ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ БИОЛОГИИ
реклама
ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ БИОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СВОЙСТВ СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЮЩИХ СРЕДСТВ Г.А. Александрова1, М.В. Злыгостева1, О.П. Пилипенко2 1 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] 2 ООО «Росса НИИБХ», г. Пермь Изучено 6 препаратов бытовой химии на выявление дезинфицирующих свойств. Для каждого средства определен способ применения, при котором достигается дезинфицирующий эффект. RESEARCH OF THE DISINFECTANT PROPERTIES OF DETERGENTS G.A. Aleksandrova1, M.V. Zlygosteva1, O.P. Pilipenko2 1 Natural Science Institute, [email protected] 2 LLC «Rossa SRIHC », Perm Was studied 6 products of household chemical goods on the identification of disinfectant properties. Method of use was defined for each of the detergents, in which reached a disinfectant effect. Введение. Чистящие средства для быта с дезинфицирующими добавками (далее, ДД) способствуют улучшению санитарных условий жилых помещений и профилактике инфекционных заболеваний. Поиск новых средств, обладающих высокими антимикробными свойствами, низкой токсичностью, простотой применения весьма актуален. Известно, что основную роль в процессе очистки поверхности играют три фактора: природа очищаемой поверхности, природа загрязнения, состав чистящего средства [3]. Чистящие средства – это многокомпонентные системы, в рецептурах которых используются ДД в сочетании с поверхностно – активными веществами (далее, ПАВ), комплексообразователями, щелочными добавками, что способствует понижению поверхностного натяжения воды, повышает смачивающую способность препаратов, в итоге приводит к надежному антимикробному эффекту [2]. 265 Введение в состав чистящих средств дезинфицирующих добавок позволяет объединить в один процесс механическую чистку и обеззараживание. Дезинфицирующие добавки (ДД), вводимые в рецептуры средств бытовой химии, могут быть из разных классов химических соединений: перекисные соединения, органические и неорганические кислоты, хлорсодержащие соединения, четвертичные аммониевые соединения и др. Анализ патентной литературы свидетельствует о значительной активности и развитии направления создания хлорсодержащих чистящих средств с дезинфицирующим действием. Это чистящие средства в виде порошков, жидкостей, гелей, спреев и т.д. Цель настоящего исследования – оценка противомикробных свойств ряда чистящих средств, содержащих дезинфицирующие добавки. Объекты исследования – 4 группы составов чистящих препаратов, разработанных ООО «Росса НИИБХ»: 1. Абразивные чистящие средства с использованием в качестве ДД: 2-хлорацетамид (0,3%, 0,4%), дихлоризоцианурат натрия (Na). 2. Техническое моющее средство (порошок), где ДД – хлорамин Б. 3. Санитарно-гигиеническое средство в виде геля, где ДД – гипохлорит Na. 4. Жидкое санитарно-гигиеническое средство в виде спрея, где ДД – гипохлорит Na. Характеристика исследованных препаратов. 1. Абразивные хлорсодержащие чистящие порошки предназначены для чистки, дезинфекции и отбеливания ванн, раковин, унитазов, кафеля, плит и кухонной утвари. Они содержат кальцит природный, ПАВ, щелочные добавки, хлорсодержащий агент, ароматизатор. 2. Техническое моющее средство (далее, ТМС) предназначено для мытья и обезжиривания металлических, стеклянных, керамических поверхностей, пластика в различных отраслях пищевой промышленности, на предприятиях общественного питания и т.д. Средство представляет собой смесь щелочных компонентов, ПАВ и дезинфектанта – натриевая соль хлорбензолсульфамида (хлорамин Б). 3. Санитарно-гигиеническое чистящее средство в виде геля предназначено для гигиенической обработки поверхностей и предметов туалета, ванной комнаты, кухни. Состав чистит, дезинфицирует, отбеливает очищаемые поверхности. Препарат имеет в составе: ПАВ, едкий натр, гипохлорит Na. Загущенная форма удобна при чистке наклонных и вертикальных поверхностей; смесь ПАВ обеспечивает загущающий и моющий эффект. Компоненты состава подобраны с учетом их влияния на стабильность хлордобавки. 266 4. Жидкое средство на основе гипохлорита Na (ДД) в виде спрея предназначено для очистки поверхностей на кухне и в ванной от жира, грязи и застарелых пятен. Состав содержит ПАВ, гипохлорит Na, стабилизатор, ароматизатор. Методы исследования. Изучение дезинфицирующих свойств препаратов проведено по общепринятым методикам [1]. В качестве тест-микроорганизмов использовали санитарно – показательные микроорганизмы: Staphylococcus aureus, 906; Escherichia coli, 1257; Bacillus cereus var. antracoides, 96. Тест-объектами служили модельные поверхности из различных материалов, которые контаминировали определенным штаммом. Препараты наносили на поверхности разными способами. Дезинфицирующие свойства для каждого средства выявляли после серии экспериментов. Критерий эффективности обеззараживания тестповерхностей – не менее 99,99% гибели культуры микроорганизмов. Результаты и обсуждения. Испытанию на выявление дезинфицирующих свойств были подвергнуты 6 препаратов (таблица 1), из них 3 средства – абразивные чистящие порошки для быта – группа 1, средство техническое моющее – группа 2, санитарногигиеническое средство в виде геля – группа 3, жидкое средство – спрей – группа 4. Таблица 1 – Результаты исследование дезинфицирующих свойств препаратов № гр. Наименование состава Дезинфицирующие добавки (ДД) 2-хлорацетамид (0,3%) 1 Абразивные чистящие порошки 2-хлорацетамид (0,4%) дихлоризоцианурат Na (1,5%) 2 3 4 Техническое моющее средство (порошок) Санитарногигиеническое средство в виде геля Жидкое средство – спрей хлорамин Б (1,5%) гипохлорит Na (4,0%) гипохлорит Na (0,7%) Способ применения концентрат на увл. поверхность 1 г на 1 м2 концентрат на увлажненную поверхность 10 г на 1 м2 концентрат на увл. поверхность 15 г на 1 м2 концентрат на увл. поверхность метод погружения 20 г/л, t=50±1°C нанесение концентрата на поверхность распыление концентрата на поверхность Экспозиция, мин. Тест-микроорганизмы St. aureus E. coli B. cereus Эф-ть обеззараживания, % 10 99,978 99,360 98,904 10 99,985 99,969 99,875 10 99,990 100,0 99,820 0,5 99,996 99,999 99,998 5 99,997 99,997 99,995 10 100,0 100,0 99,998 2 100,0 99,990 − 5 100,0 99,990 − 1 100,0 100,0 89,890 5 100,0 100,0 99,990 Как видно из таблицы 1, для абразивных чистящих порошков эффективной концентрацией для 2-хлорацетамида является 0,4%, при условии нанесения средства на 267 увлажненную поверхность из расчета 15 г на 1 м2 и экспозиции 10 минут. Однако спороцидного дезинфицирующего эффекта достигнуто не было. Чистящий порошок на дихлоризоцианурате Na показал дезинфицирующий эффект при концентрации ДД 1,5% и экспозиции 30 секунд. Для ТМС испытания проводили методом погружения контаминированных поверхностей в теплый раствор средства (50±1°C) при расходе его 20 г на 1 л. Через 5 минут от начала зарегистрирован 99,99%-й эффект помещения поверхностей в раствор. Гипохлодитсодержащее средство в виде геля проявило одинаковый дезинфицирующий эффект при экспозиции 2 и 5 минут. Аналогичное жидкое средство в виде спрея наносили на модельные инфицированные поверхности методом распыления. Надежный результат по эффективности обеззараживания был получен при экспозиции 5 минут. В результате проведенных исследований для каждого средства определен способ применения, при котором проявляется дезинфицирующий (бактерицидный) эффект, для последующего включения его в нормативную техническую документацию. Литература 1. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. / Под ред. Шандала М.Г. и Пантелеевой Л.Г., Москва: МЗ РФ, 1998. – 72 с. 2. Цетлин В.М., Вилькович В.А. Физико-химические факторы дезинфекции. – М.: Медицина, 1969. с. 145. 3. Чалмерс Л. Химические средства в быту и промышленности. – М.: Химия, 1969. – 528 с. К ВОПРОСУ О МИКОЛОГИЧЕСКОМ СОСТОЯНИИ ЖИЛЫХ ПОМЕЩЕНИЙ ГОРОДА ПЕРМИ Г.А. Александрова, И.Н. Кирьянова, С.Ю. Баландина Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] Исследовано более 100 жилых помещений г. Перми. Доминирующими представителями являются грибы родов Penicillium, Aspergillus и Cladosporium, из других выделены рода Alternaria, Mucor, Fusarium, Stachybotrys, Trichoderma. К токсинообразованию способны следующие виды: A. flavus, A. cervinus, A. niger, A. niveus, A. oryzae, A. wentii – афлатоксины; P. camembertii, P. citrinum, P. hirsutum – цитринин; у представителей родов Alternaria и Cladosporium – токсинообразующих свойств не обнаружено. 268 TO THE QUESTION OF MYCOLOGICAL THE CONDITION OF PREMISES IN PERM G.A. Aleksandrova, I.N. Kiryanova, S.U. Balandina Natural Sciencе Institute, [email protected] It has been investigated more than 100 premises in the city of Perm. Dominating representatives are of genus moulds Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, some of the other genus moulds isolated Alternaria, Mucor, Fusarium, Stachybotrys, Trichoderma. Some species of moulds are capable of generate toxins: A. flavus, A. cervinus, A. niger, A. niveus, A. oryzae, A. wentii – aflatoxins; P. camembertii, P. citrinum, P. hirsutum – citrinin; from representatives of genus moulds Alternaria and Cladosporium – not found properties of excrete toxins. Введение. Известно, что человек живет не в стерильных условиях, воздушная среда изобилует микроорганизмами, и спорами плесневых грибов. Их содержание во внутренней среде жилых и общественных помещений, по Европейскому проекту ЕСА COST 613 199300, в количестве 100,0–500,0 КОЕ/м3– характеризуется как средний уровень контаминации воздуха, а 500,0–2 000,0 КОЕ/м3 и выше – как высокий и очень высокий. По данным ВОЗ (1990), пороговой концентрацией спор в воздухе помещений предложено считать 500,0 КОЕ в 1 м3 воздуха [3, 8]. При возникновении благоприятных условий, основными из которых является повышенная влажность и оптимальная для роста грибов температура, отсутствие активного проветривания, начинается прорастание спор, развитие мицелия [1]. К основным источникам спор плесневых грибов в жилых помещениях следует отнести: наружный атмосферный воздух, строительные и отделочные материалы, протечки, нарушение микроклимата, земля в цветочных горшках, испорченные пищевые продукты, домашняя пыль; часть спор приносится на одежде и обуви, на шерсти домашних животных. Одной из причин появления очагов плесневого загрязнения является также неправильная установка пластиковых окон. По данным литературы, замена окон на металлопластиковые конструкции без усовершенствования систем вентиляции также является одной из причин нарушения влажностного режима и развития микроскопических грибов. Плохая циркуляция воздуха под широкими подоконниками, особенно при неработающих батареях центрального отопления в осенний и весенний периоды, может создавать условия для образования конденсата и застаивания влаги, благоприятные для роста плесневых грибов. При активном росте и развитии плесневых грибов образуется большое количество спор, микроскопический размер которых (от 1 мкм до 8 мкм, рисунок 1) позволяет им быстро и легко разноситься током воздуха и достигать носовой полости и альвеол легких 269 человека [4]. Впоследствии это может привести к аллергическим проявлениям и микозам внутренних органов. Значение имеет и выделение плесневыми микромицетами низкомолекулярных ядовитых вторичных метаболитов – микотоксинов, которые оказывают специфическое патологическое влияние на живой организм [7]. Рисунок 1 – Сравнительные размеры спор грибов и бронхиолы человека (по Sennekamp, 1984) Среди микотоксинов своими токсическими свойствами (мутагенность, тератогенность, канцерогенность) и широким распространением выделяются афлатоксины, охратоксины, трихотеценовые микотоксины, зеараленон, цитринин и патулин, хотя потенциально опасными для человека являются и многие другие микотоксины [7]. По данным Айме Муст (Aime Must, 1996) и его коллег, некоторые микотоксины могут присутствовать в воздухе и накапливаться во влажных гипсокартонных панелях, больше всего токсинов обнаружено по краям вентиляционных отверстий и плинтусов. Если не удалить очаги грибкового поражения, микромицеты могут способствовать развитию у человека микотоксикозов. Микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium и Cladosporium являются наиболее частыми обитателями загрязненных помещений. В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось исследование жилых помещений г. Перми на предмет выявления грибковой контаминации. Объектами исследования явились плесневые грибы, выделенные из воздуха и образцов строительноотделочных материалов. Было исследовано более 100 жилых помещений г. Перми с видимыми биоповреждениями и без биоповреждений. Методика исследований включала визуальное обследование жилых помещений, отбор проб и исследование их на контаминацию микромицетами, определение общего количества микроорганизмов с последующей идентификацией до рода, вида. Окончательные результаты работ: рекомендации по уничтожению грибков и содержанию жилья в соответствии с СанПиН 2.1.2.2645–10 [2, 5]. 