Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.

Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
УДК 581.17
ДИНАМИЧЕСКИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ
МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЯДОВ
А.А. Пономарева, Д.Ф. Рахматуллина, Н.И. Газизова, Ф.В. Минибаева
ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики Казанского
научного центра РАН»,
Россия, 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2/31
E-mail: na.ponomareva@mail.ru
Митохондрии являются ключевыми органеллами клетки, от функционирования которых
зависит не только энергообеспечение, но и поддержание общего гомеостаза, работа сигнальных
систем, запуск и контроль различных типов программируемой клеточной смерти. Применение
ингибиторов работы электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий является классическим
методом для изучения функциональной активности митохондрий как in vitro, так и in vivo.
Использование ингибиторов I и III комплексов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий,
ротенона и антимицина А вызывало изменение интенсивности поглощения кислорода,
рассеивание трансмембранного потенциала, не влияло на содержание активных форм кислорода в
клетках. Впервые показано формирование мегамитохондрий в клетках корней пшеницы.
Обсуждается влияние митохондриальных ядов на энергообеспечение и динамические
преобразования органелл за счет регуляции процессов слияния / фрагментации митохондрий.
электрон-транспортная цепь, ротенон, антимицин А, мегамитохондрии
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время роль митохондрий в клетках определяется не только
энергообеспечением, но и участием органелл в синтезе сигнальных молекул и
белковых факторов, которые необходимы для регуляции метаболических и
катаболических процессов, сигнальных каскадов и всех типов клеточной смерти.
В организме митохондрии выполняют более десятка важных функций в области
поддержания гомеостаза, клеточного цикла, процессов адаптации, а с
дисфункцией митохондрий связано развитие более 40 заболеваний [1, 2].
Использование «митохондриальных ядов» – ингибиторов работы комплексов
электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) является классическим приёмом при изучении
функциональной активности митохондрий. Блокирование работы того или иного
комплекса ЭТЦ дает возможность оценить вклад конкретного участка в
последующие метаболические и функциональные перестройки и проследить
компенсаторные реакции органелл. В задачи нашего исследования входила
характеристика функциональных изменений митохондрий и возможных путей
реорганизации митохондриома клетки при одновременном блокировании работы
I и III комплексов ЭТЦ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили отсеченные корни 4-суточных
проростков пшеницы Triticum aestivum L. сорта Казанская Юбилейная. Растения
выращивали на 0,25 мМ CaCl2, этот же раствор использовали в качестве
контрольной среды инкубации и для приготовления растворов ингибиторов.
Использовали ингибиторы ЭТЦ: I комплекса - 10 мМ ротенон, III комплекса -
175
Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
10 мМ антимицин А. Интенсивность дыхания определяли манометрическим
методом Варбурга [3]. В гомогенате находили содержание H2O2 и интенсивность
перекисного окисления липидов по содержанию ТБК-реагирующих продуктов [4].
Для качественной оценки АФК in vivo использовали флуоресцентный краситель 2′7′-дихлорфлуоресцин диацетат (1 мкМ DCFDA λab 505 нм / λem 535 нм). Для
визуализации митохондрий и оценки их мембранного потенциала применяли
потенциал-зависимый краситель – этиловый эфир тетраметилродамина (1 мкМ
TMRM λab 543 нм / λem 573 нм). Ультраструктуру клеток паренхимы центрального
цилиндра в зоне растяжения корня анализировали с помощью электронного
микроскопа Jem 1200EX (Jeol, Japan) [5]. Опыты проводили не менее чем в трех
биологических и аналитических повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При одновременном ингибировании работы I и III комплексов ЭТЦ
ротеноном и антимицином А наблюдали двухфазное изменение интенсивности
дыхания. Первоначальное подавление дыхания на 40-50 % сменялось
стимуляцией, которая к 5 ч составляла 50-60 % от контрольных значений
(таблица). Природа этой стимуляции и возможные механизмы изменения метабоТаблица. Поглощение О2, содержание Н2О2 и ТБК-реагирующих продуктов в
корнях пшеницы при инкубации в растворе, содержащем 10 мкМ ротенона и 10
мкМ антимицина А (Р + аА)
Table. Oxygen consumption, content H2O2 and TBA-reactive products the roots of
wheat after incubation in a solution containing 10 μM rotenone and 10 μM antimycin A
(Р + аА)
Время, Вариант Поглощение О2,
Н2О2,
Кол-во ТБК
ч
мкл/ч/г сыр.веса мкмоль/г сыр. веса
продуктов,
мкмоль/г сыр.
