SkMA IFA

РАБОЧАЯ ИНСТРУКЦИЯ
ПРИМЕНЕНИЕ
1 апреля 2014 г.
SkMA IFA представляет собой комплект реактивов для
качественного
и
полуколичественного
определения
аутоантител IgG к антигенам скелетных мышц в человеческой
сыворотке на срезах ткани скелетных мышц обезьяны
SkMA IFA
48 определений
3936
96 определений
3937
Непрямой иммунофлюоресцентный анализ для
определения антител IgG к анитигенам
скелетных мышц в человеческой сыворотке
Субстрат: скелетная мышца обезьяны
MEDIPAN GMBH
Людвиг-Эрхард-Ринг 3
D - 15827 Далевитц / Берлин
•••
Телефон: +49 (0) 33 708 / 44 17 - 0
Факс:
+49 (0) 33 708 / 44 17 - 25
[email protected]
www.medipan.de
Использованные обозначения нерадиоактивных методов анализа
MEDIPAN GMBH
L
In vitro диагностика
Соответствие
требованиям ЕС
Номер заказа
Обозначение
партии
Использовать до
Производитель
Учитывать
сопроводительную
документацию
Соблюдать
рабочую
инструкцию
Хранение при
SLIDE X
Носитель объекта
Промывочный буфер
Контрольная
сыворотка
MP-AL-R-3936,3937-v001-2014-04-01.doc
D
Биологический
риск
MOUNT
Покрывное
средство
COVER
Покрывные
стекла
Конъюгат
В патогенезе миастении Myasthenia gravis (MG) циркулирующие
антитела к рецепторам ацетилхолина (AChR) и антигенам
скелетных мышц (SkMA) играют важную роль. Антитела вызывают
нарушение нервно-мышечных механизмов передачи за счет
блокирования или разрушения рецепторов ацетилхолина.
Резекция вилочковой железы у пациентов с краткими эпизодами
миастении положительно влияет на течение заболевания,
поскольку производство антител регулируется за счет вырождения
клеток вилочковой железы.
Диагностика миастении основывается на определении аутоантител
к AChR и к поперечнополосатой (скелетной) мускулатуре. Высокий
уровень антител служит маркером миастении, ассоциированной с
тимомой. Напротив, отсутствие anti-AChR и SkMA свидетельствует
о том, что миастения или тимома маловероятны. Однако титр
лишь в некоторой степени коррелирует с клинической картиной,
поэтому прогнозирование по уровню антител не представляется
возможным.
Определение антител AChR осуществляется посредством
радиоиммунного анализа или ИФА, для повседневного
определения SkMA применяется непрямая флюоресценция на
продольных скелетных мышечных волокнах.
ПРИНЦИП ТЕСТИРОВАНИЯ
SkMA IFA представляет собой непрямой иммунофлюоресцентный
анализ для качественного и полуколичественного определения
антител IgG к антигенам скелетных мышц. (SkMA).
На первом этапе реакции антитела в разбавленных пробах
пациентов специфически реагируют с антигенами срезов ткани,
зафиксированными
на
носителе
объекта.
Несвязанные
компоненты удаляются на этапе промывки после 30 минут
инкубации при комнатной температуре.
На втором этапе реакции связанные антитела специфически
реагируют с
антителами anti-human-IgG, связанными с
флуоресцеин-иозтиоцианатом (FITC). Избыточные молекулы
конъюгата через 30 минут инкубирования при комнатной
температуре удаляются от прочно связанных иммунных
комплексов путем промывки.
После покрывания носители объекта считываются под
флуоресцентным микроскопом (длина волны возбуждения 490 нм,
длина волны излучения 520 нм). В соответствии с гистологической
структурой антигенов скелетных мышц положительная проба
показывает специфический рисунок флюоресценции поперечнополосатой мышечной ткани.
ПРОБЫ ПАЦИЕНТОВ
Получение и хранение
Взять кровь из вены, дать ей свернуться и отделить сыворотку
центрифугированием. Хранить до 3 суток при температуре 2-8 °C,
при более длительных сроках хранения необходимо заморозить
пробы
при
температуре
-20°C.
