ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ

Высокие технологии залог устойчивого развития: Международная конференция. - 2013. - № 1. - С. 63-66
ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ
СЕЛЕКЦИИ TMTICUMAESTIVUML. НА ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ
Б. Б. Анапияее, К.М. Искакова, Е.Б. Бейсенбек, Д.Т. Казкеев
Казахский национальный технический университет имени К.И. Сатпаева, г. Алматы
At present work it was investigated the androgenic potential of wheat hybrids possessing major RL1
and RL2 genes of adaptive drought tolerance trait "rolling leaves". Nutrient media Blaydes was more
effective for induction of androclinic structures in microspores culture of soft wheat in vitro.
It was studied the influence of osmolyte polyethylenglycol (PEG) 6000 in composition of two
nutrient media Gamborg B5 and Blaydes in 2 concentrations (5.0 % and 7.5 %) for embryo formation in
microspores culture of soft wheat in vitro. It was determined the increase of concentrations of PEG 6000
decreases formation of androclinic structures and embryoids.
Часто повторяющиеся засухи - основная причина снижения урожайности пшеницы в
Казахстане, где потери урожая могут составлять более 60 %. Из-за нехватки водных ресурсов
единственный путь борьбы с засухой - создание сортов пшеницы, способные с меньшей потерей
урожайности переносить засуху.
Методами традиционной селекции создание сортов,
удовлетворяющим современным требованиям, занимает длительный период времени в10 -12 лет. В
последнее время для ускорения селекции сельскохозяйственных культур все более интенсивно
начинают применяться современные биотехнологические методы в сочетании с традиционной
селекцией. Целесообразность использования гаплоидной технологии наряду с традиционной
селекцией обусловлена возможностями быстрой стабилизации гибридного потомства и отбора
перспективного растительного материала на ранних этапах селекционного процесса всего за 1-2 года.
В настоящей работе приведены результаты изучения андрогенетического потенциала
гибридов пшеницы, несущие доминантные гены адаптивного признака засухоустойчивости
'свернутые листья" - RL1 и RL2 и результаты клеточной селекции на засухоустойчивость.
Материалы и .методы
Объектом исследований являлись озимая форма мягкой пшеницы Грекум 476, созданная методом
химического мутагенеза и скрещиванием (Мутанта 1 х Гейнес) х Гейнес несущая два доминантных гена
RL1 и
RL2
адаптивного
признака
"свернутые листья"
способствующего
повышенной
засухоустойчивости, а также гибриды, полученные от скрещивания с участием Грекум 476, и созданные
из гибридов константные андроклинные удвоенные гаплоидные (АДГ) линии. Грекум 476 формирует
очень крупное зерно с массой 1000 зерен 50 - 62 г. в зависимости от условий выращивания,
характеризуется очень высокой комбинационной способностью. Генотрофы легли в основу создаваемых
сортов, которые имеют устойчивую к полеганию солому, хорошую продуктивность и устойчивость к
неблагоприятным условиям перезимовки [6]. В исследовании применялся
метод культуры
изолированных пыльников согласно ранее разработанному протоколу [7].
Пыльники мягкой пшеницы культивировали на питательных средах Гамборга В5 и Блейдза в
первом эксперименте и с добавлением ПЭГ 6000 в двух концентрациях: 5.0, 7.5 % к этим средам во
втором эксперименте.
Частоту образования эмбриоидов рассчитывали от общего числа высаженных на питательные
среды пыльников конкретного генотипа.
63
Полученные эмбриоиды высаживали на среду МС [8] с 2.0 мг/л 2,4-Д без стресс агента ПЭГ
6000 для накопления каллусной биомассы. С использованием полученных каллусных культур
планируется проведение следующего этапа экспериментов по клеточной селекции для создания
засухоустойчивых форм пшеницы.
