Диагностика аксонального повреждения головного мозга у

96
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
Диагностика аксонального
повреждения головного мозга
у больных с генерализованной
фармакорезистентной эпилепсией
Е.В. Лекомцева
Государственное учреждение «Институт неврологии, психиатрии и наркологии АМН Украины», Харьков
Резюме. Изложен современный взгляд на проблему ранней и адекватной диагностики аксонального поврежде-
ния головного мозга, где особое внимание уделено роли тау (τ)-протеина как нового серологического маркера
диффузного аксонального повреждения. Проведено исследование содержания тау-протеина в сыворотке крови у 10 больных с генерализованной эпилепсией иммунофлюоресцентным методом. Показано, что у пациентов
с фармакорезистентной генерализованной эпилепсией и частыми эпилептическими припадками в межприступный период повышается уровень тау-протеина.
Ключевые слова: маркеры аксонального повреждения головного мозга, тау (τ)- протеин, генерализованная эпилепсия.
Введение
Диффузное аксональное повреждение
головного мозга, которое является отличительной клинико-патологической чертой
черепно-мозговой травмы (ЧМТ), обусловлено разрывом аксона и выходом аксоплазмы из нейрона в спинномозговую
жидкость в первые часы и сутки после
травмы (Яхнo H.H., Штульман Д.Р., 2001).
Одним из возможных клинических условий,
ассоциированным с аксональным повреждением, является тяжелое неврологическое состояние — генерализованный
эпилептический припадок. На протяжении
6–12 ч после ЧМТ (Самуэльс M., 1997;
Bulut M. et al., 2006) или повреждения головного мозга инфекционно-воспалительного генеза (Irazuzta J.Е. et al., 2001) наблюдается дезорганизация нейрофиламентного скелета и мембраны аксонов
с последующим нарушением аксоплазматического тока и временной блокадой
возбуждения (Дыскин Д.Е., 1996).
Морфология нейрона определяется,
прежде всего, архитектурой его цитоскелета. Цитоскелет клетки состоит из микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных филаментов. Микротрубочки —
очень динамичная клеточная структура
и в нейробластах содержатся в состоянии
деполимеризации, которое позволяет
менять структурно-функциональные возможности этого ансамбля. Неотъемлемой
частью цитоскелетного компонента являются протеины, которые оказывают важное
влияние на морфологию и физиологию
нейрона. Термостабильный протеин, необходимый для создания микротрубочек
цитоскелета нейрона, был идентифицирован M.D. Weingarten и соавторами (1975)
и обозначен как тау (τ)-протеин (tau protein). Тау-протеин регулирует образование
микротрубочек в нейронах, служит для
проведения информации из одной части
нейрона в другую. Будучи не способными
к самополимеризации, 6S- димеры под
действием тау-протеина превращаются
в 36S-кольцевые структуры, являющиеся
промежуточным звеном в процессе формирования трубочек (Weingarten M.D. et al.,
1975). Тау- протеин является основным
ассоциированным с микротрубочками
протеином нейронов (microtubule-associated protein, МАРs), принимая участие
в стабилизации преимущественно аксональных микротрубочек (Higuchi M. et al.,
2000). Уникальная возможность тау-протеина восстанавливать нормальные свойства микротубулярной агрегации in vitro
делают его важным регулятором создания
микротрубочек в нейронах (Brandt R.,1996;
Irving E. et al., 1997).
В патологических условиях тау-протеин превращается в гиперфосфорилированную форму (P-tau protein) (Carneiro L. et al., 2008), являющуюся основным
компонентом парных спиральных филаментов (paired helical filaments — PHFs),
которые формируют нейрофибриллярные нити и клубки — главный отличительный гистопатологический признак болезни Альцгеймера и сосудистых деменций
(Bonte F. et al., 2004). Укладываясь и скручиваясь в нейрофибриллы, тау-протеин
теряет свою основную функцию и приобретает нейротоксические свойства (Irving E. et al., 1997; Mailliot C. et al., 2000).
Тау-протеиновые нейрофибриллы не являются специфичными для болезни
Альцгеймера, они также наблюдаются
и при целом ряде других нейродегенеративных заболеваний, сцепленные гены
которых локализуются на 17-й хромосоме (данные заболевания получили название таупатии).
