влияние факторов внутреннего пути свертывания на
advertisement
На правах рукописи ТИКУНОВ Андрей Петрович Роль анионного канала в транспорте супероксида из митохондрий в условиях кальциевого стресса. 03.01.02- биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Егорова Марина Олеговна доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич Bедущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Защита диссертации состоится « на заседании Диссертационного » 2010 года совета Д.001.042.02. в при часов Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан « » 2010 года Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова 2 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Митохондрия, кроме роли энергетической станции, выполняет роль спускового механизма, запускающего процессы некроза и апоптоза клетки. В нормальном состоянии митохондрия уравновешивает стрессовые воздействия разнообразными защитными механизмами. При превышении суммой стрессовых воздействий некоего порогового значения митохондрия начинает процесс митоптоза, в некоторых условиях приводящий к лавинообразному массовому самоуничтожению митохондрий и апоптозу. Основным событием, определяющим митоптоз, является формирование повышенной проницаемости, начинающееся с окисления тиоловых групп аденин-нуклеотид транслоказы. Одним из главных стресс-факторов и важнейшим сигнальным агентом является супероксид-анион, вырабатываемый дыхательной цепью митохондрии. Супероксид - не только вредоносный побочный продукт переноса электронов, но и необходимый медиатор процессов, происходящих в митохондрии и клетке. Многоуровневая антиоксидантная защита митохондрии включает в себя механизмы переработки O2•− в менее опасные активные формы кислорода, а также механизмы перераспределения супероксида между митохондрией и цитозолем. Многочисленные исследования (Han, Williams et al. 2001; Madesh and Hajnoczky 2001; Han, Antunes et al. 2003) показывают, что основной канал внешней митохондриальной мембраны – митохондриальный порин (потенциал-зависимый анионный канал) является не только переносчиком метаболитов, но и путем вывода супероксид-радикала из межмембранного пространства в цитозоль. Изменяя проводимость анионного канала клетка может регулировать поток супероксида, выходящего из митохондрии и уровень супероксида внутри нее. Многие стрессовые воздействия, например, гипер- и гипоксия, воздействие этанола, влияют на баланс супероксида и приводят к окислительному стрессу и повреждению ДНК. В то же время, грубое стимулирование антиоксидантных механизмов так же опасно и может приводить к возникновению злокачественных опухолей и дефектам развития. Таким образом, уровень и распредение потоков 3 4 активных форм кислорода является важнейшим регуляторным механизмом определяющим жизнь и смерть клетки. В настоящей работе изучено влияние ингибирования потенциал-зависимого анионного канала на уровень супероксида в изолированных митохондриях. В качестве модельной системы для определения последствий ингибирования анионного канала использовали Са2+-индуцированное набухание митохондрий в присутствии фосфата и дыхательного субстрата (сукцината). На основе анализа данных литературы сформулирована следующая гипотеза: ингибирование анионного канала усиливает чувствительность митохондрии к стрессовым воздействиям за счет затруднения оттока супероксида из межмембранного пространства в цитозоль; в результате этого нарастает внутренний окислительный стресс митохондрии и ускоряется возникновение поры повышенной проницаемости. Цель работы: Показать, что ингибирование потенциал-зависимого анионного канала уменьшает проницаемость внешней митохондриальной мембраны, что в свою очередь затрудняет отток супероксида из митохондрии, вызывает окислительный стресс и ускоряет начало Са2+-зависимого набухания. Задачи исследования: 1. Показать, что ингибитор потенциал-зависимого анионного канала (G3139) снижает проницаемость внешней митохондриальной мембраны для водорастворимых молекул. 2. Показать, что ингибитор потенциал-зависимого анионного канала (G3139) ускоряет начало Са2+-зависимого набухания митохондрий. 3. Показать, что антиоксиданты частично компенсируют действие ингибитора G3139 на Са2+-зависимое набухание митохондрий. 4. Измерить скорость накопления супероксида внутри митохондрий и показать, что она зависит от проницаемости внешней митохондриальной мембраны. Научная новизна. Предложен новый способ представления кинетики кальцийиндуцированного набухания митохондрий в виде кривых зависимости времени полуперехода от концентрации кальция, который позволяет наглядно отображать 4 5 изменения кинетики и значительно облегчает анализ экспериментальных данных. Впервые, используя продемонстрировано выделенные уменьшение митохондрии проницаемости печени внешней крысы, прямо митохондриальной мембраны для небольших водорастворимых молекул после обработки ингибитором анионного канала G3139. Экспериментально показано увеличение под действием G3139 чувствительности митохондрий к кальцию в процессе кальций-индуцированного набухания. Этот эффект компенсируется обработкой митохондрий антиоксидантом. Адаптирован для использования на митохондриях метод измерения скорости накопления супероксида при помощи мембран-проницаемого флуоресцентного красителя дигидроэтидина. Показано значительное увеличение скорости накопления супероксид-радикала в митохондриях при ингибировании потенциал-зависимого анионного канала. При этом добавленная снаружи супероксиддисмутаза не изменяла скорости накопления O2•−, что подтверждает, что супероксид-радикал накапливается не в цитозоле, а внутри митохондрий. Научно-практическое значение. Выдвинутая гипотеза, в пользу которой свидетельствуют полученные в процессе работы данные, предполагает существование митоптоза регуляторного механизма, медиатором которого является супероксидрадикал, а одним из главных регуляторов – потенциал-зависимый анионный канал. Таким образом углубляется понимание механизмов инициации апоптоза и повреждения тканей в условиях патологии. Разработанные в данной работе экспериментальные методы измерения проницаемости митохондриальной мембраны и скорости накопления супероксида внутри митохондрий могут применяться в последующих исследованиях митохондриальных функций. Положения, выносимые на защиту: 1. Ингибитор потенциал-зависимого проводимость внешней анионного митохондриальной канала G3139 уменьшает для небольших мембраны водорастворимых молекул (кальцеина). 2. Обработка митохондрий ингибитором анионного канала G3139 ускоряет начало набухания, вызванное кальцием, причем добавлением антиоксиданта. 5 этот эффект компенсируется 6 3. Реакция окисления дигидроэтидина супероксидом происходит преимущественно внутри митохондрии (в матриксе и межмембранном пространстве). 4. В митохондриях, обработанных ингибитором G3139, значительно увеличивается скорость накопления супероксида, причем этот эффект компенсируется обработкой пороформирующим реагентом дигитонином. Апробация работы состоялась 09 ноября 2009 г. на заседании проблемной комиссии ―Биохимия, биофизика и реология крови‖ в Гематологическом Научном Центре РАМН. Материалы диссертации докладывались на конференции 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society and 16th IUPAB International Biophysics Congress, Long Beach, CA, USA, 2-6 Feb 2008 Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборнике трудов конференции и 2 статьи в рецензируемых журналах. