Цитохромы Р450

Цитохромы Р450 и
лекарственные средства
Москва 2013
Общая характеристика цитохромов
Р450
Цитохромы Р450 (CYP) (К.Ф. 1.14.14.1) – семейство гем-содержащих монооксигеназ,
осуществляющих метаболизм ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов.
Локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме клетки.
RH + O2 + 2НАДФН→ ROH + H2O + 2НАДФ
Ядро
Шероховатый
ЭПР
Субклеточная локализация
ферментов монооксигеназной
системы
(цитохром Р450-содержащей
системы) [Coleman 2010].
Гладкий
ЭПР
Сечение гладкого
ЭПР
Цитохром P450
Цитохром b5
P450 редуктаза
Молекулы продукта
Молекулы субстрата
2
Разнообразие химических реакций, катализируемых
цитохромом Р450
Гидроксилирование
Эпоксидирование/
гидроксилирование циклов
S-деалкилирование
Эпоксидирование алкенов (a)/
окисление алкинов (b)
N-деалкилирование
О-деалкилирование
3
Разнообразие химических реакций, катализируемых
цитохромом Р450
Изомеризация простагландина H2
Окислительное дезаминирование
NO-восстановление
Окисление спиртовой (a)
и альдегидной (b) группы
4
Организация микросомальной Р450монооксигеназной системы
Р450 reductase
CYP17A1
Структурная организация микросомальной Р450-монооксигеназной системы на
примере CYP17A1, катализирующего реакцию окисления прегненолона.
[Ulrich M. Zanger, Matthias Schwab].
5
Каталитический цикл цитохрома Р450
Каталитический цикл цитохрома Р450. Обозначения на рисунке: Fe3+ окисленное железо гема цитохрома Р450, RH – субстрат, b5 – цитохром b5
микросомальный.
6
Фармакологическая значимость
цитохромов Р450
Процентное соотношение различных изоформ цитохрома Р450,
метаболизирующих лекарственные препараты [Virginie Y. Martiny and Maria A.
Miteva, 2013].
7
Субстраты, индукторы и ингибиторы клиническизначимых изоформ цитохрома Р450
Изоформа
цитохрома
Р450
Субстрат
Индуктор
Ингибитор
CYP3A4(5)
Диклофенак, Азитромицин,
Эритромицин, Кортизон,
Гестоден, Аторвастатин,
Доксорубицин, Галоперидол,
Амлодипин…
Токоферол, Зверобой,
Дексаметазон,
Карбамазепин,
Рифампин,
Сульфинпиразон…
Кетоконазол,
Итраконазол,
Метронидазол,
Имидазол, Продукты
биотрансформации
эритромицина и
диклофенака,
Индинавир…
CYP2C9
S-варфарин, Диклофенак,
Ибупрофен, Аценокумарол,
Гексобарбитал…
____
Амиодарон, Анастрозол,
Дисульфирам,
Изониазид…
CYP2C19
R-варфарин, S-мефенитоин,
Вальпроевая к-та,
Дронабинол, Индометацин
Карбамазепин,
Преднизон…
Кетоконазол,
Пароксетин, Ритонавир,
8
Субстраты, индукторы и ингибиторы клиническизначимых изоформ цитохрома Р450
Изоформа цитохрома
Р450
Субстрат
Индуктор
Ингибитор
CYP2D6
Амфетамин,
Буфуролол,
Венфлаксин,
Дебризохин, Доксепин,
Морфин…
___________
Амиодарон, Бупиприон,
Галоперидол,
Дезипрамин,
Доксорубицин, Кокаин,
Метадон…
CYP1A2
Амитриптилин,
Ацетоминофен,
Галоперидол,
Дезипрамин, Диазепам,
Золмитриптан…
Албендазол, Бетанафтофлавон,
Интерферон, Инсулин,
Метилхолантрен,
Никотин, Омепразол,
Фенитоин…
Амиодарон, Дилтиазем,
Кларитромицин,
Мексилетин,
Метотрексат,
Эритромицин…
CYP1A1
Бензопирен
___________
___________
9
Вещества, проявляющие одновременно субстратные и
ингибиторные свойства
Субстраты CYP3A4, проявляющие одновременно свойства ингибиторов.
В результате реакции CYP3A4-зависимого N-деметилирования образуется
соответствующий продукт, дальнейшее неферментативное окисление которого
приводит к образованию нитрозо-метаболита, ингибирующего CYP3A4.
[Amin Kamel, Shawn Harriman 2013].
10
Лекарственные взаимодействия на уровне
цитохрома Р450
Амиодарон
(антиаритмическое
средство)
И
Н
Г
И
Б
И
Т
О
Р
S-варфарин
(непрямой
антикоагулянт)
Субстрат-ингибиторное
взаимодействие
Лидокаин (местный
анестетик)
CYP2C9
С
У
Б
С
Т
Р
А
Т
Амитриптилин
(трициклический
антидепрессант)
С
У Субстрат-субстратное (конкурирующие)
взаимодействие
Б
С
Т
Р
А
CYP1А2
Т
С
У
Б
С
Т
Р
А
Т
11
In silico
In electrode
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЕ
ЦИТОХРОМА Р450
0.0
I,  A
Au+P450 2B4
-0.2
Au+P450 2B4+Bz
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
E, V vs.Ag/AgCl
In vitro
in vivo
-0.1
0.0
0.1
Электрохимический метод исследования
цитохром Р450-монооксигеназной системы
Преимущества электрохимического метода:
1. электрохимическая система не требует использование природных
дорогостоящих и неустойчивых природных восстановительных
эквивалентов NADPH и NADH, т.к. используется альтернативный
источник электронов – электрод;
2. не возникает необходимости в реконструировании монооксигеназной
системы, т.е. использование всех компонентов микросомальной системы
и белков редокс-партнеров каталитического цикла цитохрома Р450;
3. высокая чувствительность метода, позволяет использовать минимальное
количество дорогостоящего фермента (до 10-12 моль белка/электрод);
4. высокая эффективность электрокатализа и контролируемость
ферментативного процесса с помощью электрического тока;
5. использование различных синтетических модификаторов поверхности
электрода позволяет предотвращать инактивацию интактных изоформ
Р450.
