха, влажность воздуха, раз-личные
факторы антропогенного происхождения, а так же болезни [Бали-на Н. В.,
1976; Бессонова В. П. и др., 1997; Антохина С. П. и др., 2011; Бажина Е.
В., Аминев П. И., 2012; Черепанова О. Е., Мищихина Ю. Д., 2012].
В фазе кущения пшеницы при продолжительной засухе происходит
уменьшение числа продуктивных побегов растений, некроз закладывающихся колосков в колосе, а в фазе трубкования нарушается процесс образования ткани формирующихся цветков и генеративных клеток, что может
привести к снижению массы зерна [Балина Н. В., 1976].
По данным Батыгиной Т. Б. (1974) установлено, что критическим
фактором формирования урожая хлебных злаков является недостаток влаги. Снижение урожая зерна при засухе связано с увеличением количества
стерильной пыльцы, что является результатом нарушения редукционного
деления [Батыгина Т. Б., 1974].
Влажность воздуха также определяет урожай зерна. Наиболее опасна воздушная засуха в период формирования цветка и его элементов, т. к.
снижается фертильность пыльцы, что приводит к бесплодию цветков и
череззернице [Альтергот В. Ф. и др., 1998].
14
В образовании урожая хлебных злаков и повышении устойчивости
растений к неблагоприятным факторам среды большую роль играют микроэлементы. Злаковые культуры остро реагируют на потребность в минеральном питании, так у пшеницы, недостаток азота в фазе кущения и формирования колоса приводит к снижению числа колосков, что в дальнейшем снижает урожай. В период формирования колоса растениям необходимо достаточное количество фосфора [Спиридонов Ю. Я., 1996, 2003].
Известно, что при «медном» голодании растения пшеницы не
наблюдается формирование соцветий. Крайне важным элементом питания
для пшеницы является бор, т. к. он необходим для формирования генеративных органов и осуществления оплодотворения. Его дефицит приводит к
аномальному органогенезу, нарушению процесса образования колосьев, их
выхода из трубки [Куперман Ф. М., 1972, 1983].
1.2 Пыльцевой анализ репродуктивной системы
озимой мягкой пшеницы
Пыльцевой анализ это метод исследования, позволяющий определять репродуктивный потенциал растений по характерным морфологическим особенностям пыльцевых зѐрен: размеру, рисунку экзины пыльцевого
зерна, его фертильности и жизнеспособности. Все эти характеристики
очень важны при проведении селекционных работ с целью получения продуктивного потомства. Пыльцевые зерна являются частью растения, поэтому изменение их базовых характеристик могут сказаться на фертильности и репродуктивной способности растения [Левина Р. Е.,1981; Круглова Н. Н., 2001; Батыгина Т. Б., Васильева В. Е., 2002].
Цитологические методы исследования на спорофитах включают несколько методов: изучение прохождения фаз митоза в меристемах побегов
и корешков растений, а так же мейоза в цветковых почках растений. К цитогенетическим тестам на гаметофитах относят тесты на микроядра в тет15
радах микроспор, а также прохождение митоза в пыльцевых зернах и
пыльцевых трубках [Бажина Е. В. и др., 2007; Брейгина М. А. и др., 2009].
В цитологических исследованиях часто используются полигенные
признаки: фертильность и стерильность, проращиваемость пыльцы [Батыгина Т. Б., Васильева В. Е., 2002; Цаценко Л. В. и др., 2012].
Пыльцевой тест хорошо зарекомендовал себя в генетическом мониторинге агроценоза [Кулинкович Е. Н. и др., 2007]. При использовании
пыльцы растений в качестве тест-системы при мониторинге, скрининге и
для выявления токсического действия мутагенов необходимо учитывать
такие ее генетические характеристики как: вид, форма, стерильность и
жизнеспособность, содержание белков и крахмала, повреждение пыльцевой оболочки, израстание пыльцевых зерен [Биологический контроль
окружающей среды, 2010].
Преимущества пыльцевого теста:
1. технически прост в использовании;
2. не дорог в использовании;
3. позволяет получить результат за короткий промежуток времени.
Из исследований некоторых ученых установлено, что на различные
морфологические характеристики (поверхность пыльцевого зерна, диаметр, размер) влияет множество факторов биотического, абиотического, а
так же антропогенного происхождения. Аномальные пыльцевые зерна могут влиять на фертильность, тем самым снижая репродуктивный потенциал
культурных растений [Голубинский И. Н., 1974; Бессонова В. П., 1991,
1992, 1997].
Пыльцевой анализ используется как метод определения плоидности
растений, где по наличию фертильных и жизнеспособных пыльцевых зерен
можно судить об успешности селекционных работ при отдаленной гибридизации. Для высокого получения стабильного урожая зерновых культур
необходимо достаточное количество качественных семян растений с высокой всхожестью. Получение качественных семян растений, в частности,
16
зависит от качества пыльцевых зерен, которое определяется нормальным
морфогенезом пыльника [Цаценко Л. В. и др., 2012].
Пыльцевой анализ успешно может быть использован для оценки
цитогистологического статуса зрелых пыльников растений, что было продемонстрировано на остролодочнике сходном (Oxytropisambigua (Pall.)),
представителе семейства бобовых [Круглова А. Е., 2009, 2010, 2011].
В результаты исследования были включены следующие показатели: анализ количества качественных пыльцевых зерен (фертильных, без
аномалий) и аномальных пыльцевые зерна в зрелых пыльниках.
При оценке статуса адаптивности генотипа к условиям среды качество пыльцевых зерен является одним из важных показателей его репродуктивной биологии, во многом определяющим способность размножающихся растений к образованию полноценных, качественных семян. Для
воспроизводства
популяций необходимо сохранение нормального про-
хождения микро- и магрогаметогенеза.
Многие авторы активно обсуждают проблему образования различного рода аномалий пыльцевых зерен [Устинова Е. И., 1965; Куприянова
Л. А., Алешина Л. А., 1972; Хохлов С. С. и др., 1978; Веселова Т. Д. и др.,
1996; Гудкова Т. И., 2000]. Качество пыльцевых зерен является одним из
важнейших факторов репродуктивной биологии, которое во многом определяется способностью размножающихся растений к образованию полноценных качественных семян.
Микроспоро- и микрогаметогенез оценивают как функциональноадаптивные процессы, в числе прочих факторов обеспечивающих надежность воспроизводства популяций растений. Качество пыльцевых зерен
связано с понятием «реальная семенная продуктивность» – важнейшим показателем оценки механизмов семенного размножения [Злобин
Ю. А.,
2000].
По мнению Кругловой А. Е. (2011), понятие «дегенерация» расценивается как остановка в развитии и последующем нарушении процесса
17
развития пыльцевого зерна, так у остролодочника сходного это отразится
на спорогенных клетках, микроспорах с невакуолизированной, слабовакуолизированной и сильновакуолизированной фазами, микроспороцитах).
Итогом процесса дегенерации пыльцевого зерна следует считать
стерильность. К стерильной пыльце в зрелых пыльниках остролодочника
сходного следует отнести не только все аномальные пыльцевые зерна, но и
нежизнеспособные пыльцевые зерна нормальной морфологии, не прорастающие на оптимизированной питательной среде. Тем самым понятие
«стерильность» шире понятия «аномальность» [Круглова А. Е., 2010].
Помимо понятия «аномальность пыльцы» следует различать понятие «дефектность пыльцы», к ним относятся те зрелые пыльцевые зерна,
которые отличаются от нормальных слабым окрашиванием ацетокармином
или йодным раствором, формой, величиной.
По мнению Куприянова П. Г. (1975), необходимо понимать, что в
зрелом пыльнике, у растений с высокой репродуктивной способностью,
помимо фертильной (нормальной) пыльцы имеется некоторое количество
аномальных (абортивных, стерильных) пыльцевых зерен.
Нарушение развития пыльцевых зерен это защитная реакция растительного организма на воздействие негативных (неблагоприятных) внешних факторов, которое отраажается в критические периоды развития пыльника в цветке.
Известно, что на качество пыльцевых зерен могут оказывать влияние различные факторы: способ размножения, цитоплазматическая стерильность,
внутривидовая
гибридизация,
антропогенное
загрязнение
окружающей среды, ядерная мужская стерильность [Мейер-Меликян Н. Р.
и др.,1999].
Жизнеспособность пыльцевых зерен тесно связана с таким понятием репродуктивной биологии как «достаточность опыления». Жизнеспособность пыльцы – под этим термином понимают способность фертильной
пыльцы прорастать на рыльце пестика при наличии благоприятных усло18
вий опыления [Ибрагимова Э. Э., 2009].
Жизнеспособная (т. е. живая) пыльца физиологически очень активна. Разработано много методов определения жизнеспособности пыльцы,
однако универсального метода, пригодного для всех растений нет. Из всех
методов исследования жизнеспособности пыльцы в селекционных работах
основное значение имеет метод проращивания пыльцы в искусственной
питательной среде и наблюдение за прорастанием пыльцы непосредственно на рыльце пестика, а также методы окрашивания, рекомендуемые для
свежесобранной пыльцы [Крюков В. И., 1999; Дьяченко Г. И., 2003].
Фертильность пыльцы – это способность производить оплодотворение. Определяется по степени сформированности (зрелости) пыльцевого
зерна на основе нескольких методов [Биологический энциклопедический
словарь, 1986].
Фертильность пыльцевых зерен определяют их окрашиванием красителями, например, ядерными – ацетокармином или ацетоорсеином [Макогон И. В., 2007]. У фертильных пыльцевых зерен зернистая цитоплазма и
спермии окрашиваются в ярко карминово-красный цвет. Стерильные
пыльцевые зерна, в свою очередь почти не окрашиваются ацетокармином
или окрашиваются неравномерно. Спермиев в таких пыльцевых зернах
нет, а содержимое пыльцы выходит за пределы пыльцевого зерна [Паушева З. П., 1988; Пухальский В. А. и др., 2007].
Стерильность пыльцевых зерен – неспособность зрелой пыльцы к
оплодосворению. Летальность пыльцевых зерен может быть вызвана как
генами ядра, генами цитоплазмы или взаимодействием генов ядра и генов
цитоплазмы [Биологический энциклопедический словарь, 1986].
Стерильность пыльцы у растений может быть вызвана воздействием
условий внешней среды, внеядерными наследственными детерминантами
(цитоплазматическая стерильность пыльцы), генетическими дефектами
развития. Нежизнеспособной оказывается пыльца у растений с нечетной
полиплоидией в связи с невозможностью правильного расхождения хро19
мосом в мейозе [Веселова Т. Д. и др.,1996; Брейгина М. А. и др., 2009].
Встречаются случаи частичной стерильности пыльцы у растений, обозначаемой терминами полустерильность или полуфертильность [Ибрагимова Э. Э., 2009].
1.3 Действие гербицидов на функционирование мужского
гаметофита озимой мягкой пшеницы и других культур
Семенная продуктивность, как составляющая репродуктивного процесса, является одним из важных показателей жизнеспособности вида в
конкретных условиях [Вайнагий И. В., 1974].
Реальная семенная продуктивность может снижаться под действие
различных внешних факторов – температуры почвы и воздуха, влажности,
длины светового дня и интенсивности освещения, условий погоды конкретного сезона, приходящие на такие фенофазы, как цветение и созревание плодов [Левина Р. Е, 1981; Злобин Ю. А. , 2000]. Важную роль в плодообразовании играют факторы, связанные с особенностями строения и
развития репродуктивных органов, а именно дефектная пыльца, аномальные изменения зародышевого мешка, небольшое количество пыльцевых
зерен в гнездах пыльника и др.), которые определяются генотипом [Барская Е. И., Балина Н. В.,1977; Бажина Е. В., Квитко О. В., 2007].
При неблагоприятных условиях окружающей среды нарушается
процесс развития генеративных органов растения. Антропогенное загрязнение среды заметно снижает фертильность пыльцы, вызывает расширение
спектра аномалий мужского гаметофита у цветковых и влияет на морфологические особенности пыльцевого зерна, размер, плоидность, химический
состав и функционирование мужского гаметофита [Бессонова В. П. и др.,
1997; Солнцева М. П., Глазунова К. П., 2010]. Исследования реакции растений на действие каких-либо факторов позволяют выявить наиболее чувствительные фенофазы и критические стадии в развитии репродуктивных
20
структур [Челак В. Р., 1991].
В современном мире на окружающую среду все больше приходится
антропогенное воздействие. Одним из таких вмешательств является химическое загрязнение экосистемы, веществами абиотического происхождения, к числу которых относятся пестициды, широко применяемые при
выращивании сельскохозяйственной продукции [Мосунов С. А., 2008; Звягина А. С., 2014].
Сорняки могут нанести непоправимый вред культурным растениям
и снизить урожайность на 50 – 70%. Они используют из корнеобитаемого
слоя почвы огромное количество воды, макро- и микроэлементов [Лысов А. К., 2010].
Так как чувствительность мужского гаметофита растений зависит от
внешних факторов и реагирует на их изменение, то пыльцевой тест стали
широко применять при цитогенетическом мониторинге агроценоза. Этот
метод позволяет проводить учет абберантной пыльцы и за короткий промежуток времени получить первичную информацию о степени генетической стабильности вида и экосистемы в целом [Круглова А. Е., 2009,2011;
Ибрагимова Э. Э., 2010].
Механизм действия
гербицидов заключается в
многостороннем
влиянии на рост и развитие целого растения и его органов, клеток и тканей, на физиологические процессы, ферментативные реакции, белковые и
клеточные структуры, а так же различные органеллы клеток
[Антохи-
на С. П. и др., 2011; Лукомец В. М. и др., 2012]. Комплексная оценка ценоза позволяет уловить механизм действия гербицидов на растения и
почву. Действие гербицидов, в первую очередь, определяется его взаимодействием с чувствительными органами растений на молекулярном и клеточном уровнях [Захаренко В. А., 2000; Ларина Г. Е. и др., 2001; Солнцева
М. П., Глазунова К. П., 2010].
Механизм действия гербицидов связан с поведением и характером
21
вещества-токсиканта в растении, а так же с поглощением, а затем перемещением его по тканям. Влияние гербицидов заключается в нарушении
процессов образования органических соединений в ходе фотосинтеза, процессов генерирования энергетических и химических связей при дыхании и
окислительном фосфорилировании. Происходит замедление синтеза белков, нуклеиновых кислот, клетчатки и крахмала, алкалоидов, пектина, кумаринов, антоциана, фитогормонов, танинов, распад и образования низкомолекулярных органических соединений, необходимых для нового синтеза
[Федке К, 1985; Филипчук О. Д. и др., 2010; Проскурина А. А., 2011].
Устойчивость растений к гербицидам определяется совокупностью
морфологических, физиологических и биохимических факторов, от которых зависит соотношение количеств попавшего на растение, поглощенного
и разрушенного токсиканта. Если скорость детоксикации гербицида равна
скорости его поступления в места действия, растение проявляет устойчивость [Яблонская Е. К., Плотников В. К., 2006].
Работы по установлению влияния загрязнителей, в том числе и гербицидов проводились на многих культурах: кукурузе, подсолнечнике,
хлопчатнике, ячмене, томате.
По результатам исследований многих авторов было установлено,
что поллютанты, в том числе и гербициды, оказывают негативное влияние
на процессы микроспорогенеза, затрагивают различные стадии митоза и
мейоза, что в дальнейшем может привести к нарушению формирования
пыльцевых зерен при этом они теряют фертильность и жизнеспособность
[Тер-Аванесян Д. В., 1949, 1969; Венгорек В.,1992; Веселова Т. Д. и
др.,1996; Ниловская Н. Т. и др., 1999; Цаценко Л. В., Синельникова А. С., 2011, 2012].
В работе Очнева А.С. (2006) было показано, что кукуруза является
высокоустойчивой к труднорастворимым симтриазинам. Это объясняется
наличием в клеточном соке кукурузы специальных ферментов, способных
инактивировать глюкозиды и бензоксазины, которые разрушают гербицид
22
химически. Клеточный сок кукурузы, содержащий большой процент фермента пероксидазы, почти полностью разлагает симазин. Применение ацетала, примэкстры, харнеса, трофи, дуал и других
почвенных гербицидов
в рекомендованной дозе и даже в двойной дозе не влияет на микроспорогенез. Однако влияние послевсходовых гербицидов, таких как титус, магрои базис, которые на сегодняшний день наиболее часто используются по
всходам кукурузы, особенно на участках гибридизации, практически недостаточно изучены в плане пыльцеообразующей способности кукурузы,
полноте опыления женских соцветий пыльцой метелки растений, обработанных гербицидами [Очнев А. С., 2006].
Для подсолнечника, культуры с перекрестным типом опыления, качество пыльцы особенно актуально в биологии цветения. Появление стерильных пыльцевых зерен может приводить к снижению завязываемости
семян в корзинке [Whelan E. D. P., 1978]. При проведении пыльцевого
анализа важным является установление зависимости между генотипом исследуемых линий подсолнечника и их устойчивость к токсикантам. В
собственных исследованиях на определение влияния гербицидов на репродуктивную систему подсолнечника было установлено, что значительного
снижения фертильности у обработанных гербицидом Евро-Лайтнинг линий подсолнечника не происходило [Синельникова А. С. Цаценко Л. В.,
2011; Лукомец В. М. и др., 2012]. Для культуры подсолнечник фертильность пыльцы в норме достигает 90–100% [Воронова O. H., 2008]. Во всех
случаях с применением гербицидов фертильность пыльцы была в пределах
нормы.
В работе по выявлению влияния гербицидов на репродуктивную систему подсолнечника был проведен анализа изменения доли основного типа пыльцевых зерен в зависимости от обработки гербицидом.
У растений подсолнечника важным качеством пыльцы является ее
фертильность и однородность [Fairchild J. F. et al, 1997]. Было выявлено,
что пыльца всех изученных линий гербицидоустойчивого подсолнечника
23
характеризовалась неоднородностью, т.е. выделялись крупные и мелкие
пыльцевых зерна и слипшиеся, что является основной характеристикой
пыльцевой продуктивности изученных растений.
По результатам исследований Козловой Е.В. (2011) установлено,
что влияние гербицидов Грассер и Овсюген Экспресс на фертильность
пыльцы яровой пшеницы привело к увеличению доли аномальных пыльцевых зерен в 1,2 и 1,9 раза по сравнению с контрольным вариантом, а так же
возрастала частота нарушений формирования оболочек пыльцевого зерна,
более чем в 2 раза по сравнению с контролем. При анализе выделяли следующие признаки: пыльцевые зерна без вегетативного ядра, пустые, дегенеративные, с одним спермием, с отставанием цитоплазмы, с отсутствием
спермиев, с несколькими признаками.
При определении фертильности пыльцы пшеницы, после обработки
другими гербицидами было отмечено увеличение доли аномальных пыльцевых зерен на 14,0% и 20,5% по сравнению с контрольным вариантом на
вариантах, обработанных гербицидами Фенизан и Секатор. В свою очередь, в варианте с применением Триатлона фертильность была в 2 раза
ниже контроля, что выразилось в общем снижении доли аномальных
пыльцевых зерен в основном за счет уменьшения частоты дефектов оболочки [Козловой Е. В., 2012].
1.4 Биологическое тестирование в системе
генетического мониторинга
Генетический мониторинг – это научное направление, в рамках которого разрабатывается методология оценки поступления, накопления и
процесс влияния в окружающей среде генотоксических веществ, изучение
спектра мутационного воздействия, а так же способность вызывать тот или
иной вид генетических нарушений. Генотоксиканты – это вещества и агенты, способные индуцировать мутации в клетках организмов (половых и
24
соматических), что является причиной наследуемых изменений в первом
случае и бластомогенеза – во втором [Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг, 2010].
Оценка фитотоксичности почвы является одним из методов генетического мониторинга растительных систем, т. к. позволяет выявить зависимости между загрязнением почвы поллютантами и влиянием их на репродуктивную систему высших растений [Куриленко В. В. и др., 2004].
Наиболее перспективными исследованиями фитотоксичности почвы, а также тестированием загрязнения воды пестицидами является биотестирование. Биотестирование – процедура установления токсичности среды с помощью тест-объектов, показывающих присутствие отравляющих
веществ по изменению жизненно важных функций у тест-объектов. Биологические тест – системы показывают общий индекс токсичности образца и
позволяют в короткие сроки определить присутствуют или нет в среде
токсические агенты в опасной для живого организма концентрации
[Цаценко Л. В., 2001].