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 194 источника. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.). 6 7 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Все экспериментальные протоколы с участием животных были одобрены этическим комитетом по институциональному использованию животных (Institutional Animal Care and Use of Laboratory Animals, IACUC), в соответствии с рекомендациями опубликованными в «руководстве по использованию лабораторных животных» (National Academic Press, Washington DC, 1996). Реагенты и материалы. Ингибитор анионного канала G3139 был любезно предоставлен доктором R. Brown из компании Genta, inc (Berkeley Heights, NJ, USA). В случаях, когда не указано обратное, все химикаты, использовавшиеся в этом исследовании, были приобретены в фирме Sigma (St. Louis, MO, USA). Получение митохондрий печени крысы. Крысу содержали ночь перед экспериментом без еды, потребление воды не ограничивали. Крысу обезглавливали, немедленно извлекали печень. Все последующие процедуры проводили на льду используя охлажденную посуду, инструменты и растворы. Печень два раза промывали в буфере А (0,25 М сахарозы, 2 мМ K HEPES, 0,5 мМ EGTA, pH 7.4), и измельчали ножницами на куски размером 0,5-1 см в 40 мл буфера А. Печень гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса, после чего полученная суспензия переносилась в центрифужные пробирки. Гомогенат центрифугировали при ускорении 660 g в течение 15 мин. Затем 20 мл супернатанта (примерно две трети всего объѐма) переносили в чистые центрифужные пробирки. Митохондрии осаждали при ускорении 9700 g в течение 10 мин, супернатант удаляли, после чего осадок ресуспендировался в буфере Б (0,25 М сахарозы, 2 мМ K HEPES, pH 7.4). Процедура отмывки повторялась ещѐ два раза. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл буфера Б, определяли концентрацию белка, которая затем доводилась добавлением буфера Б до значения 50 мг/мл. Полученные митохондрии хранили на льду до использования (не более 8 ч). 7 8 Концентрация белка определялась методом Смита (Smith assay) при помощи набора Bicinchonic Acid Protein Assay kit (BSA, Sigma, St. Louis, MO, USA), используя бычий сыворочный альбумин в концентрации 2 мг/мл как стандарт. Измерение кальций-индуцированного набухания митохондрий. Выделенные митохондрии печени крысы разводились до концентрации 1 мг/мл в митохондриальном инкубационном буфере (МИБ: 0,2 мМ сахарозы, 20 мМ Tris/Hepes, 5 мМ сукцинат, 1 мМ KH2PO4, 20 мкМ EGTA, 2 мкМ ротенон, 1 мкг/мл олигомицин, pH=7.4). Ингибиторы ротенон и олигомицин были добавлены в МИБ для обеспечения максимального потенциала на внутренней митохондриальной мембране: ротенон блокирует обратный ток электронов с комплекса II на комплекс I электрон транспортной цепи, олигомицин блокирует работу АТФ-синтазы. Митохондрии преинкубировались в течение 5 мин при комнатной температуре в отсутствии или присутствии модификаторов. В качестве модификаторов использовались по отдельности или в комбинации (указано в подписях к рисункам): ингибитор анионного канала G3139 в конечной концентрации 5 мкМ, антиоксидант ионол (бутилгидрокситолуол, БГТ) в конечной концентрации 20 мкМ. Затем суспензия митохондрий переносилась в 96-луночный прозрачный иммунологический планшет (200 мкл/лунку) где смешивалась с заранее добавленным раствором кальция до получения конечных концентраций добавленного Са2+ 0, 100, 150, 200, 250 и 300 мкМ. Общий объем смеси в ячейке был равен 200-206 мкл. Планшет помещался в планшетный ридер FLUOStar (BMG Labtech, Durham, NC, USA) и записывалась кинетика изменения оптической плотности митохондриальной суспензии на длине волны 544 нм. Измерение уровня супероксид-радикала в митохондриях. Суспензия выделенных митохондрий печени крысы разводилась в МИБ до конечной концентрации белка 1 мг/мл и преинкубировалась в присутствии или отсутствии модификаторов в течение 4 мин при комнатной температуре. Затем к инкубационной суспензии добавлялся мембранопроницаемый, флуоресцентный, специфичный к супероксиду краситель дигидроэтидин (ДГИ) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) до конечной концентрации 2 мкМ. После перемешивания суспензия выдерживалась 1 мин 8 9 и переносилась в 96-луночный белый иммунологический планшет, в лунках которого уже находился раствор антимицина А, дающий конечную концентрацию 1 мкг/мл. Ингибитор комплекса III электрон транспортной цепи митохондрии антимицин А был добавлен для стимуляции производства супероксида. Уровень супероксид-радикала оценивается по интенсивности флуоресценции продуктов окисления дигидроэтидина при возбуждения 485 нм и испускания 590 нм, используя 96-луночный белый иммунологический планшет и многоканальный флюориметрический ридер FLUOStar (BMG Labtech, Durham, NC, USA). Таким образом, количество супероксид-радикала измеряется и представляется в виде условных (относительных) флуоресцентных единиц (УФЕ), а скорость производства O2•− определяется как УФЕ/мин. Определение проницаемости внешней митохондриальной мембраны методом фильтрации митохондрий через силиконовое масло. Выделенные митохондрии печени крысы разводились в МИБ до конечной концентрации 1 мг/мл и преинкубировались в присутствии или отсутствии модификаторов в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации митохондриальная суспензия в объеме 500 мкл переносилась в 1,5 мл пробирку (Eppendorf), и аккуратно наносилась поверх 100 мкл силиконового масла. Требуемая плотность силиконового масла 1,03 г/мл достигалась смешиванием равных объемов коммерчески доступных видов масла плотностью 1,01 г/мл (Sigma, №10836) и 1,05 г/мл (Sigma, №175633). Затем к митохондриальной суспензии добавлялся флуоресцентный водорастворимый краситель кальцеин (флуорексон) в конечной концентрации 40 мкМ, после чего содержимое пробирки перемешивалось (используя "вортекс") и незамедлительно разделялось, при помощи высокоскоростного центрифугирования (14 100 g, в течение 60 сек). За время перемешивания молекулы водорастворимого красителя проникают в межмембранное пространство митохондрий. Центрифугирование через силиконовое масло позволяет быстро отделить митохондрии, содержащие кальцеин в межмембранном пространстве от инкубационного буфера слоем масла. После центрифугирования верхняя водная фракция, состоящая из инкубационного буфера с растворенным в нем кальцеином, удалялась с помощью вакуумного отсоса. Для того, чтобы убрать остатки буфера с красителем со стенок, 9 10 пробирка аккуратно ополаскивалась водой три раза. Слой масла, прикрывающий митохондриальный осадок, при этом оставался неповрежденным. После ополаскивания слой масла аккуратно удалялся и митохондриальный осадок растворялся в 500 мкл 0.1 % Triton X100, при помощи обработки ультразвуком в течение 30 сек и перемешивания с помощью "вортекс". Оставшееся силиконовое масло удалялось при помощи высокоскоростного центрифугирования (14 100 g, 60 сек). Концентрация кальцеина в митохондриях определялась по флуоресценции супернатанта в 96-луночном белом иммунологическом планшете на многоканальном планшетном флюориметрическом ридере