ФЛАВОНОИДЫ ЦВЕТКОВ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2007. №1. С. 65–68.
УДК 615.32:547.9+543.544
ФЛАВОНОИДЫ ЦВЕТКОВ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ
©
О.В. Шарова, В.А. Куркин*
Самарский государственный медицинский университет Росздрава,
ул. Чапаевская, 89;Самара 443099 (Россия) Е-mail: [email protected]
Календула лекарственная (ноготки) – Calendula officinalis L. – (сем. Астровых или Сложноцветных – Asteraceae). Род
Calendula включает в себя около 20 видов трав и полукустарников, произрастающих в диком виде, главным образом в
странах Средиземноморья. Календула лекарственная – это декоративное и лекарственное растение. В Самарской области ведется промышленное культивирование данного растения (п. Антоновка, сорт Кальта). По литературным данным,
химический состав календулы лекарственной представлен каротиноидами, флавоноидами, тритерпеновыми сапонинами
и рядом сопутствующих веществ. Флавоноидный состав этого растения, в соответствии с литературными данными, оказался противоречивым, поэтому нами было проведено изучение цветков календулы отечественных производителей на
содержание флавоноидов.
Наряду с изокверцитрином из цветков календулы лекарственной впервые в Российской Федерации выделен доминирующий флавоноид (нарциссин), являющийся диагностическим для сырья данного растения.
Разработан способ определения подлинности цветков календулы лекарственной путем обнаружения доминирующего флавоноида – нарциссина с использованием ТСХ-анализа и ГСО рутина.
Введение
Календула лекарственная, или ноготки (Calendula officilalis L.) – одно из самых популярных растений в
народной и научной медицине. Препараты на основе цветков данного растения обладают широким спектром
биологической активности, включая противовоспалительное, спазмолитическое, желчегонное, противомикробное, успокаивающее, противоотечное, противотоксическое, гипосенсибилизирующее, антимитотическое,
репаративное, противовирусное, ранозаживляющее действие [1, 2]. Лечебные свойства календулы обусловлены наличием в сырье комплекса биологически активных соединений (БАС), а именно: каротиноидов,
флавоноидов, тритерпеновых сапонинов и целого ряда сопутствующих веществ [2, 3].
В настоящее время наряду с определением внешних и микроскопических диагностических признаков
значительное место в комплексной оценке подлинности и качества лекарственного растительного сырья
(ЛРС) занимает фитохимический анализ.
Согласно современным требованиям нормативной документации (НД) на ЛРС, фитохимический анализ
включает задачи качественного и количественного анализа ЛРС по содержанию ведущих групп БАС, обеспечивающих фармакологическую активность.
Так, в нормативной документации на сырье «Ноготков цветки» отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» [4], следовательно, для целей идентификации сырья не используются химические диагностические признаки. В этом отношении особый интерес представляет тонкослойная
хроматография, которая в последнее время широко используется в методиках качественного анализа.
Учитывая высокое содержание флавоноидов в цветках календулы лекарственной, их несомненную значимость в проявлении биологической активности данного сырья, представляется целесообразным изучение
компонентного состава календулы для обоснования возможности стандартизации данного лекарственного
растительного сырья по содержанию флавоноидов.
Флавоноидный состав этого растения, в соответствии с литературными данными, оказался противоречивым [1, 3]. Так, по одному из литературных источников [5], доминирующим компонентом является рутин, а
по данным другой работы – диглюкозид изорамнетина [6].
*
Автор, с которым следует вести переписку.
66
О.В. ШАРОВА, В.А. КУРКИН
Цель настоящей работы – проведение исследования химического состава календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, а также разработка унифицированных методик стандартизации сырья.
С целью обоснования методик качественного анализа сырья «Ноготков цветки» нами проведена препаративная хроматографическая работа по выделению и очистки соединений флавоноидной природы.
Экспериментальная часть
Методика выделения флавоноидов. Измельченные воздушно-сухие цветки календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области (п. Антоновка, сорт Кальта) (100,0 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70% этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей термической экстракцией при температуре 85–90 °С. Водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка
(около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле (СГ) L 40/100, элюировали хлороформом и
наносили на слой СГ, сформированный в хлороформе. Колонку элюировали флороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 88 : 12; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30).