веса
1
Контроль
478 ± 24
3,67 ± 0,44
4,62 ± 0,01
Р + аА
253 ± 37
4,51 ± 0,49
7,89 ± 1,71
3
Контроль
487 ± 10
4,32 ± 0,46
6,63 ± 0,95
Р + аА
542 ± 23
5,24 ± 0,67
7,30 ± 0,76
5
Контроль
580 ± 50
4,93 ± 1,14
9,06 ± 2,20
Р + аА
913 ± 15
4,55 ± 0,28
10,84 ± 1,26
лических путей, связанные с восстановлением энергообеспечения клеток,
подробно рассмотрены ранее в статье [3]. Показано, что определенный вклад в
восстановление интенсивности поглощения кислорода вносит работа
терминальных участков ЭТЦ, Н+-АТФаз и редокс-систем плазмалеммы. Мы
предположили, что возрастание интенсивности потребления кислорода
сопровождается усилением продукции активных форм кислорода (АФК). Для
клеток животных и дрожжей показано значительное усиление генерации АФК
при блокировании переноса электронов по ЭТЦ, особенно на участках I и III [6].
Интересно, что при многочасовой инкубации корней в растворе ингибиторов не
происходило значительного увеличения образования H2O2 и перекисного
окисления липидов (таблица). Эти данные были подтверждены детекцией АФК с
176
Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
помощью флуоресцентного красителя DCFDA. Окраска клеток потенциалзависимым красителем TMRM показала диссипацию мембранного потенциала
митохондрии по сравнению с контролем на протяжении всего эксперимента
(1-5 ч) (рис. А). Ультраструктура митохондрий претерпевала значительные
перестройки. В контроле митохондрии имели ортодоксальный вид, округлую
форму и линейные размеры 0,5–1 мкм в течение всего эксперимента (рис. Б, а).
Действие ингибиторов (3 ч) вызывало образование гигантских митохондрий
необычной «перфорированной» формы, при этом значительно увеличивались их
линейные размеры. Значения по длинной оси митохондрии составляли
3 - 4,5 мкм, отдельные органеллы достигали 15 мкм. Возрастала площадь
соприкосновения органелл с цитоплазмой за счет образования инвагинаций и
полостей (рисунок Б, б, в). Митохондрии такого вида можно описать как мегами-
Рис. Влияние ротенона и анатимицина А на мембранный потенциал (А) и
ультраструктуры митохондрий (Б) в клетках корней пшеницы. (А) а –
митохондрии в исходных клетках, б - 1 ч инкубации CaCl2, в – ротенон +
антимицин А 1 ч инкубации; масштабный отрезок 50 мкм. (Б) а- ортодоксальные
митохондрии, контроль 1 ч, б–г - митохондрии при действии ингибиторов 1, 3, 5 ч
соответственно. Масштабный отрезок 1 мкм. КС – клеточная стенка,
Мт – митохондрия, П - пластида, Я – ядро
Fig. 1. The influence of rotenone and antimycine A on the membrane potential (A) and
ultrastructure of mitochondria (Б) in wheat root cells. a - initial cell mitochondria, б –
incubation in CaCl2 1h, в - incubation in rotenone + antimycin A 1 h; bars μm 50. (Б) aorthodox mitochondria, control 1 h, б - г - the influence of inhibitors on mitochondria 1,
3, 5 h, respectively; bars 1 μm. КС - cell wall, Mт - mitochondria, П – plastid,
Я - nucleus
177
Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
тохондрии или «митохондриальную сеть», наличие которой характерно для
многих клеток животных. Через 5 ч инкубации корней с ингибиторами
митохондрии приобретали обычную форму и небольшие размеры, что говорит о
временнóй динамике выявленных преобразований органелл (рисунок Б, г).
