На правах рукописи Шаймарданова Гульнара Фердинантовна Генно-клеточная терапия
реклама
На правах рукописи Шаймарданова Гульнара Фердинантовна Генно-клеточная терапия для стимулирования нейрорегенерации при травме спинного мозга 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Казанском институте биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук и в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный консультант: Челышев Юрий Александрович д.м.н, профессор Заслуженный деятель науки РТ, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Официальные оппоненты: Швалев Вадим Николаевич д.м.н., профессор, академик РАЕН, ведущий научный сотрудник лаборатории нейроморфологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Сергеева Валентина Ефремовна д.б.н., профессор, заведующий кафедрой медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» Чучкова Наталья Николаевна д.м.н., профессор, заведующий кафедрой биологии с экологией Государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «25» декабря 2014 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.212.117.01 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарѐва» по адресу: 430032, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Ульянова, 26А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарѐва» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68). Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте www.mrsu.ru Автореферат разослан « » 2014 г. Учѐный секретарь диссертационного совета д.б.н., профессор В.П. Балашов 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Травма спинного мозга вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого функционального дефицита, усугубляемого естественными лимитирующими нейрорегенерацию факторами в центральной нервной системе. Поиск новых методов лечения травмы спинного мозга является актуальным. Среди немногочисленных экспериментальных подходов стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга одно из ведущих мест принадлежит клеточной терапии. Трансплантируемые клетки необходимы для восстановления тканевого матрикса и формирования направляющих путей для роста аксонов, поддержания выживания нейронов и глиальных клеток, удлинения аксонов, стимулирования процесса миелинизации. Этим условиям в разной степени удовлетворяют клетки нескольких типов, трансплантируемых при экспериментальной травме спинного мозга. Интерес вызывают работы, выполненные с трансплантацией стволовых мезенхимных клеток и нейральных клеток обонятельной выстилки (КОВ) и клеток крови пуповины человека (ККП). КОВ человека обладают способностью стимулировать регенерацию и миелинизацию поврежденных аксонов спинного мозга крысы и частично восстанавливать двигательную и чувствительную функции (Ramon-Cueto et al. 1998, Викторов и др. 2009). КОВ продуцируют комплекс нейротрофических факторов, белки внеклеточного матрикса и молекулы адгезии нервных клеток. Интерес к этим клеткам подкреплен возможностью аутотрансплантации, не приводящей к длительному нарушению обоняния. ККП активно изучаются в связи с их низкой иммуногенностью, доступностью, простотой и безопасностью получения, способностью выдерживать длительное хранение, возможностью использования аутологичного материала (Deng et al. 2010, Park et al. 2011, Han et al. 2013). Несмотря на значительное количество исследований с применением клеток данных типов для трансплантаций в спинной мозг, многие вопросы их поведения в ткани реципиента, а также влияние на конкретные события посттравматической дегенерации спинного мозга, остаются неясными. Усилить терапевтический эффект трансплантированных клеток можно за счет применения ключевых факторов, поддерживающих выживание и дифференцировку нейральных клеток и регенераторный потенциал спинного мозга. Представляют интерес сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов основной (FGF2), поскольку эти факторы являются одновременно нейротрофическими и ангиогенными. При травме спинного мозга доставка в область повреждения VEGF стимулирует нейрогенез, выживание, миграцию нейронов и рост аксонов (Benton et al. 2009, Mackenzie et al. 2012), а FGF2 стимулирует рост аксонов и восстановление двигательной функции (Moftah et al. 2008, Guzen et al. 2012, Goldshmit et al. 2012), способствует дифференциации предшественников макроглии в зрелые клетки (Ohori et al. 2006, Yang et al. 2012). Результаты различных авторов указывают на синергизм действия этих факторов в ангиогенезе in vitro и in vivo (Seghezzi et al. 1998, Laporte et al. 2011). Помимо перечисленных выше, особый интерес представляет глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Имеются данные, что при травме спинного мозга GDNF стимулирует регенерацию аксонов и образование миелина (Zhang et al. 2009, Koelsch et al. 2010). К недостаткам метода непосредственного введения пептидных факторов следует отнести необходимость применения больших доз, быстрое их расщепление эндогенными пептидазами, высокую иммуногенность, длительное присутствие in vivo минипомпы и др. В ходе клинических испытаний с системной доставкой нейротрофических факторов и факторов роста при различных заболеваниях были выявлены побочные эффекты и низкая 3 эффективность (Apfel et al. 2002). Эти осложнения стимулировали поиск других способов увеличения содержания в ткани-мишени стимуляторов регенерации. Из них наиболее эффективным представляется генная терапия. В генной терапии различают два подхода: генно-клеточную терапию (клеточно-опосредованная генная терапия), предполагающую применение в качестве носителей трансгенов генетически модифицированных стволовых клеток, обладающих способностью к длительной сверхэкспрессии эндогенных стимуляторов нейрорегнерации, и прямую генную терапию непосредственно инъекцией ДНК-содержащих векторов. При генно-клеточной терапии важным критерием отбора клеток, предназначенных для трансплантации, является возможность трансфекции терапевтическими генами с высокой эффективностью их экспрессии в ткани спинного мозга реципиента. Кроме того эффективность клеточно-опосредованного подхода зависит от выбора конкретного терапевтического гена и типа трансфицируемых клеток, применяемых для трансплантации. Для стимулирования нейрорегенерации также активно исследуют эффективность двух принципиально различных способов доставки терапевтических генов, не связанных с клеточными носителями – это доставка трансгенов при помощи вирусных и невирусных векторов. Одним из наиболее эффективных и безопасных носителей терапевтических генов считается адено-ассоциированный вирус (Исламов 2007, Colella 2010). Вирусные носители обладают высокой трансфекционной активностью, но не считаются полностью безопасными из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов и токсичности. Среди других недостатков вирусных векторов – отсутствие постоянной экспрессии (аденовирус), малый размер вставки трансгенной конструкции (аденовирус, рекомбинантный адено-ассоциированный вирус), кратковременная экспрессия трансгенов (герпесвирусы), трансдукция только делящихся клеток (ретровирусы), трудоемкость и дороговизна получения (Bleiziffer et al. 2007). Альтернативой генной терапии при помощи вирусных векторов является применение плазмидных векторов, у которых, несмотря на более низкую, чем у вирусных векторов, трансфекционную активность, вышеупомянутые недостатки либо не проявляются совсем, либо проявляются в значительно меньшей мере. Основное преимущество использования плазмидных векторов заключается в том, что на основе промышленного вектора можно конструировать векторы с различным набором необходимых трансгенов, экспрессия которых осуществляется одновременно и независимо. Встроенные в плазмидные конструкции механизмы контроля репликации позволяют регулировать их экспрессионную активность. Вопрос об оптимальном выборе терапевтических генов или их комбинаций и эффективных способах их доставки при травме спинного мозга остается не выясненным. В связи с вышесказанным, была сформулирована цель исследования и поставлены следующие задачи. Цель исследования Оценить и сопоставить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга крысы в условиях прямой и опосредованной клетками крови пуповины человека доставки в область повреждения клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF, FGF2 и GDNF и трансплантации немодифицированных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека. Задачи исследования 1. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга нативных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека, их способность к выживанию и миграционный потенциал. 4 2. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область травматического повреждения клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидами pEGFP и pBud-VEGF-FGF2. Сравнить эффективность стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга крысы при трансплантации в зону повреждения нативных и трансфицированных pBud-VEGF-FGF2 клеток крови пуповины. 3. На модели контузионной травмы спинного мозга крысы изучить эффективность прямой генной терапии путем введения в область повреждения плазмиды и pBud-VEGFFGF2. 4. Оценить эффективность посттравматической регенерации при введении в область контузионного повреждения спинного мозга крысы аденовирусного вектора AdVGDNF. 5. Изучить эффективность трансплантации в зону контузионного повреждения спинного мозга крысы клеток крови пуповины человека, трансдуцированных AdV-GDNF. 6. Провести иммуногистохимический анализ с использованием маркеров астроцитов S100В; α и β рецепторов тромбоцитарного фактора роста PDGFαR и PDGFβR, глиального фибриллярного кислого белка GFAP; транскрипционного фактора Krox20; белка периферического миелина P0; низкоаффинного рецептора фактора роста нервов p75; маркера ядер клеток человека HNu; белка теплового шока HSP25; трансмембранного белка аквапорина AQP4. С помощью специфических маркеров оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения, образование миелина, активацию перицитов и астроцитов, выживаемость и пространственную локализацию генно-модифицированных клеток крови пуповины человека, эффективность экспрессии рекомбинантного гена VEGF. 7. Сравнить эффективность стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга при генной и генно-клеточной терапии по критериям восстановления функции, сохранности ткани, величине патологических полостей, регенерации миелиновых волокон. Научная новизна На модели контузионной травмы спинного мозга изучены эффекты немедленной однократной трансплантации в зону повреждения нативных КОВ и ККП, доказана их высокая выживаемость и способность мигрировать на значительное расстояние, положительное влияние на восстановление двигательной активности и сохранность ткани, рост количества миелиновых волокон и снижение степени кавитации. На модели контузионной травмы спинного мозга впервые в одинаковых условиях эксперимента исследованы морфологические и гистохимические характеристики ткани спинного мозга в ходе генно-клеточной терапии с использованием нативных и модифицированных ККП человека. Тестирование в открытом поле (метод ВВВ) на всех этапах эксперимента позволило соотнести параметры восстановления двигательной активности со структурно-морфологическими изменениями ткани спинного мозга и количественно охарактеризовать терапевтическую эффективность различных вариантов доставки генов нейротрофических и ангиогенных факторов в область травмы. Впервые для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга применена трансплантация в зону травмы ККП, трансфицированных плазмидой pBudVEGF-FGF2, экспрессирующей одновременно и независимо гены vegf и fgf2. Обосновывается выбор факторов VEGF, FGF2 и их сочетанного применения для терапии КТСМ. Одновременно на двух моделях – КТСМ и гемисекции – показано, что по сравнению с трансплантацией немодифицированных КОВ, трансплантация ККП человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, дает более высокие показатели сохранности ткани и ремиелинизации в очаге поражения и восстановления функции спинного мозга. 5 Впервые проведено сравнение прямого и ККП-опосредованного способов введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2 по их влиянию на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы. Установлено, что непосредственная инъекция плазмидной ДНК мало уступает по эффективности доставке этих же терапевтических генов посредством ККП, а по некоторым показателям (восстановление двигательной активности, размеры патологических полостей) превосходит ее. Впервые выявлены и сопоставлены гистоморфологические проявления посттравматической регенерации, обусловленные применением плазмиды pBud-VEGFFGF2 непосредственно и в составе клеточных носителей. Установлено, что в результате трансплантации немодифицированных КОВ, а также при прямом и ККП-опосредованном введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в зоне контузионного повреждения появляются миелиновые волокна диаметром меньше 2 мкм с компактным миелином периферического типа. Источником миелина служат мигрирующие шванновские клетки. Трансплантация ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, оказывает более выраженное поддерживающее влияние на популяцию шванновских клеток, мигрирующих в зону повреждения, чем трансплантация немодифицированных ККП. Субпопуляции шванновских клеток-мигрантов имеют фенотип P0+- и P0+/p75+ в белом веществе, S100В+/GFAP+/Krox20+ и GFAP+/Krox20+ в области вхождения задних корешков и HSP25+/GFAP+/Krox20+ в задних канатиках, то есть, мигрирующие клетки находятся на разных стадиях дифференцировки в зависимости от локализации. ККП-опосредованное введение генов ангиогенного фактора VEGF сопровождается увеличением числа PDGFβR+ - периваскулярных клеток, отражающим усиление васкуляризации. Впервые на модели контузионной травмы спинного мозга исследовано действие немедленной однократной трансплантации в зону повреждения вирусной генноинженерной конструкции AdV-GDNF. Установлено, что терапевтический эффект от трансплантации AdV-GDNF посредством трансдуцированных ККП превышает эффект от прямой генной терапии. Положения, выносимые на защиту 1. Доставка в область контузионной травмы спинного мозга крысы генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF и FGF2 при помощи плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2, а также гена нейротрофического фактора GDNF при помощи вирусного вектора AdV-GDNF, сдерживает развитие дегенеративных изменений и стимулирует посттравматическую нейрорегенерацию. 