НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ БИОМАРКЕРОВ ЭФФЕКТА В

УДК 336.717.061(043)
Н.В. ЗАЙЦЕВА*, М.А. ЗЕМЛЯНОВА*, В.Н. ЗВЕЗДИН*, Д.Л. МАЗУНИНА**
*ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», Пермь, Россия
**Государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ БИОМАРКЕРОВ ЭФФЕКТА В УСЛОВИЯХ НЕПРИЕМЛЕМОГО РИСКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ
СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
Накопленные результаты собственных научных многолетних исследований позволили разработать поэтапную
систему обоснования биомаркеров эффекта в условиях неприемлемого риска воздействия внешнесредовых и
производственных химических факторов. Представлены научно-методические подходы к установлению и оценке
причинно-следственных связей вредного воздействия факторов среды обитания и нарушений состояния здоровья.
Ключевые слова: неприемлемый риск, факторы среды обитания, биомаркеры эффекта, причинно-следственные связи,
нарушения состояния здоровья
Введение. В соответствии с современными проблемно ориентированными направлениями научных исследований, как в
мире, так и в России, а также для решения спектра задач, закрепленных в контрольно-надзорной деятельности
Роспотребнадзора, гигиенического нормирования, биомониторинга актуальным является разработка научно-методических
подходов к обоснованию биомаркеров эффекта в условиях негативного воздействия факторов среды обитания на здоровье
населения и работающих. Актуальность данных исследований подчеркивается экспертами ВОЗ, по мнению которых
основным инструментом для выявления устойчивых причинно-следственных связей нарушений состояния здоровья с
воздействием внешнесредовых и производственных факторов, в первую очередь, химических, является обоснование и
использование биомаркеров экспозиции и эффекта [1-3].
Данное направление активно развивается в ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками
здоровью населения», Разрабатываемые и апробируемые технологии анализа причинно-следственных связей в условиях
экспозиции факторов среды обитания различной природы и обоснования биомаркеров эффекта основываются на
результатах многолетних масштабных наблюдений *4+. Разрабатываемые и апробируемые научные подходы к
обоснованию биомаркеров эффекта носят системный характер и базируются на совокупных результатах научного анализа
опасности и риска, связанных с действием факторов среды обитания на человека, эпидемиологических исследований,
теоретических знаниях о закономерностях и особенностях реализации негативного воздействия внешнесредовых факторов
на организменном, органно-тканевом, клеточно-субклеточном, молекулярно-генетическом уровнях.
Целью настоящих исследований являлась разработка алгоритма обоснования биомарков эффекта в условиях
неприемлемого риска воздействия факторов среды обитания различного происхождения.
Материалы и методы.
Для достижения поставленной цели использован комплекс санитарно-гигиенических, эпидемиологических, статистических
методов. Гигиеническая оценка качества атмосферного воздуха, питьевой воды на исследуемых территориях проведена по
материалам мониторинговых и натурных наблюдений Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю, ГУ «Пермский
ЦГМС», по данным исследований ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью
населения», выполненных в соответствии с РД 52.04.186-89 «Руководство по контролю загрязнения атмосферы».
Информация обобщена в соответствии с ГН 2.1.6.1338-03, СанПиН 2.1.4.1074-01. Математическое моделирование
распространения вредных веществ в атмосферном воздухе от стационарных источников изучаемых производств
осуществлено по данным расчетов среднегодовых приземных концентраций с использованием программы УПРЗА
«Эколог», версия 3.0 и «Эколог-средние», реализующей методику НИИ Атмосфера и ГГО им. Воейкова. Визуализация
результатов расчета выполнена с использованием методов пространственно-временного анализа в среде ГИС ARC/View,
версия 3.2.
Количественная оценка экспозиции, установление экспонируемой группы населения и моделирования зависимости
«экспозиция – маркер экспозиции» при различных воздействующих средах и путях поступления в организм проведена в
соответствии с «Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ,
загрязняющих среду обитания» Р.2.1.10.1920-04.
Для обоснования маркеров экспозиции и маркеров эффектов выполнено углубленное обследование лиц, подвергающиеся
экспозиции химических факторов (группа наблюдения) и находящихся вне экспозиции (группа контроля). Обследование
выполнено в соответствии с обязательным соблюдением этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации 1975
года с дополнениями 1983 года.