Фракции, содержащие доминирующий флавоноид, были объединены и нанесены на полиамид с целью
дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку
(10,0 г) (высота сорбента – 4,0 см, диаметр – 5 см). Колонку элюировали водой и водным раствором спирта
этилового (20; 40; 70; 96%). Контроль за разделением осуществлялся с помощью ТСХ-анализа. Основное
назначение данного этапа работы – отделение основной части гидрофильных соединений (флавоноиды). В
результате проведенной очистки на колонке с полиамидом было получено вещество I (доминирующий диагностический флавоноид).
Следующий блок фракций, содержащих также вещества флавоноидной природы, объединяли, упаривали
и высушивали на СГ L 40/100 (1,0 г). Сухой порошок (экстракт+силикагель) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента – 4,0 см, диаметр – 5 см). Колонку элюировали хлороформом, содержащим
этиловый спирт в различных концентрациях (5; 10; 15; 20; 25; 30; 35%). В результате было получено вещество II флавоноидного характера, имеющего желтую окраску с величиной Rf≈0,6.
Сравнение исследуемого доминирующего флавоноида с ГСО рутина (Rf≈0,4; система: хлороформ–
метиловый спирт–вода – 26 : 14 : 3) по хроматографической подвижности показало, что выделенное соединение имеет другое значение Rf≈0,5 и, значит, этот компонент является другим флавоноидным соединением.
Для изучения строения выделенных флавоноидов (I, II) были использованы химические и спектральные
методы.
22
+12,0º (0,83, вода), λmax в
Соединение I, желтые кристаллы из этанола, С28Н32О16, т. пл. 173–175 ºС, [α ]546
этаноле: 257, 268пл., 357 нм. 1Н-ЯМР-спектр в смеси дейтероацетона и D2O (200 МГц) (Gemmini 200) δ: 7,97
(д, 2 Гц, Н1-2), 7,66 (дд, 2 и 8,5 Гц, Н1-6), 6,96 (д, 2 Гц, Н1-5), 6,50 (д, 2 Гц, Н1-8), 6,24 (д, 2 Гц, Н-6), 5,23 (д, 7
Гц, Н11-1 глюкопиранозы), 4,50 (д, 2 Гц, Н111-1 рамнопиранозы), 3,95 (с, 3Н, СН3О), 3,2-3,8 (10 Н сахаров),
1,04 (д, 6 Гц, СН3 рамнозы) (рис. 1)..
Спектр ЯМР 1Н нонаацетата (I) (СDСl3) δ: 8,08 (Н-5′), 7,88 (Н-2′), 7,60 (Н-6′), 7,30 (Н-8), 6,80 (Н-6), 3,97
(СН3О), 3,1-5,4 (м, 12Н сахаров), 2,45 (3Н), 2,34 (3Н), 2,32 (3Н) – синглеты трех Ас-аром., 1,93-2,17 9 синглеты 6 Ас-алифат.), 1,09 (СН3 рамнозы).
Соединение II, желтые кристаллы из этанола, С21Н20О12, т. пл. 227–229 ºС, λmax (лямбда) в этаноле: 257,
267пл., 360 нм; +NaOMe 272, 327, 410 нм; +NaOAc 272, 379 нм; +NaOAc+H3BO3 262, 377 нм; +AlCl3 275, 412
нм; + AlCl3+HCl 270, 403 нм.
Соединение I при кислотном гидролизе (2% HCl, 100 °С, 1 ч) расщепляется на агликон, идентифицированный с изорамнетином (С16Н12О7, М+ 316, λmax (лямбда) в этаноле 257, 268 пл., 367 нм), и углеводные
фрагменты – глюкозу и рамнозу. Соединение I гидролизуется ферментом рамнодиастазой, что позволяет
сделать вывод о наличии в данном гликозиде биозы рутинозы. УФ-спектры с диагностическими реагентами
свидетельствуют о гликозилировании 3-ОН-группы изорамнетина.
Следовательно, соединение I является 3-О-рутинозидом изорамнетина (нарциссин).