При исследованиях фитотоксичности почвы или ингибирующего
действия химического препарата на рост и развитие растений необходимо
точно подбирать тестирующую систему, т. к. каждый биологический объект имеет индивидуальный отклик на токсические агенты. Тест на проростках достаточно прост и имеет быстрый отклик, что сокращает время
на проведение исследований, анализ ведется по количеству проросших и
не проросших семян. Однако есть недостаток данного теста для биотестирования и он заключается в том, что на первых этапах онтогенеза семенных культур развитие организма происходит за счет белков эндосперма,
поэтому уловить токсичный эффект анализируемых гербицидов не всегда
удаѐтся [Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг, 2010].
В настоящее время растительные тест-системы хорошо обоснованы
25
и широко используются для оценки качества окружающей среды. Растения
доминируют в любом ландшафте, воздействие на них может изменить
структуру и функции экосистемы, что ведет к снижению первичной продуктивности, увеличению поверхностного стока и эрозии почв, деградации
среды обитания. Ответная реакция растений на воздействие оценивается на
разных уровнях биологической организации от ДНК и хромосом до организма и популяции [Веселова Т. Д. и др., 1996; Ибрагимова Э. Э., 2010].
Эффекты загрязнения сначала проявляются на молекулярном
уровне, что делает анализ ответных реакций клетки быстрым и удобным
инструментом для ранней диагностики воздействия [Бажина Е. В., 2007;
Воронова О. Н., 2008].
Для растений характерны высокие темпы развития, быстрая смена
фаз онтогенеза. Они производят большое количество потомков, что открывает широкие возможности для исследования наследственных эффектов.
Генетическая идентичность используемых в целях биоиндикации
растений может быть достигнута путем вегетативного размножения. Методики работы с большинством растительных тест-систем детально отработаны и носят стандартизованный характер. Не требуют высокой квалификации персонала, а сам тест относительно недорогой и позволяет использование большинства растительных тест-систем [Цаценко Л. В., Малюга Н. Г., 2000].
Поведение поллютантов в почве достаточно хорошо изучены, однако, последствия влияния комплексного воздействия пестицидов на био- и
агроценозы, фитопопуляцию в допустимых концентрациях исследованы
недостаточно.
Остатки агрохимикатов в почве и растениях вступают в сложные
взаимодействия различного характера, включая антагонизм, синергизм,
аддитивность [Биологический контроль окружающей среды: Биоиндикация
и биотестирование, 2007].
Для получения полной картины загрязнения агроценоза необходи26
мо проводить исследования в двух и более направлениях. Должны совершенствоваться методы инструментального химического анализа с применением ряда биоиндикаторов, относящихся к разным таксономическим
группам.
Применение организмов, реагирующих на загрязнение среды обитания изменением визуальных признаков, имеет ряд преимуществ. Оно
позволяет существенно сократить или даже исключить применение дорогостоящих и трудоемких физико-химических методов анализа. Биоиндикаторы интегрируют биологически значимые эффекты загрязнения, которые
позволяют определять скорость происходящих изменений, пути и места
скопления в экосистемах различных токсикантов, делать выводы о степени
опасности для человечества и окружающей среды конкретных веществ или
их сочетаний [Barker E. А., Виkоvас М. J., 1971; Augustine J. J. et al, 1973;
Дзюба О. Ф., 2006].
Специальные биотесты для определения загрязнения среды остатками пестицидов, солями тяжелых металлов, микотоксинами и другими
агентами сводятся к оценке степени изменения показателей биоты (морфометрических, физиологических и биохимических). Нарушения развития
тест-растений, как биоиндикаторов, отражаются в изменении всхожести и
энергии прорастания семян, размеров корней и ростков проростков, а так
же в пoврeждeнии растeний под воздействием поллютантов.
В нашей стране для оценки фитотоксичности почвы используется
значительное количество методов, проводимых с использование различных культурах: озимой и яровой пшенице (Triticum aestivum L.), гречихе
(Fagopyrum L.), белой горчице (Sinapis alba L.), кресс-салате (Lepidium
sativum L.), овсе (Avena L.), сое (Glycine L.), льне (Linum L.), еже сборной
(Dactylis glomerata L.), огурце (Cucumis L.), редисе (Raphanus sativus L.).
На горчице, как тест-культуре, оценивают степень ингибирования
первичного корешка проростка при обработки семян противодвудольным
гербицидом по показателям торможения прироста листьев надземной мас27
сы проростков и увядание растений [Лисовицкая O. B. И др., 2010].
Овес, ежу сборную и рис используют как индикаторы почвенных
противозлаковых гербицидов, они являются наиболее чувствительными
видами среди злаковых культур. Основным тестом является торможение
роста зародышевого корня и листа [Галицкая П. Ю. и др., 2011; Васильев А. В. и др., 2012].
Редис и кресс-салат являются традиционными биотестерами при исследовании остатков пестицидов в почве и воздухе. Они являются наиболее высокочувствительными к токсичным препаратам, и определяются
высокой энергией прорастания семян. Тест длится 7 – 14 дней. При наличии вредных веществ снижается процент всхожести и ингибируется рост
зародышевых корешков [Заболотских В. В. и др., 2012].
Проанализировав литературу многих ученых можно предположить,
что возможно в скором времени будут созданы сорта (линии) культурных
растений чувствительные к загрязнению, для проведения биоиндикации, а
это приведет к поиску успешного решения проблемы экологического состояния окружающей среды, но, к сожалению, в настоящее время подобные сорта и линии отсутствуют, в этом случае у исследователей усилия
должны быть направлены на поиск информативных и перспективных
форм, а так же работу с ними.
Для оценки токсичности гербицидов используют помимо семенных
культур рясковый тест, т.е. в качестве тестирующего объекта выступают
водные высшие растения семейства рясковых Lemnaceae, которые характеризуются простотой строения, быстрой скоростью размножения и высокой чувствительностью [Пашкевич В. Д. и др., 1978; Цаценко Л. В., Филипчук О. Д., 1999; Евгенъев М. И., 1999; Руководство по определению
методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов, 2002].
Среди видов рясок для биотестирования используют ряску малую
(Lemna minor L.), ряску горбатую (Lemna gibba L.), многокоренник обык28
новенный (Spirodella polyrrhiza L.). В природе рясковые особенно хорошо
растут в достаточно обогащенных питательными веществами (фосфаты,
нитраты, аммиак), водоемах [Цаценко Л. В., Перстенева А. А., 2010].
При биологическом анализе загрязнения почв на основе водной вытяжки с помощью видов рясок используют следующие показатели: количество листецов и их диаметр, наличие или отсутствие корней, а также их
количество, цвет, кроме этого анализируют длину корней, сухую или сырую биомассу, интенсивность фотосинтеза, содержание хлорофилла. Продолжительность тестирования от 3 до 14 суток [Методы биоиндикации и
биотестирования природных вод, 1987; Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование, 2007].
По литературным данным
комплексных исследований действия
гербицидов на репродуктивную систему озимой пшеницы знаний еще недостаточно. Однако, имеются некоторые подходы к оценке и наблюдению
за элементами агроценоза, присутствует фрагментарность таких работ.
Разработка конкретных подходов к решению данной проблемы позволит
сделать этот метод информативным, быстрым и востребованным селекционной практикой.
29
ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ
ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Почвенно-климатические условия проведения опытов
Экспериментальная часть работы выполнена в 2011–2014 годах на
опытном поле учхоза «Кубань» КубГАУ, г. Краснодара.
Учебно-опытное хозяйство «Кубань» располагается в центральной
почвенно-климатической зоне Краснодарского края. Почва опытных
участков – чернозѐм выщелоченный слабогумусный сверхмощный тяжелосуглинистый, по структуре почвы – комковатые или комковато-зернистые
[Тишков Н. М., 2006].
Чернозѐмы выщелоченные имеют высокую водопроницаемость,
гигроскопичность и наименьшую влагоѐмкость. Запасы продуктивной влаги в двухметровом горизонте почвы составляют 25–298 мм или 34–41% от
НВ. Влажность завядания в слое почвы 0–150 см колеблется от 16 до 17 %,
глубже – от 13 до 15 %.
По данным метеостанции «Круглик» учхоз «Кубань» находится в
зоне умеренного увлажнения [Агроклиматические ресурсы Краснодарского края, 1975].
Климат Краснодарского края формируется под воздействием комплекса физико-географических условий. Благодаря своему положению почти вся территория края получает большое количество солнечного тепла
(суммарная радиация в летний период составляет 48, а зимой 12 кал/см ).
Лето жаркое, зима малоснежная с частыми оттепелями. Среднегодовая
температура +10,7 °С; средний максимум до +38 °С (июль); средний минимум -2,3 °С (январь). Сумма положительных температур воздуха на территории Краснодарского края достигает 4000–4050 °С. Сумма температур
30
выше 10 °С равна 3600 °С, что позволяет выращивать все полевые культуры. Почти ежегодно бывают понижения температур до -22 °С, а в летние
месяцы температура воздуха иногда достигает +38–40 °С [Тарасенко Б. И.,
1981; Вальков В. Ф. и др., 2002].
Продолжительность безморозного периода 191–193 дня. Первые заморозки в третьей декаде октября, последние – в первой декаде апреля,
глубина промерзания почвы до 13 см [Тишков Н. М., 2006].
Погодные условия 2011–2014 сельскохозяйственного года в целом
можно охарактеризовать как благоприятные для роста и развития растений
озимой пшеницы [Агрометеорологический обзор, 2012, 2013, 2014].
В период проведения исследований погодные условия не всегда
складывались благоприятно для развития пшеницы и в отдельные годы отличались резкими температурными аномалиями, как в летний, так и в зимний периоды. Ежегодное возрастание летних температур воздуха в этот
период вызвало увеличение среднегодовой температуры на 1,2 °С по сравнению со среднемноголетними.
Погодные условия сельскохозяйственного года 2011–2012 гг.
Осень 2011 года была прохладной. Необычно холодная погода сменилась
длительным периодом теплой погоды в декабре и первой половине января.
Осадки выпадали в виде дождя, мокрого снега.
Агрометеорологические условия для формирования урожая озимых
культур в вегетационный период 2011–2012гг. складывались малоблагоприятно. Осадки выпавшие в октябре обеспечили хорошее увлажнение
почвы, но недостаток тепла во второй половине октября сдерживал развитие озимой пшеницы. В ноябре начался период покоя зерновых. Перезимовка озимой пшеницы проходила в сложных погодных условиях. В конце
января сильно похолодало, в центральных районах края температура почвы на глубине залегания узла кущения понижалась до -12,-14° С, это вызвало повреждение и гибель посевов на значительных площадях.
31
Весна была поздней, характеризовалась повышенным температурным режимом и недобором осадков. Благодаря аномально теплой погоде и
достатку влаги в почве в апреле озимые культуры активно росли и развивались. У озимых продолжалось кущение, начало закладки колоса, рост
соломины. В мае погодные условия снова ухудшились. Недобор осадков в
апреле-мае в сочетании с жаркой суховейной погодой и интенсивный расход влаги на транспирацию обусловили понижение запасов влаги в почве к
началу налива зерна. Созревание озимых проходило при благоприятных
условиях, уборка началась с третьей декады июня.
Погодные условия сельскохозяйственного года 2012–2013 гг. В
начале октября 2012 года производили сев озимой пшеницы, погодные
условия для этого складывались неблагоприятными, так как длительное
время отсутствовали осадки и была высокая температура, что привело к
иссушению почвы. В первой половите октября прошли обильные осадки,
что улучшило условия для произрастания озимых. Необычно теплая погода обусловила активную вегетацию озимых культур. В середине декабря
озимая пшеница прекратила вегетацию. Агрометеорологические условия
для перезимовки зимующих культур складывались вполне благоприятно
[Агрометеорологический обзор за 2012–2013 сельскохозяйственный год по
Краснодарскому краю, 2013].
Январь для озимых складывался благоприятно и к концу месяца вегетация зерновых возобновилась, этому способствовали установление теплой погоды. В то же время такие условия снизили морозоустойчивость
растений.
Резкое понижение температуры наблюдалось во второй декаде марта. Осадки выпадали в виде дождя и мокрого снега. В первой декаде апреля достаток влаги и тепла создали благоприятные условия для роста и
развития растений.
32
30
25
20
15
10
5
Июль
Июнь
Май
Апрель
Март
Февраль
Январь
Декабрь
Ноябрь
Октябрь
-5
Сентябрь
0
Месяц
-10
2011
2012
2013
2014
Средняя многолетняя, °С
Рисунок 1 – Температура воздуха за период проведения исследований,°С,
Метеостанция «Круглик», Краснодар, 2011 – 2014 гг.
Погодные условия сельскохозяйственного года 2013–2014 гг. Сентябрь характеризовался прохладной погодой с осадками, местами сильными. В Центральном районе осадков выпало 16–81 мм. Осень была теплой, периодически выпадали осадки в виде дождя и снега.
В конце января произошло резкое похолодание, которому предшествовало выпадение снега. Снег сопровождался сильным ветром, что способствовало неравномерному залеганию снежного покрова.
Агрометеорологические условия для перезимовки озимой пшеницы
складывались вполне благоприятно, условий для вымерзания не отмечалось. В самые холодные дни (первая декада февраля) минимальная температура почвы на глубине залегания жизненно важных органов растении,
составляла -5...-9°С. Во второй половине февраля, вследствие повышенного температурного режима, покой растений был неустойчивым. С повышением температур у озимых культур активизировались ростовые процессы,
33
в середине марта озимая пшеница полностью начала вегетировать.
Средняя температура воздуха в апреле составила 9,7…13,7°С,
наблюдался недобор осадков. В мае условия для произрастания озимых культур ухудшились из-за
аномальной жары в середине месяца.
Среднемесячная температура воздуха составила 15,5…20,0 °С, что на 2 –
3°С выше нормы. Недобор осадков в сочетании с жаркой суховейной погодой
обусловили резкое снижение запасов продуктивной влаги в почве к
началу налива зерна.
На таких посевах наблюдалось преждевременное
пожелтение и отмирание нижних листьев и стеблей подгона, формирование мелкого зерна. Но, несмотря на ухудшение условий роста и развития
вследствие недостатка влаги в почве, состояние большинства посевов
оставалось хорошим. Дожди, прошедшие в конце мая – начале июня, прекратили негативное влияние погодных условий на посевы. Налив и созревание зерна протекало в благоприятных условиях.
160
140
120
100
80
60
40
20
Июль
Июнь
Май
Апрель
Март
Февраль
Январь
Декабрь
Ноябрь
Октябрь
Сентябрь
0
Месяц
2011
2012
2013
2014
Среднее многолетнее, мм
Рисунок 2 – Среднемесячные и годовые суммы осадков, мм., Метеостанция «Круглик», Краснодар, 2011–2014 гг.
34
2.2 Условия проведения исследований
Экспериментальная часть работы выполнена в «Инновационной лаборатории генетики, селекции и контрольно-семенного анализа», на базе
ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» и на
опытном поле КубГАУ учхоза «Кубань» г. Краснодара. В опыте высевали
оригинальные семена на делянках 1,0м х 2,0м в 3-х кратной повторности,
общая площадь делянки 36 м 2, два варианта опыта, контроль и варианты с
обработкой (рисунок 3).
Рисунок 3 – Выращивание озимой мягкой пшеницы, г. Краснодар, 2013 г.
Предшественником озимой пшеницы на стационарном опыте был озимый рапс. Основная обработка почвы заключалась в фрезеровании на глубину 8–10 см и предпосевной культивации на глубину 5 см., удобрения вносились в дозе N80P80K60 под предпосевную культивацию.
35
Направление посева поперек направления внесения удобрений и последней культивации. Сев проводили ручным способом в оптимальный для
центральной зоны Краснодарского края срок с 1 по 10 октября, глубина заделки семян 4–6 см.
В фазе кущения озимой пшеницы (апрель) на вариантах проводили
химическую прополку смесью послевсходовых гербицидов Секатор Турбо
0,1л/га и Пума Супер 75 в дозе 0,6 л/га с расходом рабочего раствора – 200
л/га агрегатом Беларусь 1225 + Rau.
Убирали озимую пшеницу (конец июня начало июля в зависимости
от погодных условий) ручным способом при влажности 8,6 – 12,3 %.
Семена исследуемых растений хранились в индивидуальном контейнере для сушки малых партий семян, который является авторской разработкой и используется как полезная модель «Контейнер для сушки малых партий семян» (рисунок 4, Приложение 3) [Патент № 140303].
Рисунок 4 – Контейнер для сушки малых партий семян. Патент на полезную модель № 140303
Исследования по влиянию гербицидов проводили не только на
культуре пшеницы, но и на линиях гербицидоустойчивого подсолнечника,
36
на опытном поле ВНИИ масличных культур им. В. С. Пустовойта, г. Краснодара (рисунок 5). Предшественником была озимая пшеница, посев осуществляли по традиционной для этой культуры схеме, т. е. по одному растению в гнезде после прорывки при расстановке 70Х35 см. Посев проводился ручными сажалками. В одно гнездо помещали по два-три семянки.
Каждый рядок включал в себя по 25 гнезд. В течении вегетации проводили
две междурядные культивации и ручную прополку в течение всего сезона.
Рисунок 5 – Линии гербицидоустойчивого подсолнечника ВНИИМК, г.
Краснодар, 2011 г.
Обработку подсолнечника осуществляли послевсходовым гербицидом Евро-Лайтнинг в дозе 1,2 л/га проводили в начале июня, когда растения достигали стадии трех пар настоящих листьев.
Ручным пульверизатором обрабатывали каждое растение, причем
гербицид наносился как на настоящие листья, так и на точку роста. Опрыскивание проводили в утренние часы при оптимальной для обработки температуре атмосферного воздуха. Обрабатывали ряд подсолнечника и междурядья, обеспечивая равномерное покрытие раствором сорных растений.
37
2.3 Характеристика материала исследования
В работе были использованы две культуры разные по геномному
составу: диплоидная форма подсолнечника Helianthus annuus L. (2n=34) и
аллогексаплоидная форма пшеницы Triticum aestivum L. (2n=42).
Первой культурой, являющейся двудольной культурой, в исследовании влияния гербицидов на репродуктивную систему был выбран подсолнечник,
а
именно
семь
гербицидоустойчивых
линий
селекции
ВНИИМК (imi-R7, imi-R12, imi-R17, imi-B5, imi-B7, imi-B19, imi-B21).
Подсолнечник является однолетней культурой, имеет стебель, достигающий в высоту до 1,6 метров, сердцевидно-треугольные листья, размещенные на стебле поочередно. Мощный стебель увенчан большим соцветием – корзинкой, диаметр составляет 15–25 см [Лукомец В. М. и др.,
2012].
Цветки подсолнечника собраны в соцветие – многоцветковую верхушечную корзинку, имеющую форму круглого плоского диска. Нижняя
часть соцветия окружена зелеными черепицеобразно расположенными листочками, тогда как цветки в центральной части корзинки отличаются более мелкими размерами и ярко-желтым цветом [Анащенко А.В., 1977; Воронова О.Н., 2008; Лукомец В. М. и др., 2012].
Подсолнечник – перекрестноопыляющаяся культура, пыльца которой переносится с цветка на цветок насекомыми, в основном пчелами, а
также ветром. Цветение наступает через 20–30 дней от начала формирования корзины и длится 2–3 недели. Количество пыльцы в пыльниках не
одинаково и зависит от сортов подсолнечника [Воронова О. Н., 2008].
Другой культурой, являющейся однодольной культурой, в исследовании была озимая мягкая пшеница сорта Таня, выведенная в Краснодарском НИИСХ им. П.П. Лукьяненко г. Краснодар. Сорт полукарликовый,
высота растений 80–85 см, высокоустойчив к полеганию.
Сорт Таня формирует продуктивный колос, в среднем масса зерна
38
колоса составляет 1,2 гр., с массой 1000 зерен от 36 до 46 граммов [Романенко А. А. и др., 2005]
Пшеница в основном самоопыляющаяся культура. При нормальных
условиях вегетации через 4 – 5 дней после формирования колоса наступает
цветение, которое продолжается 3 – 6 дней. Начинается цветение с середины колоса и постепенно переходит к низу и верхушки колоса. В колоске
сначала цветут боковые (нижние) цветки, а затем средние [Губанов Я. В.,
Иванов Н. Н., 1983; Тюпаков Э. Ф., Бровкина Т. Я., 2008].
На посевах подсолнечника для борьбы с сорной растительностью
применяли послевсходовый гербицид нового поколения Евро-Лайтнинг
производные имидазолинонов из системы CLEARFIELD ®, в переводе с
английского языка clearfield означает «чистое поле» [Филипчук О. Д. и др,
2010; Лукомец В. М. и др., 2012]. По характеру поражения растений гербицид избирательного (селективного) действия. В зависимости от характера
действия на растения – системный гербицид, проникающий через листья и
другие надземные органы.