Химико-аналитические исследования включали определение содержания приоритетных химических факторов риска в
крови в соответствии с утвержденными нормативно-методическими указаниями. В качестве критериев оценки содержания
содержания веществ в крови использованы референтные уровни [5+ или показатели группы сравнения. Обоснование
маркеров экспозиции осуществляли на основании установления связи между качеством среды обитания и концентрацией
исследуемых веществ в крови. Значимые связи описывали с помощью модели нелинейной логистической регрессии [6].
Оценку параметров моделей выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 и специально
разработанных программных продуктов, сопряженных с приложениями MS-Office. Сравнение групп по количественным
признакам проводили с использованием двухвыборочного критерия Стьюдента.
Обоснованиемаркеров эффекта осуществляли на основании расчета показателя отношения шансов (OR), характеризующего
связь маркера экспозиции с показателями ответных реакций у обследованных детей. По величине отношения шансов
оценивали наличие (при OR≥1) и силу этой связи [7]. Адекватность моделей оценивали по критерию Фишера с 95% уровнем
достоверности и коэффициенту детерминации.
Результаты. Научно-методические подходы, применяемые для обоснования биомаркеров эффекта в условиях
неприемлемого риска воздействия химических факторов, реализуются последовательно по трем приоритетным
направлениям исследований:
- обоснование маркеров экспозиции, что позволяет подтвердить и оценить уровень воздействия на организм факторов
риска. При этом обосновывали маркеры как при экспозиции отдельных факторов, так и их комплексов, а также различных
путях поступления химических веществ в организм и уровнях воздействия;
- обоснование маркеров эффекта при воздействии различных уровней и комплексов факторов риска и путях поступления в
организм;
- выявление устойчивых достоверных причинно-следственных связей между экспозицией, маркерами экспозиции и
маркерами эффекта.
Реализация первого направления - обоснование маркеров экспозиции – преследует своей целью подтверждение контакта
человека с фактором внешней среды и оценку воздействующего уровня. Для этого проводили химико-аналитическое
исследование качественного и количественного содержания в биосубстратах химических веществ или их метаболитов,
адекватных воздействию факторов риска. Отбор биологических проб осуществляли у населения, находящегося в зоне
экспозиции, а также у работающих, чьи условия труда связаны с вредными производственными факторами. Среди
населения, в первую очередь, обследуются наиболее чувствительные контингенты - это дети, беременные женщины и
женщины фертильного возраста. В настоящее время, в практической деятельности ФБУН «ФНЦ медико-профилактических
технологий управления рисками здоровью населения» используются разработанные, утвержденные Главным
государственным санитарным врачом и рекомендованные к внедрению в службе, порядка 40 методов определения в
крови, моче, грудном молоке и других биосубстратах более 50 видов загрязнителей среды обитания, в том числе металлов,
алифатических и ароматических углеводородов, спиртов, альдегидов и других химических примесей.
Для формирования перечня приоритетных веществ, идентифицируемых в биосредах и предназначенных для дальнейшего
анализа, использовали следующие критерии:
- подтверждение научными данными возможности присутствия вещества из среды обитания или его устойчивого
метаболита в биосреде в условиях известной экспозиции,
- достоверное превышение показателя среднего содержания химического вещества в биосубстрате в группе наблюдения
относительно уровня в группе сравнения или референтного значения (в частности для металлов),
Следующим этапом формирования доказательной базы причинно-следственных связей являлось выявление достоверной
связи уровня приоритетных химических веществ, содержащихся в биосредах, с уровнем экспозиции. В качестве
количественной меры экспозиции использовали потенциальную дозу, которую рассчитывали в соответствии со
стандартизованной процедурой. Учитывали при этом сценарий экспозиции и направленность повреждающего действия
исследуемых химических веществ. В собственных исследованиях расчеты средней суточной дозы проводили для веществ с
различной спецификой повреждающего действия и при различных уровнях концентраций в объектах среды обитания
(атмосферный воздух, вода питьевая и др.). Оценка экспозиции позволила выделить долю факторов и приоритетный путь
поступления.
На основе методов математического моделирования выявлены значимые связи концентрации в крови изучаемых
химических факторов с суточной дозой хронической экспозиции, что позволило повышенные концентрации приоритетных
химических веществ в крови рассматривать как маркеры экспозиции. В результате систематических медико-биологических
исследований обоснован ряд маркеров ингаляционной и пероральной экспозиции с питьевой водой химических веществ. В
частности, маркеры экспозиции, обусловленной формальдегидом, бензолом, марганцем, никелем, хромом, ванадием и
другими веществами. При этом показано, что металлы могут до 5-8 раз превышать референтный уровень, органические
соединения – до 3-4 раз.