Результаты и обсуждение
В последнее время интенсивно проводятся исследования по клеточной селекции invitro на
устойчивость к различным стрессам, имитирующим биотические и абиотические факторы
окружающей среды [2]. Имеется ряд публикаций о клеточной селекции на засухоустойчивость
соматических каллусных и суспензионных клеток злаков, в том числе и пшеницы, с применением
ПЭГ [1]. С использованием ПЭГ, обладающего свойством поглощения воды, имитируется водный
дефицит. Однако, мы не встретили в литературе упоминаний о клеточной селекции на
засухоустойчивость с применением полиэтиленгликоля (ПЭГ) в составе питательных сред на уровне
гаплоидных клеток злаков. Клеточная адаптация к осмотическому стрессу является кардинальным
биологическим процессом, который защищает организм от летальных эффектов дегидратации [3]. В
данной работе мы испытывали влияние ПЭГ 6000 в составе двух питательных сред Гамборга В5 [4] и
Блейдза [5] в двух концентрациях (12.5 и 18.75 г/л ) на выход эмбриоидов в культуре микроспор
мягкой пшеницы invitro.
В наших экспериментах наиболее высокий выход эмбриоидов у испытанных генотипов
отмечен на среде Блейдза для Грекум 476 (14.54 %) (Таблица 2). Также высокие значения показали на
среде Блейдза гибрид № 163/96 и АДГ 1057, 7.07 % и 7.41 %, соответственно. Минимальное значение
на среде Блейдза наблюдалось у гибрида № 208/96 (0.93 %). На питательной среде Гамборга В5
лучшие результаты показал гибрид 2\96 (8.47 %). Наименьшие показатели были у Грекум 476,
гибрида № 23/96 и АДГ 1051 - 0.51 %, 0.19 % и 0.79 %, соответственно. В целом, как можно судить
по табличным данным, выход эмбриоидов на среде Блейдза был значительно больше по сравнению
со средой Гамборга В5. Исходя из этого, можно сделать вывод, что питательная среда Блейдза
оказывается более эффективной при работе с культурой пыльников пшеницы.
Согласно табличным данным Грекум 476, созданные с его участием гибриды, и АДГ линии,
полученные из этих гибридов в культуре пыльников характеизуются повышенным выходом
эмбриоидов. Установлена роль определенных генов, стимулирующих эмбриогенез в культуре
пыльников. Мы предполагаем, что у гибридов, созданных с участием Грекум 476, и константных
форм, полученных от них "частота эмбриоидогенеза" в культуре пыльников является наследуемым
признаком. Форма мягкой пшеницы Грекум 476, созданная методом химического мутагенеза, имеет
измененный гормональный статус, который способствует хорошей регенерационной способности
гибридов, созданных с его участием, и константных форм гибридного происхождения.
В наших экспериментах учитывались частота эмбриоидогенеза различных генотипов в двух
испытанных питательных средах Блейдза и Гамборга В 5 (таблица 1).
Таблица 1
Частота образования эмбриоидов в культуре изолированных пыльников пшеницы с адаптивными
признаками засухоустойчивости
Питательные среды
№
Генотип
1 Грекум 476
Количество
культивир.
пыльников
110
Блейдза
Количество
получен,
эмбриоидов
16
14.54
Количество
культивир
пыльников
198
%
Гамборга В5
Количество
полученных
эмбриоидов
1
%
0.51
2 № 2\96
459
15
3.26
189
16
8.47
3 № 6\96
450
10
2.22
123
4
3.25
4 № 23/96
5 № 163/96
882
113
31
8
3.51
7.07
526
-
1
-
0.19
-
6 № 208/96
216
2
0.93
-
-
-
7 №213/96
288
7
2.43
211
5
2.37
8 №416
162
4
2.47
360
13
3.61
9 АДГ 1057
108
8
7.41
168
2
1.19
10 АДГ 1051
111
4
2.77
127
1
0.79
64
Во втором эксперименте изучали влияние осмотика ПЭГ 6000 в двух концентрациях (5 и 7.5 %) в
составе питательных сред Блейдза и Гамборга В5 на формирование эмбриоидов у Грекум 476 и АДГ
1057 (таблица 2).