Избегать
повторного
замораживания
и
размораживания,
при
необходимости,
замораживать аликвотированными частями.
Липемические пробы не использовать, поскольку на поверхности
субстрата может образоваться жирная пленка. Пробы могут
содержать протеолитические энзимы, которые могут привести к
перевариванию
субстрата,
поэтому
также
не
могут
использоваться.
Страница 1/4
Подготовка и использование
Перед использованием в тесте SkMA IFA нагреть сыворотку до
комнатной температуры. Обязательно встряхнуть реактивы и
сыворотку перед использованием для обеспечения необходимой
гомогенности.
Скрининг:
пробы пациентов для теста разбавить в соотношении
1:40 (v/v), например,. 10 мкл пробы + 390 мкл PBS
буфера (из C).
Титрование: исходя из разбавления 1:40 (v/v), пробы далее
разбавляются раствором PBS буфера (из C) в
соотношении 1:4, например, 100 мкл разбавленной
пробы + 300 мкл PBS раствора (из C) дают следующий
ряд разбавления: 1:40, 1:160, 1:640, и т.д.
КОМПОНЕНТЫ ТЕСТА для 48 (96)
oпределений
Носители объекта
A
Ag
4
Ag
8
C
BUF
PBS
12
заварены поштучно
с впитывающей
бумагой
4 места нанесения, покрытых
скелетной мышцей обезьяны
криостатный срез
PBS буфер
2 x 10г
Твердое вещество
для приготовления 2 x 1000 мл
раствора
Конъюгат
содержит anti-human-IgG (овца),
связанный с FITC, с эванс синим
3,0 мл (2x3,0)
готов к
использованию
капельница
белая крышка
MOUNT
Покрывное средство
Глицериновый раствор,
буферизованный фосфатом, pH
7,4 ± 0,2
3,0 мл
готов к
использованию
капельница
белая крышка
F
Шаблоны из впитывающей
бумаги
12
TEMPL
G
Покрывные стекла
1
D
CONJ
E
(22 x 70мм)
COVER
12
Положительный контроль
(разбавленная сыворотка крови
CONTROL человека)сведения о титре и +
спецификации на этикетке
P
N
CONTROL
Отрицательный контроль
(разбавленная сыворотка крови
человека)
−
1,0 мл
готово к
использованию
капельница
красная крышка
1,0 мл
готово к
использованию
капельница
зеленая крышка
Дополнительные материалы :
-
Регулируемые микропипетки (10, 100, 1000 мкл)
наконечники пипеток
пробирки для разбавления проб
дистиллированная или деионизированная вода
мерный цилиндр или мерная колба 1 л
влажная камера
пластиковая промывная ёмкость
красильные ванны
флуоресцентный микроскоп с длиной волны возбуждения 490 нм и
длиной волны излучения 520 нм, 100-кратное увеличение
(рекомендуется)
Количество и хранение
Каждая упаковка SkMA IFA 3936 (3937) содержит реактивы для 48
(96) определений.
Срок годности всего набора реактивов указан на внешней стороне
упаковки набора. Сроки годности отдельных реактивов могут быть
более долгими и указаны на соответствующих флаконах.
До использования хранить все реактивы теста SkMA IFA при
температуре 2 - 8 C. Твердое вещество PBS разрешается хранить
MP-AL-R-3936,3937-v001-2014-04-01.doc
при комнатной температуре. Все открытые компоненты теста при
правильном хранении при температуре 2 - 8°C можно хранить не
менее 2 месяцев.
Подготовка и использование
Открывать упаковку носителей объекта только после достижения
комнатной температуры.
PBS буфер в твердом веществе (10г) поместить в мерную колбу
или мерный цилиндр (1000 мл) и заполнить дистиллированной
водой до отметки. Растворить твердое вещество при помешивании
или встряхивании.