Роль тау-протеина в механизмах
диффузного аксонального повреждения
и, как следствие, являющегося маркером
аксонального повреждения головного
мозга, на сегодняшний день до конца
не изучена. Определение особенностей
данного протеина у больных эпилепсией
позволит расширить представления
про нейропатохимию эпилепсии и даст
возможность продолжить поиск новых
терапевтических путей лечения этого
заболевания.
Цель исследования — изучить содержание тау-протеина в сыворотке крови
больных с генерализованной эпилепсией
для разработки дифференциально-диагностических критериев.
Объект и методы
исследования
В основу работы положены результаты
обследования 10 больных (все женщины
в возрасте от 26 до 39 лет, средний возраст — 29,62±4,87 года) с первично-генерализованной фармакорезистентной
эпилепсией, находящиеся на диспансерном учете в Городском психоневрологическом диспансере № 3 г. Харькова. У всех
больных, принявших участие в обследовании, отмечали частые эпилептические
припадки (3–12 приступов в месяц), выраженные психические изменения личности, отсутствовала аутоиммунная наследственность. Средняя длительность течения
эпилепсии составила 22,45±3,6 года.
Контрольная группа состояла из 10 здоровых женщин (средний возраст —
29,11±7,14 года).
Обследование включало сбор анамнестических данных, неврологическое,
электроэнцефалографическое обследования, клинические лабораторные исследования, магнитно-резонансную томографию. Пациенты с эпилепсией получали
базисную противоэпилептическую терапию несколькими препаратами: фенитоин
в дозе 150 мг/сут в 2–3 приема, вальпроевая кислота — 300 мг/сут, бензобарбитал — 300 мг/сут, фенобарбитал —
50 мг/сут.
Для определения содержания таупротеина в сыворотке крови человека был
ÓÊÐ. ÌÅÄ. ×ÀÑÎÏÈÑ, 5 (73) – IX/X 2009 | www.umj.com.ua
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
использован иммунофлуоресцентный метод, основанный на конкурентном связывании моноклональных антител, специфичных
к двум разными эпитопам IgG и IgM тау
(Zemlan Р.F., 2003). Образцы инкубировали
с первичными моноклональными мышиными антителами, в присутствии вторичных
антител, меченных флуоресцентом. Отмывку фиксированных и несвязанных комплексов производили раствором из концентрата фосфатно-солевого буферного раствора с твином. Иммунофлуоресцентный
метод — метод флуоресцентного окрашивания, при котором происходит метка исследуемого тау-протеина антителами, FITC
(Flurescein Isothiocyanate) — конъюгированными, с последующей их визуализацией.
В исследовании были использованы антитела: антимышиные IgG (γ-chain specific)
FITC-конъюгированные (Affinity isolated antigen specific antibodies) и моноклональные
анти-τ (Tau) Clone TAU- 2 Mouse Ascites
Fluid (SIGMA, США). Оценку результатов
флуоресцентного свечения проводили
с применением микроскопа «Olympus» BX41
(Япония) при увеличении ×100, ×600.
У всех участников исследования наблюдались первично-генерализованные
тонико- клонические приступы и у 2
(20%) пациентов также в структуре заболевания отмечали абсансы и миоклонии
согласно Международной классификации
эпилепсий и эпилептических синдромов
(1989 г.). У 30% больных как проявление
синдрома дезинтеграции в межприступный период, чередуясь с эпилептическими припадками, возникали вегетативно-сосудистые пароксизмы, преимущественно смешанного характера. У всех
(100%) больных отмечали изменения
психики. Были характерны назойливость
и педантизм, патологическая обстоятельность, вязкость и тугоподвижность мышления, ригидность эмоций. Интеллектуально- мнестические изменения были
значительно выражены. Отмечали перманентные тревожно-депрессивные тенденции, реже — дисфорические нарушения.
Психическое состояние пациентов после
приступа нередко характеризовалось
импульсивностью, злобностью, агресси-
ей, иногда возникали угнетение настроения, ощущение тоски, страха, безысходности.
Неврологическая симптоматика выявлена у всех больных с генерализованной
эпилепсией. Наиболее часто наблюдались
глазодвигательные нарушения (8 больных), асимметрия носогубных складок
(7 больных), повышение сухожильных
и надкостничных рефлексов на конечностях (5 больных), патологические стопные
рефлексы (3 больных).