FLUOStar (BMG Labtech, Durham, NC, USA) при возбуждения 495 нм и испускания 520 нм. Измерение набухания митохондрий при пониженной температуре. Для исследования кинетики разбухания митохондрий и определения высвобождения цитохрома С при пониженной температуре, сконструирована термостатированная камера, в которой при помощи теплообменников и циркуляции охлажденной воды поддерживалась постоянная +10оС. температура Все растворы, посуда и иммунологический планшет были охлаждены до +10оС. Суспензия митохондрий в МИБ (1 мг/мл) преинкубировалась в присутствии или отсутствии ингибитора анионного канала G3139 (5 мкМ) в течение 5 мин при температуре +10оС. Затем митохондриальная суспензия переносилась в охлажденный 96 луночный прозрачный иммунологический планшет по 200 мкл/лунку, некоторые лунки которого содержали раствор кальция, дающий конечную концентрацию 200 мкМ. Планшет помещался на 40 сек в многоканальный спектрофотометрический ридер, производилось измерение оптической плотности суспензии, соответствующей точке 0 на временной шкале, после чего планшет возвращался в термостатированную камеру. Таким образом, большую часть времени митохондрии находились при температуре +10оС. Каждые 30 мин планшет извлекался из термостата и помещался в многоканальный ридер для замера оптической плотности суспензии. Для определения высвобождения цитохрома С из митохондрий производился отбор суспензии в начале эксперимента, через 3,5 ч и 24 ч. Из отобранной суспензии 10 11 удалялись митохондрии путем центифугирования (14 100 g, 60 с). Присутствие цитохрома С в супернатанте определялось методом вестерн блот (western blot). Вестерн блот анализ выхода цитохрома С из митохондрий. Проводили SDS-электрофорез супернатанта митохондрий (по 50 мкг общего белка на дорожку) в коммерчески произведенном полиакриламидном геле NuPAGE® Novex 412% Gel (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Полученные при разделении полосы белков переносили на дифтор-поливинилиденовую мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) в камере Bio-Rad Mini (Hercules, CA, USA) в течение 2 часов. Мембрана блокировалась 5% блокирующим буфером (5% сухого молока в TBS с 0.1% tween-20) 2 ч при комнатной температуре и инкубировалась с первичными антителами к цитохрому C (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) в разведении 1:1000 в течение ночи при температуре +4оС. Затем мембрана обрабатывалась вторичными антикроличьими антителами, меченными пероксидазой хрена, в концентрации 1:10 000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Анализ иммуноблота был осуществлен при помощи набора ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) в соответствии с инструкцией производителя: смешать растворы А и Б в пропорции 40:1, добавить 2 мл на лицевую сторону мембраны, выдержать 5 мин, обернуть пищевой пленкой. Фотопленка экспонировалась в течение 5 мин, проявлялась и затем сканировалась на планшетном сканере. Статистическая обработка данных. Разница между группами была проанализирована при помощи двустороннего ANOVA теста, используя p<0,05 в качестве критерия значимости. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение (M±SD). РЕЗУЛЬТАТЫ Кальций-индуцированное изменение проницаемости митохондрии. Явление изменения проницаемости митохондрии (ИПМ) заключается в резком увеличении проницаемости внутренней мембраны митохондрии для молекул менее 1,5 кДа. Это происходит вследствие формирования поры повышенной проницаемости (ППП) – белкового комплекса, образующегося в местах контакта внутренней и 11 12 внешней митохондриальной мембраны. Образование ППП приводит к разбуханию митохондрии, разрыву ее внешней мембраны и расправлению внутренней мембраны. В экспериментах с использованием выделенных митохондрий формирование поры повышенной проницаемости как правило определяют по резкому уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии на длине волны 540 нм. Характерный вид зависимости оптической плотности митохондриальной суспензии от времени, после добавления 150 мкМ Ca2+ представлен на рис. 1. Окружностями показана экспериментально измеренная оптическая плотности митондриальной суспензии, непрерывной линией представлена аппроксимация экспериментальных данных сигмоидной кривой. 0.8 Top а 0.6 T1/2 Оптическая плотность, OD Ca2+ 0.4 б Bottom 0.2 0 10 20 Время, мин 30 40 Рис. 1 Изменение оптической плотности митохондриальной суспензии при набухании митохондрий, вызванном добавлением ионов Ca2+. Митохондрии ресуспендированы в концентрации 1 мг/мл в митохондриальном инкубационном буфере. После добавления 150 мкМ кальция (показано стрелкой) производилось непрерывное считывание оптической плотности. Окружностями показаны экспериментальные значения оптической плотности, сплошной линией – аппроксимация экспериментальных значений сигмоидной функцией (R2=0,9974). Пунктирные линии: начальный (Top) и конечный (Bottom) уровни оптической плотности суспензии, уровень, соответствующий половине максимального изменения оптической плотности, и момент времени, когда оптическая плотность достигает этого среднего уровня – время полуперехода(T1/2). Мы можем разбить процесс перехода митохондрий из нормального состояния в разбухшее на три стадии: 1) постепенное набухание митохондрий в течение приблизительно 15 мин, характеризующееся уменьшением оптической плотности суспензии примерно на 100 мОD (рис.1, от момента добавления кальция до точки «а»), 2) резкий переход митохондрий в набухшее состояние, выраженный в скачкообразном изменении оптической плотности примерно на 330 мОD за 10 мин (рис. 1, между 12 13 точками «а» и «б»), 3) незначительное изменение оптической плотности суспензии (~на 30 мОD) после окончания процесса набухания (рис.1, после точки «б» до окончания эксперимента). Экспериментально полученная зависимость оптической плотности митохондриальной суспензии от времени аппроксимируется сигмоидной функцией вида: Y = Bottom+ (Top - Bottom) 1+10(T1/ 2 - X)×HillSlope где: Y – оптическая плотность суспензии, X – время после добавления Ca2+, Bottom – значение Y на нижнем плато, Top – значение Y на верхнем плато, T1/2 – значение X при котором значение функции преодолевает половину пути между Top и Bottom, будем называть эту величину временем полуперехода, HillSlope – tg угла наклона кривой в точке T1/2 или коэффициент Хилла (Hill), определяющий максимальную скорость перехода с верхнего плато на нижнее. Таким образом, можно заключить, что зависимость оптической плотности среды от времени в процессе кальций-индуцированного набухания митохондрий описывается сигмоидной кривой и представляет собой скачкообразный переход из нормального состояния (с высокой оптической плотностью) в набухшее состояние. Зависимость проницаемости от концентрации кальция. Рассмотрим, как влияет изменение концентрации кальция на изменения оптической плотности в процессе кальций-индуцированного набухания митохондрий. Так как кальций является активатором процесса набухания митохондрий (Chappell, Crofts 1965; Grijalba, Vercesi et al. 1999; Gunter, Buntinas et al. 2000), увеличение концентрации кальция, в суспензии, ускоряет переход митохондрий из нормального состояния в набухшее. На рис.2 представлены зависимости оптической плотности суспензии от времени при активации ИПМ различными концентрациями кальция. 