Приготовленный таким образом раствор PBS буфера хранить при
комнатной температуре в закрытом стеклянном сосуде. Не
использовать мутные, зараженные или изменившие цвет растворы
с измененным уровнем pH.
Хранить конъюгат в защищенном от света месте.
ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА
•
•
Разбавить пробы пациентов в соответствии с данными
(скрининг, титрование),
Не допускается высыхание носителей объекта во время
обработки
1. Нагреть используемые реактивы до комнатной температуры (20 25°C),
носители
объекта
распаковать
и
маркировать
непосредственно перед проведением анализа.
2. Пипетировать
по 1 - 2 капли (30 - 50 мкл) контрольных проб (P, N),
по 30 - 50 мкл разведенной сыворотки пациентов
на предусмотренное место нанесения. При этом полностью
покрыть место нанесения, не прикасаться наконечником пипетки.
3. Инкубировать носители объекта во влажной камере в течение 30
минут при комнатной температуре.
4. Промыть носитель объекта промывочным буфером, при этом не
направлять струю непосредственно на место нанесения. Во
избежание перекрёстной реакции, стекающая жидкость не должна
течь по другим местам нанесения, поэтому в случае двухрядных
носителей объекта промывать от центра в обе стороны.
5. 2 x 5 мин промыть свежим PBS раствором в красильной ванне, в
начале и перед сменой слегка покачать ванну.
6. Достать слайды - носители объекта по одному, хорошо стряхнуть
остатки раствора, осторожно просушить края носителя объекта
шаблоном из впитывающей бумаги (F), добавить 1 - 2 капли (3050 мкл) конъюгата (D) на каждое место нанесения, при этом
полностью покрыть место нанесения.
7. Инкубировать носители объекта во влажной камере при
комнатной температуре в течение 30 минут. При этом защищать
от попадания прямого света.
8. Промыть носители объекта промывалкой
буфером (из B), как описано в п. 4.
с
промывочным
9. 2 x 5 мин промыть свежим PBS раствором в красильной ванне, в
начале и перед сменой слегка покачать ванну.
10. Достать носители объекта по одному, промыть из промывалки
раствором PBS (см. 4.), хорошо стряхнуть остатки раствора,
остатки осторожно удалить шаблоном из впитывающей бумаги
(F), на каждый носитель объекта добавить 2 - 4 капли покрывного
средства (E). Осторожно установить на носитель объекта
покрывное стекло (G) таким образом, чтобы покрывное средство
образовало закрытый слой без пузырей. Смыть избыточное
покрывное средство с края носителя объекта.
11. Считать
носители объекта при помощи флуоресцентного
микроскопа. При этом не рассматривать поле зрения слишком
долго, чтобы избежать выцветания флуоресценции.
Хранение слайдов - носителей объекта
Если немедленное считывание носителей объекта невозможно,
разрешается их хранение в течение несколько дней при
температуре 2-8°C. Для длительной консервации запечатать края
покрывного стекла лаком для ногтей, хранить носители объекта
при температуре –20°C.
Страница 2/4
СЧИТЫВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
БАЗОВЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Интенсивность флюоресценции
По рекомендации CDC, Атланта, США, интенсивность
флюоресценции может быть градуирована следующим образом:
4+ = максимальная флюоресценция, блестящий желто-зеленый
3+ = менее блестящая желто-зеленая флюоресценция
2+ = однозначная, но матовая желто-зеленая флюоресценция
1+ = крайне слабая подавленная флюоресценция
Интенсивность флюоресценции не отображает концентрацию
антител и не имеет клинического значения. Различия в оптике,
фильтрах и источниках света различных микроскопов могут
вызвать различную интенсивностью флюоресценции на более чем
одну ступень.
Отрицательный результат
Разбавленная проба оценивается отрицательно на SkMA, если
интенсивность флюоресценции менее 1+ или отсутствует
характерное окрашивание поперечных волокон скелетной
мускулатуры. В результате контрастного окрашивания Эванс
синего ткань может приобрести красно-оранжевый цвет.