2. Опосредованная клетками крови пуповины человека, трансфицированными плазмидой pBud-VEGF-FGF2, доставка терапевтических генов и непосредственное введение той же плазмиды (прямая генная терапия) в область травмы спинного мозга с различной степенью эффективности влияют на параметры нейрорегенерации (уменьшение образования патологических полостей, сохранность миелиновых волокон, серого и белого вещества и восстановление функции). 3. Доставка в область повреждения спинного мозга крысы гена нейротрофического фактора GDNF при помощи клеток крови пуповины человека, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, более эффективно стимулирует посттравматическую регенерацию спинного мозга, чем инъекция в эту же область аденовируса с геном gdnf. 6 Теоретическая и практическая значимость Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы нейрорегенерации прямой и опосредованной клетками крови пуповины доставки рекомбинантных генов vegf, fgf2 и gdnf доказывают возможность использования плазмидной конструкции pBud-VEGF-FGF2 и аденовирусного вектора AdV-GDNF для дальнейших исследований клеточно-молекулярных механизмов на доклиническом этапе, и последующих клинических испытаний. Полученные свидетельства высокой эффективности прямой генной терапии трансгенами vegf и fgf2, мало уступающей по эффективности клеточно-опосредованной терапии с теми же генами, обуславливают необходимость совершенствования метода прямой доставки ДНК, не связанного с клеточными носителями. Результаты исследования имеют значение для работ по усовершенствованию и последующему применению разработанных технологических платформ генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на их основе других, более эффективных терапевтических средств, для лечения и реабилитации больных с различного рода травмами спинного мозга и другими нейродегенеративными заболеваниями. Методология исследования С применением электронной и световой микроскопии, иммуногистохимии изучены посттравматические реакции спинного мозга после травмы на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях в условиях генной, клеточной и генно-клеточной терапии. На основе анализа функциональных показателей и морфологических характеристик сопоставлена эффективность трансгенов при различных способах их доставки в область травмы. Внедрение результатов исследования Результаты исследования включены в лекционный курс для студентов Казанского государственного медицинского университета “Регенеративная медицина”, элективные курсы “Молекулярная неврология” и “Нейропатология”. Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI съезде анатомов гистологов и эмбриологов России (Саратов 2009), Всероссийском симпозиуме “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Санкт-Петербург 2010), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), 8-й Всероссийской научной конференции “Бабухинские чтения в Орле” (2011), V Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Петрозаводск 2011), Всероссийской научной конференции “Регенеративная биология и медицина” (Москва 2011), V Всероссийском симпозиуме с международным участием “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Уфа 2012), XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара 2012), ХХIV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка 2012), III международной научно-практической конференции “Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине” (Казань 2012), Всероссийской конфренции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения Д.С.Гордон (Чебоксары 2012). Публикации По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 15 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций, 12 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, симпозиумах, конгрессе, съезде. По результатам работы получено 2 патента: № 2459630 «Способ стимулирования нейрорегенерации с помощью 7 генетических конструкций», № 2521225 «Способ регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных клеток крови пуповины человека». Структура и объем диссертации Диссертация состоит из общей характеристики работы, глав «обзор литературы», «материалы и методы», «результаты исследования и их обсуждение», заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 290 источников, из них 21 на русском языке. Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 4 таблицы, 98 рисунков. Связь работы с базовыми научными программами Работа поддерживалась: контрактом ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2101; грантами РФФИ №07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона» (2007-2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофических факторов» (2012 г.), РФФИ №1204-31092-мол_а «Сравнение эффективности клеточно-опосредованной и прямой доставки генов нейротрофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012-2013 гг.). 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Животные и экспериментальные группы Эксперименты выполнены на половозрелых лабораторных крысах самках и самцах. Общее количество прооперированных животных 285. Опыты на животных выполнены в Казанском государственном медицинском университете в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. 2.1.2. Дозированная контузионная травма спинного мозга (КТСМ) и латеральная гемисекция КТСМ наносили после ламинэктомии на уровне Т8-Т9 с помощью вертикально падающего стержня весом 10 г с высоты 2,5 см (Лебедев и др. 2008). Односторонняя латеральная гемисекция была осуществлена с правой стороны на уровне Т8-Т9 после ламинэктомии. В экспериментах с КОВ крыс наркотизировали инъекцией смеси 5% раствора кетамина (120 мг/кг) и 0,5% раствора седуксена (5 мг/кг) внутрибрюшинно; в остальных экспериментах – путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). 8 Таблица 1. Экспериментальные группы и количество животных Количество животных № Экспериментальные группы Контузионная травма КТСМ (контроль) Среда Хенкса (контроль) КОВ+CFDA-SE (контроль) КОВ (опыт) DPBS (контроль) ККП (опыт) ККП+pEGFP (контроль) ККП+pBud-VEGF-FGF2 (опыт) pEGFP (контроль) pBud-VEGF-FGF2 (опыт) ККП+AdV-EGFP (контроль) ККП+AdV-GDNF (опыт) AdV-EGFP (контроль) AdV-GDNF (опыт) Всего Латеральная гемисекция 15 ККП+pEGFP (контроль) 16 КОВ (опыт) 17 ККП+pBud-VEGF-FGF2 (опыт) Всего 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 проoперированных выведенных из эксперимента на 2, 4, 6, 8-е сут выживших на 30, 60-е сут 12 16 10 27 11 12 27 24 24 13 23 12 22 12 245 10 12 12 12 12 58 6 (50%) 12 (72%) 21 (78%) 5 (42%) 8 (67%) 8 (53%) 18 (75%) 7 (58%) 9 (69%) 6 (54%) 7 (58%) 6 (60%) 8 (67%) 121 15 13 12 40 - 9 (60%) 10 (77%) 9 (75%) 28 2.1.3. Клетки обонятельной выстилки человека (КОВ) Ткань обонятельного эпителия получали в клинике «Нейровита» от пациентов с разрешения этического комитета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Под местной лидокаиновой анестезией фрагменты обонятельного эпителия размером 10х5 мм иссекали из верхнего отдела верхнего носового хода. Выделение и культивирование КОВ проводили по методу, описанному Викторовым с соавторами (Викторов и др. 2009). Состав нейральных стволовых клеток в препарате КОВ определяли по результатам иммуноцитохимического исследования клеток нейросфер 3-го пассажа и последующего культивирования в течение 2 недель после разморозки. Клетки нейросфер экспрессировали преимущественно нестин (белок нейрофиламентов) и бета-тубулин. После 3-х отмывок КОВ в охлажденном (4оС) физиологическом растворе Хенкса определяли жизнеспособность клеток (окраска трипановым синим), которая была не ниже 95%, затем готовили взвесь в концентрации 100 тыс. клеток в 1 мкл раствора Хенкса. Выделение и культивирование КОВ проводилось под руководством профессора Викторова И.В., соавторы Савченко Е.А., акад. Чехонин В.П. КОВ трансплантировали сразу после травмы в две точки в количестве 750 тыс. клеток в 10 мкл среды Хенкса в две точки на расстоянии 7 мм ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы и 0,3 мм латеральнее срединной линии (краниальную точку сдвигали вправо, каудальную - влево). Всего 1,5 млн. клеток на крысу. Животным контрольной группы в адекватных условиях вводили среду Хэнкса. Использовали гамильтоновский 9 шприц со стальной иглой № G29, соединѐнный с микропомпой (Stoelting Сo, США) Трансплантация КОВ проведена в соавторстве с профессором Лебедевым С.В., Карасѐвым А.В. (ФГУ ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, Москва). 2.1.4. Клетки крови пуповины человека (ККП) Клетки крови пуповины человека для экспериментов по генно-клеточной терапии получали из Банка стволовых клеток КГМУ. Выделение мононуклеарной фракции клеток крови пуповины человека осуществляли в градиенте фиколла по методу I.J. Fuss (Rizvanov et al. 2008). Выделенные клетки трансфицировали путем электропорации плазмидой pBudVEGF-FGF2 для введения животным 8-й опытной группы (Таб. 1). Сразу после нанесения травмы трансфицированные клетки инъецировали по 1 млн в 5 мкл DPBS (БиолоT) в 2 точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы и 0,5 мм латеральнее срединной линии при помощи гамильтоновского шприца (Sigma). Животным 7-й контрольной группы (Табл. 1) в тех же условиях и в том же количестве вводили аналогичные клетки, трансфицированные плазмидой рEGFP (Clontech), содержащей ген усиленного зеленого флюоресцентного белка (EGFP). В опытах с прямой генной терапией в тех же экспериментальных условиях крысы 10-й опытной группы (Табл. 1) получали 40 мг плазмиды pBud-VEGF-FGF2, в то время как животным 9-й контрольной группы (Табл. 1) вводили плазмиду pEGFP. Генетическая конструкции pBud-VEGF-FGF2 получена от д.б.н. Ризванова А.А. (институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета). Конструкция создана на основе коммерческой плазмиды pBudCE4.1, одновременно и независимо экспрессирует факторы роста VEGF и FGF2. Эффективность экспрессии подтверждена методами ПЦР в реальном времени, вестернблоттингом и иммуногистохимическими методами (Салафутдинов и др. 2010). В течение 7 суток после операции всем экспериментальным животным внутримышечно вводили гентамицин (5 мг/кг) один раз в сутки. 2.2. Гистологические исследования Через 30 и 60 суток после нанесения травмы животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида (4°С). Фрагмент спинного мозга длиной 5 см, включающий зону повреждения, забирали вместе с позвонками в параформальдегид. Через 12 часов спинной мозг извлекали из костной ткани и разделяли на 5 равных участков. В экспериментах 1, 2, 4 (Табл. 1) все 5 участков спинного мозга фиксировали для морфометрии. В экспериментах 5-17 (Табл. 1) участок мозга, включающий зону повреждения, фиксировали для морфометрии, остальные кусочки клали в 30% раствор сахарозы на фосфатном буфере для иммуногистохимических исследований. 2.2.1. Зоны морфометрии Морфометрические измерения и подсчет изучаемых параметров проводили на полутонких поперечных срезах, окрашенных толуидиновым синим. При 4-кратном увеличении измеряли площадь сохранного серого и белого вещества на расстоянии 3, 5 мм в экспериментах 5-17 (Табл. 1) и до 25 мм в экспериментах 1, 2, 4 (Табл. 1) от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлениях. Площадь патологических полостей и количество миелиновых волокон изучали при 20 и 40-кратном увеличении на тех же расстояниях в следующих зонах белого вещества: 1 – вентро-медиальная часть переднего канатика, прилежащая к срединной щели, правая сторона; 2 – то же, левая сторона; 3 – латеральная часть бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона; 4 – то же, левая сторона (Рис. 1). 10 Рисунок 1. Зоны морфометрии (1, 2, 3, 4) в спинном мозге крысы 2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) Для ТЕМ исследования участки спинного мозга дофиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде и 1% растворе OsO4 на фосфатном буфере с добавлением сахарозы и заливали в Epon 812 (Fluka). Полутонкие и ультратонкие поперечные срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB-III. Полутонкие препараты окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие препараты контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и просматривали с помощью трансмиссионного микроскопа JEM-1200. 2.2.3. Иммуногистохимия Иммуногистохимические исследования проводили на поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм, изготовленных на криостате Microtom HM 560 (Thermo Scientific) на расстоянии 10 -15 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы. Методом непрямой стрептавидин-биотин-пероксидазной реакции с LSAB-kit (DAKO) выявляли экспрессию белка S100В (Millipore, 1:200), PDGFβR (Sigma, 1:100) и маркера шванновских клеток транскрипционного фактора Krox20 (Covancе, 1:200). Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в тех же 4 зонах белого вещества (Рис. 1). Просмотр препаратов и оцифровку изображений проводили на световом микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss). Иммунофлюоресцентное окрашивание. Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антителами: против белка S100В (Dako, 1:1200), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Santa Cruz, 1:200), транскрипционного фактора Krox20 (Santa Cruz, 1:200), белка периферического миелина P0 (Abcam, 1:100), низкоаффинного рецептора фактора роста нервов р75 (Santa Cruz, 1:100), бета рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFβR) (Sigma, 1:100), маркера ядер клеток человека HNu (Chemicon, 1:100), VEGF (Sigma, 1:125) и белка теплового шока HSP25 (Stressgen, 1:2000) в течение одних суток при 4°C. Затем срезы промывали в фосфатно-солевом буфере и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флюоресцентными красителями anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200), anti-goat Alexa 488 (Invitrogen, 1:150), anti-mouse Alexa 488 (Invitrogen, 1:200), anti-rabbit Alexa 555 (Invitrogen, 1:150) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре в растворе 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл фосфатного-солевого буфера, Sigma). Окрашенные срезы заключали в глицерин (Галено Фарм) и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-META (Carl Zeiss). Для всех иммуногистохимических реакций проводили отрицательные контроли с исключением из инкубационной среды первичных антител или вторичных антител методом их замены на 5% сыворотку осла. Иммуногистохимические исследования проведены в соавторстве с Мухамедшиной Я.О. (КГМУ), Архиповой С.С., Мухитовым А.Р. (КИББ Каз НЦ РАН) 11 2.3. Создание AdV-GDNF и трансдукция ККП Рекомбинантные аденовирусы Ad5-GDNF и Ad5-EGFP, кодирующие гены GDNF и EGFP, соответсвенно, получены от д.б.н. Ризванова А.А., институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета (Черенкова и др. 2012). Для получения рекомбинантных аденовирусов Ad5-GDNF и Ad5-EGFP кольцевые плазмидные векторы pAd-GDNF и pAd-EGFP подвергали рестрикции ферментом PacI. Линейными формами данных плазмид трансфицировали клетки линии HEK 293A с помощью трансфекционного агента TurboFect. Клеточная линия 293A является субклоном клеточной линии 293 содержит стабильно интегрированную копию гена Е1, которая поставляет белки Е1 (Е1А и Е1В), необходимые для создания рекомбинантного аденовируса. На 7-е сутки после трансфекции суспензию зараженных клеток линии HEK 293A подвергали нескольким циклам замораживания/оттаивания. После центрифугирования, полученным супернатантом, содержащим вирусные частицы, инфицировали ККП. 2.4. Оценка восстановления функции спинного мозга Начиная с 7-х суток после КТСМ во всех экспериментах, животных тестировали в открытом поле через сутки по методу (Basso et al. 1995) (тест ВВВ). Для тестирования животных были привлечены два независимых исследователя. 2.5. Световая микроскопия Просмотр препаратов и оцифровку изображений для морфометрии проводили на микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss). Флюоресцентцию анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа «Axioskop 40». 2.6. Программное обеспечение и статистическая обработка результатов Просмотр препаратов и оцифровку изображений проводили на микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss). Измерение площади полостей на цифровых изображениях проводили с помощью программы Image Tools. Результаты морфометрии обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, ANOVA, программа OriginPro. 12 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Эффекты трансплантации в область травматического повреждения нативных КОВ и ККП человека, их жизнеспособность и миграционный потенциал 3.1.1. Влияние трансплантации КОВ на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы Жизнеспособность и миграционный потенциал. Поддерживающее влияние трансплантируемых клеток и доставляемых ими стимуляторов регенерации на восстановление утраченных функций спинного мозга в значительной мере зависит от выживания и длительности присутствия этих клеток в ткани реципиента и от их миграционного потенциала. Меченые витальным красителем CFDA-SE КОВ человека (Табл. 1, группа 3), трансплантированные в область повреждения спинного мозга крысы, выявлены в дорсальном отделе белого вещества через 7 суток после КТСМ. Трансплантируемые КОВ выживают в поврежденной ткани и мигрируют из точки введения на расстояние до 2 см как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Кроме того, они мигрируют в область очага повреждения и скапливаются преимущественно по его периферии. Меченые КОВ присутствуют в сохраненной ткани белого вещества, проникая также в формирующиеся патологические полости. Восстановление функции. Оценка восстановления двигательной активности в открытом поле – тестирование методом «ВВВ» показало, что у крыс контрольной группы (среда Хенкса) происходило постепенное частичное самовосстановление произвольных движений с 7,8±0,2 балла через 1 неделю после операции до 10,5±0,3 баллов к 30 суткам, и 12,5±0,3 в конце эксперимента. У крыс с трансплантацией КОВ восстановление произвольных движений было систематически достоверно более выраженным, чем в контроле, с 8±0,3 до 12,5±0,2 к 30 суткам, и до 15±0,4 к концу эксперимента. Средний прирост показателя «ВВВ» при трансплантации КОВ, составил через 30 суток 4,5±0,4, а в контроле – 2,5±0,3 (р≤0,05), через 60 суток 5,8±0,3 и 4,5±0,3 (р≤0,05), соответственно. Положительное влияние трансплантации КОВ на восстановление произвольных движений наиболее сильно проявляется при анализе относительных показателей. Так, доля животных с количеством баллов 13 и более составила через 30 суток в контрольной группе 0%, а в опыте 50% (р≤0,05), через 60 суток – 25% и 84% (р≤0,05), соответственно. В опытной группе доля животных с максимальным приростом показателя (более 5 баллов) через 60 суток после КТСМ была также существенно выше, чем у контрольных крыс: 100% и 38%, соответственно (р≤0,05). Сохранность ткани. К 30 суткам эксперимента на всех изучаемых расстояниях от эпицентра травматического повреждения в группе животных с трансплантацией КОВ установлено уменьшение области деструкции серого вещества. Так, на поперечных срезах спинного мозга в эпицентре отмечено сокращение площади этой области в опыте более чем в 3 раза по сравнению с контролем (среда Хенкса). Хотя к 60 суткам эксперимента различие по данному показателю уменьшается в большинстве исследованных плоскостей, проходящих на различном расстоянии от эпицентра травмы, тем не менее, в опыте площадь области повреждения серого вещества сохраняется достоверно меньшей, чем в контроле. Эта тенденция прослеживается как в ростральном, так и в каудальном фрагментах. В белом веществе на тех же сроках эксперимента уменьшение площади деструкции в опыте еще более выражено. Эти различия проявляются в максимальной степени в эпицентре травмы и в непосредственной близости от него (Рис. 2А, 2Б). 13 2,0 А Б * * * * * * * ** 1,5 * 1,0 * 0,5 0,0 -30 -20 -10 0 10 20 30 -30 -20 -10 0 10 20 30 2 Рисунок 2. Площадь (по оси ординат, мм ) области деструкции в белом веществе в поперечном срезе спинного мозга на различном расстоянии от эпицентра травмы (по оси абсцисс, мм: слева от «0» – в каудальном, справа от «0» – в ростральном направлении) на 30 (А) и 60 (Б) сутки после травмы. * – р<0,05 при сравнении показателей в контроле (среда Хенкса, светлые символы) и опыте (КОВ, темные символы) Суммарная площадь патологических полостей. Через 30 суток после КТСМ и немедленной трансплантации КОВ выявлено снижение суммарной площади патологических полостей в белом веществе спинного мозга как в ростральном, так и в каудальном направлениях от эпицентра травмы по сравнению с контрольной группой. Существенное уменьшение показателя суммарной площади патологических полостей прослежено в опытной группе на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении. Оно наиболее выражено в белом веществе передних канатиков (зона 1 и зона 2). В зоне 1 этот показатель при трансплантации КОВ меньше в 3,7 раз (р<0,05), в зоне 2 – в 16 раз, в зонах 3 и 4 – в 2 раза (р<0,05). На расстоянии 5 мм от эпицентра травматического повреждения в зонах 1 и 2 рострального фрагмента этот показатель в опыте в 5 и в 4 раза меньше, а в зонах 3 и 4 – в 2 раза меньше, чем в контроле (р<0,05). На 60-е сутки эксперимента положительное влияние КОВ сохранилось: суммарная площадь патологических полостей в изучаемых зонах морфометрии в опыте в среднем в 2 раза меньше, чем в контроле, несмотря на уменьшение абсолютных значений и в опыте, и в контроле. Количество миелиновых волокон. К 30-м суткам эксперимента на расстоянии 5 мм каудальнее эпицентра травмы не выявлено достоверного преобладания количества миелиновых волокон в опытной группе животных. Однако на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы практически во всех исследованных областях белого вещества количество миелиновых волокон в опытной группе превышает их количество в контроле. В зоне 1 этот показатель при трансплантации клеток больше в 1,5 раза (р≤0,05), в зоне 3 – в 2 раза (р≤0,05). Аналогичная позитивная картина соотношения количества сохранных миелиновых волокон в контроле и опыте отмечена на соответствующих расстояниях в ростральном направлении от эпицентра травматического повреждения. К 60-м суткам после повреждения на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травматического повреждения в контроле (среда Хенкса), как в ростральном, так и каудальном направлениях отмечена выраженная деструкция миелиновых волокон в белом веществе. Она характеризуется глубокими нарушениями структуры миелиновой оболочки, расслоением миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра. Присутствуют остатки миелиновой оболочки с фрагментами аксонов или с полностью разрушенными аксонами. В большинстве миелиновых волокон аксоны 14 сохранены, но их структура значительно изменена. Считается, что подобные волокна могут проводить импульсы, но с существенно меньшей скоростью (Lasiene et al. 2008). На сроке 60 сутки после КТСМ и трансплантации КОВ в зонах 2 и 3 на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, с помощью ТЕМ установлено увеличение количества миелиновых волокон с компактным миелином в 1,6 раза (р < 0,05) по сравнению с контролем (среда Хенкса) с преобладанием волокон диаметром менее 2 мкм (Рис. 3). * 200 160 ** 120 80 40 0 1 2 3 Рисунок 3. – количество миелиновых волокон (по оси ординат) в латеральной части бокового канатика (зона 4) на расстоянии 5 мм каудальнее эпицентра травмы к 60 суткам после КТСМ и введения КОВ. По оси абсцисс диаметр волокон: 1 – более 2 мкм, 2 – от 0,5 до 2 мкм, 3 – менее 0,5 мкм. Серые столбики – контроль (среда Хенкса), белые столбики – опыт. Б – миелиновые волокна (TEM). Длина отрезка 200 нм. * – р≤0,05, ** – р≤0,005 3.1.2. Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы Жизнеспособность и миграционный потенциал. В спинном мозге животных которым были введены ККП, трансфицированные плазмидой pEGFP (Табл.1, группа 7), специфическое свечение выявлено на расстоянии до 10 мм в ростральном и каудальном направлении от соответствующих точек инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на ранних сроках после травмы и введения клеток (2–6 суток), четко прослеживается на более поздних сроках (14–21 сутки) и постепенно затухает к 30 суткам. Меченые ККП присутствуют в сохраненной ткани серого и белого вещества и проникают в патологические полости. Если к первым суткам после трансплантации флюоресцирующие клетки распределены более равномерно и преимущественно в белом веществе, то к 6м суткам они образуют скопления с интенсивным свечением в вентральной части задних канатиков и в прилегающей к ней дорсальной части серого вещества. К 7 суткам области с характерным свечением EGFP занимают больший объем ткани, интенсивность свечения возрастает, что может быть следствием увеличения экспрессии EGFP в трансплантированных клетках или увеличения их количества за счет активной пролиферации. К 14-м суткам область присутствия EGFP+-клеток значительно сужается. К этому сроку специфическая флюоресценция EGFP выявлена в компактном скоплении клеток преимущественно в вентральной части задних канатиков на границе с серым веществом. Восстановление функции. Оценка восстановления двигательной активности в открытом поле – тестирование методом «ВВВ» показала, что у крыс контрольной группы (DPBS) происходит постепенное частичное самовосстановление произвольных движений 15 с 0,8±0,8 балла на 7-е сутки после КТСМ до 4,2±1 баллов на 30-е сутки эксперимента. У крыс с трансплантацией нативных ККП восстановление произвольных движений систематически достоверно более выражено, чем в контроле: с 4,0 на 7-е сутки до 10,5 баллов к концу эксперимента. Опытные значения показателя «ВВВ» достоверно выше контрольных на всех сроках тестирования (* – р≤0,05). Средний прирост показателя «ВВВ» при трансплантации нативных ККП составил через 30 суток 6,5, а в контроле – 3,3 (р≤0,05) (Рис.4). 20 18 16 14 Баллы 12 10 8 6 4 2 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Рисунок 4. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации нативных ККП. По оси ординат – баллы, по оси абсцисс – сутки после КТСМ и трансплантации. Черные квадратики – опыт, белые кружочки – контроль (DPBS) Сохранность ткани. Трансплантация в область травмы нативных ККП на 30-е сутки эксперимента приводит к увеличению площади сохранного серого и белого вещества по сравнению с контролем на 52% и 48% на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении и на 58% в ростральном. На расстоянии 3 мм от эпицентра повреждения достоверных различий по этим показателям не наблюдали. Суммарная площадь патологических полостей. На 30-е сутки после КТСМ и трансплантации клеток установлено уменьшение суммарной площади патологических полостей в белом веществе спинного мозга крысы по сравнению с контрольной группой на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном так и в каудальном направлениях. Наибольшая достоверная разница установлена в ростральном фрагменте. Здесь суммарная площадь патологических полостей в опыте в зонах 1 и 2 в среднем в 2,5 а в зонах 3 и 4 в 4 и 3 раза меньше, чем в контроле. На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы достоверных различий по этим показателям не наблюдали. Количество миелиновых волокон. Трансплантация нативных ККП человека в зону травмы спинного мозга крысы приводит к увеличению количества сохранных миелиновых волокон как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Наибольшая достоверная разница между контрольным и опытным значениями установлена в боковых канатиках рострального фрагмента. Количество сохранных миелиновых волокон на расстоянии 5 мм в ростральном фрагменте справа в 2,4, слева в 3 раза, на расстоянии 3 мм – в 2 раза в опыте больше, чем в контроле (Рис. 5). В каудальном направлении от эпицентра травмы наблюдается та же тенденция, но разница в количестве миелиновых волокон между опытом и контролем меньше, чем в ростральном. 16 * 800 * ** 1 2 600 400 200 0 3 4 Рисунок 5. Количество миелиновых волокон в боковых канатиках белого вещества спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации ККП в зону повреждения (белые столбики). Серые столбики – контроль (DPBS). По оси абсцисс расстояние от эпицентра травмы и зона морфометрии: 1 – 5 мм, зона 3; 2 – 5 мм, зона 4; 3 – 3 мм, зона 3; 4 – 3 мм, зона 4. * – р≤0,05, ** – р≤0,005 Характеристика миграционных качеств, витальности и способности трансплантируемых стволовых клеток к поддержанию экспрессии плазмидных генов является необходимой основой для последующей оценки результатов применения этих клеток как носителей терапевтических генов. По способности к миграции трансплантированных в спинной мозг КОВ наши данные близки результатам исследования, полученным на модели бокового амиотрофического склероза у трансгенных по супероксиддисмутазе SOD1(G93A) крыс при трансплантации КОВ в область дорсальных канатиков (Li et al. 2011). Авторы этой работы показали возможность миграции трансплантированных КОВ в спинном мозге реципиента на расстояние 4,2 мм при их выживании в течение более 4 недель. При этом зарегистрировано существенное снижение гибели мотонейронов и стимулирование процесса ремиелинизации. Область повреждения при травме спинного мозга достаточно обширна, поэтому миграционный потенциал трансплантируемых клеток представляется крайне важным для нейрорегенерации. Он особенно значим для сдерживания процесса дегенерации миелиновых волокон и для стимулирования их ремиелинизации на всем протяжении области деструкции, начиная от эпицентра травмы и заканчивая зоной сохраненной ткани с интактными волокнами. В наших экспериментах появление трансплантированных в спинной мозг КОВ на значительном удалении от места инъекции может быть отчасти также связано с их пассивным перемещением вследствие развития отека и напряжения ткани в области травматического повреждения. В отношении КОВ при их трансплантации в спинной мозг допускается возможность подобного неактивного перемещения (Andrews et al. 2007). Весьма значимым представляются выявленные нами миграционные возможности ККП. Миграционный потенциал ККП, изученный нами в области контузионного повреждения спинного мозга, превышает или находится на уровне типированных гемопоэтических и нейральных стволовых клеток в аналогичных экспериментах (Han et al. 17 2004, Khalatbary et al. 2007). ККП, трансплантированные в область повреждения, сохраняют жизнеспособность до 30 суток и способны мигрировать на расстояние до 10 мм от места трансплантации в ростральном и каудальном направлении. С учетом того, что в наших экспериментах иммуносупрессия не применялась, а клетки трансплантировали сразу в момент травмы, а не после прохождения пика цитостатического действия провоспалительных цитокинов и клеточных иммунных реакций, отмеченная выше достаточно длительная экспрессия EGFP свидетельствует не только о высокой жизнеспособности трансплантирумых клеток, но и о потенциальной возможности пролонгированной экспрессии терапевтических генов. В целом, ККП и КОВ следует признать сопоставимыми в качестве потенциальных носителей терапевтических генов. Параметризация двигательной активности позволяет в целом количественно оценить степень восстановления неврологических функций спинного мозга после повреждения. Как показывают литературные источники, восстановление движений может обусловливаться отнюдь не только собственно регенерацией поврежденных клеток спинного мозга, но в значительной мере отражать компенсаторные перестройки уцелевших и вновь сформированных аксональных отростков (Шевелев и др. 2000, Maier et al. 2006, Darian-Smith et al. 2009). Учет двигательной активности представляется совершенно необходимым для сравнительной оценки способов восстановительной терапии. Так, контрольные группы (с введением среды Хенкса и DPBS) в наших экспериментах показали к 30-му дню весьма умеренные приросты показателя «ВВВ» на уровне 2,5-3,3 балла, отражающие процесс спонтанного восстановления. В то же время в опытных группах с трансплантацией КОВ и ККП средний прирост был почти вдвое больше контрольного, что однозначно свидетельствует о терапевтической действенности трансплантации нативных стволовых клеток. Сравнительно с КОВ, ККП показали достоверно в полтора раза более высокий относительный прирост, что делает терапию на их основе предпочтительной. Можно предполагать, что сравнение по качеству и интенсивности посттравматических реакций в ткани спинного мозга между контролем и опытом позволит выявить морфологические изменения, обусловленные специфическим влиянием трансплантируемых клеток, одновременно сопоставив их с положительной динамикой восстановления функции. Наши результаты показывают, что при трансплантации нативные КОВ и ККП способствуют сохранности ткани и сдерживают развитие кавитации, хотя и в разной степени. При сравнении площадей сохранного вещества двух опытных групп 4 и 6 (КОВ и ККП, Табл.1) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы выявлено почти двукратное превышение по этому параметру у животных с введением КОВ (Рис. 13). Суммарная площадь мелких патологических полостей на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в передних канатиках (зоны 1 и 2) рострального фрагмента в опыте с КОВ в 3,5 и 4 раза, а в боковых канатиках (зоны 3 и 4) – в 5.6 и 6 раз меньше, чем в опыте с ККП. На расстоянии 5 мм от эпицентра травмы наибольшие различия установлены в зонах 1 и 2: суммарная площадь патологических полостей в ростральном фрагменте – в 3.5 раза, в каудальном – в 7 и 13 раз меньше в опыте с трансплантацией КОВ, чем в опыте с трансплантацией ККП. Более выраженные различия между контролем и опытом на удалении от эпицентра травмы свидетельствуют о том, что трансплантированные стволовые клетки сдерживают процесс вторичной дегенерации, ограничивая его распространение в объеме спинного мозга. Наши наблюдения согласуются с данными о проявлении со стороны КОВ свойств иммунокомпетентных клеток и их способности модулировать выраженность процесса воспаления и вторичного повреждения в области травмы спинного мозга (Gorrie et al. 2010, Kallincik et al. 2010). В отношении клеток крови пуповины человека также установлено, что трансплантация ККП при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al., 2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari 18 et al., 2009). Более того, высказывается гипотеза, что в основе терапевтического действия ККП лежит именно подавление нейронального апоптоза (Dasari et al., 2009]. Электронномикроскопическое исследование показывает, что мелкие патологические полости в большом количестве возникают на месте дегенерирующих миелиновых волокон (Greitz D. et al., 2006, Ek et al., 2012). В последующем может происходить заполнение этих мелких полостей глиальными клетками, что приводит к уменьшению их суммарной площади. Этот процесс протекает более интенсивно в присутствии КОВ, но, по-видимому, не коррелирует ни с абсолютным уровнем, ни с приростом показателя двигательной активности. В то же время по количеству сохранных миелиновых волокон ситуация обратная: через месяц после травмы максимальная разница с контролем зарегистрирована в опытной группе с трансплантацией ККП – примерно в 1,5 раза выше, чем в опытной группе с трансплантацией КОВ. 3.2 Влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 Восстановление функции. ККП, трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2 оказывают выраженное поддерживающее влияние на восстановление двигательной функции при однократной трансплантации как в область латеральной гемисекции, так и в область контузионного повреждения. Первые признаки восстановления двигательной активности наблюдаются в период 6–12 суток после травмы. Они характеризуются слабыми, ясно определяемыми, изолированными движениями в одном или двух суставах задних конечностей. Тестирование животных в открытом поле выявило более раннее и более выраженное восстановление двигательной функции в опытах с трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, чем в контролях (ККП+pEGFP) как при гемисекции, так и при КТСМ (Рис. 6А, Б). Баллы А 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Б * 5 9 13 * * ** * * * опыт контроль * ** * * * * * 17 21 25 29 5 9 13 17 21 25 * 29 Сутки после операции Рисунок 6. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2: А – при гемисекции; Б – при контузионной травме спинного мозга. Опыт – ККП+pBud-VEGF-FGF2, контроль – ККП+pEGFP. По оси ординат – баллы, по оси абсцисс – сутки после травмы и трансплантации. * – р≤0,05 Прирост показателя «ВВВ» при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на сроке 12-30 суток после гемисекции составил в среднем 19 7,4 балла (р≤0,05), после КТСМ 5 баллов (р≤0,05). Обращает на себя внимание двухфазный характер зависимости показателя «ВВВ» в интервале от момента проявления первых признаков активности и до окончания эксперимента: начальный крутой рост в течение первых 2-4 дней и последующий более пологий участок. Наклоны соответствующих участков зависимости, характеризующие скорость восстановления двигательной функции, имеют близкие значения в контроле и опыте. Фактически, выигрыш в приросте показателя, создаваемый экспрессией терапевтических генов, преимущественно обусловливается более продолжительным периодом начальной фазы быстрого роста независимо от характера повреждения. Сохранность ткани. К 30-м суткам после КТСМ в спинном мозге животных как опытной, так и контрольной группы на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра, формируется единая патологическая полость, которая занимает большую часть серого вещества и частично затрагивает белое. В полости присутствуют отдельные дегенерирующие клетки и их скопления. Стенка полости выстлана глиальными клетками, снаружи от которых, не образуя сплошной слой, располагаются фибробластоподобные клетки. К 30-м суткам у животных опытной группы размеры этой полости существенно меньше, чем в контроле. На поперечных срезах спинного мозга площадь полости в опыте (ККП+pBud-VEGF-FGF2) на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении уменьшается на 27% (p<0,05), а при том же удалении от эпицентра в каудальном направлении – на 10% (p<0,05), по сравнению с контролем (ККП+pEGFP). При удалении плоскости среза от эпицентра на расстояние 5 мм в ростральном направлении площадь полости в опыте уменьшается на 58% (p<0,05), а в каудальном – на 49% (р<0,05) по сравнению с контролем (ККП+pEGFP). К этому же сроку площадь сохраненного серого вещества на расстоянии 3 мм в ростральном направлении от эпицентра травмы в опыте больше на 66%, а на том же расстоянии в каудальном направлении – на 61%. На расстоянии 5 мм от эпицентра различия между опытной (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) группами выражены в меньшей степени, однако по-прежнему положительные сдвиги в ростральном направлении выше, чем в каудальном: на 40% и на 31% (р<0,05), соответственно. Уменьшение площади деструкции ткани при трансплантации клеток, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, выявлено также в белом веществе. К 30 суткам эксперимента на расстоянии 3 мм в ростральном и каудальном направлениях от эпицентра травмы площадь сохраненного белого вещества у животных опытной группы превышает данный показатель у животных контрольной группы (ККП+pEGFP) соответственно на 56% и 63%. На расстоянии 5 мм рострально и каудально от эпицентра травмы площадь сохраненного белого вещества у животных опытной группы увеличивается соответственно на 45 и 43% (р<0,05). Результаты морфометрии свидетельствуют о том, что чем ближе к эпицентру травмы и точкам введения клеток располагается исследуемый участок мозга, тем сильнее проявляется поддерживающий эффект терапевтических генов на сохранность серого и белого вещества. Сравнительно с нативными ККП и КОВ генно-модифицированные ККП в большей мере способствуют сохранности ткани (Рис. 13). Суммарная площадь патологических полостей. К 30-м суткам после нанесения КТСМ и трансплантации трансфицированных ККП в относительно сохраненном белом веществе присутствуют многочисленные мелкие полости. К этому сроку у животных опытной группы суммарная площадь патологических полостей, сосчитанная на поперечном срезе спинного мозга при удалении от эпицентра на расстояние 3 мм в каудальном направлении, значительно уменьшается. Так, по сравнению с контрольной группой крыс (ККП+pEGFP), в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева (зоны 1 и 2) она уменьшается в 2,4 и 2,2 раза, а в латеральной части бокового канатика справа и слева (зоны 3 и 4) – в 2,5 и 1,8 раза (р≤0,05). 