Каждое из двух действующих веществ гербицида (имазапир, 15 г/л,
и имазамокс, 33 г/л) эффективно само по себе, а их комбинация позволяет
получить эффект, не сопоставимый с действием других гербицидов. Он
уничтожает практически все распространенные в южных регионах России
сорняки, в том числе проблемные, такие как амброзия, осоты, подмаренник, канатник, марь белая и, что очень важно, заразиху – чрезвычайно вредоносного паразита подсолнечника [Куликова Н. А., Лебедева Г. Ф., 2010;
Антохина С. П., 2011].
В многофакторном опыте при выращивании озимой мягкой пшеницы использовали Секатор Турбо производные сульфонилмочевины (содержащая 25 г/л йодосулфуронметил-натрия, 100 г/л амидосульфурон, 250
г/л мефенпир-диэтил (антидот)), высокоселективный гербицид для применения на посевах пшеницы, ячменя, кукурузы и льна долгунца против однолетних и некоторых многолетних сорняков, применяют с 2001 в России.
39
Гербицид системного действия [Козлова Е. В., 2011; Мехдиев Т. В., 2012].
Гербицид Пума Супер 75 (содержит 75 г/л феноксапроп-П-этила и
27 г/л мефенпир-диэтила (антидот)), высокоселективный гербицид для послевсходовой обработки пшеницы против широкого спектра однолетних
злаковых сорняков. Гербицид системного действия [Сорока С.В., 2004;
Антохина С. П., 2011].
2.4 Методика пыльцевого анализа
Лабораторные исследования проводились в лаборатории «Инновационная лаборатория генетики, селекции и контрольно-семенного анализа», на базе ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет». В анализ входили
исследования по пыльцевому анализу, биоте-
стированию почвы, и анализу структуры урожая.
В нашей работе мы проводили исследования по пыльцевому анализу, метод ориентирован на установления состояния мужского гаметофита
цветковых растений и состоял из определения фертильности и стерильности пыльцевых зерен, а также их жизнеспособности и количества пыльцы в
пыльнике.
Методика анализа качества пыльцы заключается в определении
процента абортивных (стерильных) пыльцевых зерен. Пыльца проявляет
высокую чувствительность к действию мутагенов. Генетически активные
факторы среды резко нарушают процесс образования пыльцы, что в конечном итоге приводит к резкому снижению или даже полному отсутствию в пыльниках нормальных пыльцевых зерен.
Обычно пыльца у растений, произрастающих в нормальных условиях, имеет хорошее качество, высокую фертильность, а процент нормальных пыльцевых зерен близок к 100, а влияние различных факторов среды:
высокие температуры воздуха и почвы, радиация, повышенное загрязнение
могут снизить этот процент до 50% и ниже [Бессонова В. П. и др., 1997;
40
Цаценко Л. В., 2012].
Методика определения фертильности пыльцевых зерен в пыльнике
цветковых растений. Количество пыльцы в цветке и пыльцевую продуктивность растений пшеницы определяли по методике
Паушевой З. П.
(1988). С целью определения фертильности пыльцы отбирали по 10 – 15
колосьев в период начало цветения с разных делянок опытного участка.
Затем из средней части колоса выделяли по несколько цветков (3 – 4), отделяли пыльники и фиксировали их в уксусном алкоголе (1:3) в течение
суток, хранили в холодильнике при температуре 3 – 7 0С.
Для определения фертильности использовали собранные пыльники,
которые препаровальной иглой потрошили на предметном стекле, извлекая
при этом пыльцу, затем с помощью пипетки наносили на пыльцу каплю
ацетокармина и размешивали еѐ иглой так, чтобы все пыльцевые зерна были в растворе. Выдерживали препарат в таком виде в течение нескольких
минут, после этого накрывали каплю покровным стеклом и рассматривали
препарат под микроскопом при различном увеличении. В нескольких (до
пяти) полях зрения подсчитывали количество нормальных (фертильных) и
абортивных пыльцевых зерен по каждому цветку, взятому для анализа (рисунок 6, 7). Чтобы получить более точные результаты, производили отбор
одинакового количества пыльцевых зерен каждого варианта, использовали
не менее 100 – 200 пыльцевых зерен [Барыкина Р. П. и др., 2004; Пухальский В. А. и др., 2007]. Препарат микроскопировали с помощью бинокулярного микроскопа Микрос МС 100 с фотонасадкой и фотоаппаратом
Сanon A – 620 7.1 megapixels.
41
Рисунок 6 – Пыльцевые зерна сельскохозяйственных культур: слева – озимой пшеницы; справа – подсолнечника
Рисунок 7 – Пыльцевые зерна озимой пшеницы: А) фертильные; Б) стерильные
Под микроскопом можно легко отличить фертильные пыльцевые
зерна по темно-коричневому или по темно-фиолетовому (при окраске йодным раствором) или красно-карминовому (при окраске ацетокармином)
42
цвету. Стерильные пыльцевые зерна при этом морщинистые и остаются
неокрашенными или имеют следы, неокрашенными оказываются и оболочки пыльцевых зерен.
Методика определения жизнеспособности пыльцы на искусственной питательной среде. Мы в работе определяли жизнеспособность пыльцы определяли на искусственной питательной среде. На предметное стекло
препаровальной иглой в каплю среды (35 % раствор сахарозы, подкисленный 0,006 % раствором борной кислоты) проводили посев свежесобранной
пыльцы, затем стекла с пыльцой помещали в чашку Петри с увлажненной
фильтровальной бумагой и выдерживали в термостате при 30 оС в течение
5 – 9 часов (в выборку входило по 10 растений с каждого варианта).
Жизнеспособность пыльцы определяли по проценту нормально
проросших пыльцевых зерен, наблюдаемых под микроскопом в 5 – 10 полях зрения, при этом анализировали 100 случайно выбранных пыльцевых
зерен [Паушева З. П., 1988].
Методика определения количества пыльцевых зерен в пыльнике
пшеницы. У пшеницы, как известно, тычинки маленькие, производят приблизительно 450 000 пыльцевых зерен на одно растение [Molnar-Lang.M.,
2000]. Количество и качество пыльцы, произведенной цветком являются
важным показателем в процессе опыления [Alami S. et al., 1988; Johnk
Kelly et al., 2002]. Качество пыльцы часто приравнено к жизнеспособности
пыльцы, однако на эти показатели могут повлиять различные факторы. На
основе работ Aridersen S. TIi. and Bertelsen F., 1972, Slomka A. et al, 2010
известно, что пыльцевые зерна как правило, радиально симметричные от
22,2 до 34,7 мкм по максимальной оси. Пыльцевые зерна, как правило,
округлые.
Количество пыльцы в цветке растений озимой мягкой пшеницы
определяли по методике, разработанной на кафедре РГАУ – МСХА им.
К. А. Тимирязева [Иванова С. В. и др., 1996]. В анализе изучали по 10 растений пшеницы с каждого варианта.
43
Пыльник разрывали пинцетом, приливали в него 2 мл сахарозы,
микропипеткой отбирали по 4 мкл взвешенной смеси и затем каплю переносили на предметное стекло. Для подсчета количества пыльцевых зерен
использовали камеру Горяева (рисунок 8). Установление общего количества пыльцы в пыльнике рассчитывали по следующей формуле:
X = а × 50000 × b, где:
а – срeднee количество подсчитанной пыльцы зерен в 5 больших квадратах, при одном увеличении окуляра микроскопа;
b – объем исходной суспензии пыльцевых зерен;
50000 – коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на
1 мкл.
Рисунок 8 – Методика определение количества пыльцевых зерен в пыльнике: А) камера Горяева; Б) пыльцевые зерна пшеницы в камере Горяева
Анализ элементов структуры урожая озимой мягкой пшеницы. В
конце июня начале июля производили уборку урожая ручным способом,
для этого с исследуемых делянок отбирали по 25 растений каждого варианта и формировали снопы. Затем снопы хранили в контейнере и производили подсчет параметров продуктивности растений.
44
В анализе подсчитывали: количество колосков на уступе колосового стержня, количество зерен в колосе, массу колоса, массу 1000 зерен
[Тороп Е. А., Тороп А. А., 2009].
Снопы исследуемых образцов досушивали в контейнерах для сушки
и хранения растений (рисунок 9, Приложение 4)
Рисунок 9 – Контейнер для сушки и хранения плодов растений. Патент на
полезную модель № 146651
Мы использовали различные методики математической и статистической обработки полученных данных, в зависимости от поставленных целей и задач исследований. Для более точного сравнения зависимости влияния факторов применяли одно- и двухфакторный дисперсионный анализ
[Доспехов Б.А., 1979]. Оценку достоверности различий между средними
значениями признаков образцов проводили с помощью рангового теста
[Лакин Г.Ф., 1990].
Использовались пакеты программ Statistica 7, MSExcel 2000.
45
2.5 Оценка фитотоксичности почвы в системе генетического
мониторинга
Проведение биологического тестирования дает возможность охарактеризовать степень воздействия изучаемого фактора на био- и агроценозы и
природную среду [Fox R. L., Albrecht W. A., 1957]. Методы биотестирования открывают возможность для получения достаточно надежные данные о
токсичности конкретной пробы, поэтому методы биотестирования можно
сравнить с химическим методами. Они позволяют реально оценить среду по
отклику на действие токсических веществ.
Методика определения всхожести, силы роста и энергии прорастания семян тест-культур. Главным требованием при оценке состояния
среды является чувствительность применяемых методов. Потребность в
проведении исследований в настоящее время особенно возрастает, так как
необходимо оценивать не только уже необратимые изменения в окружающей среде, но и анализ незначительных отклонений, чтобы возможно было
вернуть систему в прежнее состояние.
Не менее важным требованием является универсальность метода,
причем и в отношение оцениваемого воздействия, типа экосистем и вида
живых организмов, в отношение которых проводится оценка. Система
должна быть простой и доступной, относительно не дорогой, пригодной
для широкого использования в научных и импровизированных лабораториях [Заболотских В. В. и др., 2012].
На посевах зерновых культур в период весеннего кущения применяют гербицидную обработку, с целью химической прополки, так как
именно в этот период он практически не вызывает значительного токсичного действия и не снижает урожай злаков, его действие направлено в основном на устранение сорной растительности [Яблонская Е. К., Плотников
В. К., 2006].
46
Биотестирование как метод индикации входит в систему генетического мониторинга. В ходе исследований были проведены опыты по изучению влияния гербицидов на ростовые процессы различных тест-культур.
В качестве тест-индикаторов были выбраны семена озимой пшеницы сорта
Таня (Triticum aestivum L.), кресс-салат сорт Весенний (Lepidium
sativum L.), редис сорт Розово-красный с белым кончиком (Raphanus
sativus L.).
Мы предлагаем метод биотестирования по проросткам тест-культур,
который включает три варианта:
I. Выращивание растений в почве, обработанной гербицидами на
определение токсичности.
II. Выращивание растений в растворе (почвенной вытяжке), почва
обработана гербицидами.
III. Влияние гербицидов на рост осевых органов у проростков тесткультур.
Всхожесть и энергию прорастания семян определяли по ГОСТ
12038-84 используя рулонный способ, а так же в качестве сравнения результатов исследования использовали авторское изобретение на полезную
модель – устройство для биотестирования, где семена высевались непосредственно в почву, что на наш взгляд является наиболее результативным
способом определения действия гербицидов на ростовые процессы семян
тест-культур [рисунок 10 Приложение 1, Патент № 139000 и рисунок 11,
Приложение 2, Патент № 148100].
Для определения всхожести
отсчитывали три пробы по 100 и
20 семян. Сухие семена погружали в 1%-ный раствор марганцовокислого
калия на 0,5 часа, а затем промывали дистиллированной водой, используя
два слоя марли, обсушивали на фильтровальной бумаге на воздухе [Заболотских В. В. и др., 2011, 2012].
На двух слоях увлажненной бумаги размером 10х100 см (±2 см)
раскладывают одну пробу семян зародышами вниз по линии, проведенной
47
на расстоянии 2–3 см от верхнего края листа. Сверху семена накрывали
полоской увлажненной бумаги такого же размера, затем полосы неплотно
свертывают в рулон и помещали в вертикальном положении в растильню
[Методика биотестирования по проращиванию семян, 1996].
Рисунок 10 – Устройство для биотестирования почвы. Патент на полезную модель № 139000
На седьмые сутки учитывали все проросшие семена, определяли
энергию прорастания, силу роста и всхожесть. При подсчете всхожести
отдельно учитывали нормально проросшие, набухшие, загнившие и ненормально проросшие семена. К взошедшим семенам относили только те,
которые дали нормально развитые корешки размером не менее длины семени и росток размером не менее половины длины семени [Другов Ю.С.,
Родин А. А., 2009; Заболотских В. В. и др., 2011].
48
К невсхожим относили следующие типы семян: а) набухшие, которые к моменту окончательного определения всхожести не проросли, но
имеют здоровый вид; б) загнившие, с мягким разложившимся эндоспермом, загнившими зародышем и семядолями, загнившими корешками. К
ненормально проросшим относили семена, у которых: уродливые ростки
или корешки; при наличии ростка отсутствуют корешки; водянистые корешки или со вздутиями. Оценку проростков проводили по 5-ти бальной
шкале, согласно методике. Повторность опыта трехкратная [Лихачев Б.С.,
1986]. Всхожесть и энергию прорастания семян вычисляли в процентах.
В работе, как отмечалось выше, было использовано устройство для
выращивания растений, которое заключается в исследовании почвы на
остаточное количество гербицидов прямым высевом в почву семян тесткультур. Для проведения анализа мы засыпали контейнеры почвой на 2/3
затем выкладывали семена и сверху присыпали почвой увлажняли и оставляли на время проведения теста (рисунок 10, 11).
Рисунок 11 – Переносной контейнер для биотестирования почвы. Патент
на полезную модель № 148100
49
Методика определения длины осевых (ростовых) органов проростков семян тест-культур. В данном опыте мы использовали устройство для
выращивания растений (рисунок 10), методика проведения описана выше.
Объектом исследования служила почва, взятая для анализа с пшеничного поля после обработки гербицидами, которые исследуются в данной работе. Контролем служили семена, проращенные на почве без гербицидов. На 7-е сутки регистрировали количество проросших семян и проводили измерения ростовых характеристик (длины корешков и ростков) на
10 растениях каждого варианта, в 3-х кратной повторности. Для проведения подсчета результатов необходимо было промыть корешки под проточной водой [Звягина А. С., Цаценко Л. В., 2013].
Методика проведения биотестирования с использованием ряски
малой Lemna minor L. В отличие от семенных культур в работе использовали высшее водное растение ряску малую Lemna minor L.семейства рясковых.
Это маленькое растение является удобным объектом для проведения биотестирования почвы и воды. Ряска один из представителей семейства рясковых является самым маленьким цветковым растением в мире.
Это водное, свободно плавающее, многолетнее травянистое растение.
Встречается в стоячих водах [Цаценко Л. В., Малюга Н. Г., 2000; Другов
Ю. С., Родин А. А., 2009].
Если семена высших растений на первых этапах используют для
своего роста и развития белки эндосперма, то ряска этой возможности лишена, она сразу активно растет, поэтому нам хотелось сравнить отклик
растений из разных групп на действие гербицидов.
В экспериментах исследовалась почва с обработанных смесью гербицидов (Секатор Турбо и Пума Супер 100) делянок спустя 5 дней после
обработки рабочим раствором. Температура воздуха 20 – 30 градусов.
В нескольких местах исследуемой территории отмечали по пять
участков размером 1 м 2. На участках с верхнего слоя (0 – 10 см глубины)
50
отбиралась навеска почвы (около 1000 г). Затем средняя проба с пяти
участков исследовалась непосредственно в опытах по биотестированию,
аналогичная процедура проводилась и на контрольных участках, где не
проводилась гербицидная обработка.
Для биотестирования использовали культуру ряски малой, пересаженную на свежеприготовленную среду за двое суток до постановки эксперимента. В каждую пробу помещали по 20 листецов, выбирая хорошо
развитые группы растений с ярко-зелѐной окраской в трехкратной повторности (рисунок 12). Все образцы инкубировали в термолюминостате в течение 7 суток при комнатной температуре.
Рисунок 12 – Классическое развитие ряски малой в эксперименте, 2013 г.
На 3, 5 и 7 сутки с начала эксперимента фиксировали морфологические отклонения растений ряски малой от нормы под действием поллютанта, а именно: хлорозы, пожелтения, увядания листецов. В каждом из временных промежутков эксперимента проводили учет по изменению цветовой гаммы листецов: темно-зеленые, зеленые, желтые, бурые, белые, хлорозы листа [Ляшенко О. А., 2012].
51
ГЛАВА 3
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВЫ НА ОСТАТОЧНОЕ
КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕВСХОДОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ
С ПОМОЩЬЮ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
В связи с ежегодным увеличением сельскохозяйственных площадей, которые подвержены загрязнению различными химическими веществами, в том числе и гербицидами, появилась необходимость вести исследования по определению степени загрязнения почв вредными для растений химикатами.
В настоящее время существует ряд подходов к проведению мониторинга почв, но в силу высокой стоимости и сложности проведения применение их оказывается ограниченным. Мы считаем, что наиболее эффективным подходом для определения степени фитотоксичности почв, загрязнѐнных различными видами поллютантов, в том числе и гербицидами, является использование методов биотестирования.
Биотестирование основано на исследовании реакции живых организмов, которые способны уловить стрессирующее воздействие раньше, на
ранних этапах онтогенеза. В оптимальных условиях тестируемый организм
реагирует на воздействие среды в результате сложной физиологической
системы буферных гомеостатических механизмов [Дмитриев А. И., 1996;
Биологический контроль окружающей среды, 2010].
Загрязнение почвы происходит за счет увеличения масштабов и
территориальному распространению поллютантами, которые оказывают
влияние на почву и биоту. Изменение структуры и состояния почвенной
экосистемы может повлиять на порозность и плотность горизонтов, что
приведет к уменьшению дренажа и аэрируемости. Все это приводит к затруднению прорастания семян, а так же проникновения корневой системы
в почву.
52
3.1 Сила роста семян тест-культур
Мониторингом агроценоза является выявление факторов повышенной нагрузки химикатов в ценозе, которые в свою очередь оказывают негативное влияние на морфологию растений, стабильность и величину урожая, посевные качества получаемого зерна. Влияние неблагоприятных
условий окружающей среды в период развития семени, отражается на качестве семенного материала, и может в дальнейшем сказаться на качестве
потомства.
Для определения генетической активности различных химических
веществ и загрязнителей окружающей среды невозможно обойтись без
биологических экспериментов с использованием ряда тестов, основанных
на использовании в качестве тест-систем растительные организмы.
Специальные биотесты
для определения эффективности общего
действия агрохимикатов при генетическом мониторинге сводятся к оценке
степени изменения биохимических и морфометрических показателей, т. е.
энергии прорастания и всхожести семян, роста корней, поражаемости растений болезнями под влиянием загрязнителя [Стрельцов А. Б., 2005].
При анализе почвы на содержание остаточных количеств препарата
необходимо учитывать биологические показатели (состояние признаков
объектов). В задачу нашей работы входило определение токсичности послевсходовых гербицидов на основе изменений посевных качеств семян
тест-культур в системе генетического мониторинга.
Анализ качества семян позволяет определить токсическую нагрузку на растения, уловить влияние каждого фактора токсикации (пестицидов,
удобрений, гербицидов). При использовании этого показателя в генетическом мониторинге необходимо установить критерии учета показателей
(силы роста и энергии прорастания семян, количества не проросших, загнивших семян или семян с аномалиями развития, всхожести семян), по-
53
этому вторым этапом работы было изучение действия послевсходовых
гербицидов Пума Супер 75 и Секатор на всхожесть семян тест-культур.
Биологические тесты по определению прорастания семян успешно
применяются для установления влияния различных физиологически активных веществ.
Мы предлагаем метод биологического тестирования токсичности
почв по проросткам тест-культур, который включает два варианта:
1. проращивание семян тест-культур в водных вытяжке из почвы,
обработанной гербицидами).
2. выращивание растений непосредственно в почве, токсичность которой необходимо оценить.
Данный метод основывается на реакции тест-культур на присутствие в почве загрязняющих веществ, что позволяет определить ингибирующее (токсичное) действие химических веществ или стимулирующее
влияние, которое активизирует развитие тест-культур. При исследовании
фиксируется всхожесть и энергия прорастания семян, размер корневой и
надземной систем.