Следующим этапом исследований в доказательной цепочке является обоснование маркеров ответа организма на
повышенные уровни содержания в биосредах токсичных веществ, обусловленные экспозицией. Для выявления и оценки
отклонений показателей ответов на различном структурно-функциональном уровне используется широкий спектр
высокоинформативных и чувствительных методов, реализация которых осуществляется на оборудовании экспертного
класса. Качество выполняемых исследований обеспечивается многолетним систематическим участием в Федеральной и
международной системе оценки качества.
По результатам направленных диагностических исследований осуществляются сравнительные оценки спектра и уровня
отклонений изучаемых показателей ответа в выборках экспонированных и неэкспонированных лиц для решения задач
обоснования маркеров эффекта.
Критериями включения исследуемого показателя в анализ причинно-следственных связей являются:
- наличие достоверных различий в группе наблюдения и сравнения.
- направленность изменения показателя должна отражать характер воздействия фактора экспозиции.
Заключительным этапом в обосновании маркеров эффекта является выявление и оценка причинно-следственных связей
маркеров экспозиции с показателями ответа организма на эту экспозицию.
С помощью методов математического моделирования строятся зависимости изменения показателей ответа от изменения
концентрации маркера экспозиции. При выявлении достоверных и биологически правдоподобных зависимостей
анализируемые показатели рассматриваются как маркеры эффекта. В результате многолетних исследований ФБУН «ФНЦ
медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» обоснованы биохимические,
иммуннологические, гематологические и молекулярно-генетические маркеры эффектов, характеризующие развитие
негативных процессов со стороны системы крови, печени, иммунной системы, нейроэндокринной регуляции,
окислительно-антиксидантного статуса, костного метаболизма в условиях устойчивой экспозиции, обусловленной
ароматическими углеводородами, рядом металлов, формальдегидом, хлорорганическими соединениями и другими
химическими факторами воздействия. При этом разработка и внедрение новых высокочувствительных аналитических
методов позволяет анализировать механизмы возникновения и развития ответных реакций организма на самых ранних
стадиях (клеточно-молекулярный уровень) их формирования на внешнесредовое воздействие
Углубленными исследованиями показано, что у детей в зонах экспозиции химических факторов, обусловленной
неудовлетворительным качеством атмосферного воздуха от источников выборосов металлургических производств
(коэффициент опасности HQ = 2,5-4,5), происходит нарушение протеомного профиля плазмы крови, ассоциированного с
повышенной (в 2-3 раза относительно референтного уровня) концентрацией металлов в крови. При этом доказано, что
биомаркерами эффекта, установленными по расчету отношения шансов (OR), при экспозиции ванадия является повышение
уровня аполипопротеина А1, при экспозиции никеля – повышение уровня транстеритина, снижение гаптоглобина (OR=2,52,9; DI=1,7-3,8; р=0,001-0,015). Неблагоприятный эффект воздействия может реализоваться в виде нарушения транспорта
холестерина и тироксина, структуры и функции гемоглобина, что характеризует в последующем изменение метаболомного
профиля у детей.
В зонах неприемлемого риска (HQ=6-7), обусловленного экспозиции бензола от источников выбросов нефтехимических
3
производств и автотранспорта, маркером экспозиции является концентрация бензола в крови на уровне 0,01 мг/дм и
выше. Биомаркерами установленных негативных эффектов, например, нарушения гомеостаза свободно-радикального
окисления является повышение уровня МДА и снижение общей антиоксидантной активности плазмы крови (OR=1,6-2,3;
DI=1,2-2,8; р=0,000-0,01); стимуляции нейро-гуморальной регуляции – повышение уровня ТТГ, кортизола, снижение уровня
Т4свободного в сыворотке крови (OR=1,8-2,9; DI=1,5-3,5; р=0,000-0,02); угнетения костно-мозгового кроветворения –
снижение уровня эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов (OR=2,4-3,5; DI=2,1-3,8; р=0,000-0,001). Следствием данных
процессов является нарушение внутрисердечной проводимости и условий циркуляции в сосудистом русле, что может
вызвать рост заболеваемости детского населения вегето-сосудистой дистонией, как предиктором сердечно-сосудистых
заболеваний в последующих возрастных периодах.
В условиях неприемлемого риска (HQ=1,5-3,5), обусловленного хронической экспозицией хлорорганических соединений, в
крови идентифицирован хлороформ, 1,2-дихлорэтан, дибромхлорметан, тетрахлорметан на уровне концентраций 0,00013
0,02 мг/дм . Выделен комплекс биомаркеров, отражающих негативные эффекты со стороны критических органов и систем.