20 В зонах 1 и 2 справа и слева при том же удалении от эпицентра, но в ростральном направлении, суммарная площадь патологических полостей у животных опытной группы в 2,2 и 2,7, а в зонах 3 и 4 – в 2 раза меньше соответствующего показателя в контроле (ККП+pEGFP) (р≤0,05). На расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлениях опытные значения суммарной площади патологических полостей во всех зонах морфометрии в среднем 2,5 раза меньше контрольных (ККП+pEGFP) (р≤0,05). Количество миелиновых волокон. К 30-м суткам после нанесения травмы в белом веществе в участках, забранных на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, отмечена выраженная деструкция миелиновых волокон. Она характеризуется глубокими изменениями миелиновой оболочки, расслоением и дезинтеграцией миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра. При развитии деструктивного процесса эти вакуоли вызывают значительную деформацию осевых цилиндров вплоть до полного их исчезновения. У животных опытной группы (ККП+pBud-VEGF-FGF2) на 30-е сутки после нанесения травмы в зонах морфометрии наружной части белого вещества на расстоянии 5 мм от эпицентра в ростральном направлении выявлено значительное увеличение количества миелиновых волокон с сохранной структурой. При этом в латеральной части бокового канатика справа (зона 3) количество миелиновых волокон превышало соответствующий показатель в контроле (ККП+pEGFP) на 67% (р<0,05), а слева (зона 4) – на 60% (р<0,05). В вентро-медиальной части переднего канатика это превышение в опытной группе составило 50% (р<0,05) на правой стороне (зона 1) и 47% (р<0,05) на левой (зона 2). В каудальном направлении количество миелиновых волокон увеличивается в латеральной части бокового канатика справа (зона 3) на 57% (р≤0,05), а слева (зона 4) на 65% (р≤0,05) (Рис. 7Б); в вентро-медиальной части переднего канатика этот прирост составляет соответственно 57% (р≤0,05) (зона 1) и 52% (р≤0,05) (зона 2). Ближе к эпицентру травмы, на расстоянии 3 мм в каудальном и ростральном направлении во всех зонах морфометрии количество миелиновых волокон увеличивается незначительно, в среднем на 20% (р≤0,05) (Рис. 7А). А Б ** 1000 ** ** ** 800 600 * 400 * 200 0 1 2 3 4 1 2 3 4 Рисунок 7. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) в зонах морфометрии (по оси абсцисс) при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 (белые столбики). А – 3 мм, Б – 5 мм в ростральном направлении от эпицентра травмы. Серые столбики – контроль (ККП+pEGFP). * – р<0,05; ** – р<0,01 21 В отличие от контрольной группы с трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP, в наружной части белого вещества у животных опытной группы с доставкой генов vegf и fgf2 присутствуют волокна с компактной миелиновой оболочкой. Эти волокна имеют хорошо выраженную базальную мембрану и окружены пучками коллагеновых волокон, что рассматривается как признак миграции в область повреждения шванновских клеток, способных участвовать в ремиелинизации в ЦНС (Bunge et al. 1994, Radtke et al. 2004,). Рядом с миелиновыми волокнами наблюдается большое количество безмиелиновых волокон, что не характерно для соответствующего по локализации материала, полученного от животных контрольной группы и свидетельствует в пользу позитивного влияния данной комбинации генов на процесс нейрорегенерации. Результаты иммуногистохимических исследований. Осадок конечного продукта иммуногистохимической реакции с антителами против PDGFβR выявлен в клетках преимущественно белого вещества в связи с кровеносными сосудами. Длинные PDGFβRиммунопозитивные отростки этих периваскулярных клеток ориентированы по ходу кровеносных сосудов, проходящих в радиальном направлении. Наибольшее количество PDGFβR+-клеток выявлено в наружных зонах белого вещества. Различий в характере распределения и интенсивности осадка иммуногистохимической реакции в материале от животных опытной (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) групп выявлено не было. У животных опытной группы в наружных зонах белого вещества на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы количество периваскулярных клеток, экспрессирующих PDGFβR, возрастает в среднем на 30%. PDGF-B связываясь через рецепторный вход PDGFβR стимулирует дифференцировку перицитов из предшественников, экспрессирующих PDGFβR, что оказывает поддерживающее влияние на процесс васкуляризации (Betsholtz et al. 2005). Его нарушение показано при дефектах генов PDGF-B и PDGFβR. Зарегистрированное нами к 30 суткам эксперимента увеличение количества PDGFβR+-клеток отражает усиление васкуляризации белого вещества в области травматического повреждения спинного мозга. Этот эффект, по-видимому, является результатом действия VEGF, продуцируемого трансплантируемыми ККП. Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка терапевтических генов vegf и fgf2 при помощи ККП человека стимулирует васкуляризацию ткани спинного мозга. К 30-м суткам в белом веществе в области повреждения спинного мозга у животных опытной (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) групп выявлены редкие Р0+-клетки, которые по данному фенотипическому признаку могут быть идентифицированы как шванновские клетки. Их количество постепенно уменьшается по мере удаления от эпицентра травмы. На поперечном срезе спинного мозга на расстоянии 15 мм от эпицентра в каудальном направлении в 1 мм2 белого вещества в среднем содержится до 200 Р0+-клеток. Таким образом, трансплантация в область КТСМ ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, в большей степени препятствует развитию патологической кавитации, способствует сохранности серого и белого вещества и ремиелинизации, чем трансплатация нативных клеток и клеток, трансфицированных плазмидой с нейтральным геном EGFP. Полученный результат можно объяснить действием экспрессируемых терапевтических трансгенов нейротрофических и ангиогенных факторов на клеткимишени в повреждѐнной ткани спинного мозга. Выявленное нами уменьшение патологической кавитации при введении ККП человека, трансфицированных конструкцией pBud-VEGF-FGF2, в спинной мозг крысы согласуется с результатами введения нейральных стволовых клеток, трансфицированных геном vegf при помощи ретровирусного вектора (Hwang et al. 2009). При этом в качестве благоприятного для поддержания регенерации фактора авторы исследования отмечают возрастание количества пролиферирующих NG2+-клеток (Yoo 2007, Sellers 2010), которые рассматриваются как предшественники олигодендроцитов и протоплазматических 22 астроцитов. С другой стороны, рост количества миелиновых волокон может быть следствием увеличения объема тканевого матрикса вследствие уменьшения объема патологических полостей и увеличения области сохраненной ткани в белом веществе. 3.3. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 Баллы Восстановление функции. Однократная инъекция в зону повреждения спинного мозга крысы плазмиды, экспрессирующей гены vegf и fgf2, стимулирует восстановление двигательной активности задних конечностей. В первые 6 суток эксперимента после КТСМ двигательная активность задних конечностей, как в опытной группе животных, так и в контрольной, отсутствует. После прохождения фазы спинального шока начинается период относительно быстрого нарастания двигательной активности, после чего уровень функциональности стабилизируется (фаза плато). Тестирование животных в открытом поле выявило более выраженное восстановление двигательной активности при инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2 (Рис. 8): с 3,5 баллов на 7-е сутки после КТСМ до 14,5 баллов к концу эксперимента. Средний прирост показателя «ВВВ» к 30-м суткам в опыте (pBudVEGF-FGF2) составил 11 баллов, а в контроле (pEGFP) – 4 балла (р≤0,05). 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 * * * * * * * * * * 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Рисунок 8. Результаты теста «ВВВ» при введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2. По оси ординат – баллы, по оси абсцисс – сутки после КТСМ. Черные квадратики – опыт, белые кружочки – контроль (pEGFP) Приведенные на рисунке 8 зависимости имеют уже отмечавшийся нами ранее двухфазный вид. Темпы восстановления двигательной активности при введении плазмиды с генами нейротрофических факторов и плазмиды, несущей гены нейтрального белка, до 9-х суток эксперимента примерно одинаковы. Более чем трехкратное превышение показателя к моменту выхода на плато в опыте по сравнению с контролем обеспечивается увеличением времени, в течение которого действует механизм восстановления двигательных функций до его исчерпания. Достигнутая в опыте с непосредственным введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 длительность активной фазы восстановления (11 дней) превышала также длительность активной фазы при клеточно-опосредованном введении той же плазмиды (5 дней), что обеспечило в первом случае на 2 балла более высокий уровень восстановления. Сохранность ткани. К 30 суткам после травмы спинного мозга крысы инъекция плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в область повреждения приводит к уменьшению области 23 деструкции серого и белого вещества как в ростральном, так и каудальном направлениях от эпицентра травмы. Так, в опытной группе животных площадь участка повреждения на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в среднем на 55%, а на расстоянии 5 мм в среднем на 80% меньше, чем при инъекции плазмиды с геном pEGFP (контроль). При сравнении опытных групп, получавших генно-клеточную терапию (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2, площадь деструкции ткани в последнем случае оказалась в 1,5 - 2 раза меньшей (Рис. 9). 2,0 * 1,6 1,2 * * 0,8 0,4 0,0 -6 -4 -2 0 2 4 6 Расстояние от эпицентра травмы Рисунок 9. Площадь участка повреждения (в мм2 по оси ординат) на поперечных срезах спинного мозга. По оси абсцисс – расстояние в мм от эпицентра травмы: слева от оси ординат – в каудальном направлении, справа – в ростральном. Сплошная линия – ККП+pBud-VEGF-FGF2. Пунктирная линия – pBud-VEGF-FGF2. * – р≤0,05 Суммарная площадь патологических полостей. Инъекция плазмиды pBud-VEGFFGF2 в зону травматического повреждения к 30-м суткам эксперимента значительно уменьшает образование патологических полостей в спинном мозге по сравнению с контролем. На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы во всех зонах морфометрии, как в ростральном, так и в каудальном направлениях, площадь патологических полостей в среднем в 5 раз меньше, чем в контроле (Рис.10). *** *** 0,6 ** ** 0,4 0,2 0,0 1 2 3 Рисунок 10. Суммарная площадь патологических полостей (ось ординат в мм2) в контроле (pEGFP) и в опыте (плазмида pBud-VEGF-FGF2) на 30-е сутки после КТСМ на поперечном срезе спинного мозга на расстоянии 3 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы. Серые столбики – опыт, белые столбики – контроль. ** – р≤0,005; *** – р≤0,001 4 Зоны морфометрии 24 Суммарная площадь патологических полостей в эксперименте с прямой генной терапией (pBud-VEGF-FGF2) на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в зонах 3 и 4 рострального фрагмента на 40% и 33%, а в зонах 2 и 4 каудального фрагмента – на 50% и 64% меньше, чем в эксперименте с клеточно-опосредованной терапией (ККП+pBudVEGF-FGF2). Количество миелиновых волокон. На 30-е сутки после контузионной травмы и инъекции в зону повреждения плазмиды pBud-VEGF-FGF2 количество миелиновых волокон на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы достоверно не увеличивается по сравнению с контролем (pEGFP). Однако признаки деструкции большинства миелиновых волокон опытной группы животных менее выражены. При световой микроскопии миелиновые оболочки волокон в опыте имеют более четкие очертания и толщину, а сами волокна имеют больший диаметр, чем в контроле. При изучении волокон на электронномикроскопическом уровне установлено, что миелиновые оболочки имеют незначительные локальные расслоения, характеризуются отсутствием вакуолей. Осевые цилиндры волокон в материале опытной группы животных менее деформированы. Они содержат микротрубочки, митохондрии и нейрофиламенты с более четкой структурой микротрубочек и митохондрий, чем в контроле. На расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в наружной части белого вещества в опыте обнаруживаются волокна с компактной миелиновой оболочкой диаметром меньше 2 мкм (указаны стрелками на рисунке А), с хорошо выраженной базальной мембраной и окруженые пучками коллагеновых волокон. Наличие базальной мембраны и внеклеточного коллагена является признаком миелина периферического типа (Berthold et al. 1978) и отличает миелин-формирующие клетки от миелина центрального типа, образуемого олигодендроцитами. Выявляемые ТЕМ миелинизированные