Образование разветвленной митохондриальной сети не характерно для
клеток растений in vivo. Наличие митохондриального ретикулума показано при
стрессовых условиях в единичных работах. Формирование митохондриальной
сети происходило в условиях длительного анаэробиоза клеток корня риса, при
добавлении глюкозы [7]. Образование гигантских митохондрий из отдельных
мелких органелл и дальнейшее объединение в ретикулум описано для клеток
культуры табака при недостатке кислорода в течение 3-4 ч [8]. Для клеток корней
пшеницы подобные преобразования не описаны, однако ранее мы наблюдали
изменения пространственной организации и удлинения органелл при
блокировании работы комплексов ЭТЦ митохондрий [5]. Образование кольцевых
профилей митохондрий происходило на фоне изменения их функционального
состояния и носило временный характер при непрерывном воздействии
ингибиторов.
В литературе существуют противоречивые данные о влиянии
митохондриальных ядов на пространственную организацию митохондрий.
Образование мегамитохондрий показано в клетках харовых водорослей на фоне
снижения фотосинтетической и цитохромной активности при действии
митохондриальных ядов, таких как антимицин А и цианид [9], тогда как в клетках
культуры табака цианид не оказывал эффекта на размер и форму митохондрий [8].
Нами показано, что нарушения функционирования митохондриальной ЭТЦ
влияют не только на интенсивность дыхания клетки и трансмембранный
митохондриальный потенциал, но и индуцируют динамические преобразования
митохондрий. Под термином «динамика митохондрий» подразумевают постоянно
происходящие изменения формы, размеров и числа митохондрий в пределах
одной клетки за счет таких процессов, как слияние и фрагментация органелл.
Известно, что клеточная архитектура митохондрий и динамическая реорганизация
митохондриальной сети регулируются рядом недавно идентифицированных
белков, большинство из которых относятся к динамин-подобным белкам и
являются ГТФазами [10]. Эти белки играют важную роль в биогенезе
митохондрий, процессах выживания и гибели клеток, а также в развитии многих
заболеваний. Среди необходимых условий для обеспечения процесса слияния
мембран митохондрий выделяют наличие высокого уровня ГТФ и ∆рН [10].
Попытка изучить физиологические условия, необходимые для слияния
митохондрий в клетках растений, была предпринята в работе [11], выполненной
на суспензии клеток табака BY-2. Процесс слияния митохондрий не зависел от
активности цитоскелета (полимеризации актина), тогда как нарушение процесса
окислительного
фосфорилирования
(использование
олигомицина
и
протонофоров) приводило к снижению уровня АТФ в клетках и замедлению
слияния митохондрий.
Таким образом, блокирование работы ЭТЦ на уровне I и III комплексов
непосредственно влияет на интенсивность дыхания клеток и трансмембранный
митохондриальный потенциал и вызывает динамические преобразования
178
Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
митохондрий, направленные на сохранение функциональной активности органелл
и носящие адаптационный характер.
ВЫВОДЫ
Впервые
обнаружен
факт
образования
мегамитохондрий
/
митохондриальной сети в клетках корней пшеницы при одновременном
блокировании работы I и III комплексов ЭТЦ.
В данных экспериментальных условиях динамические преобразования
митохондрий не зависели от мембранного потенциала органелл.
Работа выполнена при
(№13-04-00865, 14-04-00205).
частичной
финансовой
поддержке
РФФИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.