270 Результаты и их обсуждение. Микробиологический анализ данных показал, что в воздухе помещений без биоповреждений, количество жизнеспособных спор плесневых грибов составляет в среднем 449,2 КОЕ/м3. В помещениях с видимым поражением материалов биологическими агентами, протечками, слабой вентиляцией и повышенной влажностью содержание общего количества микомицетов возрастает в среднем до 1 943,5 КОЕ/м3, что указывает на высокий уровень микогенной контаминации воздуха. Наиболее часто встречаемые в наших исследованиях представители следующих родов (видов) плесневых грибов: Penicillium – 25 видов: P. brevi-compactum, P. camembertii, P. canescens, P. chrysogenum, P. citrinum, P. claviforme, P. corylophilum, P. funiculosum, P. giganteum, P. glabrum (frequentans), P. hirsutum, P. implicantum, P. italicum, P. lividum, P. lanosum, P. nalgiovense, P. ochraceum, P. olive-viride, P. olsonii, P. palitans, P. paraherquei, P. simplicissimum, P. sizovae, P. urticae, P. verruculosum; Aspergillus – 11 видов: A. candidus, A. cervinus, A. flavus, A. niger, A. niveus, A. ochraceus, A. oryzae, A. glaucus, A. terreus, A. ustus, A. wentii; Cladosporium – 4 вида: Cl. elegantum, Cl. cladosporioides, Cl. herbarum, Cl. sphaerospermum; Alternaria – 4 вида: Al. alternata, Al. chartarum, Al. longipes, Al. tenuissima; Mucor– 1 вид: M. lusitanicus; Fusarium – 1 вид: F. solani; Stachybotrys – 1 вид: St. alternans (St. chartarum); Trichoderma – 1 вид: Trichoderma viride (T. lignorum). В процентном соотношении на первом месте как в воздухе, так и в строительноотделочных материалах можно выделить 3 основных рода грибов: Penicillium (24,4% и 26,57% соответственно), Aspergillus (21,60% и 19,58%), и Cladosporium (13,60% и 17,48%). В меньшей степени встречались плесневые грибы родов: Alternaria (5,64% и 14,69%), Mucor (10,33% и 9,09%), Fusarium (4,69% и 0,70%), Stachybotris (2,36% и 0,70%), Trichoderma (1,89% и 0,00%), и дрожжеподобные грибы – 15,49% и 11,19% (рисунок 2 и 3). Наряду с плесневыми микомицетами, отмечено загрязнение образцов стройматериалов дрожжеподобными грибами (от 3 000,00 до 38,41 млн. КОЕ/г), что может свидетельствовать о несоблюдении санитарно-гигиенического режима в помещении и способствовать более интенсивному развитию плесневой микрофлоры. Кроме того, они были обнаружены в чистых обоях (7 351,00 КОЕ/г) и воздухе (от 11,00 до 92,00 КОЕ/м3). 271 21,60% 13,60% 24,40% 5,64% 10,33% 4,69% 15,49% 1,89% 2,36% Penicillium Aspergillus Cladosporium Alternaria M ucor Fusarium Stachybotrys Trichoderma Дрожжеподобные грибы Рисунок 2 – Частота встречаемости плесневых и дрожжеподобных грибов в строительно-отделочных материалах в жилых помещениях г. Перми 19,58% 26,57% 11,19% 17,48% 14,69% 0,00% 9,09% 0,70% 0,70% Penicillium Aspergillus Cladosporium Alternaria M ucor Fusarium Stachybotrys Trichoderma Дрожжеподобные грибы Рисунок 3 – Частота встречаемости плесневых и дрожжеподобных грибов в воздухе жилых помещений г. Перми Для исследования способности к токсинообразованию отобраны самые распространенные рода плесневых грибов, которые могут представлять опасность для здоровья. Исследования показали, что к токсинообразованию способны следующие выделенные нами виды: род Aspergillus (A. flavus, A. cervinus, A. niger, A. niveus, A. oryzae, A. wentii) – афлатоксины; род Penicillium (P. camembertii, P. citrinum, P. hirsutum) – цитринин. У родов Alternaria (Al. longipes, Al. oleracea, Al. tenuissima) и Cladosporium (Cl. elegantulum, Cl. sphaerospermum) токсинообразующих свойств не обнаружено. Заключение. В результате проведенных исследований установлено, что наиболее частыми обитателями загрязненных помещений г. Перми являются микроскопические грибы рода Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, в меньшей степени встречаются рода Alternaria, Mucor, Fusarium, Stachybotrys, Trichoderma. Обнаружено также, что представители родов Aspergillus, Penicillium, Cladosporium чаще встречаются в образцах обоях и штукатурке, 272 родов Alternaria, Fusarium, Stachybotrys, Trichoderma – в обоях и других целлюлозосодержащих материалах, рода Mucor – в образцах штукатурки и побелки. 6 видов из рода Aspergillus, 3 вида из рода Penicillium обладали токсинообразующими свойствам. Большинство из них относятся к 3–4 группе патогенности [6], что подтверждалось активным их ростом при температуре +37°C. Таким образом, длительное пребывание людей в исследованных помещениях, содержащих большое количество плесневых грибов, а особенно в помещениях с видимыми признаками биоповреждений, опасно для здоровья человека, является фактором риска, и может сопровождаться появлением аллергии, дерматитов, астмы, усугублением хронических заболеваний. Литература 1. Билай В.И. Основы общей микологии. – Киев: Выща шк., 1989. – 392 с. 2. ГОСТ 30494-96. Здания жилые и общественные. Параметры микроклимата в помещениях. 3. Желтикова Т.М. К вопросу о допустимом уровне микромицетов в воздухе помещений. // Проблемы медицинской микологии, 2009. Т11. №2. С 41-42. 4. Митрофанов В.С., Свирщевская Е.В. Аспергиллез легких. – СПб.: Фолиант, 2005. – 144 с. 5. СанПиН 2.1.2.2645-10 Санитарно-эпидемиологические требования к условиям проживания в жилых зданиях и помещениях. 6. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. 7. Тутельян В.А., Кравченко Л.В. Микотоксины (Медицинские и биологические аспекты). – М.: Медицина, 1985. – 320 с. 8. WHO. Indoor air quality: biological contaminants. Report on a WHO meeting. Copenhagen: WHO Regional publications. 1990. №31. P.1-67. (www.euro.who.int). ОЦЕНКА ФУНГИЦИДНЫХ СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ С.Ю. Баландина1, И.Н. Кирьянова1, М.В. Злыгостева1, В.В. Рябов2 1 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] 2 ЗАО «Петроспирт», г. Санкт-Петербург Проведена оценка фунгицидной активности дезинфицирующих препаратов в отношении условно патогенных грибов: Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum и Cladosporium cladosporioides, 273 выделенных из больничной среды лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ). Подобраны новые режимы по применению дезинфицирующих средств. ESTIMATION OF FUNGICIDAL PROPERTIES OF SOME DISINFECTANTS S.U. Balandina1, I.N. Kiryanova1, M.V. Zlygosteva1, V.V. Ryabov2 1 Natural Science Institute, [email protected] 2 LLC «Petrospirt», St. Petersburg Assessment was carried out fungicidal activity of disinfectants in relation to conditionally pathogenic fungi: Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum and Cladosporium cladosporioides. Molds were isolated from the hospital environment treatment-and-prophylactic institutions (TPI). New modes are selected on the application of disinfectants. Введение. Для помещений различной категорий чистоты системы здравоохранения предъявляются повышенные требования в отношении вероятности их микробного загрязнения. Особенностью микробных загрязнений является их спонтанное развитие, связанное с ненадлежащими температурой и влажностью, а главное – с некачественной уборкой помещений ЛПУ и неправильным подбором дезинфицирующих средств. В палаты, диагностические и лечебные кабинеты, в том числе операционные палаты, споры грибов могут приноситься потоками воздуха из приточно-вытяжной системы вентиляции и кондиционирования в случаях роста колоний грибов на стенах вентиляционных шахт или водосборниках кондиционеров [1]. Последнее время все чаще плесневые грибы вызывают заболевания у людей с иммунодефицитами, страдающих хроническими системными заболеваниями. Кроме того, грибы способствуют обострению и развитию аллергенных заболеваний. Восприимчивость к грибковым заболеваниям различна, она широко варьирует в зависимости от агрессивности гриба и чувствительности макроорганизма, условий труда и социальных условий. Среди выделенных в больничной среде плесневых грибов большой удельный вес занимают грибы: Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum и Cladosporium cladosporioides. Данные микромицеты являются условно-патогенными и способны вызывать заболевания у людей с ослабленной иммунной системой. Самый устойчивый род – Aspergillus fumigatus, который относится к III группе патогенности, является возбудителем аспергиллеза у человека и животных, вызывающий легочную, костную, глазную, сердечно-сосудистую или носовую инфекцию. [5, 6]. Penicillium rubrum является продуцентом токсинов: патулина, 274 рубротоксина A и B, стеригматоцистина. Некоторые штаммы выделены из бронхиальных смывов от больных карциномой и из носового синуса больного, перенесшего пересадку костного мозга [2, 5]. Cladosporium cladosporioides – это один из наиболее часто встречающихся видов грибов на отмершем органическом материале и в воздухе. Способен вызывать легочные и кожные инфекции; возможны инфекция синусов и смешанная диссеминированная инфекция [5]. Эти виды плесневых грибов были использованы для оценки фунгицидного действия дезинфицирующих препаратов. При быстро возрастающем спектре возбудителей микозов и повышением устойчивости микроорганизмов к действию дезинфицирующих средств, необходима разработка новых эффективных дезинфицирующих средств с фунгицидным действием. Цель работы: выявление фунгицидного воздействия некоторых дезинфицирующих средств на штаммы плесневых грибов выделенных из больничной среды помещений лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ). Согласно общепринятым методам дезинфицирующие препараты эффективны при 99,99% обеззараживании инфицированных объектов. Материалы и методы. Для проведения исследований взяты 7-ми суточные тесткультуры – Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum и Cladosporium cladosporioides. В качестве питательной среды использовали селективную среду Чапека-Докса. Суспензию спор грибов готовили по ГОСТ 9.048–89 [3]. Фунгицидную активность дезинфицирующих препаратов оценивали стандартным методом с использованием 1–2 млрд. взвеси жизнеспособных спор в 1 мл питательной среды [4]. Модельными тест-поверхностями служили: кафель, оцинкованное железо и окрашенное дерево. Испытания дезинфицирующих средств проводилось 3-я методами: протиранием, орошением и погружением. Объекты исследования, используемые в медицинской практике – дезинфицирующие средства «Тетрамин» и «Делансин» (производство ЗАО «Петроспирт», г. Санкт-Петербург). Результаты и их обсуждение. На 1-ом этапе нами были исследованы режимы, рекомендованные в инструкции по применению дезинфицирующего препарата в отношении плесневых грибов для обработки поверхностей в ЛПУ («Тетрамин»). При отсутствии такового, режим, рекомендованный для обработки поверхностей от дерматофитов («Делансин»). В результате проведенных исследований по дезинфицирующему препарату «Тетрамин» установлено следующее: 1)выявлено, что режимы дезинфекции (концентрация 0,5% и 1,0%), указанные в инструкции не оказывают фунгицидного действия на выделенные культуры плесневых грибов. Процент обеззараживания составляет 97,99 – 99,09%. 2) В поиске фунгицидного эффекта исследованы рабочие концентрации 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, которые 275 обеззараживали поверхности менее чем 99,99% в отношении грибов Aspergillus fumigates. 3)Исследование препарата методом однократного протирания в концентрации 1,5% и 2,0% при экспозиции 30 и 15 минут, соответственно положительного результата не показало (95,84 – 99,55% обеззараживания); 4) При использовании методов двукратного протирания и двукратного орошения (с интервалом 15 минут) в концентрации 2,0% обеззараживание модельных поверхностей составляет менее 99,99%. 5) Установлено, что целесообразнее дезинфицирующее средство наносить двукратно, т.к. через 15 минут препарат высыхал. 6) При исследовании фунгицидных свойств методом замачивания или погружения был достигнут 100,0%-ный эффект обеззараживания, в концентрации 2,0% при экспозиции 30 минут в отношении всех трех видов плесневых грибов, что соответствует режиму обеззараживания методом погружения указанном в инструкции. Таким образом, экспериментально был подобран оптимальный режим дезинфекции для препарата «Тетрамин». Результаты исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 – Эффективность действия дезинфицирующего препарата «Тетрамин» в отношении плесневых грибов, выделенных из больничной среды Объект обеззараживания Двукратное протирание с интервалом 15 минут Концентрация Время рабочего раствора обеззараживания (по препарату), % мин. Эффективность обеззараживания % в отношении Aspergillus fumigatus Дезинфицирующее средство «Тетрамин» 3,0 15'+15' Penicillium rubrum Cladosporium cladosporioides 99,99 100,0 99,98 – 99,99 Двукратное орошение с 3,0 15'+15' 99,97 - 99,98 99,99 – 100,0 интервалом 15 минут Замачивание 2,0 30' 100,0 100,0 Примечание: режим дезинфекции против плесневых грибов установленный экспериментально 100,0 100,0 Проведенные исследования фунгицидных свойств дезинфицирующих препарата «Тетрамин» на поверхностях, искусственно контаминированных спорами плесневых грибов: Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum и Cladosporium cladosporioides показали, что для достижения 99,97 - 100,0% фунгицидного эффекта в ЛПУ следует использовать 3,0% раствор препарата. Способы обеззараживания: двукратное протирание или орошение при 30 минут времени выдержки, с интервалом 15 минут, включая системы вентиляции. Потому как в последнее время дезинфекция систем вентиляции и кондиционирования воздуха в ЛПУ имеет важное значение для обеспечения благоприятной в микробиологическом отношении воздушной среды помещений относящихся к «чистым» и «особо чистым». Для достижения 100,0%-ного эффекта обеззараживания препарата методом замачивания или погружения необходим 2,0% рабочий раствор при экспозиции 30 минут в отношении всех трех видов плесневых грибов. 