волокна имеют более тонкий, чем в норме, слой миелина с присоединенной извне асимметрично расположенной цитоплазмой, в которой просматриваются ядро и другие органеллы. Указанные признаки характерны для миелинобразующих шванновских клеток (Jasmin et al. 2000, Plant et al. 2002). В непосредственной близости от миелиновых волокон прослеживается большое количество безмиелиновых волокон (указаны стрелками на рисунке Б), что не характерно для контрольной группы животных. Безмиелиновые волокна объединены в пучки, окруженные общей мембраной шванновских клеток. Пространство между пучками безмиелиновых волокон заполнено коллагеновыми волокнами. Подобная структура также характерна для волокон периферических нервов (Grisolia et al. 2006). Таким образом, однократная инъекция плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в область контузионной травмы спинного мозга крысы стимулирует прорастание и ремиелинизацию волокон, опосредованную мигрирующими шванновскими клетками. А Б Рисунок 11. Миелиновые волокна (А), безмиелиновые волокна (Б) в белом веществе спинного мозга на 30 сутки эксперимента на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы при прямом введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2. Стрелки указывают на: А – миелиновые 25 волокна, Б – безмиелиновые волокна. Увеличение на рисунке А 7500, на рисунке Б 15000. Длина отрезка на рисунке А 1 мкм, на рисунке Б – 500 нм Данные иммуногистохимии. На 30 сутки после КТСМ у животных 8-й и 10-й групп (ККП+pBud-VEGF-FGF2 и pBud-VEGF-FGF2, Табл. 1) на расстоянии до 2 см в ростральном и каудальном направлениях от эпицентра повреждения обнаружены клетки, экспрессирующие специфические маркеры шванновских клеток. Их количество и распределение в белом и сером веществе существенно отличаются в этих опытных группах от 1-й контрольной (КТСМ, Табл. 1). При помощи непрямого иммунопероксидазного метода с выявлением Krox20 обнаружено увеличение количества Krox20+-клеток во всех зонах морфометрии белого вещества на расстоянии 1 см в ростральном и каудальном направлении от эпицентра повреждения в 8-й и 10-й опытных группах по сравнению с контрольной (КТСМ), соответственно, на 61% и 50%. К 30-м суткам после нанесения травмы во всех 3-х исследуемых группах в белом и сером веществе обнаружены клетки, одновременно экспрессирующие белки S100, GFAP и Krox20 (S100+/GFAP+/Krox20+-клетки). Для контрольной группы в области вхождения задних корешков характерно: отсутствие S100+-клеток и Krox20+-клеток, преимущественно наличие GFAP+-клеток, небольшое скопление GFAP+/Krox20+-клеток и единичные S100+/GFAP+/Krox20+-клетки. Для обеих опытных групп в указанной области серого вещества характерно: наличие S100+-клеток и единичных Krox20+-клеток, присутствие GFAP+-клеток, GFAP+/Krox20+-клеток и S100+/GFAP+/Krox20+-клеток. При этом в случае доставки генов нейротрофических факторов vegf и fgf2 на клеточных носителях (ККП+pBud-VEGF-FGF2) по сравнению с прямым введением плазмиды с терапевтическими генами (pBud-VEGFFGF2) популяция S100+/GFAP+/Krox20+-клеток представляется наибольшей. В указанной области вхождения задних корешков в 8-й опытной группе (ККП+pBud-VEGF-FGF2) особенно выражена популяция GFAP+/Krox20+-клеток, являющаяся также самой многочисленной. Для 10-й опытной группы (pBud-VEGF-FGF2) в области вхождения задних корешков характерно наличие большего количества S100+-клеток и GFAP+-клеток. В белом и сером веществе обеих опытных групп экспериментальных групп характерно наличие единичных S100+-клеток округлой формы. Отмечены различия в имеющихся размерах тел и отростков S100+/GFAP+/Krox20+-клеток в белом и сером веществах, характерные для опытных и контрольной групп. Так, размер шванновских клеток, одновременно экспрессирующих белки S100, GFAP и транскрипционный фактор Krox20, в зонах белого вещества в 2 раза больше, чем в сером веществе и задних канатиках. При тройном иммунофлюоресцентом окрашивании с помощью антител против HSP25, GFAP и Krox20 в белом веществе выявлены клетки, экспрессирующие все три указанных маркера (HSP25+/GFAP+/Krox20+-клетки). В сером веществе и в области вхождения задних корешков данные клетки не обнаружены. Наибольшее количество HSP25+/GFAP+/Krox20+-клеток в области задних канатиков характерно для 8-й опытной группы с доставкой генов vegf и fgf2 на клеточных носителях. Для 10 опытной группы с прямой доставкой плазмиды с теми же генами этот показатель снижен в 2 раза. В контрольной группе HSP25/GFAP/Krox20+-клетки в области задних канатиков отсутствуют, наблюдаются лишь единичные GFAP+/Krox20+-клетки и большое количество GFAP+-клеток. HSP25+-клетки в области вхождения задних корешков обнаружены лишь в 8 опытной группе (ККП+pBud-VEGF-FGF2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка генов vegf и fgf2 приводит к увеличению количества эндогенных шванновских клеток в области повреждения спинного мозга. Данный феномен можно объяснить либо увеличением срока выживания эндогенных шванновских клеток, либо повышением их способности к миграции в область повреждения и пролиферации. Эти данные согласуются с показанной возможностью плазмиды с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf) 26 усиливать пролиферацию шванновских клеток, увеличивать экспрессию в них белка vegf, тем самым улучшая способность к регенерации аксонов (Haninec et al. 2012). Способность усиливать пролиферацию шванновских клеток in vitro установлена и для фактора роста фибробластов 2 (fgf2) (Shen et al. 2005). Транскрипционный фактор Krox20 является надежным маркером миелинобразующих шванновских клеток и также экспрессируется клетками пограничной шапочки, которые активно мигрируют в область повреждения, где дифференцируются в шванновские клетки (Shen et al. 2005). Начало экспрессии Krox20 приурочено к стадии перехода предшественников в зрелые клетки (Topilko et al. 1994). Наличие белка S100 специфично как для астроцитарной глии, так и для незрелых шванновских клеток. Ранее GFAP считался высоко специфичным только для зрелых астроцитов, но исследования последних лет показали экспрессию данного белка в миелиннеобразующих шванновских клетках (Wang et al. 2010). Обнаружение S100+/GFAP+/Krox20+-клеток в нашем исследовании может свидетельствовать о наличии мигрирующих в спинной мозг шванновских клетках на стадии неполной дифференцировки в миелинобразующий клеточный тип. При этом среди всей популяции мигрировавших шванновских клеток встречаются и зрелые Krox20+-клетки, способные к миелинизации аксонов. Увеличение количества Krox20+-клеток в 8-й опытной группе (ККП+pBud-VEGF-FGF2) по сравнению с группой 10 (pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (КТСМ) как в белом веществе, так и в области вхождения задних корешков говорит о стимулировании миграции и дифференцировке шванновских клеток в большей степени при доставке генов vegf и fgf2 при помощи ККП человека. Наиболее вероятно, что это связано со способностью к длительному выживанию трансплантированных клеток и поддержанию продукции ими терапевтических молекул. Способность к стимулированию миграции шванновских клеток в случае прямого введения плазмиды с генами vegf и fgf2 также имеет место, однако более низкие показатели по сравнению с 8-й опытной группой (ККП+pBud-VEGF-FGF2), могут быть связаны с низкой трансфекционной активностью при этом способе доставки или кратковременной продукцией нейротрофических факторов. Белок теплового шока HSP25 играет центральную роль в системе сигнализации, которая обеспечивает регенерацию нервных волокон (Murashov et al. 2001). Ранее показано, что HSP25 экспрессируется в глиальных клетках, в том числе реактивных астроцитах, находящихся в сером веществе (Pieri et al. 2001). По экспрессии белка теплового шока HSP25 в глиальных клетках можно судить о включении цитопротекторного механизма. Нами впервые обнаружена экспрессия белка теплового шока HSP25 в GFAP+/Krox20+-шванновских клетках, мигрировавших в белое вещество области повреждения. Отсутствие HSP25+/GFAP+/Krox20+-клеток в области вхождения задних корешков и их наличие в белом веществе может свидетельствовать о возможном становлении реактивности шванновских клеток после их миграции в область демиелинизации, либо о приобретении ими дополнительных защитных свойств в связи с изменением микроокружения. Появление безмиелиновых волокон в белом веществе в области повреждения у животных с доставкой генов vegf и fgf2 при помощи ККП в качестве носителей трансгенов и при прямой инъекции данной плазмиды свидетельствует о позитивном влиянии данной комбинации генов на процесс нейрорегенерации. Более высокие показатели по таким критериям, как сохранность ткани и степень восстановления двигательной функции в экспериментах с прямой инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2, дают основание полагать, что прямая генная терапия представляется эффективным дополнением к методу доставки генов при помощи трансфицированных стволовых и прогениторных клеток. Вместе с тем, представляется возможным усилить влияние прямой генной терапии с помощью создания безопасных невирусных векторов с высокой трансфекционной активностью. 27 3.4. Влияние ККП, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, на посттравматическую регенерацию Восстановление функции. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы ККП, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом ККП+AdV-GDNF, стимулирует восстановление двигательной функции. Оценка восстановления произвольных движений в открытом поле – тестирование методом «ВВВ» показала, что у крыс контрольной группы (ККП+AdV-EGFP) происходило постепенное частичное восстановление произвольных движений с 2 баллов на 7-е сутки после КТСМ до 9,6 баллов на 30-е сутки эксперимента. У крыс опытной группы (ККП+AdV-GDNF) восстановление произвольных движений было систематически более выраженным, чем в контроле: с 5 на 7-е сутки после КТСМ до 16,5 баллов к концу эксперимента. Средний прирост показателя «ВВВ» в опыте (ККП+AdV-GDNF) составил через 30 суток 10, а в контроле (ККП+AdV-EGFP) – 5 баллов. Достоверные отличия между опытными и контрольными значениями показателей «ВВВ» установлены на сроках 9, 11, 13, 15, 17, 25, 27 сутки эксперимента и составляют не менее 5 баллов (р≤0,05). Таким образом, при клеточной терапии трансплантация в зону повреждения ККП, модифицированных генами vegf, fgf2, gdnf и egfp, различным образом сказывается на восстановлении функции спинного мозга. На 30 сутки после КТСМ установлено, что показатель «ВВВ» в опытах с трансплантацией ККП, модифицированных генами терапевтических факторов, статистически достоверно выше, чем при трансплантации ККП с нейтральным геном egfp: на 3 бала при трансфекции (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и на 6 баллов при трансдукции (ККП+AdV-GDNF). Сохранность ткани. На 30 сутки после контузионной травмы и введения непосредственно в зону повреждения ККП, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом AdV-GDNF, наблюдали уменьшение площади участка повреждения и увеличение площади сохранной ткани на расстоянии 3 см от эпицентра повреждения на 30 % в ростральном направлении, на 27 % в каудальном направлении, на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения – на 70 и 65 %, при сравнении с соответствующим показателем у животных c введением тех же клеток, трансдуцированных AdV-EGFP. Суммарная площадь патологических полостей. При трансплантации в зону травматического повреждения ККП, трансдуцированных AdV-GDNF, на 30 сутки после КТСМ наблюдали уменьшение суммарной площади патологических полостей, по сравнению с контролем (AdV-EGFP). На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентромедиальной части передних канатиков каудального фрагмента справа и слева этот показатель в опыте более чем в 6 раз меньше, чем в контроле (AdV-EGFP) (р <0,05). В ростральном фрагменте это различие составляет 4,2 раза. В зонах латеральной части боковых канатиков каудального и рострального фрагментов – в среднем в 3 и 4 раза соответственно. Наибольшая разница между опытным и контрольным значениями суммарной площади патологических полостей установлена на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения. Контрольное значение превышало опытное в вентро-медиальной части передних канатиков рострального фрагмента справа и слева более чем в 10 и 8 раз, каудального – в 6 раз, в зонах латеральной части боковых канатиков каудального и латерального фрагментов – в 4 и 5 раз, соответственно (р<0,05). Количество миелиновых волокон. На 30-е сутки эксперимента с трансплантацией ККП, трансдуцированных AdV-GDNF количество миелиновых волокон достоверно больше, чем в контроле (ККП+AdV-EGFP). В наибольшей степени эта разница проявляется на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения. Так, количество миелиновых волокон в вентро-медиальной части переднего канатика рострального фрагмента было справа и слева на 40% и 56%, а каудального фрагмента на 50% и 48% больше в опыте, чем 28 в контроле. В боковых канатиках рострального фрагмента количество миелиновых волокон в опыте на 72% и 80%, каудального – на 65% больше, чем в контроле. На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в опыте количество миелиновых волокон в вентромедиальной части переднего канатика справа и слева, как в ростральном, так и в каудальном направлениях, в среднем на 25%, в боковых канатиках в ростральном направлении в среднем на 30% и в каудальном на 26% выше, чем в контроле. Результаты иммуногистохимических исследований. При проведении иммунофлюоресцентных реакций с антителами к α-рецептору тромбоцитарного фактора роста (α-PDGFR) и глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) во всех исследуемых группах в белом и сером веществе выявлены α-PDGFR+-олигодендроциты и GFAP+-астроциты. В группе ККП+AdV-GDNF в зонах подсчѐта на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении популяция GFAP-положительных астроцитов в 2 раза превышала аналогичную в контрольной группе без введения клеток. Количество α-PDGFR+-олигодендроцитов в опытной группе во всех фиксированных зонах на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в ростральном направлении было в 2-3 раза больше, чем в контроле. Выявленное нами увеличение количества GFAP+-астроцитов следует рассматривать как позитивный фактор стимулирования нейрорегенерации. Этот вывод основан на известном представлении о роли реактивных астроцитов, которые оказывают антиоксидантное и цитопротекторное действие на нейроны и мелинобразующие олигодендроциты, в том числе путѐм увеличения экспрессии мембранного транспортѐра глутамата и снижения содержания этого возбуждающего нейромедиатора во внеклеточном пространстве (Lepore et al. 2005). α-PDGFR является специфическим маркѐром клеток-предшественниц олигодендроцитов (Watzlawik et al. 2013). Наличие α-PDGFR+-клеток в области повреждения имеет большое значение для процесса регенерации, так как свидетельствует о ремиелинизации проводников. 