О повышенном цитолизе мембраны клеток свидетельствует повышение активности АСАТ в сыворотке крови. Нарушение
синтеза белка рибосомами гепатоцитов в сторону гипофункции вследствие повреждения клеток печени характеризует
2
снижение уровня общего белка, альбумина, сиаловых кислот в сыворотке крови (R =0,29-0,56; 250,98≤F≤1010,66 р=0,0000,004). Об активации окислительных процессов (как следствие повреждения клеточных мембран печени) свидетельствует
2
повышение уровня гидроперекиси липидов и малонового диальдегида в плазме крови (R =0,22-0,48; 10,88≤F≤101,22
р=0,000-0,028). Напряжение функционального состояния системы антиоксидантной защиты в результате интенсивного
образования активных форм кислорода характеризует повышение общей АОА, активности глутатионпероксидазы, Zn2
зависимой супероксиддисмутазы в сыворотке крови) (R =0,04-0,74; 10,27≤F≤409,3 р=0,000-0,002) [8].
При потреблении питьевой воды с повышенным содержанием марганца (до 3,5 ПДК) у детей регистрируется повышенное
содержание марганца в крови (до 4,5 раза относительно референтного уровня). Негативные эффекты воздействия на
нервную систему выражаются в повышенной частоте патологического дисбаланса нейромедиаторов, регулирующих
процессы возбуждения и торможения в ЦНС (биомаркеры эффекта – повышение глутамата и снижение гаммааминомасляной кислоты в сыворотке крови, OR=3,4-6,1; DI=2,2-10,5; р=0,000).). Данный процесс инициируется
активизацией окислительного повреждения клеточно-субклеточных структур (повышение уровня гидроперекисей липидов
и малонового диальдегиад, снижение глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы в сыворотке крови), на фоне
нарушения нейроэндокринной регуляции (снижение уровня кортизола и серотонина, OR=5,4-7,2; DI=4,3-9,5; р=0,000) и
обеспечения нервно-мышечной проводимости ионизированным кальцием, что в целом является прогностически
неблагоприятной тенденцией развития в последующем нейропсихологических и двигательных нарушений.
У работников сталеплавильных производств, условия труда которых характеризуются воздействием пыли, содержащей
кремний диоксид кристаллический (от 2 до 10%), в концентрации до 6,5ПДКр.з. в крови идентифицируется кремний, в
концентрации до 3 раз превышающей референтный уровень. При этом, наряду с частицами традиционной дисперсности
(больше 0,1 мкм) в крови присутствуют частицы кремния нанометрового размера (до 100 нм). Установлены выраженные
негативные эффекты в виде нарушения окислительных и антиоксидантных процессов (по повышению уровня малонового
диальдегида и снижению общей антиоксидантной активности плазмы крови), дисбаланс которых может усугублять
развитие воспалительной реакции, ведущей к развитию фиброза на уровне нижних отделов системы дыхания.
У работниц текстильных производств (отбельщицы, красильщицы, колористы) при стабильном присутствии в воздухе
3
3
3
рабочей зоны, толуола до 0,056 мг/м , свинца и марганца до 0,0012 – 0,00014 мг/м , бенз(а)пирена – до 0,00010 мг/м в
крови определяется марганец, свинец, толуол, бензпирен в концентрациях до 2 раз выше показателей сравнения. Выявлен
дисбаланс половых гормонов (повышение ЛГ и ФМСГ в сыворотке крови), обеспечивающих функционирование
2
репродуктивной системы (R =0,93; F=365,08; р=0,000).
У детей с повышенным содержанием в крови марганца, никеля и хрома (до 13 раз выше референтного уровня),
обусловленным внешнесредовой экспозицией, доказаны негативные эффекты генетической нестабильности,
характеризующиеся выраженными нарушениями ядерного аппарата буккальных эпителиоцитов в виде дисбаланса
клеточного обновления, проявляющегося замедлением апоптозной активности (повышение частоты регистрации клеток
буккального эпителия с кариорексисом, кариолизисом и апоптозными телами, р=0,012-0,028) и усилением активности
процесса пролиферации (повышение частоты регистрации многоядерных клеток и клеток с круговой насечкой ядра,
р=0,014-0,036). Установлено выраженное нарушение нормального цикла митотического деления, ведущего к
формированию микроядер (частота клеток с микроядрами и протрузиями до 5,0 раз выше среднероссийских показателей,
р=0,001-0,022;). Выражена активность окислительного повреждения на уровне ДНК клетки (повышение уровня 8-гидрокси2деоксигуанозина в моче). Вклад марганца, никеля и хрома в повышение уровня содержания 8-гидрокси-2-деоксигуанозина
в моче составил 22-29%, в формирование полиморфизма хромосом лимфоцитов и аномалий ядерного аппарата
буккальных эпителиоцитов – 24-32% (F=7,73-13,85; р=0,001-0,031) [9].