13 14 Оптическая плотность, OD Ca2+ 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 20 Время, мин 30 40 Рис. 2. Кинетика изменения оптической плотности митохондриальной суспензии после добавления различных концентраций кальция. Символами показаны измеренные в эксперименте величины оптической плотности: черные круги () – митохондрии, к которым не был добавлен кальций (контроль), ромбы () – в начальный момент времени добавлено 100 мкМ кальция, окружности () – добавлено 150 мкМ кальция, треугольники () – 200 мкМ кальция, квадраты () – 250 мкМ кальция, перевернутые треугольники () – 300 мкМ кальция. Сплошной линией показана аппроксимация экспериментальных значений сигмоидной функцией (R2>0,99). Кальций был добавлен к митохондриям в начальный момент времени. Как видно на рис. 2 в отсутствие кальция оптическая плотность митохондриальной суспензии изменяется незначительно от 750 мOD до 715 мОD, т.е. объѐм митохондрий за время проведения эксперимента (40 мин) почти не меняется. Добавление 100 приблизительно мкМ на 23 кальция запускает минуте, причем процесс набухание набухания практически митохондрий полностью заканчивается к концу эксперимента (рис. 2, ромбы). Увеличение концентрации кальция, добавленного в инкубационный буфер, на 50 мкМ (до 150 мкМ) сдвигает кривую зависимости оптической плотности среды от времени влево на 12 минут (рис. 2, белые круги). При последующем увеличении концентрации кальция переход митохондрий из нормального состояния в набухшее начинается ещѐ раньше, пропорционально концентрации кальция. Можно заметить, что все кривые берут начало примерно на одном уровне оптической плотности (740-810 мOD) и по окончании изменения проницаемости митохондрий оптическая плотность также находится примерно на одном уровне (290300 мOD). Скорость перехода суспензии (HillSlope) из состояния с высокой оптической плотностью в состояние с низкой оптической плотностью при разных концентрациях 14 15 кальция достоверно не изменяется. Сдвиг кривых изменения оптической плотности находит отражение в уменьшении времени полуперехода (T1/2). Таким образом, при добавлении к суспензии митохондрий различных концентраций кальция начальное и конечное значение оптической плотности, а также скорость перехода от одного значения к другому изменяются незначительно. Изменение сигмоидной функции, описывающей кальций-индуцированное набухание митохондрий при активации различными концентрациями кальция, наиболее адекватно отражается в изменении времени полуперехода. Представление результатов. Как показано выше, процесс кальций-индуцированного изменения проницаемости митохондрий описывается сигмоидной функцией. Изменение этой функции при изменении концентрации кальция, которым активировали ИПМ, отражается в изменении времени полуперехода. Таким образом, процесс кальцийиндуцированного изменения проницаемости митохондрий можно представить в виде зависимости времени полуперехода митохондрий из нормального состояния в Время полуперехода, мин набухшее от концентрации кальция, вызвавшего это набухание (рис.3). 30 20 10 0 100 150 200 250 300 2+ Ca , мкM Рис. 3. Зависимость времени полуперехода митохондрий из нормального состояния в разбухшее от концентрации добавленного в среду кальция. Окружностями показаны средние экспериментальных значений (n=18) времени полуперехода (Т1/2) полученные в качестве параметра сигмоидной аппроксимационной кривой (см. рис. 2) в присутствии различных концентраций кальция. Сплошной линией показана аппроксимация экспоненциальной функцией. Описанное выше представление результатов позволяет привести данные в удобном для анализа виде и перейти от рассмотрения пяти кривых к работе с одной 15 16 кривой, содержащей информацию о процессе изменения проницаемости митохондрий в широком диапазоне концентраций кальция. Ингибитор анионного канала G3139. Для изучения роли потенциал-зависимого анионного канала в регулировании процесса кальций-индуцированного изменения проницаемости митохондрий в работе использовался олигонуклеотид фосфоротиоат G3139. Этот ингибитор анионного канала соответствует первым шести кодонам открытой рамки считывания гена bcl-2 и характеризуется последовательностью 5’–TCTCCCAGCGTGCGCCAT – 3’ (Benimetskaya, Miller et al. 2001). С помощью электронной микроскопии мы показали, что обработка митохондрий ингибитором анионного канала не вызывает видимых изменений в морфологии митохондрий (рис.4). А Рис. 4. Электронная микрофотография Б контрольных и митохондрий обработанных ингибитором потенциал-зависимого анионного канала G3139 (Б) после 5 мин инкубации при комнатной температуре в стандартных условиях. Фотографии получены благодаря содействию Hal Mekeel (Cell and Developmental Biology, UNC). Изменение проницаемости внешней митохондриальной мембраны при обработке митохондрий ингибитором G3139. Способность G3139 уменьшать проницаемость потенциал-зависимого анионного канала митохондрии была непосредственно измерена только на бислойной липидной мембране со встроенным в неѐ анионным каналом, выделенным из митохондрий печени крысы (Tan, Loke et al. 2007). Кроме того, вывод об уменьшении проницаемости внешней митохондриальной мембраны для АДФ после обработки митохондрий G3139 16 17 был сделан на основе измерения митохондриального дыхания в состояниях III и IV (Tan, Lai et al. 2007). Прямого измерения влияния ингибитора G3139 на проницаемость внешней мембраны неповрежденных выделенных митохондрии проведено не было. В данной работе для прямого измерения эффекта G3139 внешней мембраны выделенных митохондрий печени на проницаемость крысы использовался флуоресцентный краситель кальцеин, способный проникать в митохондрию только через потенциал - зависимый анионный канал. Для отделения митохондрий, нагруженных красителем, от супернатанта, также содержащего кальцеин, использовался метод фильтрования митохондрий через силиконовое масло (Werkheiser and Bartley 1957). Митохондриальная суспензия наносится поверх силиконового масла с плотностью 1,03 г/мл, затем в митохондриальную суспензию добавляется водорастворимая флуоресцентная краска (кальцеин, молярная масса 622,5 г/моль, поглощения/испускания 495/515 нм соответственно) и после быстрого перемешивания (5 сек) суспензия центрифугируется при ускорении 14 100 g в течение одной минуты. В процессе центифугирования митохондрии продавливались через силикон, оседая на дно пробирки, в то время как окружающий митохондрии буфер (и не вошедший в митохондрии флуоресцентный краситель) оставались над слоем силикона. Краситель, диффундировавший внутрь митохондрий через единственно-доступный анионный канал, оказался заперт внутри митохондрий. Время между добавлением красителя к митохондриальной суспензтии и отделением митохондрий от буфера с красителем было строго одинаково в пределах одного эксперимента и достаточно мало, чтобы не успело установиться равновесие митохондрии и в окружающем буфере. концентрации кальцеина внутри Таким образом, количество кальцеина успевшего проникнуть внутрь митохондрии определялось проницаемостью внешней митохондриальной мембраны. Буфер с красителем удалялся, пробирка тщательно промывалась, слой масла при этом оставался на дне защищая митохондриальный осадок. Затем силиконовое масло удалялось, а