Положительный результат
Разбавленная проба на SkMA считается положительной при
окрашивании поперечных волокон скелетной мускулатуры с
интенсивностью 1+ или более.
Титрование
При полуколичественном титровании в качестве результата
указывается степень разбавления, при которой в последний раз
считывается флюоресценция степени 1+. Титром будет обратное
значение к данной степени разбавления.
При рекомендованной четырехкратной степени разведения
конечная точка титрования может быть экстраполирована:
1:40
1:160
1:640
1:2560
=
=
=
=
3+
2+
+/-
экстраполированный титр равен 320.
Валидация теста
Положительный и отрицательный контроль из набора должен
использоваться при проведении каждого анализа. Содержащиеся
в наборе контрольные пробы могут показать следующие
результаты:
Отрицательный контроль: Флюоресценция менее 1+, краснооранжевое окрашивание ткани за счет контраста Эванс голубого.
Положительный контроль: Флюоресценция поперечных волокон
скелетной мускулатуры с интенсивностью от 3+ до 4+.
Указание титра на положительном контроле позволяет проверить
интенсивность теста, реактивность примененных реактивов, а
также качество микроскопа. Указанный на этикетке титр должен
воспроизводиться в пределах разницы +/- одной ступени титра.
Если контрольные пробы не показывают ожидаемых результатов,
результаты анализа недействительны и анализ должен быть
повторен. Убедитесь в том, что отработка анализа проводится
строго в соответствии с рабочей инструкцией (правильная
подготовка реактивов, время и температура инкубации,
тщательная промывка). Если критерии действительности не
выполняются и при повторном проведении теста, свяжитесь с
производителем.
Для
поиска
ошибок
воспользуйтесь
информационным листком.
MP-AL-R-3936,3937-v001-2014-04-01.doc
Титр
SkMA
отрицательно
< 40
положительно
≥ 40
Ввиду различий в популяции каждой лаборатории рекомендуется
определить собственные патологические и нормальные базовые
значения для SkMA. Поэтому указанные значения имеют
рекомендательный характер.
Пределы метода
В зависимости от картины болезни антитела к волокнам
поперечно-полосатой мускулатуры встречаются в различном
процентном соотношении:
Пациенты
все пациенты с миастенией
миастения с тимомой
миастения без тимомы
тимома без миастении
частота SkMA %
40
90-100
30
25
Отсутствие SkMA практически исключает тимому.
У здоровых людей может иметь место малый уровень SkMA
примерно до 1:30. Поэтому положительным титром SkMA
считается титр начиная с 40.
Антитела к другим составляющим среза ткани могут вызвать
соответствующий рисунок флюоресценции (например, клеточные
ядра, митохондрии, гладкая мускулатура). Данный рисунок
флюоресценции оценивается как отрицательный на SkMA, однако
свидетельствует о наличии других аутоиммунных заболеваний.
Соответствующие заключения требуют подтверждения на
базовых субстратах (клетки HEp-2, почка крысы и т.д).
Определение конечной точки титрования зависит от типа и
свойств флуоресцентного микроскопа, от увеличения объектива,
а также субъективной оценки наблюдающего.
Пробы и растворы промывочного буфера, загрязненные
бактериями, могут привести к неспецифической окраске ткани.
Протеолитические энзимы в пробах могут привести
повреждению либо ликвидации клеточного субстрата.
к
Клиническая диагностика не должна основываться на результатах
только одного диагностического метода. При постановке диагноза
врач должен использовать все возможные клинические и
лабораторные исследования.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА
Перекрестная реактивность
Сведения о перекрестной реактивности других антител
специфической структурой антигена отсутствуют.
со
Точность и воспроизводимость
В данном иммунофлюоресцентном анализе интенсивность
флуоресценции контрольных проб в пределах одной партии, а
также при сравнении различных партий одинакова.