Amirsadeghi S. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic
stress / S. Amirsadeghi, Ch.A. Robson, G.C. Vanlerberghe // Physiologia Plantarum. 2007. - V. 129. - P. 253–266.
2.
Cheng W-Ch. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian
cells / W-Ch. Cheng, K. M. Leach, Hardwick J. M. // Biochim Biophys Acta. - 2008. V. 1783 - (7). - P 1272–1279.
3.
Рахматуллина, Д.Ф. Дыхание клеток корней пшеницы в условиях
одновременного ингибирования I и III участков электрон-транспортной цепи
митохондрий / Д.Ф. Рахматуллина, Л.Х. Гордон, Т.И. Огородникова // Цитология.
- 2005. - Т.47. - №3. - С.230-236.
4.
Дмитриева,
С.А.
Эффекты
окислительного
стресса
на
ультраструктуру и функциональную активность растительных митохондрий in
vivo / С.А. Дмитриева [и др. ] // Биологические мембраны. - 2012. - Т. 29. - № 4. C. 267–275.
5.
Пономарева, А.А. Изменение формы митохондрий в клетках корней
пшеницы при действии митохондриальных ядов / А.А. Пономарева,
О.О. Полыгалова // Физиология растений. - 2012. - Т. 59. - № 3. - С. 466–471.
6.
Andreyev Yu. Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species /
Yu. Andreyev, Yu.E. Kushnareva, A.A. Starkov// Biochemistry (Moscow). - 2005. - V.
70. - No. 2. - P. 200-214.
7.
Vartapetian B.B. Mitochondrial ultrastructure in roots of mesophyte and
hydrophyte at anoxia and after glucose feeding / B.B. Vartapetian, I.N. Andreeva, G.I.
Kozlova, L.P. Agapova // Protoplasma. - 1977. - V. 91. - P. 243-256.
8.
Van Gestel K. Giant mitochondria are a response to low oxygen pressure
in cells of tobacco (Niconiana tabacum L.) / K. Van Gestel, J-P. Verbelen // Journal of
Experimental Botany. - 2002. - V.53. - P. 1215-1218.
9.
Foissner I. Inhibitor studies on formation of giant mitochondria in Nitella
flexilis / I. Foissner // Phyton (Austria). - 1983. - V. 23. - P. 19-29.
10.
Dimmer K.S. (De)constructing mitochondria: what for? / K.S. Dimmer,
L. Scorrano // Physiology. -2006. – 21. – P. 233-241.
179
Научный журнал «Известия КГТУ», № 34, 2014 г.
11.
K. Wakamatsu. Fusion of mitochondria in tobacco suspension cultured
cells is dependent on the cellular ATP level but not on actin polymerization / K.
Wakamatsu, M. Fujimoto, M. Nakazono, Sh. Arimura, N. Tsutsumi // Plant Cell Rep. –
2010. – V. 29. – P. 1139-1145.
DYNAMIC TRANSFORMATIONS OF MITOCHONDRIA INDUCED BY
MITOCHONDRIAL POISONS
A.A. Ponomareva, D.F. Rakhmatullina, N.I. Gazizova, F.V. Minibayeva
Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of Kazan Scientific Centre RAS,
Russia, 420111, Kazan, Lobachevsky Street, 2/31
E-mail: na.ponomareva@mail.ru
Functional activity of mitochondria is important not only for the energy supply of cells, but also for
maintaining the homeostasis, work of signaling pathways, activation and control of various types of the
programmed cell death. The use of inhibitors of the electron transport chain (ETC) of mitochondria is a
classic method for studying the functional activity of mitochondria as in vitro, and in vivo. Inhibition of
complexes I and III of the ETC induced the dissipation of the mitochondrial transmembrane potential, the
changes in the rate of respiration and morphological transformation of mitochondria with the formation of
megamitochondria.
an electron-transport chain, rotenone, antimycin A, megamitochondria
180