3.5 Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии аденовирусом AdV-GDNF Восстановление функции. У крыс контрольной группы (AdV-EGFP) происходило постепенное частичное восстановление произвольных движений с 3 баллов на 7-е сутки после КТСМ до 9 баллов на 30-е сутки (Рис. 12). Эти контрольные значения достоверно ниже опытных на всех сроках тестирования (р≤0,05). У животных опытной группы (AdVGDNF) показатель восстановления двигательной активности к моменту первой регистрации на 7-е сутки после травмы уже имеет довольно высокое значение 9 баллов и в дальнейшем увеличивается линейно с небольшой скоростью, характерной для второй фазы, то есть вся фаза быстрого роста в этом эксперименте начинается и завершается в более ранние сроки. Максимальное значение показателя «ВВВ» на 30-е сутки эксперимента составило 17, что превышает аналогичный показатель в опытах с инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2 на 3 балла и трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на 4 балла. Средний прирост показателя «ВВВ» в опыте (AdV-GDNF) составил через 30 суток 8, а в контроле (AdV-EGFP) – 4 балла. Рисунок 12. Результаты теста «ВВВ» при введении AdV-GDNF. По оси ординат – баллы, по оси абсцисс – сутки после КТСМ. Черные квадратики – опыт (AdV-GDNF), белые кружочки – контроль (AdV-EGFP) 20 18 16 14 Баллы 12 10 8 6 4 2 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 29 Таким образом, при прямой генной терапии инъекция плазмиды pBud-VEGF-FGF2 и аденовируса AdV-GDNF в зону повреждения различным образом влияет на восстановлении функции спинного мозга. На 30 сутки после КТСМ и введения аденовируса AdV-GDNF установлено достоверное превышение значения показателя «ВВВ» на 3 балла по сравнению с инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2. Сохранность ткани. На 30 сутки после контузионной травмы и введения непосредственно в зону повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF, наблюдали уменьшение площади участка повреждения на расстоянии 3 мм от эпицентра повреждения на 20 % в ростральном направлении и на 17 % в каудальном направлении. На расстоянии 5 мм от эпицентра площадь участка повреждения уменьшалась, соответственно, на 75 и 70 %, при сравнении с соответствующим показателем у контрольной группы животных c введением рекомбинантного аденовируса AdV-EGFP. Варианты генно-клеточной терапии, из числа исследованных нами, неравнозначны по своему сдерживающему влиянию на развитие деструкции ткани спинного мозга. Площадь сохранного вещества к исходу первого месяца после травмы оказалась наибольшей в условиях прямой инъекции плазмиды с генами факторов VEGV и FGF2. Ненамного уступает ей по эффективности прямая инъекция аденовируса с геном глиального нейротрофического фактора. Клеточно-опосредованные способы введения генов терапевтических факторов, как и чисто клеточная терапия, дали менее выраженный результат (Рис.13). * ** 6 * * 5 ** 4 3 2 1 +p КК Bu П dVE G FFG pB F2 ud -V EG FFG F2 КК П -A dv -G D N F Ad vG D N F КК П КО В 0 Рисунок 13. Площадь сохранного вещества (мм2) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении (по оси ординат). По оси абсцисс – экспериментальные группы. * – р<0,05; ** – р<0,005 Суммарная площадь патологических полостей. На 30-е сутки после КТСМ и введения в зону травматического повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF зарегистрировано уменьшение суммарной площади патологических полостей, по сравнению с контролем (AdV-EGFP). Наибольшая разница наблюдалась на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части передних канатиков рострального фрагмента. Здесь опытное значение меньше контрольного более чем в 7 раз, в 30 аналогичной части каудального фрагмента – в 5,5 раза (р<0,05). Такая же тенденция наблюдается в зонах латеральной части боковых канатиков рострального фрагмента в среднем – в 6 и каудального фрагмента – в 3 раза (р<0,05). Также достоверная разница между опытным (AdV-GDNF) и контрольным (AdVEGFP) значениями суммарной площади патологических полостей выявлена на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы. В вентро-медиальной части передних канатиков рострального фрагмента суммарная площадь патологических полостей в опыте меньше, чем в контроле более чем в 7,5 раза, каудального фрагмента – 6 (р<0,05), в зонах латеральной части боковых канатиков в латеральном и каудальном фрагментах – в 7 и 6 раз соответственно. Сравнение двух вариантов прямой генной терапии – инъекции плазмиды, несущей гены ангиогенных и нейротрофических факторов VEGF и FGF2, и инъекции аденовируса с геном глиального нейротрофического фактора показало, что оба способа способствуют уменьшению суммарной площади патологических полостей, однако каких-либо существенных преимуществ одного перед другим выявить не удалось. Суммарная площадь патологических полостей в опыте с AdV-GDNF на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в зонах боковых канатиков рострального и каудальнго фрагментов достоверно не отличается от таковой в опыте с плазмидой pBud-VEGF-FGF2. Хотя ближе к эпицентру травмы, на расстоянии 3 мм в ростральном направлении этот показатель несколько больше в опыте с введением AdV-GDNF, чем в опыте с плазмидой pBud-VEGF-FGF2. В то же время, прямое введение аденовируса с геном GDNF привело к существенно более выраженному уменьшению суммарной площади патологических полостей, чем введение ККП, трансдуцированных этим же вирусом. Так, на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении этот показатель меньше, чем в эксперименте с клеточно-опосредованной терапией (ККП+AdV-GDNF) в среднем 1,5 раза. Количество миелиновых волокон. На сроке 30 суток после контузионной травмы и введения в зону повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF (опыт) количество миелиновых волокон больше, чем при введении рекомбинантного аденовируса AdV-EGFP (контроль) в следующих соотношениях: - на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева в ростральном направлении на 42% и 38%, в каудальном направлении – на 28% и 30%, в боковых канатиках в среднем в 2 раза как в ростральном, так и в каудальном направлениях; - на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева в ростральном фрагменте на 35%, каудальном – на 30%; в ростральном фрагменте боковых канатиков на 48%, в каудальном на 46%. * ** 1000 * 800 ** ** Рисунок 14. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в ростральном фрагменте на 30-е сутки эксперимента в латеральной части бокового канатика справа (зона 3). По оси абсцисс – экспериментальные группы * 600 400 200 +p КК Bu П dVE G FFG pB F2 ud -V EG FFG КК F2 П +A dv -G D N F Ad vG D N F П КК КО В 0 31 В целом, количество миелинизованных волокон при терапии с помощью рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF несколько выше, чем при прямом введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2 (Рис.14), но в обоих случаях поддерживающее влияние генной терапии на миелинизацию следует признать довольно умеренным по сравнению с клеточно-опосредованной терапией. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сравнение эффективности клеточной, генной и генно-клеточной терапии по критерию сохранности миелиновых волокон при травме спинного мозга крысы (Рис.14) позволяет заключить, что - нативные ККП при их трансплантации в зону повреждения в большей степени способствуют сохранности миелиновых волокон, чем КОВ. На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы количество миелиновых волокон в опыте с ККП больше в среднем в 1,5 раза, а на расстоянии 5 мм – в 2 раза, чем в опыте с КОВ; - прямая генная терапия относительно менее эффективна, чем клеточная; - генно-модифицированные ККП производят более выраженный эффект, чем нативные; - количественный результат комбинированной генно-клеточной терапии по данному критерию в пределах точности эксперимента проявляется как простая сумма показателей, соответствующих применению только клеточной или только прямой генной терапии. Подобная аддитивность не позволяет говорить о взаимном усилении действия клеток и генов при их объединении в общую генно-клеточную конструкцию и свидетельствует о том, что поддержка ремиелинизации обусловлена одновременной и независимой экспрессией во внешнюю среду нейротрофических факторов собственным генным аппаратом трансплантируемх клеток и внедренной в них плазмидной или вирусной конструкцией. В то же время, по площади сохранного вещества аддитивности не наблюдается (Рис.13). Прямая генная терапия посредством голой плазмиды или рекомбинантного аденовируса более эффективна, чем просто клеточная, а включение плазмиды или аденовируса в состав клеточного носителя не дает выигрыша или даже ухудшает результат. Аналогичная ситуация имеет место и в отношении суммарной площади мелких патологических полостей в белом веществе. По-видимому, здесь важен не столько уровень нейротрофических и ангиогенных факторов в межклеточной среде, сколько выработка этих факторов в самих клетках-мишенях, чему способствует встраивание в них плазмидной ДНК. Возможно, наличие промежуточного носителя в генно-клеточных конструкциях препятствует такому встраиванию. Другая причина может состоять в существенно большем количестве плазмидных молекул, вводимых при прямой генной терапии, чем при клеточно-опосредованной. Тем не менее, по совокупности результатов комбинированная генно-клеточная терапия имеет преимущество перед чисто клеточной или прямой генной терапией. Если сравнивать между собой различные генно-клеточные конструкции из числа исследованных нами, то трансдукция ККП аденовирусным вектором gdnf выглядит оптимальной. По нашим данным, клеточно-опосредованная доставка терапевтического гена gdnf при помощи аденовирусного вектора в область травмы спинного мозга позволяет наиболее эффективно стимулировать его посттравматическую регенерацию, что проявляется в виде улучшения показателей восстановления двигательной функции, степени кавитации, сохранности ткани и миелиновых волокон, увеличения количества реактивных астроцитов, а также олигодендроцитов, существенно необходимых для протекания процесса нейрорегенерации. Таким образом, результаты настоящего исследования показывают, что при травме спинного мозга терапевтический эффект немедленной трансплантации стволовых клеток, генетически модифицированных при помощи плазмидных и вирусных векторов c 32 клонированными генами ангиогенных и нейротрофических факторов, более выражен, чем при трансплантации тех же нативных клеток. В то же время клеточно-опосредованная и прямая инъекция генов проявляют специфические различия своего действия. Сравнительная оценка эффективности применения плазмиды pBud-VEGF-FGF2 при доставке с помощью ККП и при прямой инъекции плазмидной ДНК в область КТСМ по критериям площадь патологических полостей и количество миелиновых волокон, выявила большую степень нейрорегенерации в условиях проведения генно-клеточной терапии. Доставка генов vegf и fgf2 при помощи ККП человека в большей степени поддерживает миграционный потенциал и стимулирует дифференцировку заселяющих область повреждения эндогенных шванновских клеток. Более высокие показатели по таким критериям, как сохранность ткани, степень неоваскуляризации и восстановление двигательной активности в экспериментах с непосредственным введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 дают основание полагать, что исследования в этом направлении также имеют определенную перспективу. Регенераторный потенциал плазмидной ДНК может быть дополнительно усилен введением в ее состав участков, способных специфично связываться с мембранными рецепторами, для увеличения эффективности проникновения плазмиды в клетки спинного мозга. ВЫВОДЫ 1. Меченые CFDA-SE клетки обонятельной выстилки человека и трансфицированные плазмидой pEGFP клетки крови пуповины человека при трансплантации в область контузионной травмы спинного мозга крысы выявляются в данной области соответственно до 7 и 21 суток и способны мигрировать из точки введения на расстояние соответственно до 20 и 10 мм. 2. Однократная трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы клеток обонятельной выстилки человека (КОВ), клеток крови пуповины человека (ККП), клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGFFGF2 (ККП+pBud-VEGF-FGF2), клеток крови пуповины человека, трансдуцированных аденовирусом с геном GDNF (ККП+AdV-GDNF), улучшает восстановление функции. По критерию оценки произвольных движений в открытом поле (тест «ВВВ») показатель восстановления функции нарастает в следующем ряду: ККП → КОВ → ККП+pBudVEGF-FGF2 → ККП+AdV-GDNF. 3. На модели гемисекции спинного мозга крысы при однократной трансплантации в область повреждения клеток обонятельной выстилки человека (КОВ), клеток крови пуповины человека (ККП), трансфицированных плазмидами pBud-VEGF-FGF2 (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и pEGFP (ККП+pEGFP) эффективность нейрорегенерации по критерию восстановления функции возрастает в следующем ряду: ККП+pEGFP → КОВ → ККП+pBud-VEGF-FGF2. 4. Трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы клеток обонятельной выстилки человека (КОВ), клеток крови пуповины человека (ККП), клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидами pBud-VEGF-FGF2 (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и pEGFP (ККП+pEGFP): а) способствует сохранности ткани, б) сдерживает образование патологических полостей, в) стимулирует регенерацию миелиновых волокон. Выраженность положительных сдвигов по критериям сохранности ткани и площади патологических полостей увеличивается в ряду: ККП+pEGFP → ККП → КОВ → ККП+pBud-VEGF-FGF2, 33 по количеству миелиновых волокон – в ряду: ККП+pEGFP → КОВ → ККП → ККП+pBudVEGF-FGF2. 5. Инъекция плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в область травмы спинного мозга крысы приводит к лучшей сохранности тканей, чем при клеточно-опосредованном введении. По количеству миелиновых волокон более эффективна клеточно-опосредованная доставка той же комбинации терапевтических генов. Оба способа в равной степени способствуют усилению васкуляризации белого вещества и увеличению популяции шванновских клеток-мигрантов. 6. По оценке движений в открытом поле (тест «ВВВ»), однократная инъекция аденовируса с геном GDNF (AdV-GDNF) в область контузионной травмы спинного мозга крысы улучшает восстановление функции с большей эффективностью, чем инъекция плазмиды pBud-VEGF-FGF2. 7. Однократная трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы клеток крови пуповины человека, трансдуцированных вирусом AdV-GDNF, улучшает сохранность ткани, уменьшает образование патологических полостей и сдерживает дегенерацию миелиновых волокон, способствует увеличению количества реактивных астроцитов и предшественников олигодендроцитов в белом веществе. 8. Доставка генов vegf и fgf2 в область травмы спинного мозга крысы посредством инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2 или трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой, приводит к увеличению количества мигрирующих шванновских клеток в области повреждения, стимулирует прорастание и ремиелинизацию нервных волокон, усиливает процесс васкуляризации. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шаймарданова, Г.Ф. Клеточные технологии стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга / Г.Ф. Шаймарданова, Ю.А. Челышев, Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, А.А. Ризванов, Я.О. Рубашкина // VI съезд анатомов гистологов и эмбриологов России Саратов 23-25 сентября Ж. Морфология. – 2009. – Т. 136. – № 4. – С.150–151. 2. Лебедев, С.В. Исследование эффективности трансплантации нейральных стволовых клеток с травмой спинного мозга: применение функциональных нагрузочных тестов и метода ВВВ / С.В.Лебедев, А.В.Карасѐв, В.П.Чехонин, Е.А.Савченко, И.В.Викторов, Ю.А.Челышев, Г.Ф.Шаймарданова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 149. – № 3. – С. 355–360. 3. Шаймарданова, Г.Ф. Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы в условиях эктопической экспрессии генов VEGF и FGF2 в области повреждения / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Рубашкина, И.И Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // IV Всероссийский симпозиум Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии. – Санкт-Петербург 21-22 апреля. – 2010. – С.136–137. 4. Шаймарданова, Г.Ф. Рубашкина Я.О., Газизов И.М., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Челышев Ю.А. Выживание и миграционный потенциал мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных генами EGFP, VEGF И FGF2, при трансплантации в область травмы спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Рубашкина, И.М. Газизов, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. – Москва. – 11-12 ноября. – 2010. – С. 292–294. 5. Челышев, Ю.А. Глиальные NG2-клетки в нейроонтогенезе и регенерации / 34 Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова // Неврологический вестник. – 2010. – Т. ХLII. – Вып. 4. – С. 84–90. 6. Шаймарданова, Г.Ф. Трансплантация клеток обонятельной выстилки и клеток крови пуповины человека в область контузионной травмы спинного мозга крысы (по данным морфометрии) / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев, В.П. Чехонин, С.В. Лебедев, А.В. Карасѐв, Е.А. Савченко, И.В. Викторов // Бабухинские чтения в Орле. 8-я Всероссийская научная конференция. – Москва ЗАО “Ретиноиды”. – 1-2 июня. – 2011. – С. 103–105. 7. Шаймарданова, Г.Ф. Терапевтический эффект трансплантации VEGF И FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга крысы при помощи клеток крови пуповины и путем прямой инъекции / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Челышев Ю.А. // V Российский симпозиум “Белки и пептиды”. – Петрозаводск. – 8-12 августа. – 2011. – С. 146–147. 8. Шаймарданова, Г.Ф. Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы при введении вобласть повреждения плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Всероссийска научная конференция “Регенеративная биология и медицина”. – Москва. – 14-15 октября. – 2011. – С. 166–167. 9. Шаймарданова, Г.Ф. Экспрессия молекулярных детерминант шванновских клеток и периферического миелина в спинном мозге крысы при контузионной травме / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. – 2011. – № 2. – С. 73–77. 10. Шаймарданова, Г.Ф. Посттравматические изменения структуры спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных генами vegf и fgf2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Морфология. – 2011. – № 6. – С. 36–42. 11. Шаймарданова, Г.Ф. Трансплантация клеток крови пуповины человека в область контузионной травмы спинного мозга крысы / Шаймарданова Г.Ф., Мухамедшина Я.О., Мухитов А.Р., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Челышев Ю.А. // V Всероссийский симпозиум с международным участием “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии”. – Уфа. – 17-18 мая. – 2012. – С. 209–210. 12. Челышев, Ю.А. Эффект различных способов доставки терапевтических генов vegf и fgf2 в область травматического повреждения спинного мозга / Ю.А. Челышев, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, Г.Ф. Шаймарданова, А.А. Ризванов // XI Конгресс Международной ассоциации морфологов. – Самара. – 29 мая - 1 июня. – Морфология. – 2012. – Т. 141. – № 3. – С.169. 13. Шаймарданова, Г.Ф. Генно-клеточная терапия травмы спинного мозга крысы: анализ параметров структуры и двигательной функции / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. III международная научно-практическая конференция. – Казань. – 22-24 ноября. – 2012. – C. 230–231. 14. Челышев, Ю.А. Прямая доставка терапевтических генов для стимулирования посттравматической нейрорегуляции / Ю.А. Челышев, Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, С.И. Николаев // Неврологический вестник. – 2012. – Т XLIV. – Вып. 1. – С. 76–83. 15. Шаймарданова, Г.Ф. Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации клеток обонятельной выстилки человека / Г.Ф. Шаймарданова, Ю.А. Челышев, С.В. Лебедев, Е.А. Савченко, И.В. Викторов, А.В. Карасев, В.П. Чехонин // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т. 7. – № 2. – С. 92–96. 35 16. Шаймарданова, Г.Ф. Эффект трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих рекомбинантные гены VEGF и FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Морфология. – 2012. – Т. 142. – № 4. – С. 31–36. 17. Shaimardanova, G.F. Post-Traumatic Changes in the Spinal Cord in Rats after Transplantation of Mononuclear Cells from Human Umbilical Blood Modified with the vegf and fgf2 Genes / G.F. Shaimardanova, Ya.O. Mukhamedshina, S.S. Arkhipova, I.I. Salafutdinov, A.A. Rizvanov, and Yu.A. Chelyshev // Neuroscience and Behavioral Physiology. – 2012. – V. 42. – № 9. P. 1012–1018. 18. Шаймарданова, Г.Ф. Миелинизированные волокна поврежденного спинного мозга крысы при генно-клеточной терапии с vegf и fgf2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, Ю.А. Челышев // ХХIV Российская конференция по электронной микроскопии. – Черноголовка 29 мая - 1 июня. – 2012. – С. 505–506. 19. Мухамедшина, Я.О. Выживание и дифференцировка эндогенных шванновских клеток при генно-клеточной терапии травмы спинного мозга крысы / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. III международная научно-практическая конференция. – Казань. – 22-14 ноября. – 2012. – C. 213–214. 20. Шаймарданова, Г.Ф. Морфологические изменения спинного мозга крысы при введении в зону травмы рекомбинантных генов vegf и fgf2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Морфология в теории и практике // Всероссийская конфренция с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения Д.С.Гордон. – Чебоксары. – 14 ноября. – 2012. – С. 286. 21. Мухамедшина, Я.О. Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофических факторов / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, В.Н. Зарубина, Ю.А. Челышев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т. VII, №3. – С.125–129. 22. Шаймарданова Г.Ф., Мухамедшина Я.О., Ризванов А.А. Салафутдинов И.И., Челышев Ю.А. Применение плазмидного вектора с генами vegf и fgf2 при травматическом повреждении спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 1012. – №4. – С. 200–204. 23. Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, Ю.А Челышев. Шванновские клетки в области травмы спинного мозга крысы при локальной доставке генов vegf и fgf2 / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, Ю.А Челышев // Астраханский медицинский журнал. – 2012. – Т. 7. – № 4. – С. 194– 197. 24. Челышев, Ю.А. Глиальные барьеры при травме спинного мозга как мишень генно-клеточной терапии / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, М.В. Нигметзянова // Неврологический вестник. – 2013. – Т. XLV. – Вып. 1. – С. 87–93. 25. Шаймарданова, Г.Ф. Корреляционный анализ параметров структуры в условиях генно-клеточной терапии при травме спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Ю.А. Челышев // Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. – 1213. – Т. 155. – Книга 1. – С. 19–26. 26. Шаймарданова, Г.Ф. Состояние и количество миелиновых волокон в области травмы спинного мозга крысы при генно-клеточной терапии / Г.Ф. 36 Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. – 2013. – № 1. – С. 74–80. 27. Шаймарданова, Г.Ф. Оценка эффективности путей локальной доставки терапевтических генов при травме спинного мозга крысы: корреляции параметров структуры и функции / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, Ю.А. Челышев // Современные технологии медицины. – 2013. – Т. 5. – № 3. – С. 16–22. 28. Мухамедшина, Я.О. Доставка рекомбинантного аденовируса с клонированным геном GDNF в область травмы спинного мозга при помощи клеток крови пуповины человека стимулирует восстановление двигательной функции и поддерживает популяцию глиальных клеток / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, И.И. Салафутдинов, А.А. Ризванов, Т.В. Повышева, Г.А. Масгутова, М.В. Нигметзянова, Ю.А. Челышев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия – 2013. – Т. VIII. – № 3. – С. 129–132. Список сокращений КТСМ – контузионная травма спинного мозга КОВ – клетки обонятельной выстилки ККП – клетки крови пуповины VEGF (vascular endothelial growth factor) – фактор роста эндотелия сосудов FGF2 (fibroblast growth factor) – фактор роста фибробластов основный GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor) – глиальный нейротрофический фактор EGFP (enhancen green fluorescent protein) – улучшенный зеленый флюоресцентный белок AdV – рекомбинантный аденовирус PDGFβR – бета рецептор тромбоцитарного фактора роста Krox20 – транскрипционный фактор Р0 – белок периферического миелина TEM (Transmission Electron Microscopy) – просвечивающая электронная микроскопия CFDA-SE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) – сукцинимидный эфир диацетата карбоксифлюоресцеина DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) – Фосфатный буфер Дульбекко Благодарности Клетки обонятельной выстилки человека были любезно предоставлены профессором Викторовым И.В. из ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского», г. Москва; клетки крови пуповины – профессором Киясовым А.П., Банк стволовых клеток г. Казань. Генетические конструкции любезно предоставлены д.б.н. Ризвановым А.А. (институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета). Генетическая модификация клеток крови пуповины осуществлялась на кафедре генетики ИФМиБ КФУ под руководством д.б.н. Ризванова А.А. Автор благодарит всех соавторов, принимавших участие в данном исследовании. Выражаю глубокую признательность моему научному консультанту профессору Челышеву Ю.А. за неоценимую помощь в работе. 37