13
Сравнение природной и электрохимической каталитической
системы цитохрома Р450
Природный цикл
цитохрома Р450
Электрокаталитический
цикл
14
Электрохимическое оборудование
Трехконтактный печатный графитовый
электрод (ПГЭ)
1
–
рабочий
графитовый электрод
(модифицированный ДДАБ)
2 – хлорсеребряный электрод сравнения
3 – вспомогательный графитовый электрод
4 – серебряные контакты
5 - изолирующий слой на основе ПВХ
6 – подложка из ПВХ
3см
d=2мм
1см
Потенциостат/гальваностат «PGSTAT 12
Autolab» (Ecochemie, Utrecht, The Netherlands).
15
Электрохимические методы определения активности
цитохрома Р450
Fe(III)+e→Fe(II)
Циклическая вольтамперометрия
Амперометрическое титрование
1
0.0
0 мкМ 1 мкМ
0
-1
5 мкМ
Восстановительный ток CYP3A4
-2
I, A
-4
7 мкМ
-1.0
Каталитический ток
в присутствии тестостерона
-3
I, A
3 мкМ
-0.5
-5
-6
9 мкМ
-1.5
-2.0
10 мкМ
-7
-2.5
-8
-9
-1.0
-3.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E,V vs Ag/AgCl
0.2
0.4
0.6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
time, sec
16
Электрохимический скрининг
субстратов и ингибиторов
0
0
-1
I, A
I, A
-1
CYP 3A4
-2
CYP3A4+Интроконозол
-2
CYP3A4+Интроконазол+Диклофенак
CYP 3A4+Диклофенак натрия
-3
CYP3A4
-3
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
E, V vs. Ag/AgCl
-0.1
0.0
Внесение в систему маркерного субстрата
цитохрома Р450
характеризуется появлением на
вольтамперограмме
каталитического тока.
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
E, V vs. Ag/AgCl
Ингибиторы цитохрома Р450 вызывают
уменьшение восстановительного тока,
последующее добавление субстрата не
приводит к появлению
каталитического тока.
17
Влияние витаминов-антиоксидантов на
активность цитохрома Р450
0.5
0.0
-0.5
CYP3A4
CYP3A4+диклофенак
CYP3A4+витамин С+диклофенак
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
-3.5
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E, V vs. Ag/AgCl
155±7%
Каталитический ток CYP3A4, %
I, A
-1.0
Циклические
вольтамперограммы.
Витамины-антиоксиданты
увеличивают восстановительный
ток цитохрома Р450 в присутствии
маркерных субстратов
160
128±10%
140
135±10%
120
100%±2%
100
72%±10%
80
60
40
Активирующие влияние носит
концентрационно-зависимый
характер. Избыточное количество
антиоксидантов снижает
активность цитохрома Р450
20
0
1
2
CYP3A4
CYP3A4
+ ДФ
3
CYP3А4
+ 0.56 мМ
Вит. С
4
CYP3А4
+ Вит. С
+ ДФ
5
CYP3А4
+ 1.68 мМ
Вит. С
18
ЛИТЕРАТУРА
1. F. Hannemann et al. Cytochrome P450 systems—biological variations of electron transport chains.
Biochim. et Biophys. Acta 1770 (2007) 330–344.
2. A. Fantuzzi et al. A New Standardized Electrochemical Array for Drug Metabolic
Profiling with Human Cytochromes P450. Anal. Chem. 83, (2011), 3831–3839.
3. T. W. Tam et al. Inhibition of Human Cytochrome P450 Metabolism by Blended Herbal
Products and Vitamins. Pharm. Pharmaceut. Sci. 14(1), (2011)1-16.
4. N. E. Moskaleva and V. G. Zgoda. Modern Methods of Cytochrome P450 Analysis. Biomedical
Chemistry, (2013), Vol. 7, No. 2, pp. 124–135.
5. V. V. Shumyantseva et al. The Effect of Antioxidants on Electrocatalytic Activity
of Cytochrome P450 3A4. Biomedical Chemistry, (2013), Vol. 7, No. 2, pp. 160–164.
6. Sheila J. Drug–drug interactions and cooperative effects detected in electrochemically driven
human cytochrome P450 3A4. Bioelectrochemistry 86, (2012), 87–91.
7. Sandro Carrara. Multi-panel drugs detection in human serum for personalized therapy. Biosensors
and Bioelectronics 26, (2011), 3914–3919.
8. V. V. Shumyantseva et al. The dose-dependent influence of antioxidant vitamins on
electrochemically-driven cytochrome P450 3A4 catalysis. Oxid. Antioxid. Med. Sci., 2(2), (2013),
0-0.
9. Сычев Д.А. Фармакогенетическое тестирование: клиническая интерпретация результатов.
Рекомендации для практикующих врачей. Москва 2011.
10. Sheila J. Sadeghi. Breakthrough in P450 bioelectrochemistry and future perspectives. Biochimica et
Biophysica Acta.1814, (2011), 237–248.
19