Нами были проведены исследования с использованием данной методики по определению фитотоксичности почвы, отобранной с опытного
поля после обработки послевсходовыми гербицидами.
Работа выполнена в рамках однофакторного дисперсионного анализа и результаты представлены в таблице 1. При проведении биотестирования в анализ включены 2 типа проростков – сильные и слабые. К сильным
проросткам по длине ростка у кресс-салата и редиса относили те, которые
достигали 3–5 см, а у пшеницы – 8–10 см при анализе на 7 сутки эксперимента. Поскольку в нашем опыте сильные проростки составляли наибольшее количество, то исследования велись по показателю – сильные проростки.
54
Таблица 1 – Однофакторный дисперсионный анализ числа сильных проростков кресс-салата при биотестировании почвы, загрязненной послевсходовыми гербицидами Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар
(2011–2014 гг.)
ИзменчиДоля в общей
вость
SS
df
mS
F
Дисперсия дисперсии, %
Общая
943,28 17
63,89
100,00
Факторная
206,72
1
206,72
4,49
17,85
27,95
Остаточная 736,56 16
46,03
46,03
72,05
Примечание:SS – сумма квадратов (отклонений); df – степень свободы;
mS – средний квадрат; F – критерий Фишера
Различия между вариантами опыта статистически достоверны, их
доля невелика и составляет 27,9 %. Сравнение средних значений признака
показало, что число сильных проростков на культуре кресс-салата в варианте опыта без гербицидной обработки почвы достоверно выше, чем в
почве с гербицидами (таблица 2).
Таблица 2 – Результаты рангового теста определения сильных проростков
кресс-салата при биотестировании почвы, загрязненной послевсходовыми
гербицидами Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, %
Ранговый тест
Сильные проростки
почва с гербицидами
71,00
****
почва без гербицидов (контроль 2)
77,78
****
Примечание. Здесь и в последующих аналогичных таблицах знак «*», расположенный на разных вертикалях показывает различия между образцами.
В работах ряда ученых отмечено, что влияние гербицидов различных классов на энергию прорастания и силу роста семян тест-культур оказывают неоднозначное действие [Антохиной С.П. и др., 2011; Злотникова О. В. и др, 2011; Козлова Е.В. И др., 2012].
При оценке силы роста в эксперименте с семенами озимой мягкой
пшеницы достоверных различий между вариантами с обработкой по-
55
слевсходовыми гербицидами и без обработки обнаружено не было о чем
свидетельствуют результаты дисперсионного анализа (таблица 3).
Таблица 3 – Однофакторный дисперсионный анализ числа сильных проростков пшеницы при биотестировании почвы, загрязненной послевсходовыми гербицидами Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар (2011–
2014 гг.)
Изменчивость
Общая
Факторная
Остаточная
SS
df
260,44
32,00
228,44
17
1
16
mS
Дисперсия
F
32,00 2,24
14,27
14,27
0,00
14,27
Доля в общей
дисперсии, %
100
0
100
При оценке семян редиса в анализе токсичности почвы по признаку
число сильных проростков были установлены различия между вариантами
и их доля составила 48% (таблица 4).
Таблица 4 – Однофакторный дисперсионный анализ числа сильных проростков у редиса при биотестировании почвы, загрязненной гербицидами
послевсходовыми Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар (2011–
2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Общая
Факторная
Остаточная
377,11
138,89
238,22
17
1
16
138,89
14,89
9,33
Доля в обДисперсия щей дисперсии, %
28,67
100,00
13,78
48,06
14,89
51,94
В работе Антохиной С. П. и др. (2011) представлены неоднозначные результаты по влиянию гербицидов на ростовые показатели
про-
ростков тест-культур, т. к. с одной стороны происходит ингибирование
одних процессов роста развития проростков, а с другой – стимулирование
других процессов. В нашем случае при применении послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо на посевах озимой мягкой пше-
56
ницы идет снижение по показателю – сила роста семян тест-культур: редиса, кресс-салата и пшеницы.
Результаты, полученные в ходе проведения эксперимента так же
подтверждаются данными Лукаткина А. С. и др. (2010), где, в опытах с
гербицидами Гранстар и Топик почти все изученные концентрации гербицидов, которые применяются на посевах злаковых культур, вызывали существенное подавление роста проростков злаков.
Cравнение нескольких культур по морфофизиологическим показателям оценки проростков показало, что на контрольных вариантах показатель силы роста значительно выше по сравнению с исследуемым образцом,
что позволяет сделать вывод о негативном влиянии, присутствующих в
почве веществ, на проростки тест-культур.
3.2 Всхожесть семян тест-культур
Одной из главных задач для успешного получения здоровых всходов является обеспечение теплом, светом и влагой. Немаловажное значение играет так же качество семенного материала, а значит, семена должны
обладать высокой всхожестью. Всхожесть семян – способность семян давать за установленный срок нормальные проростки при определѐнных
условиях проращивания [Биологический энциклопедический словарь,
1986]. Всхожесть определяли на трех культурах, которые являются классическими при проведении биотестирования.
Проращивание семян при проведении эксперимента по определению всхожести семян тест-культур осуществляли непосредственно в почве
с использование устройства для биотестирования почвы [Патент №
139000], а так же по стандартной методике. Срок тестирования 7 дней. По
истечении времени проводили подсчет нормально проросших проростков,
пробившихся через слой почвы.
57
Эксперимент по определению всхожести семян предусматривал три
варианта:
– анализ всхожести семян в дистиллированной воде (контроль 1);
– анализ всхожести семян в почве без обработки послевсходовыми
гербицидами (контроль 2);
– анализ всхожести семян в почве после обработки послевсходовыми гербицидами.
В качестве абсолютного контроля выступал вариант с дистиллированной водой – контроль 1, а относительного – почва без обработки гербицидами – контроль 2.
Результаты эксперимента по оценке возможностей использования
пшеницы для биотестирования были обработаны в однофакторном дисперсионном анализе (таблица 5).
Таблица 5 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа всхожести семян озимой мягкой пшеницы при биотестировании почвы, обработанной смесью послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор
Турбо, Краснодар (2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в
общей
дисперсии, %
9,15
4,86
4,29
100,00
53,14
46,86
228,70
121,53
107,18
100,00
53,14
46,86
7 сутки
Общая
Факторная
Остаточная
198,96
96,07
102,89
Общая
Факторная
Остаточная
4 974,07
2 401,85
2 572,22
26
2
48,04
11,21
24
4,29
Общая всхожесть
26
2
1200,93 11,21
24
107,18
Достоверные различия между вариантами эксперимента были получены только на седьмые сутки и доля показателя «общая всхожесть». На
третьих и пятых сутках оценки различий обнаружено не было. Это может
58
быть объяснено с позиций кумулятивного эффекта воздействия гербицидного загрязнения, который начал сказываться только на седьмые сутки
эксперимента.
Таблица 6 – Средняя всхожесть семян озимой мягкой пшеницы на седьмые
сутки эксперимента по вариантам загрязнения почв гербицидами, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, %
7сутки
Почва с гербицидами
14,33*
Дистиллированная вода (контроль 1)
17,89
Почва без гербицидов (контроль 2)
18,67*
Ранговый тест
****
****
****
Характер различий между вариантами опыта раскрывают данные
таблиц 6, 7, где видно, что на седьмые сутки самая высокая всхожесть
получена на варианте «Почва без гербицидов», а наименьшая на варианте
«Почва с гербицидами». Различия между вариантами «почва без гербицидов» и «Дистиллированная вода» не значительные, однако лучшие результаты на первом варианте.
Таблица 7 – Результаты множественного сравнения средних значений общей всхожести семян озимой мягкой пшеницы сорта Таня по вариантам
загрязнения почв гербицидами, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Почва с гербицидами
Дистиллированная вода (контроль 1)
Почва без гербицидов (контроль 2)
Среднее, %
71,67*
89,44
93,33*
Ранговый тест
****
****
****
По данным общей всхожести получены идентичные результаты и
являются достоверными по различию результатов всхожести в вариантах с
дистиллированной водой и чистой почвой (без гербицидов) над вариантом
«Почва с гербицидами» (проростки пшеницы представлены на рисунке 13).
59
А
Б
А
Б
В
Рисунок 13 – Пшеница в устройстве для биотестирования почвы (Патент
№ 139000). А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, контроль
2; В – проростки на дистиллированной воде, контроль 1, 2013 г.
В качестве возможного растения – биотестера использовали редис.
Эксперимент по изучению его всхожести с последующим анализом был
аналогичен эксперименту с пшеницей (таблица 8).
60
Таблица 8 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа всхожести
семян редиса при биотестировании почвы, загрязненной послевсходовыми
гербицидами Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар (2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в
общей
дисперсии, %
4,61
0,86
0,24
0,61
100,00
28,61
71,39
1,03
6,55
0,00
6,55
100,00
0,30
100,00
5,48
2,47
0,82
1,65
100,00
33,25
66,75
5,48
61,73
20,52
41,20
100,00
33,25
66,75
3 сутки
Общая
Факторная
Остаточная
20,30
5,63
14,67
26
2
24
Общая
Факторная
Остаточная
170,07
13,41
156,67
26
2
24
Общая
Факторная
Остаточная
57,63
18,07
39,56
26
2
24
Общая
1
440,74
451,85
988,89
26
2
24
Факторная
Остаточная
2,81
0,61
5 сутки
6,70
6,55
7 сутки
9,04
1,65
Общая
225,93
41,20
Различия между вариантами опыта с редисом были выявлены на
третьи и седьмые сутки проращивания. На пятые сутки достоверного влияния гербицидов не обнаружено. Доля дисперсии на 3-и сутки составила
28,6 %, а 7-е сутки 33,25%. Проростки редиса представлены на рисунке 14.
61
Б
А
А
Б
В
Рисунок 14 – Редис в устройстве для биотестирования почвы (Патент №
139000). А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, контроль 2;
В – проростки в чашках Петри на дистиллированной воде, контроль 1,
2013 г.
Первое заключение, сделанное по результатам данного эксперимента указывает на значительное снижение доли дисперсии «Между вариантами опыта». Так, если в эксперименте с пшеницей она составляла 53%, то
для эксперимента с редисом обнаружено снижение до 28–33%. Иными
62
словами, эффективность использования данной культуры для решения задач биотестирования значительно ниже.
Таблица 9 – Результаты множественного сравнения средних значений
всхожести семян редиса на третьи сутки эксперимента, Краснодар (2011–
2014 гг.)
Вариант
Среднее, %
Ранговый тест
3 сутки
Почва с гербицидами
2,11
****
Дистиллированная вода (контроль 1)
2,56
****
Почва без гербицидов (контроль 2)
3,22
****
****
Из представленных данных следует, что наибольшее среднее значение всхожести семян редиса на третьи сутки наблюдалось на варианте
«Почва без гербицидов» и составило 3,22 % и достоверно отличалось от
варианта «Почва с гербицидами» и составила 2,11 %. Различия между вариантами «Дистиллированная вода» и «почва без гербицидов» не существенны.
Таблица 10 – Результаты множественного сравнения средних значений
всхожести семян редиса на седьмые сутки эксперимента, Краснодар (2011–
2014 гг.)
Вариант
Среднее, %
Ранговый тест
7 сутки
Почва с гербицидами
14,67
****
Дистиллированная вода (контроль 1)
15,78
****
Почва без гербицидов (контроль 2)
16,67
****
****
Характер различий между вариантами эксперимента достаточно
сложен. Так, достоверные различия выявляются только между вариантами
63
«Почва без гербицидов» и «Почва с гербицидами». Вариант с «Дистиллированной водой» достоверно не отличается от двух других вариантов.
Следующей культурой в качестве тест-культуры выбрали кресссалат. Результаты эксперимента по оценке возможностей использования
кресс-салата для биотестирования были проанализированы с помощью
дисперсионного анализа (таблица 11).
Таблица 11 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа всхожести семян кресс-салата при биотестировании почвы, загрязненной послевсходовыми гербицидами Пума Супер 75 и Секатор Турбо, Краснодар
(2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в общей дисперсии, %
5,68
1,94
0,66
1,28
100,00
34,22
65,78
4,89
2,82
2,07
100,00
57,61
42,39
112,04
65,97
46,06
100,00
58,88
41,12
3 сутки
Общая
Факторная
Остаточная
45,19
14,52
30,67
26
2
24
Общая
Факторная
Остаточная
104,67
54,89
49,78
26
2
24
Общая
Факторная
Остаточная
2 385,19
1 279,63
1 105,56
26
2
24
7,26
1,28
5 сутки
27,44 13,23
2,07
7 сутки
639,81
46,06
13,89
Из представленных данных можно заключить, что доля дисперсии
«Между вариантами опыта» находилась в пределах 34,2–58,8 %. Это свидетельствует о достоверных различиях между вариантами, а так же негативном эффекте влияния загрязнения почв гербицидамина тест-растение.
Характер различий между вариантами опыта более подробно представлен в таблице 12, где видно, что на третьи сутки эксперимента всхожесть семян кресс-салата была выше на варианте «Почва без гербицидов», а на варианте «Почва с гербицидами» она была значительно ниже.
64
Таблица 12 – Результаты множественного сравнения средних значений
всхожести семян кресс-салата, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, %
Ранговый тест
3 сутки
Почва с гербицидами
Дистиллированная вода (контроль 1)
Почва без гербицидов (контроль 2)
5 сутки
Почва с гербицидами
Дистиллированная вода (контроль 1)
Почва без гербицидов (контроль 2)
7 сутки
Почва с гербицидами
Дистиллированная вода (контроль 1)
Почва без гербицидов (контроль 2)
4,44
5,11
6,22
****
****
12,22
14,44
15,67
****
61,67
72,22
78,33
****
****
****
****
****
****
Согласно представленных данных наибольшая всхожесть семян
кресс-салата наблюдается на варианте «Почва без гербицидов», причем на
третьи сутки она составила 6,2 % и достоверно отличалась от двух других
вариантов опыта, на пятый и седьмой день отличалась только от варианта
«Почва с гербицидами». Результаты показывают достоверные различия
между вариантами опыта «Почва без гербицидов» и «почва с гербицидами», различий между вариантами «Почва без гербицидов» и «дистиллированная вода» различии нет. Проростки кресс-салата представлены на рисунке 15.
65
А
А
Б
Б
В
Рисунок 15 – Кресс-салат в устройстве для биотестирования (Патент №
139000). А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, контроль 2;
В – проростки в чашках Петри на дистиллированной воде, контроль 1,
2013 г.
Таким образом, опытов подтверждают, что в варианте с использованием послевсходовых гербицидов идет снижение всхожести семян по
сравнению с контролем. Наименьшие средние значения изучаемых признаков наблюдались на варианте «Почва с гербицидами».
Предложенная нами система оценки качества семян предполагает
выявление вариантов, несущих повышенную агротехнологическую нагрузку по отклонениям в формировании здоровых проростков, а также таким
66
показателям как сила роста и всхожесть семян. Так, наиболее результативной культурой при оценке отзывчивости на присутствие послевсходовых
гербицидов в почве оказался кресс-салат, так как отклик обнаружен уже на
третьи сутки начала эксперимента, на втором месте оказался редис.
Наименее результативной оказалась пшеница, так как эффект негативного
влияния гербицидов проявился только на седьмые сутки.
3.3 Определение длины осевых органов
проростков тест-культур
Проведение биотестирования на определение токсического влияния
поллютантов включает в себя не только определение силы роста семян, но
и исследование ростовых показателей тест-культур, а именно размер осевых органов проростков, в данном случае корешков и ростков.
Тест-параметры, используемые исследователями, довольно неоднозначны. Так, некоторые исследователи анализируют всхожесть, длину корешков проростков и поглотительную способность корней [Антохина С. П.
и др., 2011]. В ряде работ оценивается только длина корешков проростков
[Козлова Е. В., 2011].
В работах Яблонской Е. К. и др. (2006) и Васильева А. В. и др.
(2012) оценивается длина корешка и длина ростка проростков молодых
растений. Несмотря на различия в наборе анализируемых параметров, мы
предпочли методику анализа длины корешка и ростка проростков семян
тест-культур.
При исследовании влияния гербицидов на рост надземной и подземной систем проростков, по результатам Яблонской Е. К. и Плотникова
В. К. (2006), установлено, что гербицид ингибирует рост надземных органов в одних случаях, в других стимулирует, однако не для всех сортов
одинаково. Мы провели исследования по установлению влияния послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо на ростовые ор67
ганы проростков, с использованием устройства для биотестирования [Патент № 139000]. Данные эксперимента по оценке влияния послевсходовых
гербицидов на кресс-салат были обработаны при помощи дисперсионного
анализа (таблица 13).
Таблица 13 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа длины
корешка и ростка проростков кресс-салата, Краснодар (2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в
общей
дисперсии, %
92,48
39,39
53,09
100,00
42,59
57,41
107,55
49,68
57,87
100,00
46,19
53,81
Корешок
Общая
Эффект
Остаточная
21 372,46
7 196,36
14 176,10
269
2
267
Общая
Эффект
Остаточная
24 508,70
9 057,27
15 451,43
269
2
267
3 598,18 67,77
53,09
Росток
4 528,63 78,25
57,87
Для двух исследуемых признаков были установлены существенные
различия между вариантами опыта. Их доля в общей дисперсии превышает
40 %. О том, каков характер различий вариантов позволяет судить результаты множественного сравнения средних значений изучаемых признаков(таблицы 14).
Таблица 14 – Ранговый тест средних значений длины корешка и ростка
проростков кресс-салата, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, мм
Корешок
Почва без гербицидов (контроль 2)
53,82
Дистиллированная вода (контроль 1)
53,21
Почва с гербицидами
42,58
Росток
Почва без гербицидов (контроль 2)
67,28
Дистиллированная вода (контроль 1)
65,44
Почва с гербицидами
54,18
68
Ранговый тест
****
****
****
****
****
****
Установлено, что достоверные различия выявляются только для варианта «Почва с гербицидами» от двух других, между которыми различий
нет. Видно, что применение послевсходовых гербицидов на посевах зерновых культур замедляет развитие органов растений тест-культуры. Проростки кресс-салата представлены на рисунке 16.
Рисунок 16 – Проростки кресс-салата на 7 сутки анализа во время биотестирования почвы, обработанной смесью гербицидов (Пума Супер 75 и
Секатор Турбо).
А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, 2012 г.
Данные эксперимента по оценке влияния гербицидов на надземные
органы пшеницы были обработаны при помощи дисперсионного анализа
(таблица 15).
69
Таблица 15 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа длины
корешков и ростков проростков пшеницы, Краснодар (2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в
общей
дисперсии, %
223,59
399,86
284,73
115,13
100,00
71,21
28,79
552,09
1 495,45
1 285,51
209,94
100,00
85,96
14,04
Корешок
Общая
Эффект
Остаточная
82 220,30
51 481,87
30 738,43
269
2
267
Общая
Эффект
Остаточная
287 865,33
231 811,11
56 054,22
269
2
267
25 740,93
115,13
Росток
115 905,51
209,94
При определении признаков длины корешков и ростков пшеницы
установлено существенное влияние вариантов, доля которого превышает
70 %. О том, каков характер различий вариантов позволяют судить результаты множественного сравнения средних по вариантам (таблицы 16).
Таблица 16 – Ранговый тест средних значений длины корешков и ростков
проростков пшеницы, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, мм
Корешок
Почва без гербицидов (контроль 2)
131,54
Дистиллированная вода (контроль 1)
124,41
Почва с гербицидами
99,34
Росток
Почва без гербицидов (контроль 2)
171,27
Дистиллированная вода (контроль 1)
165,33
Почва с гербицидами
106,36
Ранговый тест
****
****
****
****
****
****
На варианте опыта с почвой без гербицидной обработки при измерении длины корешков и ростков установлено достоверное отличие от
других вариантов опыта. Проростки пшеницы представлены на рисунке 17.
70
Рисунок 17 – Проростки пшеницы во время биотестирования на 7 сутки
анализа почвы, обработанной смесью гербицидов (Пума Супер 75 и Секатор Турбо). А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, 2012 г.
Данные эксперимента по оценке влияния загрязнения почв послевсходовыми гербицидами на рост органов проростков редиса были обработаны при помощи дисперсионного анализа (таблица 17).
Таблица 17 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа длины
корешков и ростков проростков редиса, Краснодар (2011–2014 гг.)
