Лаборатория флуоресцентного биоимиджинга

Лаборатория флуоресцентного
биоимиджинга
«Флуоресцентные белки: новые
подходы к изучению механизмов
физиологических и патологических
процессов в живых системах»
Проект направлен на разработку и
использование принципиально новых подходов
к исследованию молекулярных механизмов
биологических процессов и прицельному
воздействию на живые системы с
использованием флуоресцентных маркеров
последнего поколения.
Лаборатория флуоресцентного биоимиджинга
Создана в декабре 2010 году
Лабораторные помещения:
общей площадью 131, 9 м2 и
площадью коридора 30,7 м2 в
подвале морфологического корпуса
Зал семинаров: кабинет №110 на
первом этаже морфологического
корпуса
Виварий для лабораторных
животных:, общей площадью 147
м2 и площадью коридора 17 м2 в
учебном корпусе номер 3
Выполнен ремонт всех
помещения, с организацией
чистых помещений со
специальной очисткой воздуха
для SPF вивария.
Структура лаборатории
Культуральный блок: Предназначен для наработки, поддержания,
траснфекции эукариотических клеток. Будет организована стерильная
зона.
Генно-инженерный блок: Предназначен для работы с молекулами
нуклеиновых кислот и создания генетических конструкций, кодирующих
флюоресцентные белки с различной локализацией в клетке.
Блок флюоресцентного имиджинга: Предназначен для проведения
экспериментов по флуоресцентному наблюдению опухолей, меченых
флуоресцентными белками.
Виварий по стандартам SPF: Система особо-чистых помещений,
включающих моечную с системой автоклавирования, предбокс, коридорраспределитель и три изолированных чистых помещения под содержание
трансгенных животных. Организована особая системы поддержания
температуры, влажности и чистоты воздуха. Ведется оборудование
специальных клеточных боксов.
Лаборатория
флуоресцентного
имиджинга
Лаборатория
флуоресцентного
имиджинга
Оборудование лаборатории
Генно-инженерный блок:
• Камера для вертикального электрофореза VE-10 (Helicon)
• Камера для горизонтального электрофореза (Helicon)
• Система полусухого переноса Semi Dry (Helicon)
• Источники питания Эльф-4 (ДНК-Технология)
• Система гельдокументирования MiniLumi (Bioimaging systems)
• Трансиллюминатор TFX-20 МС (Vilber Lourmat)
• Оборудование для работы с бактериальными культурами клеток
• ДНК-Амплификатор GeneAmp 2720 (Applied Biosystems)
• Микроцентрифуги MiniSpin (Eppendorf),
• Центрифуги-вортекс Микроспин FV-2400 (Biosan),
• Термостаты твердотельные ТЕРМО 24-15 (Биоком),
• Магнитная мешалка с подогревом MSY-300 (Biosan)
• Водяная баня TW-2 (ELMI)
• Холодильник двухкамерный NBA20 (Indezit)
• Сосуд Дьюара СДС-35М
Оборудование лаборатории
Клеточный блок:
• Ламинарно-потоковый шкаф (Biowizard - 3 шт.)
• CO2-инкубатор
• Микроскоп биологический (лабораторный) Leica DMIL
• Холодильники
Комплекс оборудования для имиджинга флуоресцирующих объектов
in vivo и in vitro (блок флуоресцентного биоимиджинга):
• Диффузионный флуоресцентный томограф (ДФТ)
• Моторизированный инвентированный микроскоп Nikon Eclipse
THE (Nikon Corporation, Япония) с модулем сверхвысокого
разрешения N-STORM (Nikon Corporation, Япония)
• Система имиджер IVIS Спектрум фирмы Калипер (США)
• Спектрофлуориметр RF-5301PC (Шимадзу, Германия) c диапазоном
измерения 220-900 нм
• 2 Твердотельных лазерных модуля с диодной накачкой MBL-III473nm-200mW-11077431 (CNI, Китай). Длина волны 473 нм.