Страница 3/4
SkMA IFA (3936,3937)
СХЕМА АНАЛИЗА
Разбавить пробы сыворотки пациентов в соответствии с заданием:
Разбавление для скрининга / разбавление для титрования раствором PBS (из C)
1
Согреть до комнатной температуры носители объекта и используемые реактивы теста
Контрольные пробы
2
Пипетирование
Контроль P, N
Пробы пациентов
1 - 2 капли (30 - 50 мкл)
предварительно
разбавленная
сыворотка
30 - 50 мкл
3
Инкубирование
30 минут, комнатная температура (20 - 25°C)
4
Ополоснуть PBS раствором (из С)
5
Промывка
6
Пипетирование конъюгата (D)
7
Инкубирование
8
Ополоснуть PBS раствором (из С)
9
Промывка
10
Покрыть; 3-4 капли покрывного средства (E) на каждый носитель объекта, осторожно установить
покрывное стекло (G)
11
Считать под флуоресцентным микроскопом
2 x 5 минут в свежем PBS растворе (из С)
1 - 2 капли (30-50 мкл)
1 - 2 капли (30-50 мкл)
30 минут, комнатная температура (20 - 25 °C)
2 x 5 минут в свежем PBS растворе (из С)
ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
•
Набор для тестирования предназначается исключительно для исследований методами in vitro и должен использоваться
квалифицированным лабораторным персоналом. Строго соблюдать рабочую инструкцию.
•
Использовать набор для тестирования и открытые реактивы строго в пределах указанных сроков хранения.
•
Не использовать в тесте носители объекта с перфорированной упаковкой.
•
Смешивание компонентов наборов для теста различных партий, а также использование реактивов других производителей может привести к
искажению результатов.
•
Некоторые реактивы содержат небольшое количество азида натрия (< 0,1%) в качестве консерванта. Не проглатывать
реактивы, избегать их попадания на слизистые.
•
Рекомендуемая температура хранения открытых реактивов до следующего использования составляет 2 - 8 °C.
•
Все реактивы данного набора для тестирования человеческого происхождения проверены на отсутствие HBsAg (Hepatitis B surface Antigen),
антител к ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) и вирусу гепатита С (Hepatitis C Virus). Тем не менее, присутствие данных инфекционных
возбудителей не может быть полностью исключено никаким из тестов. Обращаться с реактивами как с потенциально инфицированным
материалом.
•
При использовании компонентов набора для тестирования, а также проб пациента и контрольных проб, соблюдать меры
предосторожности при обращении с потенциально инфицированным материалом и опасными химикатами. В частности, соблюдать
следующие правила:
Не принимать пищу, не пить, не курить!
Не пипетировать ртом!
Во избежание контакта с реактивами и сывороткой использовать перчатки!
Соблюдать меры безопасности по каждому из компонентов!
Рекомендуем проводить собственный контроль качества посредством лабораторных контрольных проб сыворотки (см. тж. Порядок градуировки,
Федеральный бюллетень I, с. 1657, 1988, а также директивы Федеральной палаты врачей для обеспечения качества количественных
лабораторно-медицинских исследований, Немецкий медицинский вестник 98, номер 42, S. A2747-59, 2001).
•
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
Vincent A, Newson-Davis J: Anti-acetylcholine receptor antibodies. J Neorol Neurosurg Psych 1980, 43, 590-600
Peers J, McDonald BL, Dawkins RL: The reactivity of the antistriational antibodies associated with thymoma and myasthenia gravis. Clin
Exp Immunol 1977, 27, 66
Pachner AR, Kantor FS: The relation of clinical disease to antibody titer, proliferative response and neurophysiology in murine experimental
autoimmune myasthenia gravis. Clin Exp Immunol 1983, 51, 543.
Nicholson GA, McClod JG, Griffiths LR: Comparison of Diagnostic Tests in Myasthenia Gravis. Clin Exp Neurol 1982, 19, 45.
Lyerla HC, Forrester FT: The Immunofluorescence (IF) test. In: Immunofluorescence methods in virology, USDHHS, Georgia, 1979, 71-81
MP-AL-R-3936,3937-v001-2014-04-01.doc
Seite 4/4