Изменчивость
SS
df
mS
F
Дисперсия
Доля в
общей
дисперсии, %
126,52
181,27
105,57
75,70
100,00
58,24
41,76
Корешок
Общая
Эффект
Остаточная
39 365,63
19 154,81
20 210,82
269
2
267
9 577,40
75,70
71
продолжение таблицы 17
Росток
Общая
Эффект
Остаточная
73 424,71
43 897,31
29 527,43
269
2
267
21 948,6
110,59
198,47
353,23
242,64
110,59
100,00
68,69
31,31
Проведенные нами исследования по определению влияния загрязнения почв послевсходовыми гербицидами на рост осевых органов проростков редиса показали статистически достоверные различия для двух
признаков: длина корешка и ростка. Различия между вариантами опыта
статистически достоверны их доля составляет 58,2% для признака длина
корешков и 68,6% для признака длина ростков.
Таким образом, при исследовании длины корешков и ростков проростков редиса установлено статистически достоверное влияния послевсходовых гербицидов на рост осевых органов. Причем достоверны
различия между вариантами опыта «почва без гербицидов» и «почва с
гербицидами». Проростки редиса представлены на рисунке 18.
Рисунок 18 – Проростки редиса на 7 сутки анализа почвы, обработанной
смесью гербицидов (Пума Супер 75 и Секатор Турбо). А – почва с гербицидами; Б – почва без гербицидов, 2012 г.
72
Завершением дисперсионного анализа был ранговый тест, который
позволил выявить различия между средними значениями каждого варианта
опыта (таблица 18).
Таблица 18 – Ранговый тест средних значений по вариантам длины корешков проростков редиса, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
Среднее, мм
Корешок
Почва без гербицидов (контроль 2)
56,57
Дистиллированная вода (контроль 1)
55,40
Почва с гербицидами
38,14
Росток
Почва без гербицидов (контроль 2)
75,38
Дистиллированная вода (контроль 1)
73,21
Почва с гербицидами
47,31
Ранговый тест
****
****
****
****
****
****
По результатам таблицы 18 можно заключить, что длина осевых органов была выше на варианте «Почва без гербицидов» и достоверно отличалась от варианта с применением гербицидов, а вариант с «Дистиллированной водой» выступал как нейтральный вариант, так как его результаты
были средними по значению между двумя предыдущими.
3.4 Фитоиндикация загрязнения почвы с помощью
ряски малой Lemna minor L.
В качестве тест-растения при проведении биотестирования в нашей
работы был взят четвертый объект – высшее водное растение – ряска малая
(Lemna minor L.). Для объективной оценки о действии поллютанта на свойства почвы согласно требованиям методики биотестирования по которым
тест-объекты должны относится к разным таксономическим группам.
В нашей работе первую группу составили семена кресс-салата, редиса и пшеница, а вторую группу – взрослое растение ряски малой, которая размножается преимущественно вегетативно, и поэтому является кло73
ном растений одного поколения с идеальной генетической однородностью
[Цаценко Л. В., Филипчук О. Д., 1998, 1999, Michel A. et al, 2004]. Ряска
является очень чувствительным и информативным объектом для анализа,
особенно по показателям прироста растений на третьи, пятые и седьмые
сутки. Была использована модель однофакторного дисперсионного анализа, в котором в качестве фактора выступала почва обработанная гербицидами и контроль (почва без обработки гербицидами). Результаты анализа
представлены в таблице 19 и на рисунке 19.
Таблица 19 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа биотестирования почвы с использование тест-культуры ряски малой, Краснодар
(2011–2014 гг.)
Изменчивость
Общая
Факторная
Остаточная
Общая
Факторная
Остаточная
Общая
Факторная
Остаточная
SS
df
mS
F
σ2
Количество листецов на третьи сутки
66,50
17
5,33
29,39
1
29,39
12,67
3,01
37,11
16
2,32
2,32
Количество листецов на пятые сутки
122,50
17
11,03
76,06
1
76,06
26,20
8,13
46,44
16
2,90
2,90
Количество листецов на седьмые сутки
231,78
17
21,22
150,22
1
150,22
29,47
16,13
81,56
16
5,10
5,10
Доля в
общей
дисперсии, %
100,00
56,46
43,54
100,00
73,68
26,32
100,00
75,98
24,02
Межгрупповые различия между вариантами проб почвы по учтенным признакам установлены в каждом из изучаемых временных промежутков. Причем, доля влияния учтенного фактора со временем увеличивается. Так, на третьи сутки она составляет 56,5 %, на пятые – 73,7 %, на
седьмые – 76,0 %. Это позволяет сделать заключение о накоплении однотипности действия токсических веществ в растениях в период эксперимента.
74
Сделать вывод о характере различий между вариантами опыта позволяет сравнение средних значений числа листецов на конкретный момент
времени (таблица 20).
Таблица 20 – Средние значение количества листецов ряски малой в опыте
и контроле (2013 г.)
Вариант опыта
3 сутки
24,78
22,22
2,56
Почва без гербицидов (контроль 2)
Почва с гербицидами
Разность
Среднее, шт
5 сутки
28,22
24,11
4,11
7 сутки
32,00
26,22
5,78
Таким образом среднее значение образовавшихся листецов на третьи сутки составило на контроле 24,78 шт., а на варианте с применением
послевсходовых гербицидов 22,22 шт., на пятые 28,22 шт. и 24,11 шт. соответственно, только на седьмые сутки существенное отличие между вариантами опыта 32,00 и 26,22 шт. соответственно.
Рисунок 19 – Ряска малая в эксперименте по биотестированию почвы,
определение влияния послевсходовых гербицидов на тест-объект на 7-е
сутки закладки опыта. А – ряска малая, на варианте с водной вытяжкой
(почва без гербицидов, контроль 1); Б – ряска малая, на варианте с водной
вытяжкой (почва с гербицидами), 2014 г.
75
Сравнение между двумя группами тест-растений позволяет сделать
вывод о том, что ряска малая по отклику на присутствие послевсходовых
гербицидов в почве аналогично кресс-салату по чувствительности и реакции.
Таким образом, представленные в работе данные по определению
влияния загрязнения почв послевсходовыми гербицидами Пума Супер 75 и
Секатор Турбо на рост и развитие исследуемых культур на различных вариантах опыта дают возможность сделать следующие выводы:
1. выбранные для мониторинга тест-культуры позволяют в однофакторном опыте достоверно определить биологический эффект торможения роста и развития растений при их выращивании в почвах, загрязненных и не загрязненных гербицидами.
2. Для оценки присутствия гербицидов в почве необходимо в качестве индикаторов учитывать рост и развитие осевых органов проростков
тест-растений, всхожесть и силу роста семян озимой пшеницы, редиса,
крес-салата.
3. Для мониторинга загрязнения почв гербицидами отличным тестрастением является ряска малая. При этом достаточно информационным
признаком является прирост количества дочерних листецов, которые следует учитывать на седьмые сутки от начала опыта.
Кресс-салат и ряска малая, как объекты с наибольшей чувствительностью к загрязнению почв гербицидами могут служить основными тестрастениями для мониторинга. Следует заметить, что определение загрязнения почв продуктами антропогенного происхождения (пестицидами и
другими агрохимикатами) не так очевидно, как деградация почв (засоление, эрозия, переуплотнение, истощение и др.), поэтому для достоверной
оценки необходимы исследования разработанной методикой, аналитической базой, которая способна на начальных этапах диагностировать негативное влияние загрязнителей. Известно, что загрязнение почвы связано с
ростом и развитием растения, формированием его репродуктивной систе76
мы. Биотестирование проводят с целью выявления и определения степени
загрязнения по оценке угнетения объекта исследования. В систему биологического тестирования входят следующие этапы:
– определение и обследование объекта наблюдения;
– составление информационной модели объекта;
– подбор способов и методов биотестирования;
– анализ и интерпретация результатов.
Рассмотренные в главе 3 методы биотестирования загрязнения агроценоза озимой пшеницы определили возможность их использования в
системе генетического мониторинга. Главной характеристикой данной системы является эффективность применения кресс-салата и ряски малой в
качестве чувствительных, относительно недорогих и неприхотливых тестобъектов для анализа загрязнения почвы в посевах озимой пшеницы, обработанной послевсходовыми гербицидами (Пума Супер 75 и Секатор
Турбо).
77
ГЛАВА 4
СКРИНИНГ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ПЫЛЬЦЫ И СОСТОЯНИЕ
МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ
РАСТЕНИЙ
Для успешного прохождения процессов микро- и маркроспорогенеза и возможности оплодотворения высшие растения производят качественную пыльцу. Наличие этого процесса служит показателем репродуктивного потенциала высших растений, т. е. в нем находится часть генетической
информации о геноме всего растения и к тому же оно является индикаторным экраном отражающим неблагоприятное воздействие биотических и
абиотических факторов среды на гаметогенез.
Для анализа качества пыльцевых зерен использовали пыльцевой
тест, который основан на разделении пыльцы на стерильную и фертильную. Формирование пыльцы является завершающим процессом микроспорогенеза, поэтому «качество» пыльцы зависит от условий протекания фаз
мейоза. Различные нарушения отражаются на фертильности пыльцы
[Harder L.D., 1998; Яндовка Л. Ф. и др., 2006].
Для успешной оценки токсичного эффекта поллютантов ведут тщательный подбор видов для данного теста по признакам: относительность
длительный периода цветения, универсальность и легкость сбора, низкий
уровень формирования аберрантной пыльцы (до 10 %) у вида [Бессонова В. П. и др., 1997; Цаценко Л. В., 2001].
В нашей работе в качестве объектов исследования влияния применения послевсходовых гербицидов в посевах сельскохозяйственных растений мы использовали линии гербицидоустойчивого подсолнечника, обработанного послевсходовым гербицидом Евро-Лайтнинг, и озимую мягкую пшеницу сорта Таня, растения которой в опыте обрабатывались смесью послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо.
78
4.1 Анализ состояния пыльцы линий гербицидоустойчивого
подсолнечника, обработанного послевсходовым
гербицидом Евро-Лайтнинг
Подсолнечник является перекрестноопыляемой культурой, где число пыльцевых зерен на один цветок достигает 40 тыс. шт. Линии гербицидоустойчивого подсолнечника характеризуются устойчивостью к группе
имидозолиноновых гербицидов. Для каждой культуры фертильность
пыльцевых зерен, необходимая для завязываемости семян в норме может
колебаться от 60 до 100%, что обусловлено типом и способом опыления
(таблица 21).
Таблица 21 – Фертильность пыльцевых зерен линий подсолнечника,
ВНИИМК, Краснодар (2011 г.)
Линия
imi-R7
imi-R12
imi-R17
imi-B5
imi-B7
imi-B19
imi-B21
НСР05
Фертильность пыльцы, %
не обработанные
обработанные
96,3
95,5
95,3
92,3
98,3
93,2
98,4
91,6
97,4
93,8
92,2
98,8
95,1
99,4
2,4
1,0
Анализ данных показал, что снижения фертильности у обработанных линий подсолнечника послевсходовым гербицидом Евро-Лайтнинг не
произошло. Для культуры подсолнечник фертильность пыльцы в норме
достигает 90 – 100%. Во всех случаях фертильность пыльцы была в пределах нормы. Фертильность пыльцы может не отражать эффекты токсичности гербицидов. Для выявления этой мутации в работе был проведен
анализа изменения доли основного типа пыльцевых зерен в зависимости от
обработки послевсходовым гербицидом (таблица 22 и рисунок 20).
79
Рисунок 20 – пыльцевые зерна подсолнечника, окрашенные ацетокармином, А – нормальные пыльцевые зерна; Б – стерильные пыльцевые зерна;
В – деформированные пыльцевые зерна с изливанием содержимого
Таблица 22 – Частота встречаемости различных типов пыльцевых зерен у
линий подсолнечника, ВНИИМК, Краснодар (2011 г.)
Линия
imi-R7
imi-R12
imi-R17
imi-B5
imi-B7
imi-B19
imi-B21
Тип пыльцевых зерен
необработанные
обработанные
основной - аномальныйосновной - аномальныйcтерильный, %
стерильный, %
96 - 3 - 1
89 - 5 - 6
94 - 6 - 0
92 - 5 - 3
97 - 0 - 3
90 - 3 - 7
92 - 3 - 5
87 - 9 - 4
95 - 2 - 3
87 - 5 - 8
98 - 1 - 1
86 - 6 - 8
92 - 4 - 4
85 - 9 - 6
Из данных таблицы 22 видно, что изученные линии подсолнечника
после обработки послевсходовым гербицидом отличались по проценту
80
аномальных пыльцевых зерен, которые не могут успешно участвовать в
процессе оплодотворения. За счет достаточного количества нормальных
пыльцевых зерен,
происходит компенсация и процесс оплодотворения
протекает успешно.
Учитывая тот факт, что анализ пыльцевых зерен является широкоопробированным тестом, тем не менее исследование генетической особенности каждой культуры играет важную роль. Анализ гаметофита у растений подсолнечника позволил оценить действенность данного метода и поскольку существенных отличий не обнаружено мы решили продолжить исследования на культуре отличной от подсолнечника по геномному составу,
технологии возделывания и способу опыления.
4.2 Пыльцевой анализ у растений озимой мягкой пшеницы
Трехлетнее исследование пыльцы озимой мягкой пшеницы, позволили наблюдать изменения состояния мужского гаметофита в вариантах
опыта с озимой мягкой пшеницей при применении послевсходовых гербицидов. Наши исследования были начаты с оценки влияния послевсходовых
гербицидов на пыльцевую продуктивность и качество пыльцы озимой мягкой пшеницы. Оценка была проведена с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.
Эксперимент оценки фертильности пыльцы предусматривал изучение материала за три года. В связи с этим помимо фактора вариант опыта
год также выступал в качестве самостоятельного контролируемого фактора. Результаты эксперимента были обработаны с использованием модели
двухфакторного дисперсионного анализа (таблица 23).
81
Таблица 23 – Результаты двухфакторного дисперсионного анализа фертильности пыльцы пшеницы сорт Таня с факторами «Вариант опыта» и
«Год»
Изменчивость
df
mS
F
Общая
Между годами
Между вариантами
Взаимодействие
Остаточная
239
2
1
2
234
76,91
990,54
99,34
49,08
1,57
20,18
2,02
Доля в обДисперсия щей дисперсии, %
49,08
100
0,00
0,00
7,85
13,41
0,00
0,00
49,08
86,59
Дисперсионный анализ показал, что на фертильность пыльцы зависит только от фактора вариант опыта. Доля его влияния не столь высока и
составляет 13,4%.
Сравнение средних значений фертильности показало, что фертильность в варианте без обработки гербицидами статистически достоверно
выше, чем в варианте с обработкой (х 1=85,96±1,11; х2=79,82±0,52; p<0,05,
где х1 – контроль, х2 – вариант с обработкой гербицидами).
Анализ определения фертильности показал, что на фоне общего количества нормальных (фертильных) пыльцевых зерен встречается небольшой процент абортивных, т. е. с нарушениями структуры оболочки пыльцы, которые представлены в таблице 24.
Таблица 24 – Характеристика пыльцевых зерен озимой мягкой пшеницы
сорта Таня, Краснодар (2011–2014 гг.)
Год
ФертильСреднее, %
ность
2012
2013
2014
пыльцы,
кон- вари- кон- вари- кон- вари- кон- вари%
троль
ант
троль
ант
троль
ант
троль
ант
Фертиль86,1
76,7
85,7
83,0
86,1
79,7
85,9
79,8
ные
Стериль10,5
17,9
10,4
12,2
9,6
14,5
10,1
14,8
ные
Аномаль3,4
5,4
3,9
4,8
4,3
5,8
3,8
5,3
ные
Примечание: Контроль – делянки без обработки гербицидами, вариант –
делянки обработанные гербицидами
82
По результатам представленной таблицы 24, можно сделать вывод,
что у растений без применения послевсходовых гербицидов процент фертильности пыльцы значительно выше, чем на варианте растений с обработкой послевсходовыми гербицидами, данная тенденция прослеживается
во все годы исследований.
Типы пыльцевых зернен озимой мягкой пшеницы представлены на
рисунке 21.
Рисунок 21 – пыльцевые зерна озимой мягкой пшеницы, окрашенные
ацетокармином. А – нормальные пыльцевые зерна; Б – стерильные пыльцевые зерна; В – мелкие пыльцевые зерна; Г – деформированные пыльцевые зерна с изливанием содержимого.
83
Проведенные исследования показали, что существенных различий
между вариантами с обработкой послевсходовыми гербицидами и без нее
не обнаружено. На обоих вариантах среднее количество пыльцевых зерен в
пыльнике находилось в пределах 2829–2946 шт., что достаточно для
успешного оплодотворения.
Рисунок 22 – Проросшие пыльцевые зерна озимой мягкой пшеницы, Краснодар, 2014 г.
Важным показателем качества пыльцы является ее жизнеспособность, т. е. способность пыльцы к прорастанию на рыльце пестика или питательной среде [Симоненко В. К., 1983; Прохоров И. А. и др., 1997]. В
наших исследованиях жизнеспособность пыльцы на пшенице мы определяли в растворе сахарозы. По литературным данным температура для прорастания пыльцевых зерен злаковых культур в условиях термостата составляет
15–40 оС, в течение 2–8 часов. В нашей работе результат
прорастания
пыльцевых зерен пшеницы получили только при температуре + 30 оС, и через 6 часов.
Установлено, что существенных различий между вариантами обнаружено не обнаружено. По определению жизнеспособности пыльцы пшеницы в опытах были предприняты неоднократные попытки установления
зависимости влияния поллютантов на данный показатель, однако получен84
ные данные не позволяют сделать однозначное заключение, так как процент проросших пыльцевых зерен слишком низкий и составляет 5–10 %,
рисунок 22.
Количественный показатель функционально активной пыльцы, достаточный для завязывания семян, у каждого вида растений оказывается
специфичным и определяется биологией развития растения, системой его
размножения, способа опыления и приспособлений к нему [Френкель Р.,
Галун Э., 1982; Круглова Н. Н., 2001]. Для завязывания одного семени
необходимо некоторое минимальное количество пыльцевых зерен, характерное для каждого вида [Пивоваров С. В., Балашова Н. Н., 1995].
Использование гербицидов в современных технологиях– является
обязательным элементом технологии возделывания сельскохoзяйственныx
культур. Bысокое насыщение химическими соединениями, которые характеризуются различной степенью метаболизма в почве и растениях, сказывается на физиологических и биохимических процессах роста и развития
возделываемых культур, отражение на качество урожая, состоянии наземных и подземных вод, плодородии почв [Лунев М. И., 1992; Спиридонов
Ю. Я., 1996]. Оценка и выбор сочетания химических препаратов при применении в качестве агроприемов возделывания, ограничиваются критерием высокого получения урожая. Следует подчеркнуть, что комплексное
применение химических, агрохимических и других методов исследований
в настоящее время является необходимостью [Венгорек B.,1992; Ченкин А.
Ф., 1997].
По результатам наследований можно сделать вывод, что при применении послевсходовых гербицидов на посевах подсолнечника и пшеницы происходит снижение фертильности пыльцы. Однако это влияние не
губительно для растения и мало значимо для урожая. За счет компенсаторного механизма растений и высокой пыльцевой продуктивности культур
процесс опыления и оплодотворения протекает успешно.
85
ГЛАВА 5
АНАЛИЗ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ОЗИМОЙ
МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ
5.1 Формирование элементов продуктивности озимой мягкой
пшеницы с учетом действия послевсходовых гербицидов
При неблагоприятных условиях окружающей среды происходит
нарушение процесса развития генеративных органов, что может привести к
снижению продуктивности растений и в конечном итоге недобору урожая.
Потеря урожая зерна зависит как от продолжительности времени
действия неблагоприятных факторов среды, так и от агротехнологий возделывания. По мнению Галкина А. П. и др. (1999) воздействие негативных
факторов в фазе кущения и трубкования ведет к повреждению ткани формирующих цветков и генеративных клеток, а в фазе цветения нарушение
процесса опылении и оплодотворения. Было выявлено, что гербициды вызывают внутрисортовые изменения, которые характеризуются разной интенсивностью роста и развитием репродуктивных органов, а так же с индивидуальными генетическими особенностями самого растения [Заугольнова Л. Б. и др., 1976; Гасанов Г. Н., и др. 2010].
Оценка озимой мягкой пшеницы сорта Таня по основным элементам продуктивности представляет интерес при определении уровня реализации генетического потенциала урожайности сорта в определенных условиях возделывания.
Сравнение признаков продуктивности растений пшеницы в вариантах с обработкой и без обработки послевсходовыми гербицидами было
первоначально выполнено с использованием t-критерия Стьюдента (таблица 25).
86
Таблица 25 – Сравнение средних значений признаков продуктивности
озимой мягкой пшеницы сорт Таня (2011–2014 гг.)