Оборудование лаборатории
Виварий:
• Стереомикроскоп для работы с ортотопическими опухолями Лейка М60
• Наркозный аппарат,
• Столик-гомогенизатор
• 2 Стеллажа для вивария Mustinox (Charles River)
• 76 боксов 2L и 2B (Charles River)
Вспомогательное оборудование:
• Мультимедийная техника
• Лабораторная мебель
Флуоресцентные белки – генетически
кодируемые флуоресцентные пробы
•
•
•
•
•
•
Автокаталитическое формирование хромофора (нужен только O2)
Низкая токсичность
Высокая стабильность
Возможность экспрессии в различных организмах, тканях, клетках
Возможность направлять в различные клеточные компартменты
Широкий спектр цветов для многоцветного мечения и набор инструментов
для мониторинга различных биологических процессов
Основные направления исследований
•
Тестирование дальнекрасных флуоресцентных белков для
прижизненного наблюдения за клетками на целых организмах
•
Исследование сигнальной функции пероксида водорода
с помощью генетически кодируемых флуоресцентных
индикаторов
•
Исследование возможностей генетически кодируемого
фотосенсибилизатора KillerRed для направленного
уничтожения раковых клеток на животных моделях
Тестирование дальнекрасных
флуоресцентных белков для
имиджинга в целом организме
Дальне-красные флуоресцентные белки –
удобный инструмент для мечения
объектов в системах in vivo
ПЕРСПЕКТИВА: использование флуоресцентных
белков для скрининга лекарственных препаратов
Cell transfection with
fluorescent protein
genes linked to
genes of interest
Transfer of visible
targets to mice
Stably transfected tumor cells
Discovery and evaluation
of candidate drugs
Target visualization
Drug treatment
control
control
drug1
drug2
treated
Исследование сигнальной функции
пероксида водорода
с помощью генетически кодируемых
флуоресцентных индикаторов
Н2О2 как сигнальная молекула
Ростовой
фактор
активация
активация
NADPH
оксидаза
ТКР
Плазматическая
мембрана
Цитоплазма
Р
Р
SH
PTP
SOH
PTP
Сигнальный каскад
Н2О2
Исследование продукции Н2О2 с помощью
индикатора HyPer
Строение HyPer
• флуоресцентный белок cpYFP
• регуляторный домен белка OxyR E. coli
Belousov et al, Nat Meth 2006
HyPer, слитый с рецептором фактора роста
EGFR-HyPer
клетки HeLa
локализация на цитоплазматической стороне
плазматической мембраны и эндосом
Рецептор
эпидермального
ростового фактора
(EGFR)
HyPer
C-конец
Клетки HeLa, экспрессирующие pEGFRHyPer
[H2O2]
[H2O2]
+ EGF
HyPer, слитый с рецептором фактора роста
PDGFR-HyPer
локализация на цитоплазматической стороне
плазматической мембраны и эндосом
Рецептор
тромбоцитарного
ростового фактора
(PDGFR)
HyPer
клетка NIH-3T3
C-конец
Клетка HeLa, экспрессирующая pPDGFR-Hyper
[H2O2]
+ PDGF
Активация продукции Н2О2
происходит преимущественно
на плазматической мембране в
ответ на стимуляцию
[H2O2]
Какие внутриклеточные компартменты отвечают за продукцию
Н2О2 при активации тирозинкиназных рецепторов?
HeLa – эндосомы, мембрана ЭПР
NIH 3T3 – плазматическая мембрана, мембрана ЭПР
Существует ли ограничение диффузии Н2О2 в клетке?
Свободная диффузия Н2О2 в клетке ограничена
Гипотеза компартментализации
SOH
Prx2
Prx2
PTP
H2O2
SO2H
Prx2
Prx2
Prx2
Prx2
Заключение
• Предложен новый подход к исследованию распределения и
динамики изменения концентрации пероксида водорода в
различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки
c помощью иммобилизованных вариантов белка-индикатора
HyPer.
• Показано, что свободная диффузия Н2О2 в клетке ограничена
ПЛАНЫ 2012
• Исследование внутриклеточной генерации Н2О2 in vivo на целых
животных
• Исследование механизма действия препаратов-радиомиметиков
с использованием иммобилизованных вариантов белкаиндикатора HyPer.
Исследование генетически-кодируемого
фотосенсибилизатора KillerRed
Цель исследования:
Оценить возможность лечения экспериментальных
опухолей с белком Killer-Red
Фотосенсебилизаторы
Фотосенсебилизаторы - красители, способные к светозависимой
генерации активных форм кислорода (reactive oxygen species,
ROS)
Фотосенсебилизаторы используются для:
– Инактивации специфических белков (Chromophore-assisted
light inactivation - CALI)
– Фотодинамической терапии – уничтожения опухолевых
клеток
Низкомолекулярные красители-фотосенсебилизаторы должны
добавляться экзогенно
GFP – неэффективный фотосенсебилизатор
Поиск фототоксичных флуоресцентных
белков
Bulina et al. Nat. Biotech. 2006
Структура KillerRed: водный туннель к
хромофору
Облучение KillerRed зеленым
светом приводит к генерации
перекиси водорода
Возможные функции водного
тоннеля:
• Обеспечение доступа O2
• Обеспечение доступа
протона
Fluorescence, a.u.
120
100
80
60
40
20
0
450
500
550
600
650
700
750
Wavelength, nm
Pletnev et al JBC 2009
Локализованный в митохондриях KillerRed,
вызывает при облучении клеточную гибель
путем апоптоза
Bulina et al. Nat. Biotech. 2006
Светозависимая супрессия клеточных
делений с помощью KillerRed с локализацией
в хроматине
Облученная клетка
Необлученная клетка
Влияние активации KillerRed-TD на митотическую активность клеток.