Соединение II при кислотном гидролизе дает агликон, идентифицированный как кверцетин (С15Н10О7,
+
М 302, λmax (лямбда) в этаноле 256, 267пл., 370 нм), и глюкозу. Кроме того, данный гликозид расщепляется
под воздействием β-гюкозидазы, что свидетельствует о β-связи с агликоном. Батохромный сдвиг длинноволновой полосы в УФ-спектре агликона в присутствии AlCl3 (+60 нм) в отличие от исходного соединения
(+42 нм) позволяет сделать вывод о том, что гликозилирована 3-ОН-группа. Следовательно, совокупность
ФЛАВОНОИДЫ ЦВЕТКОВ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ
67
спектральных данных и результатов химических превращений, а также непосредственное сравнение с достоверно известным образцом позволяет идентифицировать соединение как 3-О-β-D-глюкопиранозид кверцетина (изокверцитрин)
OCH3
OH
OH
HO
O
OH
HO
O
OGlc Rham
OH
O
Соединение I
OGlc
OH
O
Соединение II
Для качественной оценки сырья и цветков календулы предложен ТСХ-анализ, в котором предусматривается определение доминирующего компонента – нарциссина, имеющего диагностическое значение на основе ряда изученных флавоноидов цветков календулы лекарственной. В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих эффективно
разделить и однозначно идентифицировать основные компоненты объекта.
В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами (хлороформ–этанол,
хлороформ–метанол, хлороформ–метанол–вода в различных соотношениях) предпочтение было отдано системе растворителей хлороформ–метанол–вода (26 : 14 :3), обеспечивающей наиболее четкое разделение
флавоноидов, в том числе 3-О-рутинозида изорамнетина (нарциссин) и изокверцитрина. При просмотре
хроматограммы в УФ-спектре при длине 254 и 366 нм нарциссин обнаруживается в виде доминирующего
пятна желто-оранжевого цвета с Rf около 0,5 (рис. 1).
Для обнаружения вещества хроматограмму просматривали в видимом свете, УФ-спектре и после проявления с раствором диазобензолсульфокислоты. При обработке реактивом хроматографические пластинки
нагревались при температуре 110 С° в течение 5 мин в сушильном шкафу. При этом 3-О-рутинозид изорамнетина проявляется в виде хорошо заметного пятна желто-оранжевого цвета. Следовательно, описанная в
литературе методика [5], в соответствии с которой доминирующий флавоноид цветков календулы лекарственной трактуется как рутин, требует критического пересмотра.
Рис. 1. ТСХ-анализ цветков календулы лекарственной.
«Силуфол УФ -254», система растворителей: хлороформ –
метиловый спирт – вода (26 : 14 : 3); проявитель:
диазобензолсульфокислота.
Обозначения: 1. Государственный стандартный образец
рутина. 2. Рабочий стандартный образец нарциссина.
3. Рабочий стандартный образец β-каротина. 4. Извлечение
на 40% этиловом спирте из цветков календулы
лекарственной. 5. Извлечение на 70% этиловом спирте из
цветков календулы лекарственной. I. 3-О-рутинозид
изорамнетина (Rf≈0,5). II. Изокверцитрин (Rf≈0,6).
III. β-каротин (Rf≈0,9)
68
О.В. ШАРОВА, В.А. КУРКИН
На наш взгляд, в данной методике целесообразно использовать ГСО рутина, по физико-химическим
свойствам близкий к нарциссину, так как расчет величины Rs позволит повысить объективность методики
для анализируемого вещества. Кроме того, в данной методике возможно определение β-(бета)-каротина с
использованием рабочего стандартного образца облепихового масла (рис. 2).
Рис. 2. ЯМР-спектр 3-О-рутинозида изорамнетина в дейтероацетоне (+D2O)
Выводы
1. Из цветков календулы отечественного производства (сорт Кальта) выделен впервые в Российской Федерации доминирующий и диагностический флавоноид, идентифицированный как нарциссин (3-Орутинозид изорамнетина). В ходе исследования установлен также изокверцитрин.
2. С использованием ТСХ-анализа разработана методика качественного анализа цветков календулы лекарственной, заключающаяся в обнаружении в сырье данного растения доминирующего флавоноида – нарциссина по величине Rs относительно ГСО рутина.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Исмагилов Р.Р., Костылев Д.А. Календула. Уфа, 2000. 102 с.
Ладыгина, Е.Я. Календула лекарственная // Фармация. 1992. Т.40. №4. С. 84–86.
Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2004. 1180 с.
Государственная фармакопея СССР. 11-е издание. Вып. 1 и 2. М., 1991. Т. 2.
Слуева, Е.К., Жукович Е.Н., Шарикова Л.А., Прибыткова Т.Ф., Деревщикова Е.Б. Оценка содержания суммы
флавоноидов в настойке календулы // Фармация. 2003. Т. 51. №1. C. 13–15.
Абдуллабекова В.Н., Тулаганов А.А. Разработка метода количественного анализа цветков календулы лекарственной // Химико-фармацевтический журнал. 2001. Т. 35. №10. С. 25–26.
Поступило в редакцию 12 февраля 2007 г.