Элементы продуктивности
Среднее 1 Среднее 2 t-критерий
Длина колоса, см
10,15
9,23
4,24 *
Число колосков в колосе, шт
19,40
18,08
5,61 *
Число недоразвитых колосков в ко1,04
0,83
1,67
лосе, шт
Масса колоса, г
2,12
1,94
2,59 *
Число зерен с колоса, шт
35,78
33,31
2,35 *
Число недоразвитых зерен с колоса,
0,65
0,67
0,12
шт
Масса зерен с колоса, г
1,56
1,48
1,92
Масса 1000 зерен, г
42,23
43,72
-1,43
Примечание: Среднее 1 – контроль, среднее 2 – варианты с обработкой гербицидами; * указывает на достоверность различий
По результатам сравнения установлено, что из 8 учтенных признаков статистически достоверные различия выявлены только для четырех:
длина колоса, число колосков, масса колоса, число зерен с колоса.
Для этих признаков установлено достоверное превышение значений
в варианте без обработки, что свидетельствует о негативном влиянии внесения послевсходовых гербицидов на продуктивные качества растений
пшеницы.
Известно, что продуктивные качества растений, оцениваемые в
рамках полевых экспериментов, зависят от конкретных условий сезонов
вегетации, что может внести свои коррективы
в конечный результат. В
связи с этим на материале изучения продуктивности растений пшеницы
был выполнен двухфакторный перекрестный дисперсионный анализ с факторами «вариант опыта» и «год» (таблица 26).
Таблица 26 – Результаты двухфакторного дисперсионного анализа признаков продуктивности пшеницы сорт Таня (2011–2014 гг.)
Изменчивость
df
mS
F
Дисперсия
Доля в общей
дисперсии, %
3,30
100,00
Длина колоса
Общая
599
87
продолжение таблицы 26
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
2
1
2
594
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
mS
F
Дисперсия
599
3,94
2
5,08
1,42
0,00
1
114,68
32,06
0,37
2
2,11
0,59
0,00
594
3,58
3,58
Число недоразвитых колосков в колосе
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
599
2
1
2
594
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
599
2
1
2
594
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
23,13
7,69
0,10
55,59
18,47
0,18
4,20
1,39
0,00
3,01
3,01
Число колосков в колосе
mS
F
Дисперсия
1,02
0,08
0,00
0,00
0,92
16,27
17,71
2,78
3,02
2,38
2,59
0,92
Масса колоса
mS
F
Дисперсия
15,46
73,74
2,01
9,59
1,04
4,96
0,21
Число зерен в колосе
mS
F
0,30
0,08
0,01
0,01
0,21
Дисперсия
599
70,19
2
1757,96 28,92
8,49
1
399,29
6,57
1,13
2
39,09
0,64
0,00
594
60,79
60,79
Число недоразвитых зерен в колосе
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
599
2
1
mS
0,06
0,01
88
F
Дисперсия
0,07
0,01
0,82
0,00
0,00
3,18
5,45
0,00
91,37
Доля в общей
дисперсии, %
100,00
0,00
9,39
0,00
90,61
Доля в общей
дисперсии, %
100,00
7,58
0,00
0,00
92,42
Доля в общей
дисперсии, %
100,00
25,40
2,00
2,76
69,84
Доля в общей
дисперсии, %
100
12,01
1,38
0,00
86,61
Доля в общей
дисперсии, %
100
0,00
0,00
продолжение таблицы 26
Взаимодействие
Остаточная
2
594
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
599
2
1
2
594
Изменчивость
df
Общая
Год
Вариант
Взаимодействие
Остаточная
599
2
1
2
594
0,47
0,57
0,00
0,83
0,83
Масса зерен с колоса
mS
F
Дисперсия
11,87
76,57
0,77
4,95
1,49
9,58
0,16
Масса 1000 зерен
F
Дисперсия
50,98
2,48
15,29
82,40
14,73
0,00
8,43
58,96
mS
3005,35
146,07
901,46
58,96
0,23
0,06
0,00
0,01
0,16
0,00
100,0
Доля в общей
дисперсии, %
100
25,59
0,89
5,81
67,71
Доля в общей
дисперсии, %
100
17,89
0,00
10,44
71,67
Дисперсионный анализ показал, что различия между годами вносят
заметное варьирование для 6 признаков. Их доля колебалась от 3 % до
25 %. Различия между вариантами опыта выявлены для пяти признаков, их
доля составляла от 1 % до 17 % от общей изменчивости признаков. Взаимодействие установлено в трех случаях с эффектом 2 –10 %.
Невысокая доля эффектов контролируемых факторов («Год», «Вариант» и «Взаимодействие») объясняется высокой остаточной дисперсией,
однако сам факт выявления достоверных различий между средними разных факторов.
Результаты множественного сравнения средних значений по признакам продуктивности растений представлены в таблице 27.
89
Таблица 27 – Результаты множественного сравнения средних значений по
признакам продуктивности растений, Краснодар (2011–2014 гг.)
Вариант
С обработкой
Без обработки
С обработкой
Без обработки
С обработкой
Без обработки
С обработкой
Без обработки
С обработкой
Без обработки
Среднее
Ранговый тест
Длина колоса, см
9,2
****
10,2
****
Число колосков в колосе, шт
18,08
****
19,40
****
Масса колоса, г
1,94
****
2,12
****
Число зерен с колоса, шт
33,31
****
35,78
****
Масса зерен с колоса, г
1,45
****
1,56
****
Длина колоса в варианте «Без обработки» статистически достоверно
была больше, чем в варианте «С обработкой», так 10,2 см против 9,2 см,
соответственно. «Число колосков в колосе» так же на контрольном варианте была выше, чем в исследуемом варианте.
Количество зерен в колосе на варианте с обработкой послевсходовыми гербицидами составило 33,3 шт., а на варианте без обработки
–
35,8 шт., что свидетельствует о не существенном различии между вариантами опыта.
Воздействие послевсходовых гербицидов на культурные растения
проявляется, как правило, не в их гибели, а некотором снижении интенсивности роста, изменениях репродуктивных органов и в конечном итоге –
на урожайности растений. В благоприятных для роста и развития растений
условиях фитотоксическое действие послевсходовых гербицидов может
оказаться не очевидным, так как будет скомпенсировано устранением сорняков и за счет этого увеличением урожайности.
90
5.2 Подходы к исследованию потомства озимой мягкой
пшеницы сорта Таня на действие послевсходовых гербицидов
Пума Супер 75 и Секатор Турбо
Проведенные нами исследования по установлению зависимости
влияния послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо, на
ценоз в целом, показали неоднозначные результаты. Так, при проведении
биологического тестирования почвы наиболее чувствительными оказались
кресс-салат, как представитель семенных культур и ряска малая, как
взрослое растение одного поколения.
Исследования
репродуктивной
системы
сельскохозяйственных
культур на примере состояния мужского гаметофита и анализа структуры
урожая позволяет получить интегральную оценку состояния целого растения в ценозе, проследить изменения, затрагивающие репродуктивную систему и отражение влияния на потомство, выбрать стратегию селекционных работ с учетом воздействия гербицидной нагрузки.
В целях полной оценки последствий применения гербицидов на
возделываемые растения нами были проведены исследования по установлению последствий
влияния послевсходовых гербицидов в потомстве.
Анализ по определению фертильности пыльцы в потомстве, обработанных
гербицидами материнских растений представлен в таблице 28.
Таблица 28 – Фертильность пыльцевых зерен в потомстве, обработанных
послевсходовыми гербицидами растений озимой мягкой пшеницы сорта
Таня, Краснодар (2013–2014 гг.)
Фертильных пыльцевых
зерен, %
Вариант
mах
min
V,% ср.кв.откл.
μ
̅
Контроль
86,1
94
71
7,54
6,49
1,31
Контроль 2
82,4
92
62
10,95
9,02
1,81
Вариант 1
82,8
94
70
9,59
7,94
1,59
Вариант 2
80,9
89
70
6,34
5,13
1,03
Примечание: Контроль – без обработки гербицидами два года проведения
исследований; контроль 2 – обработка гербицидами на второй год прове91
дения исследований; вариант 1 – гербицидная обработка на второй год исследования не проводилась; вариант 2 – два года проводили гербицидную
обработку. V – коэффициент вариации, μ – средняя ошибка выборки.
Установлено, что фертильность пыльцевых зерен в потомстве не зависит от обработки растений послевсходовыми гербицидами не смотря на
высокий коэффициент вариации (от 6, 34 % до 10,95 %).
Таблица 29 – Результаты двухфакторного дисперсионного анализа признаков продуктивности пшеницы сорт Таня при изучении влияния послевсходовых гербицидов в потомстве, Краснодар (2014 г.)
Длина колоса
Число колосков
Число недоразвитых колосков
Масса колоса
Число зерен с колоса
Число недоразвитых зерен с
колоса
Масса зерен с колоса
Масса 1000 зерен
Длина колоса
Число колосков
Число недоразвитых колосков
Масса колоса
Число зерен с колоса
Число недоразвитых зерен с
колоса
Масса зерен с колоса
Масса 1000 зерен
Длина колоса
Число колосков
Число недоразвитых колосков
Масса колоса
Число зерен с колоса
Контроль
mах
7,5
15
0
0,68
15
0
min
11
23
5
2,93
49
3
̅
8,75±0,107
18,82±0,239
2,92±0,187
1,45±0,070
27,71±1,153
0,74±0,121
0,48
18,3
Контроль 1
mах
6
16
0
0,66
15
1,97
47,9
1,07±0,052
39,10±0,918
min
11
21
6
2,93
47
Среднее
8,77±0,136
18,56±0,174
2,52±0,239
1,53±0,050
30,84±1,173
0
0,21
14
Вариант 1
mах
8
16
0
0,84
17
3
1,63
54,3
0,66±0,112
1,10±0,035
37,05±1,373
min
12,5
23
2
2,6
57
Среднее
9,64±0,147
19,46±0,224
0,44±0,091
1,63±0,057
33,82±1,208
92
продолжение таблицы 29
Число недоразвитых зерен с
колоса
Масса зерен с колоса
Масса 1000 зерен
0
0,55
25,4
Вариант 2
mах
8
17
0
1,31
23
3
1,86
47,1
0,71±0,119
1,14±0,044
34,01±0,682
min
12
22
2
3,24
52
Среднее
9,95±0,137
19,41±0,187
0,38±0,094
2,05±0,069
39,10±0,995
Длина колоса
Число колосков
Число недоразвитых колосков
Масса колоса
Число зерен с колоса
Число недоразвитых зерен с
колоса
0
3
0,50±0,104
Масса зерен с колоса
0,79
2,32
1,51±0,053
Масса 1000 зерен
29,3
47,8
38,38±0,671
Примечание: Контроль – без обработки гербицидами два года проведения исследований; Контроль 2 – обработка гербицидами на второй год проведения исследований; Вариант 1 – гербицидная обработка на второй год исследования не проводилась; Вариант 2 – два года проводили гербицидную обработку.
Из таблицы видно, что при анализе потомства на выявление влияния послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо значительных различий между вариантами не обнаружено, однако на вариантах
с применением гербицидов по показателям «Длина колоса», «Масса колоса», «Число зерен» происходит небольшое увеличение значений признака.
Известно что масса 1000 зерен стабильна для каждого генотипа и мало зависит от условий опыта. В работе так же замечено, что она изменяется вне
зависимости от применения гербицидов на материнские растения. Этот
случай подтверждает гипотезу о том, что гербициды не вызывают мутации
и не изменяют наследование признаков в поколениях.
Таким образом анализ данных представленные в таблицах 28 и 29
позволяет сделать вывод, что действие послевсходовых гербицидов на
потомство растений пшеницы не проявляется по таким показателям как
фертильность пыльцы, длина колоса, масса колоса и число зерен с колоса,
т. е. проявляется на двух уровнях клеточном и организменном. Возможно,
93
это связано с механизмом действия самого препарата или кумулятивной
системы растений пшеницы.
Предлагаемая нами схема анализа влияния послевсходовых гербицидов на репродуктивную систему сельскохозяйственных растений представлена на рисунке 23.
Влияние послевсходовых
гербицидов на репродуктивную систему сельскохозяйственных растений
Анализ продуктивности растений
пшеницы
Рисунок 23 – Схема проведения скрининга действия послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо, на примере озимой мягкой пшеницы.
Проведение цитогенетического скрининга посевов пшеницы может
Биотестирование
почвы
Пыльцевой
анализ
проходить в несколько этапов:
1. Биотестирование почвы, нацеленное на выявление негативного
действия послевсходовых гербицидов, которые тестируют на двух культурах: кресс-салате, как семенной тест и ряске малой, как взрослое растение.
При проведении анализа необходимо учитывать следующие показатели:
энергию прорастания семян тест-культур, силу роста и всхожесть семян,
длину ростовых (осевых) органов тест-культур, число листецов на 3, 5 и 7
сутки, что подтверждает таблица 30.
2. Из пыльцевого анализа в скрининг включают анализ фертильности и стерильности, поскольку эти показатели являются наиболее информативными по сравнению с жизнеспособностью пыльцы растений.
3. Анализ репродуктивного потенциала культуры связан с продуктивностью растений, и включает восемь показателей: 1) длина колоса, 2)
число колосков, 3) число зерен, 4) масса колоса, 5) масса зерен, 6) число
94
недоразвитых колосков, 7) число недоразвитых зерен. 8) масса 1000 зерен.
В нашем случае информативными оказались четыре: длина колоса, число
колосков, масса колоса, число зерен с колоса.
Общая схема проведения скрининга представлена в таблице 30, которая состоит из трех основных блоков: 1-й блок (Биотестирование почвы), 2-й блок (Пыльцевой анализ), 3-й блок (Анализ продуктивности растений пшеницы).
Таблица 30 – Рекомендации по проведению тестирования действия гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо в посевах пшеницы
Метод
анализа
Цель
исследования
1-й блок
Биотестирование
почвы
Выявление
негативных
эффектов
применения
послевсходовых гербицидов на почву
как один из
компонентов
ценоза
Рекомендуемый
способ
Тестирование почвы проводить несколькими методами, в том числе методом
прямого высева семян в почву, обработанной послевсходовыми гербицидами.
Использовать в качестве тест-объектов
несколько культур, разных по таксономической характеристике (рекомендуются семена кресс-салата и ряска малая, как
взрослое растение).
Учитывать следующие показатели:
1. энергию прорастания семян тесткультур;
2. силу роста и всхожесть семян;
3. длину ростовых (осевых) органов тесткультур;
4. число листецов на 3, 5 и 7 сутки.
При проведении исследований сбор
материала (пыльцы) осуществлять в фазу
начала цветения (девятый этап органогенеза) и проводить в утренние часы.
95
продолжение таблицы 30
2-й блок
Пыльцевой
анализ
Влияние послевсходовых
гербицидов на
репродуктивную систему
сельскохозяйственных растений
3-й блок
Анализ продуктивности растений
Влияние гербицидов на
репродуктивную систему
сельскохозяйственных растений
Использовать метод определения фертильности пыльцевых зерен, в выборку
включать по 10 растений с каждого варианта опыта. При этом проводить анализ
пыльцы не менее чем на 100 пыльцевых
зернах и учитывать следующие параметры:
1. фертильность пыльцы;
2. стерильность пыльцы;
3. наличие аномальных пыльцевых зерен.
Для подсчета количества пыльцевых зерен использовать камеру Горяева и в качестве красителя использовать ацетокармин или раствор йодида калия.
Анализ продуктивности растений пшеницы проводить по следующим показателям:
1. длина колоса,
2. число колосков в колосе,
3. число зерен с колоса,
4. масса колоса,
5. масса зерен с колоса,
6. число недоразвитых колосков,
7. число недоразвитых зерен с колоса.
8. масса 1000 зерен.
Полученные и обоснованные критерии коррелируют с цитологическими показателями продуктивности озимой мягкой пшеницы и позволят
рекомендовать систему анализов включающую три блока «Биотестирование почвы», «Пыльцевой анализ», «Анализ продуктивности растений».
96
ВЫВОДЫ
Проведенные в 2011–2014 годах исследования по изучению влияния
послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо на репродуктивную систему сельскохозяйственных растений и почву позволили сделать следующие выводы:
1. Наиболее эффективной культурой по отзывчивости на присутствие послевсходовых гербицидов Пума Супер 75 и Секатор Турбо в почве
является кресс-салат, так как он показал результат уже на третьи сутки от
начала эксперимента. Другим пригодным для тестирования растение является редис, различия между вариантами эксперимента были выявлены на
третьи и седьмые сутки оценки эксперимента. Наименее результативной
оказалась пшеница, так как эффект негативного влияния послевсходовых
гербицидов проявился только на седьмые сутки.
2. При исследовании длины корешков и ростков пригоден для тестирования кресс-салат. Аналогичен ему редис, на котором были получены
достоверные различия между вариантами опыта.
4. В мониторинге токсического действия послевсходовых гербицидов можно использовать ряску малую, по которой легко дифференцировать почву разного уровня загрязнения на седьмые сутки проведения эксперимента.
5. Разработаны и предложены
для практического использования
биологического тестирования почвы биологические модели анализа почвенных образцов, позволяющих поддерживать постоянный микроклимат
тестируемых образцов. На разработанные модели получены два патента
Российской Федерации (Устройство для биотестирования почвы: патент на
полезную модель № 139000 РФ, 2014; Переносной контейнер для биотестирования почвы: патент на полезную модель № 148100 РФ, 2014).
5. Анализ линий гербицидоустойчивого подсолнечника, обработанного послевсходовым гербицидом Евро-Лайтнинг в фазу 3–4 пар настоя97
щих листьев показал, что фертильность пыльцы у обработанных линий
подсолнечника не снижается при норме фертильности 90–100%. Во всех
случаях фертильность пыльцы была в пределах нормы. По результатам
анализа репродуктивной системы озимой мягкой пшеницы было получено,
что на фертильность пыльцы достоверно влияет только вариант опыта
«Обработка гербицидами».
6. Исследования количества пыльцевых зерен в пыльнике пшеницы
в зависимости от обработки послевсходовыми гербицидами Пума Супер 75
и Секатор Турбо в фазе кущения показали, что существенных различий
между вариантами с обработкой гербицидами и без нее не обнаружено,
среднее количество пыльцевых зерен в пыльнике находилось в пределах
2829–2946 шт., что достаточно для успешного оплодотворения. Определению жизнеспособности пыльцы пшеницы в лабораторных условиях не дает
информации о влиянии послевсходовых гербицидов на растения пшеницы,
так как процент проросших пыльцевых зерен слишком низкий и колеблется в пределах 5–10%.
7. По результатам сравнения элементов продуктивности растений
пшеницы установлено, что из 8 учтенных признаков статистически достоверные различия выявлены только для четырех: длина колоса, число колосков, масса колоса, число зерен с колоса в изученных вариантах, что
свидетельствует о негативном влиянии внесения послевсходовых гербицидов на продуктивные качества растений пшеницы. Различия между годами
установлены для 6 признаков. Их доля в общей дисперсии варьировала от
3 % до 25 %. Различия между вариантами опыта выявлены по пяти признаков, их доля составляла от 1 % до 17 % от общей изменчивости признаков.
Невысокая доля эффектов изученных факторов дисперсии («Год», «Вариант» и «Взаимодействие») объясняется значительной индивидуальной изменчивостью растений в пределах изучаемых выборок. Показатели продуктивности колоса растений в варианте «Без обработки» статистически
достоверно были больше, чем в варианте «С обработкой».
98
8. Фертильность пыльцевых зерен, в зависимости от обработки послевсходовыми гербицидами не изменяется в потомстве. Отклонение от
средних значений в процентном отношении составляет от 6,34% до
10,95%. При анализе потомства обработанных растений на выявление влияния послевсходовых гербицидов по показателям продуктивности растений различий по вариантам не наблюдается.
Таким образом на элементы продуктивности колоса растений пшеницы послевсходовые гербициды, применяемые на материнские растения,
в их потомстве не влияют, продуктивность не меняется.
99
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИКИ
Предлагаются методы оценки адаптивных и урожайных свойств
высших растений подвергнутых обработке послевсходовыми гербицидами
на основе анализа репродуктивной системы, по состоянию мужского гаметофита, анализа структуры урожая колоса и биотестирования почвы.
При биологическом тестирования почвы на присутствие послевсходовых гербицидов анализируют почву с использованием биологических
моделей, на которые получены патенты Российской Федерации (Патент на
полезную модель № 139000 РФ, 2014; № 148100 РФ, 2014) и двух тесткультур: кресс-салата и ряски малой.
Для индивидуального анализа продуктивности растений использовать биологические модели, сушки малых партий семян и хранения плодов растений, на которые получены патенты Российской Федерации (Патент на полезную модель № 140303 РФ, 2013; № 146651 РФ, 2014).