276 В результате исследования дезинфицирующего средства «Делансин» на выявление фунгицидного действия было установлено следующее: – при исследовании препарата методом протирания в концентрации 2,0% при экспозиции 30 минут и 60 минут фунгицидного эффекта не достигнуто. Процент обеззараживания составил 35,44 – 95,93%. 3,0%-ная концентрация препарата при экспозиции 30 минут обеззараживает поверхности на 77,50 – 95,15%; – обеззараживание модельных поверхностей методом однократного орошения в концентрации 2,0% и времени выдержки 30 минут и 60 минут, а также при концентрации 3,0% при экспозиции 30 мин. было не эффективно (процент обеззараживания менее 97,75%); – применение 2% рабочих растворов при двукратном протирании (с интервалом 15 минут) показали обеззараживание 3-х видов поверхностей на 90,42 – 98,09%; – при двукратном орошении поверхностей рабочего раствора в концентрации 2,0% с интервалом 15 минут процент обеззараживания составил 81,67 – 96,73%; – фунгицидный эффект препарата методом замачивания или погружения составил 99,93% при использовании его 2% раствора и выдержке 60 минут. В поиске фунгицидного действия дезинфицирующего препарата «Делансин» экспериментально был достигнут 99,99 – 100,0% эффект обеззараживания. Результаты исследований представлены в таблице 2. Таблица 2 – Эффективность действия дезинфицирующего препарата «Делансин» в отношении плесневых грибов, выделенных из больничной среды Объект обеззараживания Концентрация Эффективность обеззараживания % в отношении Время рабочего обеззараживания Aspergillus Penicillium Cladosporium раствора (по мин. fumigatus rubrum cladosporioides препарату), % Дезинфицирующее средство «Делансин» Двукратное протирание с 3,0 15'+15' 99,99 - 100,0 99,99 – 100,0 интервалом 15 минут Двукратное орошение с 3,0 15'+15' 99,99 - 100,0 99,99 – 100,0 интервалом 15 минут Замачивание 3,0 30' 100,0 100,0 Примечание: режим дезинфекции против плесневых грибов установленный экспериментально 100,0 100,0 100,0 Фунгицидный эффект препарата был достигнут при 3,0%-ной концентрации раствора. Методы обеззараживания: двукратное протирание или орошение при 30 мин. времени выдержки, с интервалом 15 минут, включая системы вентиляции. Процент обеззараживания модельных поверхностей контаминированных спорами плесневых грибов Aspergillus fumigatus, Penicillium rubrum и Cladosporium cladosporioides составил 99,99 – 100,0%. Достигнут 100%-ный эффект обеззараживания методом замачивания или погружения в 3,0% рабочий раствор препарата «Делансин» при экспозиции 30 минут. 277 Экспериментально достигнутые нами режимы дезинфекции препаратов «Тетрамин» и «Делансин» были рекомендованы для внесения их в инструкции с дальнейшим использованием препаратов по назначению, а именно в ЛПУ, где необходимо регулярно использовать дезинфицирующие средства для соблюдения требований, изложенных в нормативных документах [7,8]. Литература 1. Биоповреждения больничных зданий и их влияние на здоровье человека. Под ред. А.П. Щербо и В.Б. Антонова. – СПб: МАПО, 2008. – 232 с. 2. Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинообразующих микромицетов. – Киев: Наук. думка, 1990. – 236 с. 3. ГОСТ 9.048-89. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов. 4. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности / Под ред. Шандала М.Г. и Пантелеевой Л.Г., Москва: МЗ РФ, 1998. – 72 с. 5. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно-патогенных грибов: Пер с англ. яз. – М.: Мир, 2001. – 486 с. 6. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. 7. СП 1.1.1.058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением противоэпидемических мероприятий». 8. СП 3.1.2485-09. Санитарно-эпидемиологические правила. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИК ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК НЕКОТОРЫХ ХВОЙНЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ Н.Н. Бельтюкова1,2, Ю.С. Нечаева2, Я.В. Пришнивская1, К.Е. Тайман1 1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 2 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected], [email protected] Проведен подбор и оптимизация методик выделения для ДНК некоторых хвойных видов растений, на примере трех ресурсных видов растений Пермского края: ель сибирская (Picea obovata Ledeb.), сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) и лиственница Сукачева (Larix sukaczevii Dyl.). Оценена возможность использования выделенной ДНК для изучения генетического полиморфизма посредством ПЦР с пятью ISSR-праймерами. Рекомендован наиболее оптимальный и доступный метод выделения геномной ДНК хвойных видов растений. 278 OPTIMIZATION OF METHODS FOR DNA EXTRACTION OF SOME CONIFEROUS SPECIES PLANT OF PERM KRAI N.N. Beltukova1,2, U.S. Nechaevaа2, Y.V. Prischivskaya1, K.E. Tayman1 1 Perm State University 2 Natural Science Institute, [email protected], [email protected], [email protected] The selection and optimization of DNA extraction methods of some conifer species, using three species of Perm krai: Picea obovata Ledeb., Pinus sylvestris L. and Larix sukaczevii Dyl. The possibility of the use of extracted DNA to study genetic polymorphism by PCR with the five ISSR-primers is evaluated. The most appropriate and affordable method for extracting of total DNA of coniferous plant species is recommended. В настоящее время для решения современных проблем лесоводства необходима оценка биоразнообразия лесных экосистем, важным элементом которой является изучение генофонда основных лесообразующих пород. Генетическая структура определяет адаптивный потенциал и устойчивость природных популяций, поэтому для разработки стратегии сохранения и рационального использования лесных ресурсов необходимы глубокие знания их генетического разнообразия. Одним из основных методов изучения динамики состояния генофондов является молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК [2]. Данные, полученные с его помощью, могут оказаться перспективным для создания селекционно-генетической основы дальнейшего плантационного выращивания высокопродуктивных и устойчивых форм для нужд лесопромышленного комплекса. Генофонд ценных ресурсных хвойных видов растений в Пермском крае молекулярно-генетическими методами не изучен. Для проведения молекулярно-генетического анализа и получения достоверных результатов необходимо выделение очищенной геномной ДНК, что в случае древесных растений, производящих большое количество вторичных метаболитов и эфирных масел, таких как хвойные, может оказаться трудоемким и дорогостоящим. Цель данной работы – подбор оптимального метода выделения геномной ДНК хвойных видов деревьев; проведение полимеразной цепной реакции последовательностей ДНК с использованием ISSR-маркеров, анализ дискретных ДНК-продуктов амплификации. Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования были избраны три ресурсных вида хвойных растений Пермскрго края: ель сибирская (Picea obovata Ledeb.), сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) и лиственница Сукачева (Larix sukaczevii Dyl.). Геномную ДНК выделяли тремя методами: первый – с помощью 279 коммерческого набора «ChargeSwitch gDNA Plant Kit» на приборе «Thermo scientific KingFisher mL»; второй модифицированный метод С.O. Роджерса и Э.Дж.Бендича [4]), c использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone, [3]); третий метод выделения ДНК – с использованием СТАВ по методике A.M. Торрес c соавторами [5]. Материалом для выделения служили свежие почки и хвоя избранных для изучения видов растений. Каждая навеска составляла 100 мг. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000». Для молекулярно-генетического анализа использовался ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeats) [6]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с пятью праймерами CR–215 ((СA)6GТ) [1], M1 ((AC)8 CG), M12 ((AGC)6G), X9 ((ACС)6G), X10 ((AGC)6C). Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мM dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72ºС. Температура отжига в зависимости от праймера варьировала от 56 до 64°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Результаты и обсуждение При выделении ДНК из почек и хвои изучаемых видов растений с помощью набора «ChargeSwitch gDNA Plant Kit» концентрация геномной ДНК P. obovata по оптическому поглощению препарата при длинах волн 260 нм (А260) составляла 70–140 нг/мкл, L sukaczevii – 80–110 нг/мкл, а P. sylvestris – 26–30 нг/мкл. Чистота препарата А260/280 (соотношение между оптическом поглощением нуклеиновых кислот при А260 и оптическим поглощением белков при длине волны 280 нм) для P. obovata и L. sukaczevii варьирует от 1,6 до 2,0, а для ДНК P. sylvestris этот показатель изменялся от 2,4 до 2,7. ДНК, выделенная модифицированным методом С.O. Роджерса и Э.Дж. Бендича (с использованием в качестве сорбента PVPP) для P. obovata и L. sukaczevii, имела концентрацию 170 и выше нг/мкл, а значение А260/280 колебалось от 1,8 до 2,4. Концентрация геномной ДНК P. sylvestris составляла 60–95 нг/мкл, а показатель А260/280 варьировал от 1,95 до 2,0. При использовании метода A. M. Торреса концентрация ДНК P. obovata находилась в пределах от 1000 до 4000 нг/мкл, L. sukaczevii – от 500 до 1600 нг/мкл, с показателем А260/280 от 1,9 до 280 2,0; концентрация P. sylvestris – от 900 и выше нг/мкл, с показателем чистоты от 1,8 до 2,0 (таблица 1). Таблица 1 – Сравнение трех методов выделения ДНК Метод выделения вид 1 2 3 концентрация, нг/мкл чистота (А260/280) концентрация, нг/мкл чистота (А260/280) концентрация, нг/мкл чистота (А260/280) P. obovata 70 – 140 1,8 – 2,0 250 – 12311 1,9 1000 – 4000 1,9 – 2,0 L. sukaczevii 80 – 110 1,6 – 1,8 170 – 1100 1,8 – 2,4 500 – 1600 1,9 – 2,0 P. silvestris 26 – 30 2,4 – 2,7 60 – 95 1,9 – 2,0 900 – 10000 1,8 – 2,0 Примечание: 1 – метод с использованием набора «ChargeSwitch gDNA Plant Kit», 2 – метод С.O. Роджерса и Э.Дж. Бендича с использованием СТАВ [4], 3 – метод A.M. Торреса c соавторами с использованием СТАВ[5] Для оценки пригодности выделенной ДНК для ПЦР и изучения генетического полиморфизма применялся ISSR-метод. Анализ продуктов амплификации геномной ДНК выделенной различными методами после электрофоретического анализа в 1,7% агарозном геле показал, что возможно четко идентифицировать продукты амплификации и их размер. При использовании всех трех методов выделения были получены приемлемые значения концентрации и чистоты ДНК, которая может быть использована для проведения ПЦР Таким образом, предварительные данные показали, что образцы геномной ДНК, выделенные сравнительно не дорогими СТАВ-методами по качественным характеристикам практически не отличаются от дорогостоящих методов Kits, и могут так же успешно применяться в работах по изучению генетического полиморфизма. При учете времени, затраченного на работу, наиболее приемлемым оказался метод A.M. Torres, который можно рекомендовать для изучения генетической гетерогенности ресурсных хвойных видов растений. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (номер государственной регистрации темы НИР 01201150303). Литература 1. Гут Р.Т. Характерные особенности выделения суммарной ДНК из листьев и почек древесных растений при изучении генетического полиморфизма / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницкий // ИВУЗ. Лесной журнал. – 2005 – №5 – 25-30с. 2. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред.Ю. П. Алтухова. – М.: Наука. – 2004. – 619с. 3. Звягин А.С., Трошин Л.П. Выделение ДНК из листьев Vitis vinifera L./ А. С. Звягин, Л. П. Трошин // Научный журнал КубГАУ.. – 2010 – №60. – 571-587с. 281 4. Rogers S.O. & Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues./ S. O. Rogers &A. J. Bendich // Plant Molecular Biology. – 1985. – V. 5. – Р. 69-76. 5. Torres A.M., Weeden N.F, Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba/ A.M. Torres, N.F. Weeden, A. Martin // Theor. Appl. Genet. V.5. – 1993. – 937–945. 6. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)- anchored polymerase chain reaction amplification/ E. Zietkiewicz, A. Rafalski., D. Labuda // Genomics. – 1994 – V.20. – Р. 176– 183. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРЕХ СОРТОВ TRITICUM AESTIVUM L. И.В. Бобошина1,2 1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 2 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] Проведен молекулярно-генетический анализ трех сортов Triticum aestivum L. с использованием ISSRметода. Определены маркирования показатели генофонда полиморфизма так T. aestivum, как ДНК. ISSR–маркеры являются высоко рекомендуются полиморфными, для четко воспроизводимыми и стабильными маркерами. THE MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF THREE GRADES TRITICUM AESTIVUM L. I.V. Bobochina1,2 1 Perm State University 2 Natural Science Institute, [email protected] The molecular genetic analysis of three grades Triticum aestivum L. is carried out by ISSR-method. Indicators of polymorphism of DNA are defined. ISSR-markers are recommended for marking of gene pools T. aestivum because they are highly polymorphic, accurately reproduced and stable markers. К настоящему времени установлено, что генетические различия между отдельными организмами наиболее полно представлены на уровне ДНК. С помощью современных молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации 282 отдельных сортов, линий и форм сельскохозяйственных растений. Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации. Они позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую силу анализа [1]. Для изучения полиморфизма ДНК перспективен ISSR-метод (Inter-Simple Sequence Repeats) [5] или межмикросателлитный анализ, который позволил выявить высокий уровень генетического разнообразия у различных сельскохозяйственных культур [3]. Пшеница мягкая (Triticum aestivum L.) является важнейшей сельскохозяйственной культурой: более ¾ населения использует в пищу продукты переработки ее зерна [2]. Нами проведен молекулярно-генетический анализ трех сортов пшеницы мягкой (T. aestivum), районированных в Пермском крае: «Горноуральская», «Иргина» и «Московская 39». Амплификацию ДНК проводили с использованием 5 ISSR-праймеров, синтезированных в ЗАО «Синтол» (г. Москва). Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, проводили в 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию термоциклерах амплификации ISSR-методом «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва). Для использовалась следующая программа: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72ºС. Температура отжига в зависимости от праймера варьировала от 55 до 60°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее двух раз. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем УФ-свете в системе гельдокументации Gel Doc XR («Bio-Rad», USA). Определение длин фрагментов ДНК проводили с использованием программы «Quantity One» и маркера молекулярного веса (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder, «ООО-СибЭнзим-М», Москва). При молекулярно-генетическом анализе T. aestivum у сорта «Горноуральская» выявлено 48 ISSR-фрагментов (таблица 1). Число ампликонов варьировало от 7 (праймер Х10) до 12 (праймер М1). У сорта «Иргина» выявлено 35 ISSR-фрагментов. Число ампликонов варьировало от 6 (праймеры М27, Х10) до 9 (праймер М1). При ISSRмаркировании сорта «Московская 39» выявлено 43 фрагмента. Число ампликонов 283 варьировало от 6 (праймер Х10) до 11 (праймер М3). Длины фрагментов у сорта «Горноуральская» варьировали от 200 пн (праймер Х10) до 1130 пн (праймеры М1, М3, М27), у сорта «Иргина» – от 130 пн (праймер М1) до 910 пн (праймер М1), а у сорта «Московская 39»–от 130 (праймеры М1, М3) до 1130 (праймер Х11). Таблица 1 – Характеристика ISSR-фрагментов трех сортов T. aestivum Нуклеотидна Размеры Число фрагментов ДНК последовательность фрагментов «Горноуральская» «Иргина» «Московская 39» (5'→ 3') , пн М1 (AC)8CG 130–1130 12 (0,92) 9 (0,89) 10 (0,80) М3 (AC)8CT 130–1130 9 (0,78) 7 (0,43) 11 (0,91) М27 (GA)8C 200–1130 11 (0,91) 6 (1,00) 9 (0,67) Х10 (AGC)6C 140–800 7 (1,00) 6 (0,33) 6 (0,67) Х11 (AGC)6G 270–1130 9 (1,00) 7 (1,00) 7 (1,00) Всего: 48 (0,92) 35 (0,74) 43 (0,81) Примечание: в скобках указаны доли полиморфных фрагментов ДНК Праймер Полиморфизм ДНК, выявленный ISSR-методом, у сорта «Горноуральская» составил 91,7%, у сорта «Иргина» – 74,3 % и у сорта «Московская 39» – 81,4%. Таким образом, на основании ISSR-анализа полиморфизма ДНК T. aestivum установлено, что сорт «Горноуральская» характеризуется более высоким уровнем генетического полиморфизма, чем сорта «Иргина» и «Московская 39». Необходимо также изучать качественный состав разнообразия. В дальнейшем планируется использовать и другой метод исследования ДНК на основе ПЦР – IRAP (InterRetrotransposon Amplified Polymorphism) [4]. Это позволит увеличить число ДНК-маркеров, а значит более точно идентифицировать молекулярно-генетическую основу каждого важного сельскохозяйственного сорта T. aestivum. Работа выполнена при частичном финансировании АВЦП "Развитие научного потенциала высшей школы" (тема НИР с номером государственной регистрации 01201054037) и проекта национального исследовательского университета. Литература 1. Малышев С.В. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров / С.В. Малышев // Методические рекомендации. – Минск. – 2006. – 27с. 2. Мельникова Н.В. Мировое разнообразие твердой пшеницы (Triticum durum Desf.) по аллелям глиадинкодирующих локусов: автореф. дис… канд. биол. наук.– Москва. – 2010. – 24 с. 3. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Боронникова С.В. ISSR-маркирование генома Populus tremula L. / Т.Н. Светлакова, И.В. Бобошина, С.В. Боронникова // Биотехнологии начала III тысячелетия: сборник тезисов Международной научной конференции. Саранск, ООО «Мордовия – Экспо». – 2010. – С. 86. 284 4. Kalendar R., Grob T., Regina M. et al. IRAP and REMAP: two new retrotransposon–based DNA fingerprinting techniques/ R. Kalendar, T. Grob, M. Regina et al. // Theor. and Applied Genetics. – 1999. – V. 98. – P. 704–711. 5. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. – 1994. – V. 20. – P. 176–183. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: СОСТОЯНИЕ, ПРОБЛЕМЫ И НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ С.В. Боронникова1,2 1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 2 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет, [email protected] Рассмотрены проблемы и перспективы развития молекулярно-генетических исследований, сформулированы основные принципы молекулярно-генетического маркирования геномов растений, разработаны критерии и шкала оценки состояния их генофондов. Определены популяции редких лекарственных видов растений Пермского края с типичными и специфическими особенностями генофондов. MOLECULAR-GENETIC RESEARCHES: STATE, PROBLEMS, DIRECTIONS OF DEVELOPMENT S.V. Boronnikova1,2 1 Perm State University 2 Natural Science Institute, [email protected] The problems and prospects of development of molecular genetic researches w are described, the basicprinciples of molecular genetic marking of genoms of plants are formulated, the criteria and scale preservation of gene pools are developed, the populations of rare medicinal plants from Perms krai with specific features of gene pools are defined. Характерной особенностью современной биологии является доминирование в познании явлений жизни идеологии и методологии молекулярной биологии. Интенсивно развиваются 285 интегральная молекулярная биология и генетика, методы которых позволяют проводить анализ и синтез большого объема молекулярно-генетической информации [3]. До расшифровки геномов исследователи имели дело с отдельными биологическими молекулами, в том числе генами. Анализ генетического разнообразия проводился методами анализа белков и ДНК-фингерпринтинга. Изменчивость белков отражает лишь часть всех различий в нуклеотидных последовательностях ДНК. Не весь геном, а лишь его часть кодирует и экспрессирует какие-либо белки. А изменения в некодирующей части генома или регуляторных районах генов выпадают из поля зрения исследователей. С появлением методики, позволяющей оперировать с ДНК, внимание исследователей в значительной степени переключилось на нуклеиновые кислоты как источник информативного полиморфизма. Были разработаны молекулярные методы исследования организмов с использованием ДНК-маркеров. Совокупность этих методов, получивших название ДНКфингерпринтинг, довольно широко используется для решения разнообразных задач в различных областях биологии [5]. Решающую роль в становлении и развитии ДНК-маркеров сыграло открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Большое количество разнообразных ДНК-технологий построено на этом принципе. В конце прошлого и в начале этого столетия ДНК-маркеры полиморфизма различных генетических элементов получили широкое применение во всех направлениях исследований генофондов. Этап развития биологии после расшифровки генома человека (2001 год) и геномов других организмов методом секвенирования последовательностей ДНК назван постгеномной эрой биологических исследований. Ученые оперируют с крупными массивами генов, пытаясь понять гармонию сложнейшей системы взаимодействий геномов, их продуктов, клеточных структур и систем сигнализации [4]. Основные направления развития биологии в постгеномную эру в фундаментальных исследованиях являются создание генетических коллекций, идентификация большинства генов, построение глобальной регуляторной карты геномов, классификация генов по биохимическим функциям их продуктов, идентификация всех потенциальных белков и доменов, анализ распределения полиморфизма и мутаций, определение эволюционных и популяционных взаимосвязей и многие другие. В прикладных исследованиях будут доминировать диагностика предрасположенности к заболеваниям, фармакогенетика, генная терапия, создание лекарств нового поколения, а именно эндогенных биостимуляторов, ДНК-вакцин; экспресс-диагностика вновь появляющихся инфекций, идентификация личности в судебной медицине. В сельском хозяйстве будут актуальны диагностика болезней, идентификация генетических признаков пород и сортов, получение животных и растений с улучшенными свойствами после направленного изменения из геномов, а также использование новых технологий для развития производства 286 пищевых продуктов, использование новых технологий для контроля и улучшения экологической ситуации [4]. Одним из перспективных направлений современной биологии является функциональная геномика, основной целью которой является определение функции генов с применением технологий, таких как микрочипы и ПЦР в реальном времени. Данные молекулярно-генетического анализа популяций редких и лекарственных видов растений Пермского края послужили основой для разработки и создания концепции идентификации популяционных генофондов растений на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК [1]. Тандемно организованные повторяющиеся последовательности ДНК различных типов широко представлены в эукариотических геномах. Они варьируют по длине кластера и размеру повторяющегося звена. Среди них наиболее полиморфными являются минисателлитные и микросателлитные ДНК, а также ретротранспозоны. Нами сформулировали основные принципы молекулярно-генетического маркирования геномов: использование высоко полиморфных молекулярных маркеров, основанных на широко представленных в геномах тандемных повторах; использование не менее двух типов молекулярных маркеров ДНК, основанных на различных структурных повторяющихся элементах генома; один из используемых молекулярных маркеров должен быть основан на вариабельных элементах генома, например, мобильных генетических элементах – ретротранспозонах; оценка полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК; выявление общих (идентификационных) для рода и вида мономорфных фрагментов ДНК и характеристика популяционных генофондов посредством сочетание полиморфных фрагментов ДНК; обобщение характеристик генофондов в виде молекулярно-генетической формулы, штрих-кода и генетического паспорта Анализ генетического разнообразия редких и ресурсных видов растений на основании оценки полиморфизма ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats, [7]) и IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism, [6])–маркеров предложен в качестве критерия оценки состояния их генофондов. Разработана шкала и дана оценка состояния 20 популяционных генофондов. Определены популяции с типичными и специфическими особенностями генофондов и составлены их генетические паспорта [2]. Разработанные нами подходы и технологии позволяют дать оценку генофондам растений в гетерогенной среде и рекомендовать меры охраны их популяционных систем. Работа выполнена при частичном финансировании АВЦП "Развитие научного потенциала высшей школы" (темы НИР с номерами государственной регистрации 01201054037 и 01201150303) и проекта национального исследовательского университета. 287 Литература 1. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений. – Перм. ун-т. Пермь, 2008. – 120с. 2. Боронникова С.В. Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края: автореф. дис… д-ра биол. наук. – Пермь: Изд-во ПГТУ, 2009.–44с. 3. Плотников В.К. Еще раз об изучении слона слепыми мудрецами /В. К. Плотников // Научное наследие Николая Ивановича Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства: Материалы Междунар. науч. конф. – М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2008. – С. 146–151. 4. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине/ С. Примроуз, Р. Тваймен; пер. с англ. – М.БИНОМ:Лаборатория знаний, 2010. 277с. 5. Чесноков Ю.В. ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений / Ю. В. Чесноков // Сельскохоз. биология. – 2005. – № 1. – С. 20–40. 6. Kalendar R., Grob T., Regina M. et al. IRAP and REMAP: two new retrotransposon–based DNA fingerprinting techniques/ R. Kalendar, T. Grob, M. Regina et al. // Theor. and Applied Genetics. – 1999. – V. 98. – P. 704–711. 7. Zietkiewic E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification /E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. – 1994. –V. 20. –P. 176183. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДНК ГЕНОМНЫХ МАРКЕРОВ РАСТЕНИЙ C ЦЕЛЬЮ ИЗУЧЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ С.В. Боронникова1,2, Н.Н. Бельтюкова1,2, Т.Н. Светлакова1,2, И.В. Бобошина1,2, Ю.С. Нечаева2, С.А. Кольцов1 1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 2 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] Изучены популяционные генофонды культурных и дикорастущих ресурсных, редких травянистых и древесных видов растений. Проанализирован полиморфизм ДНК 800 геномных маркеров, основанных на микросателлитах и ретротранспозонах (ISSR-PCR – и IRAP-PCR-маркеры). Разработана концепция молекулярно-генетической идентификации и оценки состояния генофондов. Рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных видов растений. 