митохондриальный осадок растворялся в детергенте (детергент в использовавшейся концентрации не влияет на флуоресценцию кальцеина) и подвергался УЗ-гомогенизации. При этом краситель содержащийся в митохондриях 17 18 выходил в раствор. Липидная фракция удалялась повторным центрифугированием после чего измерялась флуоресценция красителя в супернатанте. Флуоресценция раствора линейно отражает концентрацию красителя. При обработке митохондрий ингибитором анионного канала ожидается уменьшение скорости диффузии красителя внутрь митохондрий и, как следствие, уменьшение флуоресценции супернатанта, полученного после процедуры фильтрования митохондрий через силиконовое масло. В нашей работе измерено изменение флуоресценции после обработки митохондрий ингибитором G3139 (5 мкМ) и частичная компенсация этого изменения при обработке митохондрий G3139 и детергентом дигитонином (DIG, 50 мкМ) (рис.5). Как известно, DIG специфически растворяюет холестерол внешней митохондриальной мембраны (Hoppel and Cooper 1968; Morton, Hoppel et al. 1968; Newman, Gordesky et al. 1968) и частично ускоряет 11.3 12 9.9 10 7.6 8 6 4 2 5. Уменьшение проницаемости 9 Ди г./ G 31 3 G ро л нт Ко Рис. 31 39 0 ь Флуоресценция (тыс.флуо.ед) поступление красителя в митохондрии через образующиеся неспецифические поры. внешней митохондриальной мембраны для флуоресцентного красителя кальцеина под действием ингибитора анионного канала. После обработки ингибитором G3139 флуоресценция кальцеина, успевающего проникнуть внутрь митохондрии, упала с 11,3 ± 0,3 до 7,6 ± 0.3 тыс. флуо. единиц (n=3, p<0.005). Действие дигитонина как формирующего поры агента частично компенсирует эффект ингибирования анионного канала и увеличивает флуоресценцию кальцеина до 9.9 ± 0.7 тыс. флуо. единиц (n=3, p<0.005). Как видно, преинкубация митохондрий с ингибитором потенциал-зависимого анионного канала уменьшает количество кальцеина, диффундировавшего внутрь митохондрии, на 33 ± 2 %. Можно сделать вывод об уменьшении проницаемости внешней митохондриальной мембраны. При этом закрывание анионного канала частично компенсируется обработкой митохондрий дигитонином, формирующим поры 18 19 во внешней митохондиальной мембране и, таким образом, создающим альтернативный проход для гидрофильных молекул. Влияние ингибирования потенциал-зависимого анионного канала на процесс Са2+-индуцированного изменения проницаемости митохондрий. Как показано выше, обработка митохондрий ингибитором анионного канала олигонуклеотидом G3139 уменьшает проницаемость внешней митохондриальной мембраны для небольших водорастворимых молекул. Какое влияние оказывает ингибирование потенциал-зависимого анионного канала на кальций-индуцированное именение проницаемости митохондрии? Характерные кривые изменения оптической плотности митохондиальной суспензии свидетельствуют о том, что проницаемость митохондрий резко отличается после добавления 200 мкМ кальция в присутствии и Оптическая плотность, мОD отсутствии ингибитора G3139 (рис.6). 850 Ca2+ 750 650 550 G3139 450 350 250 0 5 10 Время, мин 15 20 Рис. 6. Влияние ингибитора анионного канала на проницаемость митохондрий. Оптическая плотность суспензии контрольных митохондрий после добавления 200 мкМ кальция показана окружностями (), обработанных ингибитором анионного канала без добавления кальция – квадратами (), после добавления кальция (200 мкМ) – треугольниками () (n=4). Ингибитор кальцийстимулированного изменения проницаемости митохондрий циклоспорин А (1 мкМ) полностью подавляет переход из нормального состояния в набухшее у митохондрий обработанных G3139 в присутствии 200 мкМ кальция (перевернутые треугольники, ). Там где ошибка не указана, она находится в пределах символа, обозначающего экспериментальную точку. Как видно, ингибирование анионного канала митохондрий ускоряет начало кальций-индуцированного изменения проницаемости и несколько уменьшает конечное значение прозрачности. В то же время ингибирование анионного канала в отсутствие кальция не влияет на прозрачность митохондриальной суспензии. 19 20 Циклоспорин А ингибитор формирования поры повышенной проницаемости, способный связывать один из компонентов поры – циклофилин (Novgorodov, Gudz et al. 1991; Bernardi 1996), и блокировать образование ППП (Halestrap, Connern et al. 1997), отменяет изменение оптической плотности в митохондриях, обработанных G3139 в присутствии 200 мкМ кальция. Этот факт свидетельствует о том, что изменение оптической плотности обусловлено кальций-зависимым ИПМ. Показанное выше ускорение начала перехода митохондрий из нормального состояния в разбухшее после обработки их ингибитором анионного канала имеет место Время полуперехода, мин в широком диапазоне концентраций кальция 30 Контроль 20 10 0 G3139 100 150 200 250 300 Ca2+, мкM Рис. 7. Зависимость времени полуперехода митохондрий из нормального состояния в набухшее от концентрации кальция в нормальных митохондриях и в контрольных митохондриях обработанных ингибитором (G3139). Сплошные линии - аппроксимации экспериментальных значений (n=4) экспоненциальными функциями (R2=0,9940 и 0,9948 соответственно). Там где ошибка не указана – она находится в пределах символа, обозначающего экспериментальную точку. Предложенный нами ранее способ представления данных в виде кривых зависимости времени полуперехода (Т1/2) от концентрации кальция, позволяет наглядно показать изменение кинетики Са2+-индуцированного ИПМ под действием ингибитора G3139. После обработки митохондрий ингибитором G3139 (5 мкМ) кривая зависимости T1/2 смещается вниз; процесс ИПМ в условиях ингибирования происходит в среднем на 6.8 ± 1.4 мин (n=4, p<0,05) раньше, чем в контрольных митохондриях (рис.7). Влияние обработки митохондрий ингибитором G3139 на транспорт кальция. Показанное выше ускорение кальций-стимулированного изменения проницаемости митохондрий может быть обусловлено влиянием G3139 на транспорт кальция. Чтобы проверить такую возможность измеряли скорость митохондриального 20 21 дыхания в нормальных условиях (МИБ в присутствии ингибиторов ротенона и олигомицина, и сукцината в качестве субстрата) и после обработки митохондрий ингибитором анионного канала. Затем дыхание митохондрий (контрольных и обработанных G3139) стимулировалось добавлением 250 мкМ кальция. При этом скорость стимулированного дыхания определяется скоростью транспорта кальция в матрикс (Lehninger, Rossi et al. 1963; Vasington, Gazzotti et al. 1972). В том случае, если обработка митохондрий ингибитором анионного канала, вызывает ускорение транспорта кальция можно ожидать усиление кальций-стимулированного дыхания. Результаты экспериментов представлены на рис.8. Дыхание, нМ О2/мин/мг 60 40 20 0 Контроль Ca2+ G3139 Ca2+/G3139 Рис. 8. Скорость поглощения кислорода митохондриями в нормальных условиях и после стимулирования кальцием. Скорость дыхания митохондрий в нормальных условиях («Контроль») составляет 6,9 ± 0,1 нМ/мин/мг, митохондрий обработанных ингибитором анионного канала G3139 (5 мкМ) – 5,8 ± 0,4 нМ/мин/мг. Скорость стимулированного кальцием (250 мкМ) дыхания в контрольных митохондриях («Ca2+») равна 54,6 ± 1,7 нМ/мин/мг, в митохондриях, обработанных ингибитором («Ca2+/G3139») – 45,5 ± 0,7 нМ/мин/мг. Разница в скорости дыхания между контрольными митохондриями и обработанными