Для оценки действия послевсходовых гербицидов на растения в посевах подсолнечника и озимой мягкой пшеницы использовать пыльцевой
анализ с определением фертильности и однородности пыльцевых зерен.
100
Список использованных источников
Авторские свидетельства и патенты на селекционное достижение,
изобретение.
1. Свидетельство
о
государственной
регистрации
базы
данных
№ 2014620098 РФ, Иллюстрированный гид по теме «Мейоз у растений /
Цаценко Л. В., Синельникова А. С. Заявка № 2013621519, дата приоритета
от 18.11.2013. – авт. 15 %.
2. Свидетельство
о
государственной
регистрации
базы
данных
№ 2014621088 РФ, Модели в биологических исследованиях» / Цаценко Л.
В., Синельникова А. С., Цаценко Н. А. // Заявка № 2014620790, дата приоритета 11.06.2014. – авт. 15 %.
3. Свидетельство о государственной регистрации базы данных №
2012620192РФ,
Пыльцевой анализ
в иллюстрациях и комментариях /
Цаценко Л. В., Синельникова А. С. // Заявка № 2011620973, дата приоритета 15.12.2011. – авт. 15 %.
4. Патент на полезную модель № 139000 РФ, Устройство для биотестирования почвы: МКП А01G / Цаценко Л. В., Звягина (Синельникова)
А. С., Цаценко Н. А., заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО Кубанский ГАУ. – № 2013148492/13, заявл. 30.10.2013: опубл. 27.03.2014, Бюл.
№ 9. – авт. 15 %.
5. Патент на полезную модель № 140303 РФ, Контейнер для сушки
малых партий семян: МКП А23L3/00 / Цаценко Л. В., Звягина (Синельникова) А. С., Цаценко Н. А., заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО
Кубанский ГАУ. – № 2013157689/13, заявл. 24.12.2013: опубл.10.05.2014,
Бюл. 12. – авт. 15%.
6. Патент на полезную модель № 146651 РФ, Контейнер для сушки
и хранения плодов: МКП А01F 25/14 (2006.01), А01F 25/00 (2006.01),
B65B 25/02 (2006.01) / Цаценко Л. В., Моисеев А. В., Звягина (Синельникова) А. С., Цаценко Н. А., заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО
101
Кубанский ГАУ. – № 148100 U 1, заявл. 01.07.2014: опубл 20.10.2014),
Бюл. 29. – авт. 15%.
7. Патент на полезную модель № 148100 РФ, Переносной контейнер для биотестирования почвы: МКП А01 G 31/02 (2006.01) / Цаценко Л. В., Перминова Г. В., Звягина (Синельникова) А. С., Цаценко Н. А.,
заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО Кубанский ГАУ. – № 148100
U 1, заявл. 29.07.2014: опубл. 27.11.2014, Бюл. 33. – авт. 15%.
8. Агроклиматические ресурсы Краснодарского края. – Ленинград,
1975. – 276 с.
9. Агрометеорологический обзор за 2011–2012 сельскохозяйственный год по Краснодарскому краю. – Краснодар: ГУ «Краснодарский краевой центр по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды»,
2012.
10. Агрометеорологический обзор за 2012–2013 сельскохозяйственный год по Краснодарскому краю. – Краснодар: ГУ «Краснодарский краевой центр по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды»,
2013.
11. Агрометеорологический обзор за 2013–2014 сельскохозяйственный год по Краснодарскому краю. – Краснодар: ГУ «Краснодарский краевой центр по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды»,
2014.
12. Альтергот В. Ф. Тепловые нарушения развития мужского гаметофита у яровой пшеницы / В. Ф. Альтергот, С. С. Мордкович, Л. Г. Фадеева // Физиология и биохимия культурных растений. – 1998. – Т. 10. № 5. –
С. 451–456.
13. Анащенко А. В. Достижения и перспективы селекции подсолнечника. М., ВНИИТЭИСХ, 1977. – 53 с.
14. Антохина С. П. Влияние некоторых гербицидов на сельскохозяйственные растения / С. П. Антохина, Е. С. Патей, Н. В. Кабанова, А. И.
Соколик, В. М. Юрин // Труды БГУ. – 2011. – Т. 6 (2). – С. 22–32.
102
15. Бажина Е. В. Влияние язвенного рака на жизнеспособность
пыльцы и изменчивость признаков побегов сосны обыкновенной / Е. В.
Бажина, П. И. Аминев //Экология. – 2012. – № 2. – С. 96–101.
16. Бажина Е. В. Мейоз при микроспорогенезе и жизнеспособности
пыльцы у пихты сибирской в среднегорье Восточного Саянса / Е. В. Бажина, О. В. Квитко, Е. Н. Муратова // Лесоведение. – 2007. № 1.– С. 57–64.
17. Балина Н.В. Действие повышенных температур на рост пыльцевых трубок / Н. В. Балина // Физиология растении. – 1976. – Т. 23. № 4. –
С. 805–811.
18. Барская Е. И. О роли каллозы в пыльниках растении / Е. И. Барская, Н. В. Балина // Физиология растении. – 1977. – Т. 18. № 4. – С. 716–
721.
19. Барыкина Р. П. Справочник по ботанической микротехнике /
Р. П. Барыкина, Т. Д. Веселова, А. Г. Девятов и др. – М. : Изд-во МГУ,
2004. – 312 с.
20. Батыгина Т. Б. Движение ядра и клеток в развивающемся пыльцевом зерне / Т. Б. Батыгина, Н. Н. Круглова // Эмбриология цветковых
растений. Терминология и концепции. Т. 1: Генеративные органы цветка.
СПб. : Мир и семья. – 1994. – C. 99–101.
21. Батыгина Т. Б. Микроспорогенез и развитие пыльцевого зерна у
пшеницы / Т. Б. Батыгина// Докл. АН СССР. – 1962. – Т. 142. – № 5. –
С. 1205–1208.
22. Батыгина Т. Б. От микроспоры – к сорту
/ Т. Б. Батыгина,
Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова и др. – М. : Наука. – 2010. – 174 с.
23. Батыгина Т. Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза / Т. Б. Батыгина //Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1: Генеративные органы
цветка. – СПб. : Мир и семья. – 1994. – С.120–121.
24. Батыгина Т. Б. Размножение растений / Т. Б. Батыгина, В. Е. Васильева. СПб. : Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2002. – 232 с.
103
25. Батыгина Т. Б. Хлебное зерно: атлас / Т. Б. Батыгина. – Л. :
Наука, 1987. – 102 с.
26. Батыгина Т. Б. Эмбриология пшеницы / Т. Б. Батыгина. – Л.,
«Колос», 1974. – 206 с.
27. Бессонова В. П. Влияние загрязнения окружающей среды на
мужскую фертильность декоративных цветочных растений / В. П. Бессонова, Л. М. Фендюр, Т. Н. Пересыпкина // Бот.журнал. – 1997. – Т. 82.
№ 5. – С. 38–45.
28. Бессонова В. П. Влияние загрязнения среды на прорастание и
физиологическое состояние
пыльцы некоторых древесных растений /
В. П. Бессонова, И. И. Люженко // Бот. журнал. – 1991. – Т. 76. № 3. –
С. 422–426.
29. Бессонова В. П. Состояние пыльцы как показатель загрязнения
среды тяжелыми металлами / В. П. Бессонова // Экология. – 1992. – № 4. –
С. 45–50.
30. Билич Г. Цитология / Г. Билич, Г. С. Катинас, Л. В. Назарова :
Учебник. – 2- изд., испр. и доп. – СПб. : Деан, 1999. – 112 с.
31. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и
биотестирование. Под ред. Мелеховой О. П., Егоровой Е. И. М. : Академия, 2007. – 288 с.
32. Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг: учеб. пособие для студ. высш. проф. образования / С. А. Гераськин, Е. И. Сарапульцева, Л. В. Цаценко и др.; под ред. С. А. Гераськина и
Е. И. Сарапульцевой. – М. : Издательский центр «Академия»,
2010. –
208 с.
33. Биологический энциклопедический словарь. Гл. ред. М. С. Гиляров; Редкол.: А. А. Бабаев, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин и др. – 2-е изд.,
исправл. – М. : Советская энциклопедия, 1986. – 831 с.
34. Брейгина М. А. Изменения мембранного потенциала в процессе
прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки / М. А. Брейгина,
104
А. В. Смирнова, Н. П. Матвеева, И. П. Ермаков // Цитология. – 2009. –
Т. 51. № 10. – С. 815–823.
35. Вайнагий И. В. О методике изучения семенной продуктивности
растений / И. В. Вайнагий // Бот. журн. – 1974. Т. 59. № 6. – С. 826–831.
36. Вальков В. Ф. Почвоведение (Почвы Северного Кавказа) / В. Ф.
Вальков, Ю. А. Штомпель, В. Н. Тюльпанов // Краснодар: Изд-во «Советская Кубань», 2002. – 722 с.
37. Васильев А. В. Экологический мониторинг токсического загрязнения почвы нефтепродуктами с использованием методов биотестирования / А. В. Васильев, В. В. Заболотских, О. В. Тупицына, А. М. Штеренберг // Электронный научный журнал «Нефтегазовое дело». – 2012. –
№ 4 – С. 242–250.
38. Венгорек В. Влияние пестицидов на урожай и окружающую среду / В. Венгорек // Защита растений. – 1992. – № 10. – С. 6–8.
39. Веселова Т. Д. О возможности выявления видов индикаторов загрязнения окружающей среды на основании анализа состояния мужской
генеративной сферы у цветковых растений / Т. Д. Веселова, Н. А. Гревцова, Х. Х. Джалилова и др.// Бюл. Моск. общ-ва испытателей природы. –
1996. – Т. 101. Вып. 4. – С. 69–72.
40. Воронова О. Н. Аномалии в развитии репродуктивной системы
подсолнечника фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в
начале XXI века / О. Н. Воронова // Материалы всероссийской конференции. Эмбриология и репродуктивная биология. Петрозаводск: Карельский
научный центр РАН. – 2008 С. 262–264.
41. Галицкая П. Ю. Тестирование отходов, почв, материалов с использованием живых систем : Учебно-методическое пособие / П. Ю. Галицкая, С. Ю. Селивановская, Р. Х. Гумерова. – Казань: Казанский университет, 2011. – 47 с.
42. Галкин А. П. Популяционная генетика: эффекты инбридинга /
А. П. Галкин, С. В. Мыльников, В. Г. Смирнов // Вестник Санкт105
Петербургского университета. – Сер. 3. – 1999. – № 4. – С. 32–34.
43. Гасанов Г. Н. Озимая пшеница без применения гербицидов /
Г. Н. Гасанов, А. А. Айтемиров // Защита и карантин растений. – 2010. –
№ 9. – С. 36–35.
44. Геодакян В. А. Количество пыльцы как передатчик экологической информации и регулятор эволюционной пластичности растений / В.
А. Геодакян // Жypн. общ. биологии. – 1978. – 39. – № 5. – С. 743–753.
45. Гилберт С. Биология развития (в трех томах). – М. : Мир, 1994.
Т. 3. – 352 c.
46. Голубинский И. Н. Биология прорастания пыльцы / И. Н. Голубинский. – Киев: Наукова думка, 1974. – 368 с.
47. ГОСТ 12038-84 Семена сельскохозяйственных культур. Методы
определения всхожести. – Введ. 01.07.1986. – М. : 2011. – 30 с.
48. Губанов Я. В. Озимая пшеница / Я. В. Губанов, Н. Н. Иванов. –
М., 1983. – 358 с.
49. Гудкова Т. И. Физиолого-цитологические исследования причин
стерильности пыльцы яровой пшеницы в условиях пониженных температур / Т. И. Гудкова // Научные труды СПбАУ. – 2000. – Вып. 394. – С.103–
108.
50. Дзюба О. Ф. Полииндикация качества окружающей среды /
О. Ф. Дзюба. – СПб: Недра, 2006. – 198 с.
51. Дмитриев А. И. Биоиндикация / А. И. Дмитриев. – Н. Новгород,
1996. – 33 с.
52. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта : (с основами статистической обработки результатов исследований) / Б. А. Доспехов. – М. :
Колос, 1979. – 416 с.
53. Другов Ю. С. Мониторинг органических загрязнений природной
среды: 500 методик : практ. руководство / Ю. С. Другов, А. А. Родин. –
М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 893 с.
106
54. Дубровский М. Л. Цитологические особенности формирования
мужского гаметофита у отдаленных гибридов Pyrus Malus и Ribes
Crossularia / М. Л. Дубровский, Р. В. Папихин, С. А. Брюхина // Вестник
Тамбовского ун-та. – 2011. – Т. 16. №2. – С. 633–637.
55. Дьяченко Г. И. Мониторинг окружающей среды (экологический
мониторинг) : учебное пособие / Г. И. Дьяченко. – НГТУ, 2003. – 64 c.
56. Евгенъев М. И. Тест-методы и экология / М. И. Евгенъев // Соросовский образ. журнал. – 1999. – Т. 5. № 11. – С. 29–34.
57. Жученко А. А. Генетика томатов / А. А. Жученко. – Кишинев:
Штиинца, 1973. – 663 с.
58. Заболотских В. В. Биоиндикация и биотестирование: лабораторный практикум / В. В. Заболотских, Л. В. Нюхтина, О. В. Бынина. – Тольятти: ТГУ, 2011. – 135 с.
59. Заболотских В. В. Экспресс-диагностика токсичности почв, загрязнѐнных нефтепродуктами / В. В. Заболотских, А. В. Васильев, С. Н.
Танких //Известия Самарского научного центра Российской академии наук.
2012. – Т. 14. №1 (3). – С. 734–738.
60. Заугольнова Л. Б. Неоднородность особей в пределах популяций
по некоторым признакам экобиоморфы / Л. Б. Заугольнова, Т. Д. Михайлова, Е. А. Просвирнина // Ценопопуляции растений (основные понятия и
структура). – М. : Наука. 1976. – С. 61–70.
61. Захаренко В. А. Защита растений в третьем тысячелетии. (Материалы XIV международного конгресса по защите растений) / В. А. Захаренко // Агрохимия. – 2000. – №4. – С. 84–93.
62. Звягина А. С. Оценка фитотоксичного действия гербицидов по
изменению роста проростков озимой пшеницы / А. С. Звягина, Л. В.
Цаценко // Наука и Образование в XXI веке. – Москва. – 2013. – Ч. 5. –
С. 65–66.
107
63. Звягина А. С. Показатель фертильности мужского гаметофита
как критерий в биотестировании влияния гербицидов на репродуктивную
систему озимой мягкой пшеницы / А. С. Звягина // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. –
Краснодар: КубГАУ. – 2014. – № 04 (098). – С. 675–685. Режим доступа:
http://ej.kubagro.ru/2014/04/pdf/50.pdf
64. Злобин Ю. А. Реальная семенная продуктивность / Ю. А. Злобин // Эмбриология цветковых растений : Терминология и концепции : Системы репродукции. – СПб. : Мир и семья. – 2000. – Т. 3. – С. 260–262.
65. Злотникова О. В. К проблеме
экологической оценки послед-
ствий применения пестицидов для агроценозов / Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: мат-лы Международ, науч.-практ. конф. / О. В. Злотникова, В. К.
Пурлаур, Т. В. Ким, Е. В. Козлова // Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск. – 2011. – С. 265–267.
66. Ибрагимова Э. Э. Индикация загрязнения окружающей среды в
урбанизированных
экосистемах
с
использованием
пыльцы
Pinussy
lvestris L. / Э. Э. Ибрагимова // Ученые записи Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Серия «Биология, химия». –
2009. – Т. 22 (61). № 4. – С.54–65.
67. Ибрагимова Э. Э. Оценка последствий аэротехногенного загрязнения окружающей среды выбросами автомобильного транспорта по их
гаметоцидному влиянию на высшие растения / Э. Э. Ибрагимова // Экосистемы, их оптимизация и охрана. – 2010. Вып. 2. – С. 192–199.
68. Иванова С. В. Цитогенетическая характеристика мей-мутантов
томата / С. В. Иванова, Л. И. Долгодворова, М. В. Кирцова, С. В. Зверкова,
С. А. Варакина // Известия ТСХА. Вып. 3. – М. : Изд-во МСХА. – 1996. –
С. 54–63.
108
69. Кашин А. С. Апомиксис / А. С. Кашин, Н. А. Шишкинская. –
Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 1999. – 102 с.
70. Кожуро Ю. И. Анализ цитогенетического действия гербицидов
трефлан и зенкор на растения ячменя / Ю. И. Кожуро, Н. П. Максимова //
Белорусский
государственный
[Электронный
ресурс].
–
университет,
2008.
г.
–
Минск,
Режим
Беларусь
доступа:
"mailto:%[email protected]" [email protected].
71. Козлова Е. В. Влияние обработок посевов противооднодольными гербицидами на последующие поколения яровой пшеницы / Е. В. Козлова // Студенческая наука – взгляд в будущее: материалы VI Всероссийской студенческой научной конференции. – Красноярск. – 2011. – С. 257–
259.
72. Козлова Е. В. Реакция мужского гаметофита пшеницы на обработку посевов гербицидом секатор турбо и его смесью с гепардом экстра /
Е. В. Козлова, О. В. Злотникова // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. – 2012. – № 12. – С. 95–99.
73. Козлова Е. В. Реакция мужского гаметофита яровой пшеницы на
применение граминицидов / Е. В. Козлова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учѐных: труды 5 Междунар. науч.практ. конф. мол. учѐных, посвящ. 10-летию еѐ проведения. – Новосибирск. – 2012. – С. 182–184.
74. Козлова Е. В. Сохранение эффекта влияния гербицидов на формирование мужского гаметофита яровой пшеницы в последующих поколениях / Е. В. Козлова, О. В. Злотникова // Тр. Красноярского ГАУ. – 2009. –
№ 34. – С. 36–39.
75. Круглова А. Е. Оценка качества пыльцевых зерен в зрелых
пыльниках остролодочника сходного в условиях интродукции / А. Е. Круглова // Вестник Удмуртского университета. – 2011. Вып.1. – С. 67–74.
76. Круглова А. Е. Периодизация морфогенеза пыльника остролодочника сходного / А. Е. Круглова // Интродукция растений: теоретиче109
ские, методические и прикладные проблемы: материалы Междунар. науч.
конф. Йошкар-Ола. – 2009. – С. 178–181.
77. Круглова А. Е. Эмбриология редкого вида Южного Урала остролодочника сходного: морфогенез семяпочки / А. Е. Круглова, А. А. Катасонова, Н. В. Маслова, Н. Н. Круглова // Изв. Самар. НЦ РАН. 2010. –
Т. 12. № 1 (3). – С. 727–729.
78. Круглова Н. Н. Критические фазы развития спорогенной клетки
пыльника: к постановке проблемы / Н. Н. Круглова // Цитология. – 2001.
Т. 43. № 3. – С. 86–87.
79. Круглова Н. Н. Анализ развития пыльников и пыльцевых зерен
амброзии трехраздельной и циплохены дурнишниколистной: возможные
критические стадии // Вестник ОГУ. – 2009. – № 6. – С. 176–178.
80. Крюков В. И. Генетический мониторинг антропогенного загрязнения окружающей среды: Автореф. дис. доктора биол. наук: 05.13.09. –
Тула, 1999. – 47с.
81. Куликова Н. А. Гербициды и экологические аспекты их применения : Учебное пособие / Н. А. Куликова, Г. Ф. Лебедева. – М. : Книжный
дом «ЛИБРОКОМ», 2010. – 152 с.
82. Кулинкович Е. Н. Пыльцевой анализ в селекции клевера лугового на высокую адаптивную способность / Е. Н. Кулинкович, М. А. Пайкова, Е. Ф. Барчевская // Межд. науч. Конф. "От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям" : (к 95-летию со дня рождения академика Н. В. Турбина). – Минск, 2007. – С . 47.
83. Куперман Ф. М. Морфофизиология растений / Ф. М. Куперман. – М. : Агропромиздат, 1983. – 392 с.
84. Куперман Ф. М. Этапы формирования органов плодоношения
злаков / Ф. М. Куперман. – М. : Агропромиздат, 1972. – 234 с.
85. Куприянов П. Г. Диагностика систем семенного размножения в
популяциях цветковых растений / П. Г. Куприянов. – Саратов: Изд – во
Саратовского ун-та, 1989. – 160 с.
110
86. Куприянов П. Г. Уточнение понятий нормальная и дефектная
пыльца в антморфологическом методе / П. Г. Куприянов, В. Г. Жолобова //
Апомиксис и цитоэмбриология растений. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. –
1975. Вып. 3. – С. 45–52.