Результаты исследования представлены на рис. 1–7. Установлено, что содержание тау-протеина у пациентов с генерализованной эпилепсией в межприступный
период повышено по сравнению с контролем. Определение уровня тау-протеина
в сыворотке крови показало достоверное
повышение данного показателя на
0,32 усл. ед. оптической плотности (D)
(p<0,05) у больных. Анализ степеней отклонения от контрольных значений (t-критерий) уровня тау-протеина выявил, что
наблюдаемая разница между показателями была достаточно выражена. Таким образом, у пациентов с генерализованной
эпилепсией в межприступный период от-
Рис. 3
*
0,36 — ãðóïïà
ïàöèåíòîâ
ñ ãåíåðàëèçîâàííîé
ýïèëåïñèåé
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0,04 — ãðóïïà
êîíòðîëÿ
D=Log10 FITC
Fluorescence Dtau/Dfon
Рис. 1
Результаты
и их обсуждение
97
Содержание тау-протеина (фосфорилированной и нефосфорилированной
изоформ, диапазон молекулярной
массы — 55–62 кДа) в сыворотке крови больных с фармакорезистентной
генерализованной эпилепсией и частыми эпилептическими припадками
*p<0,05.
Рис. 2
Представлены две гистограммы распределения оптической плотности (D) депозитов тау-протеина (фосфорилированной и нефосфорилированной изоформ с молекулярной массой 55–62 кДа), отображенного предварительно на рис. 2 у больной К.,
возраст — 31 год, с генерализованной эпилепсией
Рис. 4
Электронная микрофотография демонстрирует иммунофлуоресцентное
окрашивание тау-протеина у больной
с генерализованной эпилепсией в реакции с моноклональными антителами.
В качестве первичных антител для выявления специфической реакции были
использованы моноклональные анти-τантитела. На фото — зеленый крупный
иммунный флуоресцирующий корпускул (immune particles) тау-протеина
(green fluorescent tau protein, GFtP),
меченного антимышиными IgG (γ-chain
specific) FITC-конъюгированными моноклональными антителами
Две электронные микрофотографии, выполненные в разном цветовом спектре: GRB
(зеленый, красный, голубой, то есть весь спектр) и в красном цвете (Red) демонстрируют наличие депозитов тау-протеина у больной с генерализованной эпилепсией в реакции с моноклональными мышиными антителами. В качестве первичных
антител для выявления специфической реакции были использованы моноклональные анти-τ-антитела. На фото — размытые нити GFtP тау-протеина
www.umj.com.ua | ÓÊÐ. ÌÅÄ. ×ÀÑÎÏÈÑ, 5 (73) – IX/X 2009
98
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
ment of free radicals. J. Cereb. Blood Flow Metab.,17(6): 612–622.
Mailliot C., Podevin-Dimster V., Rosenthal R.Е. et al. (2000) Rapid tau protein dephosphorylation and differential rephosphorylation during cardiac arrest-induced cerebral ischemia and reperfusion.
J. Cereb. Blood Flow Metab., 20(3): 543–549.
Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y.,
Kirschner M.W. (1975) A protein factor essential for
microtubule assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72(5):
1858–1862.
Zemlan P.F. (2003) Method of detecting axonallyderived protein tau in patients with traumatic CNS injury. US Patent 6589746 (http://www.ipo.uc.edu/index.
cfm?fuseaction=patents.results&item_number=6,589,746; http://www.freepatentsonline.
com/6589746.html).
Рис. 5
Представлены две гистограммы распределения оптической плотности (D) депозитов тау-протеина: фосфорилированной и нефосфорилированной изоформ с молекулярной массой 55–62 кДа, отображенного предварительно на рис. 4 у больной С.,
возраст — 25 лет, с генерализованной эпилепсией
Рис. 6
Рис. 7
Діагностика аксонального
пошкодження головного
мозку у хворих
на генералізовану
фармакорезистентну
епілепсію
Є.В. Лекомцева
Электронная микрофотография демонстрирует иммунофлуоресцентную
реакцию с моноклональными анти-τантителами и антимышиными IgG FITCконъюгированными моноклональными
антителами здоровой женщины В.,
возраст — 30 лет. На фото — небольшая корпускула FITC-тау-протеина,
которые в норме выявляют у 5% практически здоровых людей, особенно
у лиц пожилого и старческого возраста (Zemlan P.F., 2003)
мечается достоверное повышение уровня
тау-протеина.