288 THE ANALYSIS OF POLIMORFYSM DNA OF GENOMS PLANTS MARKERS FOR BIODIVERSITY RESEARCH S.V. Boronnikova1,2, N.N. Beltukova1,2, Т.N. Svetlakova1,2, I.V. Bobochina1,2, U.S. Nechaevaа2, S.А. Kolzov1 1 Perm State University 2 Natural Science Institute, [email protected]; [email protected], [email protected];[email protected]; Aeneas"<[email protected] The population gene pools of cultivated and wild-growing resource and rare species of grassy and woody plants are studied. The polymorphism of DNA of 800genomic markers, based on microsatellite and retrotransposon (ISSR-PCR-and IRAP-PCR-markers) is analyzed. The molecular-genetic identification concept and estimation of condition the gene pools of plants is developed. The scientifically proved of gene preservation of the studied kinds of plants are recommended. Биологическое разнообразие является мировым достоянием огромной ценности для нынешних и будущих поколений. Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности [6,7]. Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся условиям окружающей среды [6,7,8]. Проблема потери генетического разнообразия одна из главных в постиндустриальных обществах. Несмотря на «Красные книги», наличие конвенции о биологическом разнообразии, парки, заповедники, охраняемые территории и так далее, антропогенное давление приведет к исчезновению из биосферы в ближайшее время по разным подсчетам до 10–15% составляющих ее видов. Кроме этого, генетическое разнообразие – один из необходимых и достаточных элементов устойчивого развития. Ближайшая задача состоит не столько в том, чтобы найти новые способы создания генетического разнообразия, а столько в том, чтобы найти новые методы критического анализа того разнообразия, которое уже обеспечено природой, то есть идентифицировать разные компоненты ценных признаков, в основе которых лежат молекулярно-биологические механизмы реализации генетической информации в особенности физиологии и развития растения [10]. Использование молекулярных ДНК маркеров открыло большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации 289 генов, их клонирования, конструирования новых сортов растений и паспортизации сортов. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне [5]. Наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений остается популяционный подход, поскольку до сих пор отсутствуют общепринятые методы идентификации не только популяционных, но даже видовых особенностей генофондов. В современном генетическом анализе центральным инструментом является генетический полиморфизм, выявляемый с помощью молекулярных маркеров. Анализ молекулярно-генетических маркеров полиморфизма различных участков геномной ДНК позволил выявлять внутривидовое генетическое разнообразие, оценить гетерозиготность, реконструировать филогенетические взаимоотношения между видами и пространственные взаимосвязи между популяциями [1]. Популяционный подход очень важен, так как именно при данном подходе используется одно из свойств популяции – способность к устойчивому поддержанию численности при внешних возмущениях системы. В связи с этим применение популяции в качестве индикационного объекта позволяет выявить общие закономерности устойчивости при антропогенном воздействии. В то же время, эффективность использования традиционных молекулярно-генетических маркеров (структурных генов, мини- и микросателлитных локусов) для исследований генофондов до сих пор остается достаточно низкой из-за ограниченности количества локусов, доступных для одновременного генотипирования особей. Это требует поиска новых подходов одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков, которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного индивидуума и, таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия – отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению. Нами впервые получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии популяций ряда редких травянистых реликтовых видов растений, произрастающих на территории Пермского края: адониса весеннего (Adonis vernalis L.), адониса сибирского (Adonis sibirica Patrin ex Ledeb.), бубенчика лилиелистного (Adenophora lilifolia (L.) A.DC.), пиона уклоняющегося (Paeonia anomala L.), наперстянки крупноцветковой (Digitalis grandiflora Mill.), ресурсных видов растений (тополь дрожащий Populus tremula L., сосна обыкновенная Pinus sylvestris L.), основной продовольственной культуры пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.), а также ряда редких для Пермского края папоротников (многорядник Брауна (Polystichum braunii (Spenn.) Fée), многорядник копьевидный (Polystichum lonchitis 290 (L.) Roth), многоножка обыкновенная (Polypodium vulgare L.). У изученных лекарственных растений выявлены и проанализированы 800 молекулярных маркеров. Уникальностью проделанной работы является то, что одновременно проанализирован полиморфизм ДНК геномных маркеров двух типов [4], основанных на тандемных повторах, таких как микросателлиты (ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats, [12]) и ретротранспозоны (IRAP–Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism, [11]). Впервые оценена эффективность в исследованиях генофондов редких и ресурсных видов растений IRAP-метода, который основан на использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы последовательности ДНК пяти лекарственных видов растений Пермского края. Нуклеотидные последовательности LTR-ретротранспозонов некоторых редких видов растений были включены в мировую базу генетических данных «GenBank» NCBI под номерами: EF191000-EF191012 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Определены основные показатели генетического разнообразия на популяционном уровне. Установлено, что изученные популяции лекарственных видов растений характеризуются высокими показателями генетического разнообразия: на основании анализа полиморфизма ISSRмаркеров доля полиморфных локусов ( Р95 ) варьировала в пределах от 81.08% до 91.74%, а на основании IRAP-маркеров – от 80.43 до 92.91%. Выявлен высокий уровень межпопуляционной дифференциации у A. vernalis (коэффициент подразделенности популяций G ST =0.400) и у A. sibirica – (0.360); и низкий ее уровень у D. grandiflora (0.270) и у Ad. lilifolia (0.155). Даны характеристики изученных популяций с указанием показателей численности, возрастного спектра и определением степени антропогенного воздействия [2]. Впервые разработана концепция идентификации генофондов редких и ресурсных видов растений с использованием оценок геномного распределения повторов, таких как микросателлиты и ретротранспозоны. С целью оптимизации сохранения генофондов редких и ресурсных видов растений разработана методика молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярногенетической формулы, штрихкода и генетического паспорта [3]. На основании полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных видов растений при естественных колебаниях и антропогенной трансформации среды, а также разработаны подходы оптимизации сохранения генофондов редких и ресурсных видов растений. 291 Работа выполнена при частичном финансировании АВЦП "Развитие научного потенциала высшей школы" (темы НИР с номерами государственной регистрации 01201054037 и 01201150303) и проекта национального исследовательского университета. Литература 1. Алтухов Ю.П Генетика популяций и сохранение биоразнообразия / Ю. П Алтухов // Соросовский образоват. журн. – 1995. – №1. – С.32–43. 2. Бельтюкова Н.Н. Оценка состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений Пермского края с использованием молекулярно-генетических методов: автореф. дис… к-та биол. наук.– Пермь, 2010. – 19 с. 3. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений. – Перм. ун-т. Пермь, 2008. – 120с. 4. Боронникова С.В. Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края: автореф. дис… д-ра биол. наук.– Пермь: Изд-во ПГТУ, 2009. – 44 с. 5. Гостимский С.А., Кокаева З. Г., Коновалов Ф. А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С. А. Гостимский, З .Г. Кокаева, Ф. А. Коновалов // Генетика. – 2005. – Т. 41, № 4. – С. 480–490. 6. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред.. Ю. П. Алтухова. – М.: Наука, 2004. – 619 с. 7. Конвенция о биологическом разнообразии [Электронный ресурс]. – Рио-де-Жанейро, 1992. – URL: http://www.isu.ru/inst/botcad/cbd/cbd_rus.htm (дата обращения: 10.06.2009). 8. Лебедева Н. В., Дроздов Н. Н., Криволуцкий Д. А. Биоразнообразие и методы его оценки.– М.: МГУ. – 1999. –94 с. 9. Мэгарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. – М.: Мир, 1992.–184 с. 10. Плотников В.К. Еще раз об изучении слона слепыми мудрецами / В. К. Плотников // Научное наследие Николая Ивановича Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства: Материалы Междунар. науч. конф. – М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2008. – С. 146–151. 11. Kalendar R., Grob T., Regina M. et al. IRAP and REMAP: two new retrotransposon–based DNA fingerprinting techniques/ R. Kalendar, T. Grob, M. Regina et al. // Theor. and Applied Genetics. – 1999. – V. 98. – P. 704–711. 12. Zietkiewic E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification /E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. – 1994. –V. 20. –P. 176183. 292 ИЗМЕНЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ПРОПОЛИСА В ПРОЦЕССЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ Р.В. Кайгородов Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] Исследовано валовое содержание макро- микро- и токсичных элементов в прополисе нативном, в водных, солевых, водно-спиртовых и спиртовых экстрактах, а также в прополисном шроте. Выявлены изменения состава экстрактов и остатков прополиса в зависимости от происхождения прополиса и способа экстракции. CHANGE OF MINERAL STRUCTURE OF PROPOLIS IN THE COURSE OF ALLOCATION OF OPERATING SUBSTANCES R.W. Kaygorodov Natural Science Institute, [email protected] The total maintenance makro - micro- and toxic elements in propolis, in water, salt, aqueous-alcoholic and spirit extracts, and also in the rest propolis extraction investigated. Changes of structure of extracts and the rests of propolis depending on origin of propolis and on way of extraction are revealed. Прополис является одним из важнейших продуктов пчеловодства, он образуется в результате переработки пчелами смолистых веществ растительного происхождения. Прополис обладает сложнейшим химическим составом, в нѐм по оценкам разных авторов насчитывается от 50 до 200 и более соединений разной природы и широко используется в косметической и фармацевтической промышленности. Из минеральных элементов в прополисе преимущественно содержаться K, Ca, P, Na, Mg, S, Cl, Al, Fe, V, Mn, Zn, Cu, Si, Sr, Se, F, Co [1, 4, 5]. Вследствие высокого содержания жироподобных веществ и восков прополис обладает способностью к повышенному накоплению тяжелых металлов – свинца, кадмия [2, 3]. Большинство из загрязнителей чрезвычайно устойчивы и сохраняются в продуктах переработки и экстракции прополиса или трансформируются в более токсичные соединения. В связи с этим прополис, промежуточные, конечные продукты экстракции, жмых и продукты глубокой переработки (в случае дальнейшего использования) должны 293 подвергаться обязательному контролю на соответствие санитарно-гигиеническим требованиям. Для разработки способов рационального промышленного использования продуктов и остатков экстракции прополиса необходимо исследование содержания минеральных питательных и токсичных элементов в исходном сырье прополиса, в промежуточных и конечных продуктах экстракции и остатках. Наиболее распространенными способами промышленной переработки прополиса являются водная, водно-спиртовая и спиртовая экстракции. Водой и спиртом из прополиса нативного извлекаются: большая часть фенольных соединений (включая флавоноиды), витамины группы В, аминокислоты, органические кислоты, полигликозиды флавонолов, ацилированные флавоноиды, конденсированные фенольные соединения. Водорастворимые и спирторастворимые биологически активные вещества прополиса представляют используются в косметической, пищевой и фармацевтической промышленности. Тяжелая фракция гидрофобных компонентов прополиса – углеводороды, воски, сложные эфиры, эфиры, жирные кислоты, стероиды, которые также представляют определѐнный интерес для косметического, пищевого и фармацевтического производства, экстрагируют разными способами: перегонкой с водяным паром, экстракцией органическими растворителями (диэтиловый эфир, ацетон, петролейный эфир, гексан, бензол, толуол). Минеральные элементы прополиса соединения входят в состав неогранических солей, солей органических кислот, органо-минеральных комплексов, находятся на поверхности коллоидных частиц. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений минерального состава прополиса при разных способах экстракции действующих веществ. Материал и методы исследования. Объектами исследования послужили образцы прополиса разного географического происхождения: из России (Пермский край) и Прибалтики. Исследовали содержание водорастворимых, обменных и спирторастворимых микро-, макро- и токсичных элементов в жидких экстрактах и валовое содержание элементов в твердых остатках после разных способов экстрагирования. Экстрагирование водой 294 (кипячение), солью (1 М раствор NH4NO3), этиловым спиртом (98% и 70%) проводили четырьмя порциями по 25 мл соответствующего растворителя, нерастворенный остаток отделяли путем фильтрования, жидкую фазу (экстракты) объединяли в мерных колбах на 100 мл. Анализ химического состава проводили по схеме, приведенной в таблице 1. Таблица 1 – Схема исследования химического состава прополиса Экстракция Водная Анализируемая фаза Экстракт Испытуемая фракция Водорастиримая Водно-спиртовая (98% этанол после водной экстракции) Экстракт, остаток Спирторастворимая, валовая Спиртовая 70- и 98%-ый этанол Остаток Валовая Солевая Экстракт, остаток Обменная, валовая Содержание элементов определяли методом оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Perkin Elmer 3300 RL с использованием мультиэлементного стандартного раствора Merck IV (23 элемента). Нижний предел обнаружения элементов составлял 1,0 мг/кг. Пробы анализировали в 4-х кратной повторности. Исследования проводили на базе Института химии окружающей среды университета «Leuphana» (г. Люнебург, Германия). Для статистической обработки данных использовали программу SigmaPlot 11.0. Результаты и их обсуждение. Содержание химических элементов в остатках (шрот) и экстрактах (жидкая фаза) прополиса представлено в таблицах 2 и 3. Изменения состава продуктов и остатков экстракции оценивали по повышению или понижению содержания элемента относительно сырья (прополиса нативного). В шроте прополиса после водно-спиртовой экстракции существенно снижается содержание большинства элементов, что говорит об их выделении в ходе водной экстракции. Таблица 2 – Состав твердых остатков экстракции прополиса (шрот), мг/кг Элемент Al Ca Cu Fe K Mg Mn Na Ni Pb Zn Нативный Водно-спиртовой Россия Прибалтика Россия Прибалтика 96 ± 3,8 331±16 12,3±1,1 99±4,2 494±4,9 115±3,2 88,6±0,3 88,6±0,3 8,1±0,4 4,22±1,1 13,4±1,4 140 ± 5,7 380±18,4 13,6±1,3 183±7,6 423±8,5 114±3,6 11,2±0,4 74 ± 1,3 8,1 ± 0,4 5,62±0,83 27,3±1,5 109±3,5 41,8±1,8 11,7±1,6 92,1±3,2 42,95±0,5 17,4±2,7 3,4±0,08 26,1±0,2 9,6±0,74 1,79±0,8 3,3±0,2 178±8,5 81,8±3,2 15,1±1,7 204±9,7 52,8±2,2 32,2±1,5 3,5±0,1 18,6±4,2 10,28±1,3 4,26±0,56 8,5±0,9 После экстракции: Спиртовой Спиртовой (этанол 70%) (Этанол 98%) Россия Прибалтика Россия Прибалтика 160±5,7 814±55 14,9±1,1 192±9,7 287±3,5 191±8,9 42,6±2,0 37,5±1,2 10,7±1,0 5,59±1,53 84,8±5,1 295 271±3,5 1655±120 23,9±1,7 398±11,6 739±17,7 467±33,2 39,7±1,2 29,9±9,6 15,3±1,7 9,49±1,3 69,7±3,4 202±2,1 902±50 14,1±1,1 277±8,6 1025±35 297±17 55,3±1,8 100±12 10,9±0,6 5,02±1,78 41,8±2,2 377±2,1 2185±120 19,5±0,9 492±19,3 2090±10 694±39 57,9±2,2 135±11 11,5±0,6 13,42±0,36 88,9±4,8 Солевая Россия Прибалтика 93±5,5 189±11 11,9±1,5 110±6,0 230±3,5 58±5,7 10,5±0,4 19±4,5 8,1±0,8 1,54±0,4 9,0±1,5 127±4,2 368±21 14,3±1,4 159±6,0 260±17,7 77,4±10,6 8,3±0,2 26,4±5,4 9,9±1,2 6,08±0,85 17,1±1,3 Таблица 3 – Состав экстрактов (жидкая фаза) прополиса, мг/кг Элемент Al Ca Cu Fe K Mg Mn Na Ni Pb Zn Водная (суспензия) Россия Прибалтика 257±7,3 180±0,7 3000±70,7 6850±70,7 19,8±1,2 15,9±1,3 521±7,2 384±1,7 2875±7,1 5015±21,2 1110±63,8 1890±80 143±2,2 172±0,9 1188±43,5 1610±18,3 16,3±2,6 12,9±1,8 9,14±1,1 16,5±0,19 315,5±8,2 412±9,3 Способ экстракции Водно-спиртовая Россия Прибалтика 24,8±2,3 24,4±1,7 32,1±2,7 31,8±3,4 10,2±1,3 8,8±1,7 89,2±3,7 87,5±2,1 904±11 891±5,2 139±5,4 134±4,7 1,9±0,3 1,9±0,6 77±3,2 89,1±4,7 4,6±1,1 5,3±2,4 1,08±0,05 1,78±0,06 5,7±0,9 5,4±1,1 Россия 2,4±0,1 158±0,7 1,7±0,2 0,7±0,01 204±4,9 52,1±1,3 8,0±0,1 97±2,5 1,4±0,2 0,42±0,05 6,8±0,1 Солевая Прибалтика 4,6±0,1 371±8,5 1,9±0,1 1,7±0,03 481±9,2 152±2,4 11,1±0,2 137±1,3 1,4±0,2 0,69±0,11 12,5±0,4 В водном экстракте (суспензии) повышается содержание большинства элементов. После экстрагирования 70%-м этанолом часть элементов за счѐт присутствия в растворителе водной фазы (30%) извлекается в экстракт (K, Na, Mn), другая часть остается и концентрируется в шроте (остатке) прополиса. При обработке прополиса 98%-м спиртом в шроте повышается содержание большинства элементов, в водно-спиртовом экстракте одновременно наблюдается уменьшение концентрации многих элементов, что связано с извлечением 98%-м спиртом гидрофобных органических компонентов прополиса (фенольные соединения, воски, смолы) в жидкую фазу и приводит к относительной концентрации минеральных компонентов в шроте. Солевая экстракция прополиса в промышленной переработке прополиса не используется, но может представлять интерес для извлечения обменных катионов, входящих в состав коллоидов прополиса. Наши исследования показали, что при обработке прополиса раствором аммонийной селитры наблюдается выделение в раствор обменных катионов натрия, магния и свинца. Остальные катионы металлов ведут себя неоднозначно, что может быть связано с образованием промежуточных комплексных соединений и требуются дополнительные исследования обменной способности коллоидов прополиса. Солевая экстракция прополиса может быть направлена на удаление свинца перед дальнейшей промышленной переработкой для получения безопасных продуктов. Таким образом, в процессе экстракции содержание и соотношение минеральных элементов в экстрактах и остатках прополиса существенно изменяется. Динамика минерального состава прополиса в ходе экстракции зависит от природных свойств нативного прополиса, т.е. от его происхождения, и свойств (концентрация, формы нахождения элементов), а также от характера экстрагирующего вещества и от способа экстракции. При извлечении гидрофобных органических компонентов 98%-м спиртом в шроте прополиса увеличивается доля минеральных веществ. Разбавленный (30%-й) спирт 296 позволяет экстрагировать помимо органических компонентов часть минеральных соединений, что является важным для производства биологически активных добавок. Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта «РФФИ-Урал», проект № 11-04-96010. Литература 1. Bankova V.S., De Castro S.L., Marcucci M.C. //Apidologie. – 2000, vol. 31. – Р. 3 – 15 2. Bogdanov S. Bienenvolk und Schadstoffbelastung //Schweiz. Bienen-Zeitung. – 1988, № 111 (11). – S. 571 – 575. 3. Bogdanov S., Kilchenmann V., Imdorf A. Acaricide residues in some bee products. // Apiculture Research. – 1998, № 37 (2). – S. 57 – 67. 4. Greenaway W., Scaysbrook T., Whatley F.R. The compositions and plant origin of propolis: a report of work at Oxford. //Bee World. – 1990, №71. – P. 107 – 118. 5. Marcucci M.C. Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic activity. //Apidologie. – 1995, №26. – P. 83 – 93. БОТАНИЧЕСКОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕДОВ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И ЮЖНОЙ ЧАСТИ ПЕРМСКОГО КРАЯ Р.В. Кайгородов1, С. Самовольникова2, А. Шилова2 1 Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] 2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» Обобщены данные по ботаническому происхождению и физико-химическим свойствам медов собранных в центральной и южной частях Пермского края. Исследования направлены на выявление закономерностей формирования состава и свойств медов. 297 BOTANICAL ORIGIN AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF HONEYS OF THE CENTRAL AND SOUTHERN PART OF THE PERM REGION R. W. Kaygorodov1, S. Samovolnikova2, A. Shilova2 1 Natural Science Institute, [email protected] 2 Perm State University Data on a botanical origin and physical and chemical properties of honeys the collected in central and southern parts of the region Perm is generalized. Researches are directed on revealing of laws of formation of structure and properties of honeys. Введение. Мѐд представляет собой уникальный биопродукт, производимый пчѐлами из растительных компонентов (нектар, пыльца, выделения растений и обитающих на них насекомых) путѐм обработки собственными ферментами и за счѐт процессов трансформации в сотах. Результаты исследования состава и свойств мѐда необходимо рассматривать в тесной связи с условиями его происхождения и способом получения. Такой подход дает возможность научной интерпретации результатов, составления прогнозов состояния на рынке меда, разработки мер по охране пчел и прав потребителей, но редко практикуется при исследовании меда. Состав и уникальные свойства меда меняются в зависимости от природноклиматических факторов. Пермский край характеризуется большой меридиональной протяженностью, наличием горной полосы на восточной окраине и уникальной Кунгурской лесостепи на юго-западе [1]. В связи с этим природно-климатические условия (климат, рельеф, почвенный и растительный покров и др.) проявляют зональность, которая может отражаться на качественном и количественном характере взятка (ботаническое происхождение), на составе и свойствах мѐда, его конкурентных преимуществах. Нами проведена оценка различий ботанического происхождения (состава основных медоносов) и физико-химических показателей качества и натуральности мѐда в разных зонах Пермского края. Материал и методы исследования. Фактический материал (протоколы испытаний) предоставлен аккредитованной в области исследований продукции пчеловодств лабораторией ООО «Федерал» (г. Пермь). Исследования ботанического происхождения выполнено согласно ГОСТ Р 52940-2008 «Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен». Определение ботанического и географического происхождения мѐда основано на комплексе органолептических 298 и физико-химических показателей и микроскопическом анализе. Составные элементы осадка мѐда, такие как пыльцевые зерна, споры грибов, клетки водорослей, кристаллические массы и т.д. позволяют распознавать ботаническое и географическое происхождение мѐда. Физико-химические показатели мѐда исследованы по стандартным методикам ГОСТ 19792-2011 «Мѐд натуральный. Технические условия». Основными физико- химическими показателями мѐда являются: доля воды, ферментативная активность, содержание сахаров и аминокислот, водородный показатель и общая кислотность, содержание гидроксиметилфурфурола, электропроводимость. Исследованные мѐды собраны в разных административных районах и населенных пунктах центральной и южной зон Пермского края: Центральная зона: Пермский район (ст. Ферма, п. Звездный) и Оханский район (с. Острожка, д. Тулумбаиха); Южная зона: Чернушинский район (г. Чернушка, д. Еремия, д. Зверево), Кунгурский район (с. Юговское, п. Бымож) и Октябрьский район (п. Тюш). Частота встречаемости пыльцевых зерен отдельных растений в мѐде отражает состав медоносной флоры определенной территории. Состав медоносной флоры, окружающей пасеку, а также время и последовательность еѐ цветения, являются главнейшими факторами, определяющими медосбор, ботаническое происхождение, состав и свойства мѐда. В нашей работе диагностика ботанического происхождения проводилась по преобладающим в мѐде пыльцевым зернам растений. В качестве критерия использовали частоту встречаемости пыльцевых зерен более 10% от их общего числа. Результаты и их обсуждение. Данные пыльцевого анализа показали, что ботаническое происхождение мѐда на территории Пермского края проявляет определенную зональность. В Центральной зоне медосбор осуществляется преимущественно с липы мелколистной (Tilia cordata Mill.), клевера позднего и клевера гибридного (Trifolium repens L. T. hibridum L.), в южной – с растений семейства зонтичные (Apiaceae Lindl.). Мѐд некоторых населенных пунктов проявляет уникальные особенности ботанического происхождения, например, в мѐде, собранным около д. Тулумбаиха (Оханский район) установлена очень высокая доля пыльцевых зерен малины. Мѐд, собранный около п. Бымож и п. Тюш, отличается чрезвычайно высоким содержанием пыльцевых зерен зонтичных растений. Исследованные территории относятся к разным ботанико-географическим районам Пермского края [2], различия растительности которых нахоят своѐ отражение в ботаническом происхождении мѐда и в формировании его свойств. В таблице 2 приведены усредненные физико-химические показатели мѐдов по центральной и южной зоне Пермского края и дана оценка достоверности различий. 