87. Куприянова Л. А. Пыльца и споры растений флоры европейской части СССР / Л. А. Куприянова, Л. А. Алешина. – Л. : Наука,
1972. – Т. 1. – 172 с.
88. Куриленко В. В. Основы экогеологии, биоиндикации и биотестирования водных экосистем / В. В. Куриленко, О. В. Зайцева, Е. А. Новикова, Под ред. В. В. Куриленко. – СПб. : Изд-во СПбГУ, 2004. – 448 с.
89. Курманов Р. Г. Палинология : Учебное пособие / Р. Г. Курманов,
А. Р. Ишбирдин . – Уфа : РИЦ БашГУ, 2012. – С. 92.
90. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. – М. : Высшая школа,
1990. – 350 с.
91. Ларина Г. Е. Индикация остатков гербицидного препарата
«Пульсар» в объектах агроценоза / Г. Е. Ларина, Ю. Я. Спиридонов, С. А.
Захаров, Т. В. Захарова // Агрохимия. – 2001. – № 4. – С.67–75.
92. Левина Р. Е. Репродуктивная биология семенных растений / Р.
И. Левина. – М. : Наука, 1981. – 96 с.
93. Лисовицкая O. B. Фитотестирование: основные подходы, проблемы лабораторного метода и современные решения
/ O. B. Лисовиц-
кая, В. А. Терехова // Доклады по экологическому почвоведению. – 2010. –
№ 1. Вып. 13. – С. 1–18.
94. Лихачев Б. С. Сила роста семян (теория, методы, значение): /
Автореф… дис.доктора с.-х. наук: 06.01.05. – КСХИ, Краснодар, 1986. –
39 с.
95. Лукаткин А. С. Влияние гербицидов Гранстар и Топик на прорастание семян и ростовые параметры культурных злаков / А. С. Лукаткин,
М. М. Русяева, А. Н. Гарькова, Ю. Н. Аросланкина // Аграрный вестник
Юго-Востока № 3 – 4 (6–7), 2010. – С. 32–35.
111
96. Лукомец В. М. Цитологический скрининг мужского гаметофита
линий подсолнечника,
устойчивых к имидазолиноновым гербицидам /
В. М. Лукомец, Н. И. Бочкарев, А. А. Пихтярѐва, Л. В. Цаценко, А. М. Бурдун, А. С. Синельникова // Труды Кубанского государственного университета. – 2012. – № 2 (35). – С. 117–122.
97. Лунев М. И. Пестициды и охрана агрофитоценоза / М. И. Лунев. – М. : Колос, 1992. – 270 с.
98. Лысов А. К. Европейский Союз проявляет заботу о дальнейшем
ограничении использования пестицидов / А. К. Лысов // Защита и карантин растений. – 2010. – № 4. – С. 16.
99. Ляшенко О. А. Биоиндикация и биотестирование в охране
окружающей среды: учебное пособие / О. А. Ляшенко. – СПб ГТУРП. –
СПб., 2012. – 67 с.
100. Макогон И. В. Качество пыльцы Piceaаbies (L.) Karst. в дендрарии донецкого ботанического сада Нан Украины / И. В. Макогон // Промышленная ботаника. – 2007. Вып. 7. – С. 148–150.
101. Мейер-Меликян Н. Р. Принципы и методы аэропалинологических исследований / Н. Р. Мейер-Меликян, Е. Э. Северова, Г. П. Гапочка,
С. В. Полевова, П. И. Токарев, И. Ю. Бовина // М., 1999. – С. 5–8.
102. Методика биотестирования по проращиванию семян. Санитарные правила и нормы САНПиН 2.1.7.573-96 «Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения». – 1996.
103. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод /
Сборник трудов под редакцией Брызгало В. А. и Хоружей Т. А. – Л. : Гидрометеоиздат, 1987. Вып. 1. – 160 с.
104. Мехдиев Т. В. Изучение влияния гербицидов, применяемых на
посевах озимой пшеницы, на показатели качества зерна и урожайность /
Т. В. Мехдиев / Аграрный вестник Урала– 2012 – С. 13–17.
112
105. Молканова О. И. Влияние экзогенных факторов на андрогенез
пшеницы в культуре пыльников / О. И. Молканова // Бюллетень Главного
ботанического сада. – 1996. – Вып. 173. – С. 137–141.
106. Морозова З. А. Морфогенетический анализ в селекции пшеницы : методолого-методическое пособие / З. А. Морозова. – М. – 1983. –
77 с.
107. Морозова З. А. Род Triticum L. Морфогенез видов пшеницы /
З. А. Морозова, В. В. Мурашев. – ООО ≪УМЦ≫ ≪Триада≫, 2009. –
232 с.
108. Мосунов С. А. Фертильность пыльцы у Nicotiana tabacum L. /
С. А. Мосунов, Л. В. Цаценко // Сб. науч. тр. ин-та ГНУ ВНИИТТИ. –
Краснодар, 2008. – С. 55–60.
109. Ниловская
Н.
Т.
Методика
проведения
морфо-
физиологического контроля за состоянием зерновых культур / Н. Т. Ниловская, Н. В. Остапенко. – М., 1999. – 56 с.
110. Нокс Р. Б. Биология пыльцы / Р. Б. Нокс. – М. : Агропромиздат.
Пер. с англ., 1985. – 83 с.
111. Очнев А. С. Продуктивность гибридов и самоопыленных линий кукурузы в зависимости от химического способа борьбы с сорняками
на выщелоченном черноземе Западного Предкавказья: автореф. дис. канд.
с. – х. наук. – Краснодар, 2006. – 24с.
112. Паушева З. П. Практикум по цитологии растений / З. П. Паушева. – М. : Агропромиздат. – 1988. – 208 с.
113. Пашкевич В. Д. Водные растения и животные земли / В. Д.
Пашкевич, Б. С. Юдин. – Изд-во «Наука», 1978. – 129 с.
114. Поддубная-Арнольди В. А. Общая эмбриология покрытосеменных растений. – М. : Наука, 1964. – 482с.
115. Полевой В. В. Физиология растений / В. В. Полевой. – М.:
Высшая школа, 1989. – 464 с.
113
116. Проскурина А. А. Урожайность и засоренность яровой пшеницы по основной обработке почвы / А. А. Проскурина // Вестник Краснояр.
гос. аграр. ун-т. – 2011. Вып. № 9 (77). – С. 309–311.
117. Прохоров И. А. Селекция и семеноводство овощных культур /
И. А. Прохоров, А. В. Крючков, В. А. Комиссаров. – М.: Колос, 1997. –
480 с.
118. Пухальский В. А. Практикум по цитологии и цитогенетике растений / В. А. Пухальский, А. А. Соловьев, Е. Д. Бадаева, В. Н. Юрцев. –
М. : КолосС, 2007. – 198 с.
119. Романенко А. А. Новая сортовая политика и сортовая агротехника озимой пшеницы / А. А. Романенко, Л. А. Беспалова, И. Н. Кудряшов,
И. Б. Аблова. – Краснодар, 2005. – 224 с.
120. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. ЭФИА, НИА-Природа, Москва, 2002. – 118 с.
121. Симоненко В. К. Развитие пыльника и микроспор в фертильных
и ЦМС-линиях подсолнечника / В. К. Симоненко // Цитология и генетика. – 1982. – Т. 16. № 5. – С. 34–41.
122. Синельникова А. С. Влияние гербицида нового поколения Евро-Лайтнинг на состояние мужского гаметофита растений подсолнечника /
А. С. Синельникова, Л. В. Цаценко // Научное обеспечение агропромышленного
комплекса. Материалы V Всероссийской научно-практической
конференции молодых ученых. Краснодар, 2011. – С.746 –747.
123. Синельникова А. С. Использование тест-системы на основе
ряски малой Lemna minor для выявления остаточного действия гербицида в
селекционных посевах подсолнечника / А. С. Синельникова, А. А. Пихтярева // Вклад ВОГиС в решение проблем инновационного развития России: Материалы научно-практической конференции Кубанского отделения
ВОГИС. – Краснодар, 2012. – С.155 – 156.
114
124. Сладков А. Н. Введение в спорово-пыльцевой анализ / А. Н.
Сладков. – М. : Наука, 1967. – 275 с.
125. Солнцева М. П. Влияние промышленного и транспортного загрязнения среды на репродукцию семенных растений / М. П. Солнцева, К.
П. Глазунова // Журнал общей биологии. – 2010. – Т. 71, № 2. – С. 163–175.
126. Сорока С.В. Сульфонилмочевинные гербициды в посевах зерновых культур и льна-долгунца / С. В. Сорока, Т. Н. Лапковская, Л. И.
Сорока, А. А. Ивашкевич // Защита и карантин растений. – 2004. – № 3. –
С. 54–55.
127. Спиридонов Ю. Я. Проблемы засоренности посевов и борьбы с
ней в условиях современного состояния сельского хозяйства России /
Ю. Я. Спиридонов // Агрохимия. – 1996. – № 10. – С. 75–83.
128. Спиридонов Ю. Я. Рекомендации по применению имидазолиноновых гербицидов в посевах зернобобовых культур в России / Ю. Я.
Спиридонов, Г. Е. Ларина и др. – М. : БАСФ-ВНИИФ, 2003. – 94 с.
129. Стрельцов А. Б. Региональная система биологического мониторинга на основе анализа стабильности развития – Автореф. дис. доктора
биол. Наук; 03.00.16 – Калуга., 2005. – 46 с.
130. Тарасенко Б. И. Повышение плодородия почв Кубани / Б. И.
Тарасенко. – Краснодар, 1981. – С. 6–23.
131. Тер-Аванесян Д. В. Значение количества пыльцы при гибридизации пшеницы / Д. В. Тер-Аванесян. – Генетика. – 1969. – Т. 5, № 10. –
С. 103–107.
132. Тер-Аванесян Д. В. Роль количества пыльцевых зерен цветка в
оплодотворении растений / Д. В. Тер-Аванесян. – Труды по прикладной
ботанике, генетике и селекции. – 1949. – Т. 28. Вып. 2. – С. 119–133.
133. Тишков Н. М. Плодородие выщелоченного чернозѐма Западного Предкавказья и продуктивность зернопропашного севооборота с масличными культурами при длительном применении удобрений: автор. Дис.
доктора с.-х. наук; Краснодар, 2006. – 48 с.
115
134. Тороп Е. А. Метод анализа структуры урожая зерновых колосовых по З. А. Морозовой и его применение в селекционной практике (на
примере сортов озимой ржи) / Е. А. Тороп, А. А. Тороп // Сельскохозяйственная биология. – 2009. – № 1. – С. 118–124.
135. Тюпаков Э. Ф. Озимая пшеница на Северном Кавказе. Монография / Под ред. проф. Н. Г. Малюги / Э. Ф. Тюпаков, Т. Я. Бровкина. –
Элиста : ЗАО «НПП «Джангар», 2008. – 326 с.
136. Устинова Е.И. Эмбриология покрытосеменных растений с основами цитологии / Е. И. Устинова. – М. : Изд. МГУ, 1965. – 190 с.
137. Федке К. Биохимия и физиология действия гербицидов / К.
Федке / пер. с англ. – М. : Агропромиздат, 1985. – 224 с.
138. Филипчук О. Д. Гербицид Евро-Лайтнинг: действие и последействие / О. Д. Филипчук, В. Н. Орлов // Защита и карантин растений. –
2010. – № 6. – С. 61–63.
139. Хохлов С. С. Выявление апомиктичных форм во флоре цветковых растений СССР / С. С. Хохлов, М. И. Зайцева, П. Г. Куприянов. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1978. – 224 с.
140. Цаценко Л. В. Фитоиндикация загрязнения воды и почвенной
вытяжки) / Л. В. Цаценко, О. Д. Филипчук //Агрохимия, 1999. – №1.
С. 90–93.
141. Цаценко Л. В. Оценка фитотоксичности почвы на посевах подсолнечника с помощью биотеста ряски малой (Lemna minor L.) / Л. В.
Цаценко, А. А. Перстенева // Политематический сетевой электронный
научный журнал «Кубанский государственный аграрный университет». –
№ 59 (05). – 2010. – С. 190–194. – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru.
142. Цаценко Л. В. Пыльцевой анализ в селекции растений /
Л. В. Цаценко, А. С. Синельникова // Политематический сетевой электронный научный журнал «Кубанский государственный аграрный университет». – 2012. – № 03 (077). С. 88–98. – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru.
116
143. Цаценко Л. В. Пыльцевой анализ сельскохозяйственных растений: метод. пособие / Л. В. Цаценко, А. С. Синельникова, С. А. Нековаль. –
Краснодар: КубГАУ, 2012. – 56 с.
144. Цаценко Л. В. Пыльцевой анализ сельскохозяйственных растений (цитологический словарь с иллюстрациями) / Л. В. Цаценко, Ю. С. Андреева, А. С. Синельникова – Краснодар: КубГАУ, 2012. – 67 с.
145. Цаценко Л. В. Рясковые – биоиндикаторы агроценоза / Л. В.
Цаценко, Н. Г. Малюга. – Краснодар, КубГАУ, 2000. – 76 с.
146. Цаценко Л. В. Фитоиндикация загрязнения агроценоза потенциальными мутагенами (в условиях Краснодарского края) / Л. В. Цаценко,
О. Д. Филипчук // Производство экологически безопасной продукции растениеводства. – Москва: Пущино. – 1998. – Вып. 4. – С. 190–194.
147. Цаценко Л.В. Генетический мониторинг сортов-популяций
озимой пшеницы в условиях различных технологий возделывания: Автореф. дис. доктора биол. наук: 06.01.05 – Краснодар, 2001. – 47с.
148. Челак В. Р. Система размножения пшеницы Triticum L. / В. Р.
Челак. – Кишинев: «Штиинца», 1991. – 320 с.
149. Ченкин А. Ф. История развития и проблемы защиты растений;
под обш. ред. А. Ф. Ченкина. – М.: РАСХН, 1997. – 331 с.
150. Черепанова О. Е. Влияние факторов среды (температуры и
влажности воздуха) на качество пыльцы сосны обыкновенной (Pinussy
lvestris L.) / О. Е. Черепанова, Ю. Д. Мищихина //Аграрный вестник Урала. – 2012, № 07 (99). – С 72–73.
151. Эрдтман Г. Морфология пыльцы и систематика растений /
Г. Эрдтман. – М. : Иностр. литература, 1956. – 486 с.
152. Яблонская Е. К. Влияние гербицида 2,4-д и антидота фуролан
на ростовые и синтетические процессы в проростках озимой пшеницы / Е.
К. Яблонская, В. К. Плотников // Политематический сетевой электронный
научный журнал «Кубанский государственный аграрный университет»
(Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. – Краснодар: КубГАУ,
117
2006. – № 24 (8). Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2006/08/pdf/31.pdf
153. Яндовка Л. Ф. Фертильность и жизнеспособность пыльцы
Cerasus vulgaris и C. Tomentosa в связи с УФ-облучением / Л. Ф. Яндовка,
Н. Н. Никифорова, Н. М. Туровцева // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 11. – С. 57–58.
154. Adachi Y. Characteristics of fruiting and pollen tube growth of appleau to tetraploid cultivars showing self-compatibility / Y. Adachi, S. Komori,
Y. Hoskikawa, N. Tanaka et. al. // J. Japan. Soc. Hort. Sci. – 2009. –
№ 78 (4). – P. 402–409.
155. Alami S. The effect of stress (cold and darkness) on pollen viability
of the varieties of grain Sorghum / S. Alami, A. Souvre, A. Albertini // Sexual
reproduction in Higher plants (Eds.): E. Cresti, P. Gori, E. Pacini. – Verlag,
Springer. – 1988. – P. 259–264.
156. Albooghobaish N. Effect of lead toxicity on pollen grains in Matricaria Chamomilla / N. Albooghobaish, F. Zarinkamar // Internat. Conference
of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics. – IPCBEE, 2011. – V. 5. –
P. 292–295.
157. Ali M. A. Pollen viability, germination and rates of pollen tube
growth in Some pomegranate Cultivars (Punica granatum L.) / M. A. Ali, M. A.
Bacha, F. A. Farahat // J. King Saud Univ. – 1998. – V. 10, Agric. Sci. (l).
P. 73–81.
158. Aridersenand S. TIi. Scanning electron microscope studies of pollen
of cereals and other grasses / S. TIi. Aridersenand, F. Bertelsen // Grana. –
1972. – V. 12. – P. 79–86.
159. Augustine J. J. Chemical reversion of sex expression on dioecious
cucumber with ethephon and a benzothiadia-zole / J. J. Augustine, L. R. Barker,
Н. M. Sell // Hort. Sci., 1973, V. 8, № 3. – Р. 218–219.
160. Barker E. А. Characterization of the compo-nents of plant cuticles
in relation to the penetration of 2,4D / E. А. Barker, М. J. Виkоvас // Ann.
Appl. Biol., 1971, V. 67, № 2. – Р. 243–253.
118
161. Bolat I. An investigation on pollen viability, germination and tube
growth in some stone fruits / I. Bolat, L. Pirlak // Tr. J. of Agriculture and Fo restry. – 1999. – № 23. – P. 383–388.
162. Chang M. X. A simple method for staining nuclei of mature and
germinated maize pollen / M. X. Chang, M. G. Neuffer // Stain Technology,
1989. V. 64 (4). – P.181–184.
163. Fairchild J. F. Comparative sensitivity of Selenastrum capricornutum and Lemna minor to Sixteen Herbicides / J. F. Fairchild, D. S. Ruessler, P.
S. Heverland, A. R. Carlson // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1997. № 32,
P. 353–357.
164. Fox R. L. Soil fertility and quality of seeds / R. L. Fox, W. A. Albrecht // Res. Bull. Mo. Agric. Exp. Stn. – 1957. – № 619. – P. 23.
165. Harder L. D. Pollen - size comparisons among animal-pollinated
angiosperms with different pollination characteristics / L. D. Harder // Biol. J.
Linn. Soc. 64, 1998. – P. 513–525. doi:10, 1006/ Bijl. 1998.0235.
166. Helcel R.M., Effect of 2,4 D and et hephonbolicer Spraus on incluction of pollen stenlity in Eggplant / R. M. Helcel, M. E. Saiecl – Zari //
Eggplant J. Hon. – 1981. – V. 8 (1). – P. 101–108.
167. Kelly J. K. A method to estimate pollen viability from pollen size
variation / J. K. Kelly, A. Rasch, S. Kalizz // Amerikan journal of Вotany. –
2002, № 89. Р. 1021–1023.
168. Lord E. M. Adhesion and guidance in compatible pollination /
E. M. Lord // J. Exp. Bot. – P. 2003. Р. 47–54.
169. Michel A. Dose-response
relationships between herbicides with
different modes of action and growth of Lemna paucicostata: an improved ecotoxicological method / A. Michel, R. D. Jonhson, S. O. Duke, B. Scheffler //
Environmental toxicology and Chemistry. – 2004, V. 24. № 4. – P. 546–553.
170. Molnar-Lang M. Production and meioncpain ngbehaviour of new
hybrids of winter wheat (Triricum aestivum) and winter barley (Hordeum vulgare) / M. Molnar-Lang., G. Line, A. Logojan, J. Sutka // Genome, 2000.
119
P. 1045–1054.
171. Slomka A. Was reduced pollen viability of rather the tests applied? / A. Slomka, P. Kawalec, K. Keller // Acta Biologicacracovensia. – Series
Botanica. – 2010. – V. 52 (1). – P. 123–127.
172. Thomas W. Ylyphosate negative affects pollen viability but not pollination and seed set in glyph sateresistance corn. / W. Thomas, W. Pline-Srnic,
J. F. Thomas, J. W. Wilaut, K. L. Edmisten // Weed science, – 2004. – V. 52. –
P. 725–734
173. Volkova P. A. Changes of sizes and shape of pollen grains and
leaves of Nymphaea alba, N. candida and N. tetragona (Nymphaeaceae) after traditional means of treatment of fresh plants // The materials of the
White Sea Expedition of Moscow South-West High School. Vol. 6
[Elec-
tronic resourse]. 2006. Mode of access: http://herba.msu.ru/shipunov/ belomor/2006/flora/nym_ch.htm
174. Whelan E. D. P. Interspecific hybrids between annual and peunnial
diploid species of Helianthus // Con. J. Yenet Cytol /.20. 1978. – P. 523–530.
120
ПРИЛОЖЕНИЯ
121
Приложения 1
122
123
Приложения 2
124
125
Приложения 3
126
127
Приложения 3
128
129