Выводы
У пациентов с фармакорезистентной
генерализованной эпилепсией с частыми эпилептическими припадками в межприступный период наблюдается повышение уровня тау-протеина в сыворотке
крови. Вопрос о содержании тау- протеина в сыворотке крови больных эпилепсией является принципиально важным с точки зрения этиопатогенеза
и дифференциальной диагностики. Высокий уровень тау-протеина в сыворотке
крови может отражать тяжесть течения
заболевания как по показателю частоты
эпилептических припадков (все исследуемые пациенты были с частыми приступами), так и по длительности заболевания (длительность эпилепсии у больных в данном исследовании составляла
более 16 лет).
Таким образом, все изложенное делает целесообразным изучение состояния
маркеров аксонального повреждения го-
Представлена гистограмма оптической
плотности (D) фонового свечения у здоровой женщины В., возраст — 30 лет
ловного мозга при эпилепсии и определение их роли в патогенезе заболевания.
Литература
Дыскин Д.Е. (1996) Комплексная диагностика
поражений головного мозга у больных с эпилептическими припадками: Автореф. дис. … канд. мед.
наук: 14.00.13. Ленинградский педиатрический мед.
ин-т. Ленинград, 16 с.
Самуэльс M. (1997) Неврология (Пер. с англ.).
Практика, Москва, 638 с.
Яхно Н.Н., Штульман Д.Р. (2001) Болезни
нервной системы. Т. 2, Медицина, Москва, 480 с.
Bonte F., Harris T.S., Roney C.A., Hynan L.S.
(2004) Differential diagnosis between Alzheimer’s and
frontotemporal disease by the posterior cingulate sign.
J. Nucl. Med., 45(5): 771–774.
Brandt R. (1996) The tau proteins in neuronal
growth and development. Front Biosci. 1: d 118–130.
Bulut M., Koksal O., Dogan S. et al. (2006) Tau
protein as a serum marker of brain damage in mild
traumatic brain injury: preliminary results. Adv. Ther.,
23(1): 12–22.
Carneiro L., Magalhaes J., Tattoli I., Philpot D., Travassos L. (2008) Nod-like proteins in inflammation and disease. J. Pathol., 214: 136–148.
Irazuzta J.Е., de Courten-Myers G., Zemlan F.Р., Bekkedal M.Y, Rossi J. 3rd (2001) Serum
cleaved Tau protein and neurobehavioral battery of tests
as markers of brain injury in experimental bacterial
meningitis. Brain Res., 913(1): 95–105.
Irving E.А., Yatsushiro K., МсCulloch J.,
Dewar D. (1997) Rapid alteration of tau in oligodendrocytes after focal ischemic injury in the rat: involve-
Резюме. Викладено сучасний погляд
на проблему ранньої та адекватної діагностики аксонального пошкодження
головного мозку, де особливу увагу приділено ролі тау (τ)-протеїну як нового
серологічного маркера дифузного аксонального пошкодження. Проведено дослідження вмісту тау-протеїну в сироватці крові у 10 хворих на генералізовану
епілепсію імунофлюоресцентним методом. Показано, що у пацієнтів із фармакорезистентною генералізованою епілепсією та частими епілептичними нападами у міжнападний період
підвищується рівень тау-протеїну.
Ключові слова: маркери аксонального
пошкодження головного мозку, тау (τ)-протеїн, генералізована епілепсія.
Diagnostics of axonal brain
damage in patients with
generalized drug-resistant
epilepsy
Ye.V. Lekomtseva
Summary. The article presents an up-todate opinion concerning problem of early
and adequate diagnostics of axonal brain
damage. The particular attention was
given to the role of tau (τ)-protein as a
brand-new serological marker of diffuse
axonal damage. Tau protein was quantified
in blood serum of 10 patients with generalized epilepsy vs control via immunofluorescence method. It was revealed that
patients with drug-resistant generalized
epilepsy and frequent seizures under a
baseline condition had increased serum
levels of tau protein.
Key words: markers of axonal brain damage,
tau (τ) protein, generalized epilepsy.
Адрес для переписки:
Лекомцева Евгения Владимировна
61064, Харьков, ул. Пермская, 9, кв. 53
E-mail: [email protected]
ÓÊÐ. ÌÅÄ. ×ÀÑÎÏÈÑ, 5 (73) – IX/X 2009 | www.umj.com.ua