Таким образом, внедрение в практику гигиенических исследований и экспертиз обоснованных биомаркеров экспозиции и
эффекта позволяет решать задачи по установлению причинно-следственных связей развития негативных эффектов у
населения и работающих, подвергающихся экспозиции внешнесредовых и производственных факторов. И тем самым
формировать базу для доказывания причинения вреда здоровью, обусловленного факторами риска.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Biomarkers and human biomonitoring. Children's Health and the Environment WHO Training Package for the Health Sector
World Health Organization. 2011. Available at: www.who.int/ceh (accessed 19 March 2014).
Principles for evaluating health risks in children associated with exposure to chemicals (Environmental Health Criteria 237).
WHO, 2006. Available at: www.inchem.org (accessed 19 March 2014).
Centers for Disease Control and Prevention. National Biomonitoring Program. CDC. – 2011. Available at:
www.cdc.gov/biomonitoring / (accessed 19 March 2014).
Зайцева Н.В., Май И.В., Клейн С.В. К вопросу установления и доказательства вреда здоровью населения при выявлении
неприемлемого риска, обусловленного факторами среды обитания //Анализ риска здоровью. – 2013. – № 2. – С. 14-27.
Клиническое руководство по лабораторным тестам / Под ред. проф. Норберта У. Тица / Перевод с англ. Под ред. В.В.
Меньшикова. – М.: ЮНИМЕД-пресс, 2003. – 960 с.
Четыркин Е.М. Статистические методы прогнозирования. – М.: Статистика, 1977. – 356 с.
Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. – М.: Медиа Сфера,
1998. – 352 с.
Онищенко Г.Г., Зайцева Н.В., М.А. Землянова. Гигиеническая индикация последствий для здоровья при внешнесредовой
экспозиции химических факторов / под ред. Н.В. Зайцевой. – Пермь: Книжный формат, 2011. – 489.
Зайцева Н.В., Землянова М.А., Алексеев В.Б., Щербина С.Г. Цитогенетические маркеры и гигиенические критерии
хромосомных нарушений у населения и работников в условиях воздействия химических факторов с мутагенной
активностью (на примере металлов, ароматических углеводородов, формальдегида). – Пермь: Книжный формат, 2013. –
222 с.
Н.В. ЗАЙЦЕВА, М.А. ЗЕМЛЯНОВА, В.Н. ЗВЕЗДИН, Д.Л. МАЗУНИНА
ТІРШІЛІК ЕТУ ОРТА ФАКТОРЫНЫҢ ӘСЕРІНЕН ҚАБЫЛДАРЛЫҚ ЕМЕС ҚАУІП-ҚАТЕР ЖАҒДАЙЫНДА БИОМАРКЕРЛЕРДІҢ
ЭФФЕКТІСІН ҒЫЛЫМИ НЕГІЗДЕУ
Түйін: Көпжылдық өзіндік ғылыми зерттеулердің нәтижесінде жиналған кәсіби және сыртқыорталық химиялық
факторларынан қабылдарлық емес қауіп-қатер жағдайында биомаркерлердің эффектісін жүйелі негізделді. Денсаулық
жағдайы мен тіршілік ету ортада кері әсер етуші факторлармен себеп-салдарлық байланысты бағалау және бекітуіне
ғылыми-әдістемелік әдістері берілуде.
Түйінді сөздер: қабылдарлық емес қауіп-қатер, тіршілік ету орта факторы, биомаркерлік эффектілер, себеп-салдарлық
байланыс, денсаулық жағдайдың бұзылуы
N. ZAITSEVA, M. ZEMLYANOVA, V. ZVEZDINAБ, D. MAZUNINA
SCIENTIFIC BASIS BIOMARKER EFFECT UNDER CONDITIONS UNACCEPTABLE RISK IMPACT ENVIRONMENTAL FACTORS
Resume: The accumulated results of their scientific research will provide a multi-year phased system of validation of biomarkers
effect in conditions of unacceptable risk of exposure to exogenous and production of chemical factors. Presented scientific and
methodological approaches to the identification and assessment of causality adverse effects of environmental factors and disorders
of health.
Keywords: unacceptable risk, environmental factors, biomarkers of effect, cause-and-effect relationship, breach of health status.