Как видно из табличных данных, четко прослеживается зависимость выхода эмбриоидов от
концентрации ПЭГ 6000 как на среде Блейдза, так и на среде Гамборга В5. С увеличением
концентрации ПЭГ в составах питательных сред уменьшается выход эмбриоидов в культуре
пыльников. Согласно приведенным в таблицах результатам является очевидным, что выход
эмбриоидов у Грекум 476 во втором эксперименте более чем в два раза превышает таковой
показатель для данных генотипов в первом эксперименте на среде Блейдза, а у АДГ линии 1057 - в
3.3 раза. В первом эксперименте у Грекум 476 на среде Блейдза формирование эмбриогенных
структур составило 14.54 %, тогда как во втором эксперименте с активированным углем - 35.24 %, а у
АДГ линии 1057 - 7.41 % в первом и 24.76 % во втором опыте. Такая же закономерность
наблюдалась на среде Гамборга В5.
Таблица 2
Частота образования эмбриоидов в культуре изолированных пыльников пшеницы на питательных
средах Блейдза и Гамборга В5, содержащие ПЭГ 6000
Питательные среды
Генотип
Грекум
476
АДГ
1057
Концентрация
ПЭГ 6000,
г/л
Блейдза
Кол-во
культивир
пыльников
Кол-во
получен,
эмбрио.
Гамборга В5
%
Кол-во
культивир
пыльников
Кол-во
получен,
эмбрио.
%
0
105
37
35.2
252
14
5.56
12.5
105
14
13.3
147
6
4.08
18.75
105
6
5.71
147
5
3.4
0
105
26
24.8
231
9
3.9
12.5
105
16
15.2
147
4
2.72
18.75
126
4
3.17
147
4
2.72
Данный положительный эффект мы связываем с присутствием в питательных средах Блейдза
и Гамборга В5 активированного угля во втором эксперименте. Считается, что полиэтиленгликоль
является непроникающим в клетку осмотиком. В данном эксперименте нами были модифицированы
питатательные среды Блейдза и Гамборга В5 с добавлением активированного угля (1 г/л). Добавление в
питательную среду активированного угля связывают с адсорбцией: 1)фенольных ингибиторов
(гидроксихинон, п-гидроксибензойная кислота), присутствующих в культивируемом экспланте;
2) 5-гидроксиметил фурфурола - ингибитора образующегося при автоклавировании сахарозы. Также
активированный уголь может нейтрализовать потенциальный вредный эффект ПЭГ.
Таким образом, в результате наших исследований установлено, что среда Блейдза с
активированным углем является более эффективным для формирования эмбриоидов для испытанных
нами генотипов яровой мягкой пшеницы. ПЭГ 6000 позволяет проводить первичный отбор на
осмоустойчивость в культуре изолированных микроспор пшеницы invitro.
ЛИТЕРАТУРА
1 Серазетдинова Л.Д., Лесова Ж.Т., Аликулов З.А. и др. Клеточная селекция на устойчивость
к засолению и засухе // Биотехнология. Теорияипрактика. - № 4 - 1997 - С. 63-67.
2 El-Hennawy M.F., Abdalla A.F., Shafey S.A., Al-Ashkar I.M. Production of doubled haploic
wheat lines (Triticum aestivum L.) using anther culture technique. Annals of Agricultural Science. - 2011
- 5 6 . - P . 63-72.
3 ПирузянЭ.С.Основыгенетическойинженериирастений.-M.: Наука, 1988.-С. 175.
4 Gamborg O.L., Miller R.A. & Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybeer
root cells // Exp.Cell.Res. - 1968. - Vol.50. - P. 151-158.
65
5 Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitory in the growth of soybean tissue
// Physiol. Plant. - 1966. - 19. - P. 748 - 753.
6 Богданова Е.Д. Морфогенетическая изменчивость пшеницы, индуцированная никотиновой
кислотой. -Алма-Ата: Наука, 1984. - 168 с.
7 Анапияев Б.Б., Сатыбалдиев Д.Д., Богданова Е.Д. и др. Использование гаплоидной
технологии в селекции пшеницы на засухоустойчивость // Известия МОИ РК, НАН РК. Серия
биологическая и медицинская. - 1999. - №5-6 - С. 116-120.
8 Murashige Т. & Scoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue cultures // Physiol Plant 15: 473-497.
66