299 Массовая доля воды в мѐде служит критерием его зрелости и согласно ГОСТ 197922011 должна превышать 18%. Достоверных различий по количеству воды в мѐде между зонами края не установлено. Таблица 1 – Частота встречаемости пыльцевых зерен (свыше 20%) в медах разных территорий Пермского края Зона Центральная Район/населенный пункт Медоносное растение Частота встречаемости пыльцевых зерен в меде, % Пермский ст. Ферма Липа мелколистная 47,2 Клевер ползучий Липа мелколистная Зонтичные* 30,2 26,3 22,5 Клевер ползучий 35,5 Клевер гибридный Малина обыкновенная 32,3 31,7 Липа мелколистная Клевер ползучий 36,0 26,1 Зонтичные Липа мелколистная Клевер ползучий 39,8 27,1 24,7 Зонтичные Клевер ползучий 27,0 23,2 Зонтичные 67,2 Зонтичные 57,5 п. Звездный Оханский с. Острожка д. Тулумбаиха Южная Чернушинский г. Чернушка д. Еремия Кунгурский с. Юговское п. Бымож Октябрьский п. Тюш Примечание: *пыльцевой анализ мѐда не всегда позволяет определить принадлежность пыльцевых зерен с точностью до вида Таблица 2 – Физико-химические свойства медов центральной и южной зоны Пермского края Показатель Массовая доля воды, % Диастазное число (активность диастазы), ед. Готе Содержание редуцирующих сахаров (глюкоза и фруктоза), % Содержание сахарозы, % Зона Центральная Южная n= 5 n= 7 17,22±0,59 18,07±1,36 F-тест* Fоп Fт 1,98 4,27 28,22±5,47 89,12±1,97 17,43±6,69 91,55±1,13 7,78 6,88 4,27 4,27 2,84±1,50 2,24±0,46 0,90 4,27 Примечание: *Критерий Фишера: разница достоверна при Fоп>Fт., ± - стандартное отклонение. Статистическая обработка данных проведена с использованием программы SigmaPlot 11.0 300 Активность ферментов используется для подтверждения степени зрелости мѐда, его природной неизменности и соблюдения правил хранения и обработки. В отечественной практике для оценки активности ферментов мѐда используется диастазное число (активность фермента диастазы). Диастазы (амилазы) – группа ферментов, расщепляющих крахмал и олигосахара до моносахаров. Активность диастазы выражают в условных единицах Готе, активность фермента согласно требованиям по качеству мѐда должна быть не ниже 7 ед. Готе. Изученные мѐды обладают достаточно высокой ферментативной активностью. Мѐды центральной части Пермского края обладают более высокой активностью фермента по сравнению с южной зоной, что может зависеть от расы пчѐл, ботанического происхождения мѐда, природно-климатических условий территорий. Содержание и соотношение сахаров в мѐде является критерием его натуральности и ботанического происхождения. Спектр сахаров в мѐде определяется составом нектара, частотой кормления пчѐл сахарным стропом. Как правило, в натуральном мѐде преобладают редуцирующие сахара (глюкоза и фруктоза), однако в зависимости от происхождения мѐда в нем может увеличиваться доля сахарозы. Различия в ботаническом происхождении и экологических условиях центральной и южной частях Пермского края отражаются на содержании редуцирующих сахаров (таблица 2). Высокое содержание глюкозы приводит к быстрой кристаллизации мѐда, что отражается на его потребительских свойствах (внешний вид, консистенция), но не означает ухудшения качества. Таким образом, установлены различия между центральной и южной частью Пермского края по ботаническому происхождению мѐда, его составу и свойствам. Различия обусловлены разнообразием природных и антропогенных условий территорий. Дальнейшие исследования направлены на выявление закономерностей формирования состава и свойств продуктов пчеловодства, что необходимо для формирования комплексного представления о процессах в природных и природно-антропогенных экосистемах, для разработки методов диагностики состояния окружающей среды и мониторинга и для научно-обоснованного рационального использования биопродуктов. Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта «РФФИ-Урал», проект № 11-04-96010. Литература 1. Коротаев Н. Я. Почвы Пермской области, Пермь. – 1962. – 276 с. 2. Овеснов С.А. Ботанико-географическое районирование Пермской области / С.А. Овеснов // Вестник Перм. ун-та. Биология. – 2000. Вып. 2. – С. 13-21. 301 ПРОБЛЕМА РЕДУКЦИОНИЗМА В БИОЛОГИИ Р.H. Календарь Институт биотехнологии, лаборатория геномики, Биоцентр 3, ул. Виикинкаари 1, 00014, Хельсинский университет, Финляндия, [email protected] Проводится обсуждение ограничения редукционистского метода при анализе биологических систем. Редукционистский метод расчленения биологических систем на их составные части был эффективен при объяснении химических реакций в многочисленных живых процессах. Однако, сейчас отчѐтливо видно, что этот подход достиг своего предела. Биологические системы чрезвычайно сложны и находятся в становлении, а не в законченном виде, и имеют свойства, которые не могут быть объяснены или даже предсказаны, изучая их отдельные части. Необходимо рассматривать объект не как законченную вещь, а в его становлении, чтобы узнать, какого он происхождения. THEORY OF RELATIVITY AND THEORY OF TOTALITY IN BIOLOGY R.N. Kalendar Institute of Biotechnology, MTT/BI Plant Genomics Lab, Biocentre 3, Viikinkaari 1, 00014, University of Helsinki, Finland, [email protected] The reductionist method of dissecting biological systems into their constituent parts has been effective in explaining the chemical basis of numerous living processes. However, now is clearly visible that this approach has reached its limit. Biological systems are extremely complex and have emergent properties that cannot be explained, or even predicted, by studying their individual parts. Our thinking should not also be adequate to ask where an organ of a living being originates instead of what purpose it serves. Should be viewed the object as is never what purpose something serves but always how it develops. Основа редукциониского метода состоит в том, что биологические системы составлены исключительно из атомов и молекул, и поэтому должны быть интерпретированы, используя физико-химические свойства их отдельных компонентов. Предполагается, что изучение отдельных молекул и их структур вполне достаточно для объяснения целой системы. Крайняя форма проявление редукционистского представления - мнение, высказанное некоторыми физиологами и нейробиологами, что сознание и психические состояния могут быть восстановлены до химических реакций, которые происходят в мозге [2,12]. Сегодня, уже понятно, что специфика сложной биологической активности не является результатом специфики отдельных, составляющих их, молекул и клеток, поскольку эти компоненты часто функционируют во многих других процессах. Например, гены, которые воздействуют на 302 формирование памяти в дрозофиле, также участвуют в синтезе белков при цАМФ метаболизме, которые не являются необходимыми для процесса запоминания. Это результат отношений клеточных компонентов и среды, в которых вторичный компонент, такие как цАМФ позволяют проявить продукту гена уникальный эффект. Биологическая специфика следует по пути, в котором эти компоненты собираются и функционируют вместе [9]. Взаимодействия между частями, так же как и влияние окружающей среды, дают начало новым особенностям, таким как поведение [1], которые отсутствуют для изолированных компонентов. Следовательно, «возникновение» это, то новое, что находит свою почву там, где редукционизм бессилен [12]. Свойства на стадии становления не могут быть предсказаны или выведены явным вычислением или любыми другими средствами. В этом отношении свойства на стадии становления отличаются от результирующих свойств, которые могут быть предсказаны на молекулярном уровне. Важный аспект свойств живого на стадии становления - то, что у них есть свои собственные причины, которые не сводятся к свойствам их компонентов. В живом организме развитие одного из другого, переход состояний друг в друга не является готовым завершенным «бытиѐм отдельностей», но постоянным становлением [13,15]. Новые стратегии разработки лекарств, основанные на использовании комбинаторной химии, генетики, биохимии и биоинформатики, не показывают те результаты, которые от них ожидались [4,7]. Знание последовательностей генома человека и различных патогенных агентов привело к идентификации только очень ограниченного числа новых лекарственных препаратов [3]. Кроме того представлен список несколько биотехнологических проектов [4], которые, до сих пор, не соответствуют возложенных на них ожиданиям, используя генную терапию, исследование стволовых клеток, технологию антисмысловых нуклеиновых кислот и вакцины против рака[14]. Однако, пожалуй, нет более фундаментальной причины всех этих неудач: главным образом потому, что большинство из этих подходов выполняли исследования физическими методами и руководствовались принципом абсолютного редукционизма. Как следствие, сложность биологических систем, целых организмов и человека, как сложной биологической системы, как правило, недооцениваются [5]. Большинство болезней человека развиваются в результате взаимодействия многих генных продуктов, и мы редко знаем обо всех этих генах и их продуктах, которые участвуют в биологической функции. Тем не менее, для достижения понимания сложных генетических сетей, биологи склонны полагаться на эксперименты, в которые объясняют функцию гена по делеции этого гена (метод нокаута). Нокаутные эксперименты над мышами используются для определения роли отдельных генов, в которых исследуемый ген инактивирован или удален. Во многих таких экспериментах, нокаут не имеет никакого эффекта, несмотря на то, 303 что ген кодирует белок и считается необходимым. В других случаях нокаутом демонстрирует совершенно неожиданный эффект [9]. Кроме того, нарушение одного и того же гена может иметь разнообразные последствия даже для разных линий мышей [11]. На самом деле результаты, полученные в экспериментах с генетически модифицированными мышами, нельзя переносить на сложные взаимодействия генов, которые происходят в организме человека [6]. Предположим, что мы идентифицировали ген и объяснили его функцию. Например, образование глаза у дрозофилы, что функция сама по себе недостаточна, чтобы объяснить непосредственно «значение» еѐ для организма. Достаточно часто, могут быть получены трансгенные животные с правильными генетическими изменениями, но у них нет ожидаемого фенотипа. Один из самых важных примеров - ген ретинобластомы. Этот ген существенен для регулирования цикла клетки, но при мутациях этого гена образуются опухоль глаза. Мыши с тем же самым генетическими мутациями в этом гене развивают множество отклонений, но ретинобластома не обнаружена ни у одного животного. Если бы ген был первоначально обнаружен у мыши, то его бы никогда бы не назвали - геном ретинобластомы. Генетическое условие необходимо, но не достаточно для формирования фенотипических характеристик организма. Другой пример - ген изомеразы, идентифицированный у млекопитающих и у дрозофилы. С высокой гомологией установлено, что у других организмов он кодирует каталазы с различными функциями. У мышей этот ген вовлечен в процесс созревания клеток в иммунной системе, но у дрозофилы он способствует правильному транспорту пигмента глаза белка - родопсина. Одинаковая белковая функция, но приводит к различным фенотипическим эффектам. Гены - не причины, но условия для процессов жизни. Гены обеспечивают информацию для первичной структуры белков, но их функции не могут быть выведены из последнего; следовательно, должен быть «мир» процессов, где белки - в их распоряжении. И, наконец, функции продуктов гена должны быть объединены целостностью организм. Разочаровывающие результаты с нокаут экспериментами частично обусловлены избыточностью генов и плейотропией, и тем фактом, что генные продукты являются компонентами путей и сетей, в которых гены, действующих в параллельных системах могут компенсировать друг друга [10]. Как и многие факторы, одновременно влияют на поведение системы, одна часть системы может функционировать только в присутствии других компонентов. Например, опыт боли может изменить поведение человека, но химические реакции низшего уровня в нейронах, которые включаются в восприятии боли, не являются причиной измененного поведения, поскольку сама боль и есть эта причина. В свете этих проблем стало популярным, критиковать редукционистский подход, который используется в исследованиях биологических систем [8], хотя более трудно 304 определить то, что должно быть сделано вместо этого. Необходимо учитывать и различать особенность живого объекта от не живого. Метод физики есть просто частный случай общего способа научного исследования, причѐм принимается во внимание природа соответствующих предметов и область, которой занимается эта наука. Когда этот метод распространяют на биологические объекты и системы, то тем самым вычѐркивают специфическую природу биологического. Вместо того чтобы исследовать биологическое сообразно его природе, ему навязывают чуждую ему закономерность. Но таким образом, отрицая живое, никогда не удастся познать его. Всѐ это происходит от ошибочного мнения, полагающего, будто метод науки имеет к еѐ объектам чисто внешнее отношение и обусловливается не ими, а нашей природою. Никто не отрицает существование атомов как мельчайших частиц, но дело заключается в ином, чтобы познание тотальных процессов (организм) не пытаться строить, исходя из процессов в молекулах, но поступать прямо противоположным образом. Было бы целесообразно вместе того, чтобы наши процессы привязывать к какой-либо координат, привести их в связь с их собственной внутренней действительностью; тогда мы пришли бы к тотальной системе. Мы бы преодолели теорию относительности, и пришли бы к теории абсолютного. Наше мышление должно спрашивать относительно какого-нибудь органа живого существа не: к чему он служит, а: откуда он происходит. Ненаучно рассматривать одну лишь внешнюю целесообразность органа. Для органа дело идѐт всегда не о том, к чему что-нибудь пригодно, а только о том, как оно развивается. Необходимо рассматривать объект не как законченную вещь, а в его становлении, чтобы узнать, какого он происхождения. В развитие эта обусловленность каждой отдельной части целого имеет место в той мере, в какой все органы построены на основе одной и той же исходной формы. В биологическом мире одна часть существа не обусловловливает другую, а целое (идея) обусловливает из себя все отдельности. Живые формы, пребывающие в определенном жизненном элементе, обусловлены природой самого этого элемента. Если некая биологическая форма из единого жизненного элемента перейдет в другой, то она должна будет также измениться и сама. Преобразование одной формы в другую, следует представлять себе не так, что внешние обстоятельства непосредственно преобразуют форму, а так, что они становятся побуждением к превращению внутренней сущности (содержания). Изменившиеся условия жизни побуждают организм изменяться в соответствии с внутренними законами. Опосредованно, а не непосредственно воздействуют внешние влияния на живое существо [15]. Внешние условия могут иметь определяющее влияние, но не могут быть производящей причиной. Мы можем, правда, сказать: под влиянием того или иного положения вещей данный вид должен был развиваться так, что тот или другой орган получил особое развитие, - но само содержание, само специфически 305 биологическое не может быть выведено из внешних условий [15]. Мы очень хорошо знаем, что специализация совершается под влиянием воздействий извне. Но саму получившую специализацию форму мы должны производить из внутреннего начала. Почему развилась именно эта особенная форма, об этом мы узнаем, когда изучим окружающие условия этого существа. Но ведь эта особенная форма есть нечто и сама по себе, она является нам с определенными свойствами. Внешнему явлению противостоит некое оформленное в самом себе содержание, оно даѐт нам путеводную нить, чтобы вывести эти свойства. На место доказывающего метода здесь становится развивающий метод. Им устанавливается не то, что внешние условия действуют друг на друга определѐнным образом и приводят, поэтому к определѐнному результату, но то, что под влиянием определѐнных внешних обстоятельств из живого образовалась особая форма. Таково коренное различие между науками физической и биологической. Таким образом, необходимы новые методики исследований уникальной сложности биологических систем, которая следует из разнообразия взаимодействий и регулирующих процессов. Литература 1. Alm E., Arkin A.P. Biological networks// Curr Opin Struct Biol. 2003. V.13. P.193–202. 