ингибитором незначительна (P>0,05, n=4) как в нормальных условиях, так и при стимулировании кальцием. Стимулирование кальцием, увеличивает скорость дыхания примерно в 8 раз (p<0,001, n=4). Как видно, добавление кальция к митохондриальной суспензии увеличивает поглощение кислорода, как в контрольных митохондриях, так и в митохондриях, обработанных G3139. При этом обработка ингибитором анионного канала незначительно замедляет дыхание митохондрий, что согласуется с данными, о том, что G3139 может ингибировать работу дыхательной цепи митохондрии (Tan, Lai et al. 2007). Таким образом, предположение о том, что обработка митохондрий ингибитором потенциал-зависимого анионного канала G3139 21 ускоряет начало изменения 22 проницаемости митохондрий (ИПМ) за счет ускорения транспорта кальция в матрикс, не находит экспериментального подтверждения. Проверка предположения о том, что ингибитор G3139 может формировать канал во внешней мембране митохондрии независимо от формирования поры повышенной проницаемости митохондрии. Механизм взаимодействия ингибитора анионного канала G3139 с внешней мембраной митохондрии до сих пор остаѐтся предметом дискуссии. Побочные эффекты обработки митохондрий ингибитором также оставляют множество открытых вопросов. В одной из работ выполненных на митохондриях, выделенных из культивированных клеток человеческой меланомы 518А2 группой M. Colombini (Lai, Tan et al. 2006), было показано, что обработка митохондрий ингибитором G3139 увеличивает выход цитохрома С из митохондрии. Это наблюдение было интерпретировано в пользу гипотезы о том, что G3139 может формировать канал во внешней мембране митохондрии независимо от формирования поры повышенной проходимости. Однако в экспериментальных условиях, использующихся настоящей работе, не наблюдается набухания митохондрий, обработанных ингибитором G3139 (рис. 6, квадраты), к чему неминуемо приводило бы формирование неспецифического канала во внешней митохондриальной мембране. Чтобы проверить возможность формирования неспецифического канала во внешней мембране, достаточного для выхода цитохрома С из межмембранного пространства, был частично воспроизведен эксперимент группы M. Colombini (Lai, Tan et al. 2006). В отличие от оригинального эксперимента мы использовали митохондрии печени крысы (вместо митохондрий, выделенных из культивированных клеток человеческой меланомы 518A2) и митохондриальный инкубационный буфер с другим набором ингибиторов (рис. 9). 22 23 Оптическая плотность, ОD Ca2+ 0.9 0.8 0.7 0.6 150 мин 0.5 0.4 0.3 30 60 90 120 150 Время, мин Рис. 9. Изменение оптической плотности митохондриальной суспензии и выброс цитохрома с из митохондрий при температуре +10оС. Оптическая плотность суспензии контрольных митохондрий без добавления кальция показана квадратами (), после добавления 200 мкМ кальция – окружностями (). Митохондрии обработанные ингибитором анионного канала в отсутствие кальция практически не меняют оптическую плотность в течение эксперимента (ромбы, ), в то время как в присутствии кальция обработанные G3139 митохондрии раньше переходят из нормального состояния в набухшее (треугольники, ). Циклоспорин А полностью ингибирует кальций-стимулированное набухание митохондрий обработанных G3139 (перевернутые треугольники, ). В конце опыта (150 мин) цитохром С в окружающем буфере обнаруживается только в митохондриях, к которым добавлен кальций (в отсутствие циклоспорина А) - два нижних фрагмента вестерн блот. В отсутствие кальция выход цитохрома С из митохондрий не наблюдается. Митохондрии инкубировались с различными добавками (кальций, ингибитор G3139, циклоспорин А) при температуре +10оС; каждые 30 мин отбиралась порция для измерения оптической плотности суспензии. В конце эксперимента отбирались образцы для определения цитохрома С в растворе. Митохондрии осаждались центрифугированием. Как видно, охлаждение митохондриальной суспензии от 23оС до 10оС замедляет процесс кальций-индуцированного изменения проницаемости митохондрий примерно в 10 раз. При этом эффект ускорения ИПМ после обработки митохондрий ингибитором анионного канала усиливается: время полуперехода в контрольных митохондриях составляет 120 мин в митохондриях, обработанных G3139, 60 мин. При этом в обоих случаях по окончании набухания наблюдается выход цитохрома С из митохондрий в раствор (два нижних фрагмента вестерн блот). В контрольных митохондриях, в митохондриях, обработанных ингибитором анионного канала в отсутствие кальция и в митохондриях, обработанных G3139 в присутствии кальция и специфического ингибитора ИПМ циклоспорина А не происходит ни набухания митохондрий (что 23 24 согласуется с полученными ранее данными), ни выхода цитохрома С из митохондрий в раствор (три верхних фрагмента вестерн блот). Таким образом, гипотеза о том, что при обработке митохондрий ингибитором G3139 может формироваться канал во внешней мембране достаточно большой для выхода в раствор цитохрома С не находит подтверждения. Это можно утверждать для экспериментов, проведенных с использованием митохондрий печени крысы в условиях, принятых в данной работе. Зависимость проницаемости митохондрий от дозы G3139. В работах группы M. Colombini, выполненных на потенциал-зависимом анионном канале, встроенном в липидный бислой, было показано, что эффект ингибирования канала зависит от концентрации G3139 (Lai, Tan et al. 2006). Проводимость анионного канала уменьшается пропорционально концентрации ингибитора. Следовательно, влияние ингибитора G3139 на изменение проницаемости митохондрий также должно быть пропорционально концентрации ингибитора. Для проверки этого предположения измерено время полуперехода митохондрий из нормального состояния в разбухшее после предварительного инкубирования в присутствии 1, 2 и 5 мкМ ингибитора G3139. Изменение проницаемости митохондрий Б60 40 30 D T1/2, % А Время полуперехода, мин индуцировалось кальцием в концентрациях 100, 150, 200, 250 и 300 мкМ (рис.10). 20 40 20 10 0 100 150 200 250 300 2+ Ca , мкM 0 20 40 60 G3139, мкМ 80 Рис. 10. Влияние различных доз ингибитора анионного канала на кальций - индуцированное изменение проницаемости митохондрий. А – обработка митохондрий ингибитором при различных концентрациях кальция. Окружности () отражают время полуперехода в контрольных митохондриях; перевернутые треугольники () – в митохондриях, обработанных 1 мкМ G3139; ромбы () – 2 мкМ G3139, треугольники () – в митохондриях обработанных 5 мкМ ингибитора. Непрерывной линией показана аппроксимация значений экспоненциальной функцией (R2>0.996). Б обработка митохондрий в 24 25 широком диапазоне концентраций ингибитора G31339 при одной концентрации кальция (150 мкМ). Окружностями показаны экспериментально полученные значения, непрерывной линией – аппроксимация экспоненциальной функцией (R2=0.9816). Число измерений n=3. Как видно зависимость времени полуперехода от концентрации кальция носит экспоненциальный характер и мало изменяется при обработке митохондрий различными концентрациями ингибитора анионного канала. При постоянной концентрации кальция эффект ингибитора анионного пропорционально возрастает при небольших концентрациях G3139 и становится постоянным при концентрациях более 40 мкМ. Приведенные экспериментальные данные позволяют заключить, что обработка митохондрий