Наложение фотографий клеток НеLa, экспрессирующих KillerRed-TD,
полученных в проходящем свете и с помощью флуоресцентной
микроскопии. Цифрами указано время (мин) после облучения.
Нарушение формирования переднего мозга
и глаз у эмбрионов X. laevis
Трансгенные эмбрионы шпорцевой лягушки, экспрессирующие H2B–tKR под
контролем промотора гена Xanf, вовлеченного в формирование переднего мозга.
Облучение зеленым светом (525 нм, 45 мВ/см2, 1 ч) на стадии средней нейрулы
приводило к разной степени редукции переднего мозга и циклопии.
Клетки HeLa Kyoto с белком Killer-Red:
В митохондриях
В ядре
(KillerRed-Mito)
(KillerRed-H2B)
Использование KillerRed для направленного
уничтожения раковых клеток на моделях
лабораторных животных
Стабильно-трансфецированные
раковые клетки,
экспрессирующие KillerRed
Введение клеток в мышь
Облучение
Контроль
Процедура лечения
•
Время облучения: 30 min
•
Дважды в день
•
Длина волны: 595 нм
•
Плотность мощности: 85 мВт/см2
•
Продолжительность сеанса: 10
дней
•
Начало лечения с 8 дня после
прививки опухолевых клеток
Флуоресцентный имиджинг опухолей in
vivo с белком KillerRed
•
•
•
•
•
•
Цифровая камера Hamamatsu ORCA2
Источник: светодиоды
Конфигурация «на отражении»
Возбуждение флуоресценции: 585 nm
Регистрация эмиссии: 645-730 nm
Обработка изображений: ImageJ
Установка для флуоресцентного
имиджинга (ИПФ РАН, Нижний
Новогород)
HeLa Kyoto, 8 дней
KillerRed-H2B
Заключение
• Фотодинамическая терапия с белком KillerRed привела к
выраженным патологическим изменениям в опухоли
• Белок KillerRed разрушает опухоль специфически, на
субклеточном уровне
• Наибольшую эффективность демонстрирует белок KillerRed-H2B
с ядерной локализацией
• ПЛАНЫ 2012
• Выявление наиболее эффективных для работы in vivo
генетически кодируемых фотосенсебилизаторов
• Выявление наиболее чувствительных к действию
фотосенсебилизаторов клеточных компартментов
Спецкурс «Биоинженерия»
В НижГМА приказом ректора № 333 от 11.11.11 создан элективный спецкурс
«Биоинженерия» для студентов младших и старших курсов, который читает
д.б.н., член-кор. РАН В.А.Лукьянов.
Курс включает 9 лекция (3 лекции в 2011 и 6 – 2012 году) и посвящен практике
современных технологий биоинженерии.
Лекции проводятся в здании НГГУ им. Лобачевского и его, кроме студентов
НижГМА, посещают студенты и аспиранты биологического фальтета НГГУ. В среднем
на лекции присутствует 20-40 человек.
Программа лекций и материал презентаций прочитанных лекций доступен на сайте
лаборатории «Флюоресцентного биоимиджинга» НижГМА http://www.nizhgma.ru/
В 2011 году прочитаны лекции:
Лекция 1. Центральная догма молекулярной биологии,
основные понятия - ген, геном, генотип, фенотип. Основы
генной инженерии: экзонуклеазы рестрикции, вектора,
молекулярное клонирование
Лекция 2. Создание и анализ геномных библиотек.
Секвенирование ДНК по Сенгеру.
Лекция 3. Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР).
Показатели эффективности
Опубликованы 3 и принята в печать 1 статья, индексируемые Web of
Science и Scopus:
– Mishina N, Tyurin-Kuzmin P, Markvicheva K, Vorotnikov A, Tkachuk V, Laketa V,
Schultz C, Lukyanov S, Belousov V. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act
locally? Antioxid. Redox Signal. 2011. 14: 1-7.
– E.O. Serebrovskaya, T.V. Gorodnicheva, G.V. Ermakova, E.A. Solovieva, G.V.
Sharonov, E.V. Zagaynova, D.M. Chudakov, S.A. Lukyanov, A.G. Zaraisky, K.A.
Lukyanov. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic
fluorescent protein. Biochem. J, 2011. 435: 65–71.
– Q. Wang, L.J. Byrnes, B. Shui, U.F. Rohrig, A. Singh, D.M. Chudakov, S. Lukyanov,
W.R. Zipfel, M.I. Kotlikoff, H.Sondermann. Molecular Mechanism of a Green-Shifted,
pH-Dependent Red Fluorescent Protein mKate Variant. PLoS ONE. 2011. August. 6
(8): e23513. 1-12.
– KE Luker, LA Mihalko, BT Schmidt, SA Lewin, P Ray, D Shcherbo, DM Chudakov & GD
Luker In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase
complementation Nature Medicine - press online 4 Dec 2011.
Лаборатория
флуоресцентного
имиджинга