ингибитором анионного канала G3139 уменьшает проницаемость внешней мембраны для небольших водорастворимых молекул. Ингибитор не нарушает целостность мембраны, увеличивает чувствительность митохондрий к кальцию, и таким образом ускоряет кальций-индуцированное набухание митохондрий. Компенсирующее влияние антиоксиданта на ингибирование проницаемости внешней мембраны митохондрий. Как установлено ранее увеличение количества активных форм кислорода (как в результате стимулирования их производства митохондрией, так и после добавления к митохондриальной суспензии) также ускоряет наступление кальций-индуцированного ИПМ (Halestrap, Woodfield et al. 1997; Nieminen, Byrne et al. 1997; Lemasters, Nieminen et al. 1998). Можно предположить, что при уменьшении проницаемости внешней митохондриальной мембраны в следствие затруднения оттока супероксид-радикала из межмембранного пространства митохондрия испытывает окислительный стресс. При этом ускоряется начало изменений проницаемости в митохондрии. Если это предположение верно, (бутилгидрокситолуена), то добавление способного водорастворимого проникать внутрь антиоксиданта митохондрии, должно компенсировать эффект ускорения ИПМ, вызванный ингибитором G3139. В наших экспериментах изучены зависимости времени полуперехода от концентрации кальция, после обработки митохондрий ингибитором анионного канала G3139, антиоксидантом бутилгидрокситолуеном и обоими реагентами (рис. 11). 25 Время полуперехода, мин 26 30 БГТ 20 10 G3139 0 100 150 200 250 300 Ca2+, мкM Рис. 11. Преинкубировние митохондрий с антиоксидантом бутилгидрокситолуеном компенсирует эффект ингибитора анионного канала. Сложение эффекта ингибитора G3139 (5 мкМ, треугольники, ) с эффектом антиоксиданта (20 мкМ, закрашенные квадраты, ) в сумме дают зависимость (показана квадратами, ) близкую к контрольным митохондриям (окружности, ). Символами показаны экспериментальные значения (n=3), линиями – аппроксимации экспоненциальными функциями. Как видно, обработка митохондрий ингибитором G3139 ускоряет ИПМ, в то время как в присутствии антиоксиданта БГТ происходит замедление ИПМ. Сложение эффектов ингибирования анионного канала и поглощения активных форм кислорода приводит к взаимной антиоксиданта можно компенсации двух эффектов. Изменяя концентрацию добиться полной компенсации эффекта ингибирования анионного канала внешней митохондриальной мембраны. Приведенные выше данные не могут служить доказательством того, что обработка митохондрий ингибитором анионного канала G3139 увеличивает окислительный стресс. Процессы уменьшения проницаемости канала и поглощения АФК могут влиять на кальций-индуцированное набухание митохондрий будучи вовлеченными в различные регуляторные механизмы. Логичным в этой ситуации является изучение эффекта ингибитора G3139 на уровень супероксида внутри митохондрии. Определение скорости производства супероксида дыхательной цепью митохондрий с помощью дигидроэтидина. Для определения уровня супероксида в митохондрии использован мембранопроницаемый краситель дигидроэтидин, позволяющий специфично детектировать супероксид (Vanden Hoek, Li et al. 1997; Scanlon and Reynolds 1998; Becker, vanden Hoek et al. 1999). Для определения места реакции супероксида с дигидроэтидином в 26 27 митохондриях была измерена скорость изменения фрлуоресценции продуктов окисления ДГЭ в безмитхондриальной системе (ксантин/ксантин оксидаза) и в выделенных митохондриях печени крысы в присутствии различных концентраций ДГЭ флуо., тыс. Ед./мин супероксиддисмутазы (рис.12). Ксан.Оксидаза Митохондрии 2000 1000 С С О Д, Ко 0. нтр 1 О Ед оль Д, /л С О 1 Е унк Д, д/ у 10 лу Ед нку /л ун ку С О К Д, он 0 т С .1 Е рол О Д, д/л ь С О 1 Е унк Д, у д 10 /лу Ед нку /л ун ку 0 Рис. 12. Зависимость скорости изменения флуоресценции дигидроэтидина от количества супероксиддисмутазы при производстве супероксида в процессе ферментативной реакции и неповрежденными митохондриями печени крысы. Концентрация ксантин оксидазы подобрана так, чтобы количество супероксида, произведенного в процессе ферментативной реакции, приблизительно соответствовало его производству митохондриями, стимулированными антимицином А в концентрации 1 мг/мл. Наблюдается значительное уменьшение скорости изменения флуоресценции дигидроэтидина (четыре левых столбца) при добавлении 0,1, 1 и 10 ед/лунку супероксиддисмутазы по сравнению с контролем (P<0,05, P<0,01 и P<0,001 соответственно, n=6). В случае производства супероксида дыхательной цепью митохондрии (четыре правых столбца) добавление супероксиддисмутазы (0,1, 1 и 10 ед/лунку) незначительно влияет на скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина (P>0,05, n=6). Скорость изменения флуресценции дигидроэтидина в ксантин/ксантин- оксидазной реакции равна приблизительно 2,2 тыс единиц в минуту. С примерно такой же скоростью изменяется интенсивность флуоресценции в митохондриальной суспензии – 2 тыс. единиц в минуту. Супероксиддисмутаза перерабатывает супероксид в перекись водорода, уменьшая количество O2•−, доступного для ДГЭ. Добавление супероксиддисмутазы значительно уменьшает изменение флуоресценции ДГЭ в безмитохондриальной, ксантин-ксантиноксидазной реакции. В случае производства супероксида внутри митохондрии добавление супероксиддисмутазы достоверно влияет на изменение только при высоких концентрациях (50 Ед/мл) дисмутазы. 27 28 Ввиду относительно большого размера молекул (приблизительно 32 500 Да) супероксиддисмутаза и не может транспортироваться через потенциал-зависимый анионный канал, который пропускает молекулы не больше 5 000 Да. Можно заключить, что реакция окисления дигидроэтидина супероксидом, произведенным дыхательной цепью митохондрии, происходит преимущественно внутри митохондрии, т.е. вне досягаемости для добавленной в суспензию супероксиддисмутазы. Чтобы ответить на вопрос о локализации в митохондриях реакции окисления дигидроэтидина супероксид-радикалом, в нашей работе изучено, как распределяется продукт реакции между митохондриями и окружающим буфером. Для этого через 5 мин после начала реакции окисления митохондрии и буфер разделяли центрифугированием и измеряли флуоресценцию в супернатанте и осадке (рис.13). ДГЭ флуо., тыс. Ед 100 80 60 40 20 0 Буфер Митохондрия Рис. 13. Распределение продукта реакции дигидроэтидина с супероксидом вне и внутри митохондрий . После 5 мин стимуляции производства супероксида антимицином флуоресценция буфера составляла 4,2 ± 0,1 тыс. Ед; флуоресценция митохондрий 78,5 ± 10,2 тыс. Ед (n=3). Ошибка измерения флуоресценции буфера слишком мала, чтобы быть представленной на графике. Определение объѐма митохондриального осадка (около 5 мкм) вносит значительную ошибку в расчетную величину флуоресценции до разделения. Тем не менее, можно заключить, что около 95% флуоресцентного продукта реакции окисления дигидроэтидина супероксидом, произведенным митохондриальной дыхательной цепью, находится внутри митохондрии, и только около 5% флуоресцентного продукта обнаружено в окружающем буфере. Приведенные выше данные позволяют считать, что существенная часть реакции дигидроэтидина с супероксид-радикалом происходит внутри митохондрии, поскольку а) добавление супероксиддисмутазы в суспензию митохондрий не влияет на скорость окисления дигидроэтидина, б) около 95% продукта реакции окисления 28 29 ассоциированы с митохондриальным осадком. Таким образом, дигидроэтидин может использоваться для определения скорости производства/накопления супероксида внутри митохондрии. Влияние ингибитора анионного канала на уровень супероксида внутри митохондрии. Данные о компенсации эффекта ингибирования анионного канала в присутствии проникающего в митохондрию антиоксиданта, позволяют сделать вывод о возможной роли потенциал-зависимого анионного канала в транспорте супероксида из митохондрии в окружающий буфер. Ранее показано, что при нормальных условиях супероксид практически не появляется в детектируемом количестве за пределами внешней митохондриальной мембраны, хотя дыхательная цепь производит O2•− непрерывно. В стрессовых ситуациях, предшествующих изменению проницаемости митохондрии, а также в случае стимулирования производства супероксида ингибиторами дыхательной цепи значительное количество супероксид-радикала может быть обнаружено в окружающем митохондрию буфере (цитоплазме)(Piskernik, Haindl et al. 2008). Влияние обработки ингибитором анионного канала G3139 на накопление супероксида внутри митохондрий изучено в опытах стимулирования производства O2•− ингибитором комплекса III антимицином A. Как известно, антимицин А увеличивает производство супероксид-радикала дыхательной цепью митохондрии в 6-10 раз (Han, Antunes et al. 2003; Piskernik, Haindl et al. 2008). Ниже представлена скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина в суспензии митохондрий, при добавлении ингибитора G3139, антимицина А и их сочетания (рис.14), которая, как мы показали ранее, отражает скорость накопления супероксида внутри митохондрий. 29 ДГЭ флуо., тыс. Ед/мин 30 6 5.3 3.4 4 2 0.65 0.6 9/ Ан тА тА G 31 3 Ан 9 31 3 G Ко нт ро л ь 0 Рис. 14. Увеличение флуоресценции дигидроэтидина в нормальных и стимулированных антимицином митохондриях под действием ингибитора анионного канала. Скорость увеличения флуоресценции ДГЭ в нормальных митохондриях составляла 0,58 ± 0,12 тыс. флуо. ед./мин, после обработки (5 мкМ) ингибитора (0,6 ± 0,1 тыс. флуо. ед./мин, (P>0,05, n=4). Обработка митохондрий антимицином А (1 мкМ) увеличивает скорость изменения флуоресценции в 6 раз (3,4 ± 0,2 тыс. флуо. ед./мин; P< 0,001, n=4). Комбинация ингибиторов увеличивает скорость изменения флуоресценции на 60 процентов, до 5,3 ± 0,1 тыс. флуо. ед./мин (P< 0,05, n=4). Итак, добавление ингибитора дыхательной цепи антимицина А значительно увеличивает уровень производства супероксида, что согласуется с опубликованными ранее данными. Обработка контрольных митохондрий в отсутствии стимуляторов окислительного стресса ингибитором анионного канала G3139, не влияет на накопление супероксида внутри митохондрий, в то время, как ингибирование анионного канала в митохондриях с повышенным уровнем производства супероксида значительно увеличивает скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина. Следовательно уменьшение проницаемости внешней митохондриальной мембраны сопровождаемая увеличением скорости накопления супероксид-радикала внутри митохондрии. Формирующий пору агент уменьшает накопление O2•− в митохондриях, вызываемое ингибированием потенцал-зависимого анионного канала с помощью G3139. Если верно предположение, что обработка митохондрий ингибитором G3139 уменьшает отток супероксид-радикала из межмембранного пространства, то при образовании альтернативных пор во внешней митохондриальной мембране можно 30 31 ожидать снижения скорости накопления супероксида внутри митохондрий. Для образования пор во внешней митохондриальной мембране мы использовали дигитонин, специфически растворяющий холестерол внешней митохондриальной мембраны (Hoppel and Cooper 1968; Morton, Hoppel et al. 1968; Newman, Gordesky et al. 1968). Производство супероксида было стимулированно антимицином А (1 мкМ) во всех митохондриях. Таким образом, группа «контроль» отражает скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина в митохондриях, обработанных антимицином А (рис.15). ДГЭ флуо., тыс. Ед/мин 5 4 3 2 1 М /G IG 31 5м 39 кМ D / IG G 31 10 39 мк М D /G IG 31 50 39 мк М /G 31 39 D D IG 1м кМ 5м к 9 31 3 G Ко нт ро л ь 0 Рис. 15. Компенсирование дигитонином эффекта ингибитора анионного канала. При обработке митохондрий ингибитором G3139 скорость увеличивается до 4,2 ± 0,1 тыс. Ед/мин (P<0,001, n=4). Небольшие концентрации дигитонина (1-5 мкМ) не влияют на скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина (4,2 ± 0,2 и 4,1 ± 0,1 тыс. Ед/мин соответственно, n=4). Концентрация дигитонина 10 мкМ понижает скорость изменения флуоресценции до 3,4 ± 0,1 тыс. Ед/мин (P>0,05, n=4). Напротив концентрация 50 мкМ дигитонина приводит значение скорости изменения флуоресценции к контрольному значению (2,5 ± 0.1 тыс. Ед/мин, P<0,01, n=4). Таким образом, ингибирование анионного канала значительно увеличивает скорость изменения флуоресценции дигидроэтидина, пороформирующий агент дигитонин в концентрациях 1 и 5 мкМ практически не влияет на скорость производства/накопления супероксида, в то время, как при концентрациях дигитонина 10 и 50 мкМ эффект ингибитора анионного канала G3139 компенсируется сначала частично, а затем полностью. 31 32 ВЫВОДЫ 1) Разработан кинетический метод определения проницаемости внешней митохондриальной мембраны для небольших водорастворимых молекул, по скорости диффузии кальцеина в межмембранное пространство. 2) Показано, что ингибитор анионного канала G3139 уменьшает проницаемость внешней митохондриальной мембраны в интактных выделенных митохондриях печени крысы. 3) Установлено, что уменьшение проницаемости внешней митохондриальной мембраны под действием ингибитора анионного канала G3139 увеличивает чувствительность митохондрий к кальцию; переход митохондрий из нормального состояния в набухшее происходит раньше, чем в контрольных митохондриях. 4) Адаптирован метод определения уровня супероксида с помощью дигидроэтидина для использования с митохондриями. Показано, что реакция окисления дигидроэтидина супероксидом происходит внутри митохондрии. 5) Доказано, что при ингибировании потенциал-зависимого анионного канала накопление супероксида внутри митохондрии происходит быстрее, чем в отсутствие ингибитора, этот эффект компенсируется образованием альтернативной поры во внешней мембране митохондрий. Список работ, опубликованных по теме диссертации Theruvath T. P., Zhong Z., Pediaditakis P., Ramshesh V. K., Currin R. T., Tikunov A., Holmuhamedov E., Lemasters J. J. Minocycline and N-Methyl-4-Isoleucine Cyclosporin (NIM811) Mitigate Storage/Reperfusion Injury after Rat Liver Transplantation through Suppression of the Mitochondrial Permeability Transition. Hepatology. 2008 Jan; 47(1):236-46 Tikunov A., Johnson C. B., Pediaditakis P., Lemasters J. J., Holmuhamedov E. L.. VDAC Closure Sensitizes Rat Liver Mitochondria toward Ca2+-induced Permeability Transition. Biophysical Journal 2008; 95 (12):6081-6081. 32 33 Tikunov A., Bryce Johnson C, Pediaditakis P, Markevich N, Macdonald JM, Lemasters JJ, Holmuhamedov E. Closure of VDAC causes oxidative stress and accelerates the Ca(2+)-induced mitochondrial permeability transition in rat liver mitochondria. Arch Biochem Biophys. 2010 Jan 25. Принята в печать [Epub ahead of print] 33