2. Bickle J. Philosophy and Neuroscience: a Ruthlessly Reductive Account // Kluwer Academic, Dordrecht, The Netherlands. 2003. P. 235. 3. Drews J. Strategic trends in the drug industry// Drug Discov Today. 2003. V.8. P. 411–420. 4. Glassman R.H., Sun A.Y. Biotechnology: identifying advances from the hype // Nat Rev Drug Discov. 2004. V.3. P. 177–183. 5. Horrobin D.F. Realism in drug discovery: could Cassandra be right? // Nature Biotech. 2001. V. 19. P. 1099– 1100. 6. Horrobin D.F. Modern biomedical research: an internally self-consistent universe with little contact with medical reality? // Nat Rev Drug Discov. 2003. V.2. P. 151–154. 7. Kubinyi H. Drug research: myths, hype and reality //Nat Rev Drug Discov. 2003. V. 2. P. 665–668. 8. Lewontin R. The Triple Helix. Gene, Organism and Environment. Harvard University Press. Cambridge: MA, USA. 2000. 9. Morange M. A successful form of reductionism // The Biochemist. 2001a. V. 23. P. 37–39. 10. Morange M. The Misunderstood Gene. Harvard University Press. Cambridge: MA, USA. 2001b. 11. Pearson H. Surviving a knockout blow // Nature 2002. V.415. P. 8–9. 12. Van Regenmortel M.H.V. Biological complexity emerges from the ashes of genetic reductionism // J. Mol Recognit. 2004. V.17 P. 145–148. 13. Van Regenmortel M.H.V. Reductionism and complexity in molecular biology// EMBO reports. 2004. V. 5 P. 1016 – 1020. 14. Williams D.A., Baum C. Gene therapy: new challenges ahead // Science. 2003. N. 302. P. 400–401. 306 15. Штейнер Р. Очерк теории познания, Гѐтевского мировоззрения, составленный, принимая во внимание Шиллера. Разрешенный автором перевод Н.Боянуса. /M.:Парсифаль, 1993.- 144 c. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ПАПОРОТНИКОВ С.А. Кольцов Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», [email protected] Метод был отобран из числа методик выделения растительной ДНК на основе CTAB. Модификация метода заключалась в отказе от β-меркаптоэтанола и использовании поливинилполипирролидона (PVPP). PVPP использовался для очистки образцов от полифенольных соединений. Этим методом можно выделять ДНК, пригодную для ПЦР, как из свежего, так и из гербарного материала. OPTIMIZATION OF THE METHOD OF ISOLATING DNA FROM FERN S. Koltsov Natural Science Institute, [email protected] The method has been selected from among isolation methods of plant DNA based on CTAB. Modification of the method is to avoid the β-mercaptoethanol and use polyvinylpolypyrrolidone (PVPP). PVPP was used to clean samples of polyphenol compounds. This method can be isolated DNA suitable for PCR, from both fresh and herbarium material. Введение. Одной из актуальных методических проблем молекулярно-генетического анализа является выделение ДНК высокого качества. Основным требованием для методик выделения ДНК является чистота полученной ДНК и ее пригодность для ПЦР-анализа. Листья поздних этапов вегетации и листья из гербарных образцов являются проблемным материалом, так как содержат большое количество вторичных метаболитов, особенно полифенольных соединений и полисахаридов, которые ингибируют процесс амплификации. Основываясь на обзорах методик выделения ДНК из растений [3, 4, 6, 8], для дальнейшего тестирования были отобраны методики с использованием CTAB в качестве детергента. В результате исследований была подобрана методика, которая позволяет за короткое время извлекать ДНК, пригодную для ПЦР, то есть свободную от полисахаридов и полифенольных соединений. 307 Материал и методы и методы исследования. Образцы вай папоротников собирались в разных районах Пермского края. Для выделения ДНК использовались как свежесобранные образцы, так и гербаризированные с различным сроком хранения. Для исследований брались 100 мг для свежих и 20 мг для предварительно высушенных образцов. Для оптимизации методики выделения ДНК были протестированы CTAB-метод выделения ДНК С. Роджерса (Rogers) [7] и модифицированный метод Дж. Кота-Санчес (Cota-Sanchez) [2, 5]. Для модификации методов использовался PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Определение концентрации и качества ДНК (соотношение А280/A260 и А260/А230) проведено на спектрофотометре «Nanodrop 2000» («Thermo Scientific», USA). Результаты и их обсуждение. Первый метод выделения ДНК С. Роджерса [7] был модифицирован следующим образом: вместо растворимого поливинилпирролидона (PVP) использовался нерастворимый PVPP, что позволило гарантировать его отсутствие в продуктах выделения и исключить возможное влияние на процесс амплификации. Необходимые для модификации метода реагенты: 2xCTAB [2% CTAB, 100 mM Tris (pH 8.0), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1–2% PVPP], 5xCTAB [5% CTAB, 0.7 M NaCl], буфер для преципитации [1% CTAB, 50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM EDTA], HS-TE буфер [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 M NaCl], 1xTE буфер [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA], хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), 95% этанол, 80% этанол. Предлагаемый протокол выделения ДНК: Поместить в 1,5 ml Eppendorf образец весом 10-20 mg. Добавить 400 μL горячего (65°С) 2хCTAB буфера; Хорошо растереть пестиком для Eppendorf; 13. ЦФ 5 - 8 krpm при NT, 20'; 14. Растворить осадок в 500 µL HS-TE; 15. 16. 7. Добавить еще 400 μL 2xCTAB буфера; встряхнуть на вортексе; Инкубировать при 65°С минимум 20'; периодически встряхивать; Охладить до NT, добавить равный объѐм Ch:I, мягко перемешивать ~20' при NT; ЦФ 10 krpm при NT, 10'; Добавить 1000 µL 95% этанола; держать 1-2h при -20°С или 30' при -70°С; ЦФ 8 krpm при 4°С, 10'; супернатант слить; К осадку добавить 200 µL MQ и 100 µL 7.5M NH4OAcetat; держать 20' при 0°С; ЦФ 13 krpm при 4°С, 10'; 8. Перенести водную фазу в новую пробирку; 20. Добавить к супернатанту 600 µL 95% этанола; держать 20' при -70°С; ЦФ 13 krpm при 4°С, 10'; 9. Перемешать, инкубировать при 65°С 10'; 21. Сполоснуть 80% этанолом; 10. Охладить до NT; добавить равный объѐм Ch:I, мягко перемешивать ~10' NT; ЦФ 10krpm при NT, 10'; перенести водную фазу в другую пробирку; Добавить равный объѐм буфера для преципитации, перемешать и оставить на 1h; 22. Просушить в термостате 20' при 37°С; 23. Растворить в TE; 24. Хранить при -20°С. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 11. 12. 17. 18. 19. К достоинствам данной методики относится возможность извлечения пригодной для амплификации ДНК из гербарных образцов большого срока хранения. Основным 308 недостатком является ее длительность — при выполнении 12 пункта методики рекомендуется оставлять пробирки на ночь. Кроме этого необходимо большое количество буферных растворов и две смены пробирок в процессе работы, что увеличивает стоимость выделения ДНК. Второй метод рекомендуется нами для выделения ДНК из свежесобранных листьев и является модификацией метода Дж. Кота-Санчес предложенной М. Риахи (Riahi) [5]. Этот метод также был оптимизирован добавлением PVPP для очистки выделенной ДНК от полифенольных соединений [1] и предполагает отказ от использования β-меркаптоэтанола, который является токсичным, летучим веществом и требует особых предосторожностей для работы с ним. Необходимые для модификации метода реагенты: 2xCTAB [2% CTAB, 100 mM Tris (pH 8.0), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1-2% PVPP], 1xTE буфер [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA], хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), изопропанол, 70% этанол. Предлагаемый протокол выделения ДНК: 1. Растереть в пробирке 20 mg сухого образца с прогретым до 65°С буфером (400 μl); 9. Добавить 0,7V ледяного изопропанола, перевернуть пробирки 10 раз; 2. Добавить еще 400 μl буфера, встряхнуть на вортексе; 10. ЦФ 15' при 10 krpm; 3. Инкубировать 20' при 65°С, периодически встряхивая; 11. Супернатант осторожно слить; 4. Охладить до NT; 12. Промыть 70% этанолом (1 ml); 5. Добавить 750 μl смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1); 13. ЦФ 15' при 10 krpm; 6. Мягко перемешивать 1-2'; 14. Высушить 20' при 37°С; 7. ЦФ 15' при 10 krpm; 15. Разбавить 100 μl TE; 8. Перенести водную фазу в другую пробирку; 16. Хранить при -20°С. Основным достоинством этого метода является его небольшая продолжительность (от 1,5 до 2,5 часов), что позволяет за день обработать большое количество образцов. Немаловажное значение имеет также небольшое количество буферных растворов и однократная смена пробирок, что снижает затраты на выделение ДНК. Использование в методике PVPP позволяет получить чистую ДНК из образцов, содержащих большое количество полифенольных соединений. Протестированные модификации методик показали высокое качество выделенной ДНК (соотношение А260/А280 составило >1,8, а соотношение А260/А230 - >2,0). Концентрация ДНК была обычно >200 ng/μl, что является хорошим результатом и пригодно для 309 дальнейшей амплификации. Существенной разницей между методиками является только время выделения и стоимость процедуры. Обе методики также были проверены на других видах растений, относящихся к хвойным и покрытосеменным растениям. Работа выполнена при частичном финансировании АВЦП "Развитие научного потенциала высшей школы" (тема НИР с номером государственной регистрации 01201054037). Литература 1. Звягин А. С. Выделение ДНК из гербарных листьев Vitis vinifera L. // Научный журнал КубГАУ. 2010. Т. 58, № 4. С. 336–347. 2. Cota-Sanchez J. H., Remarchyk K., Ubayasena K. Ready-to-Use DNA Extracted with a CTAB Method Adapted for Herbarium Speciemens and Mucilaginous Plant Tissue // Plant Molecular Biology Reporter. 2006. Vol. 24. P. 161–167. 3. Drabkova L., Kirschner J., Vlcek C. Comparison of Seven DNA Extraction and Amplification Protocols in Historical Herbarium Specimens of Juncaceae // Plant Molecular Biology Reporter. 2002. Vol. 20. P. 161–175. 4. Ivanova N. V., Fazekas A. J., Hebert P. D. N. Semi-automated, Membrane-Based Protocol for DNA Isolation from Plants // Plant Molecular Biology Reporter. 2008. Vol. 26. P. 186–198. 5. Riahi M., Zarre S., Maassoumi A. et al. An inexpensive and rapid method for extracting papilionoid genomic DNA from herbarium specimens // Genetics and Molecular Research. 2010. Vol. 9, no. 3. P. 1334–1342. 6. Ribeiro R., Lovato M. Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and herbarium specimens of the genus Dalbergia // Genetics and Molecular Research. 2007. Vol. 6, no. 1. P. 173–187. 7. Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. Vol. 5, no. 19. P. 69–76. 8. Sanchez-Hernandez C., Gayta n-Oyarzun J. Two mini-preparation protocols to DNA extraction from plants with high polysaccharide and secondary metabolites // African Journal of Biotechnology. 2006. Vol. 5, no. 20. P. 1864– 1867. ГЕТЕРОГЕННЫЙ БИОКАТАЛИЗ АКРИЛОНИТРИЛА КЛЕТКАМИ БАКТЕРИЙ И ИЗОЛИРОВАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ Ю.Г. Максимова Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь, [email protected] Разрабатывались подходы к созданию гетерогенных биокатализаторов гидролиза нитрилов на основе целых клеток нитрилутилизирующих бактерий и ферментного препарата, содержащего нитрилгидратазу и нитрилазу. Показано, что наиболее перспективной является адсорбция клеток на пористых и высокодисперсных материалах и ковалентная сшивка фермента с активированным носителем, что позволяет получить активный и стабильный гетерогенный биокатализатор. 310 HETEROGENEOUS BIOCATALYSIS OF ACRYLONITRILE BY BACTERIAL CELLS AND ISOLATED ENZYMES Yu.G. Maksimova Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS, Perm, [email protected] Approaches to the creation of heterogeneous biocatalysts of nitrile hydrolysis based on whole cells of nitrile utilizing bacteria and enzyme preparation containing nitrile hydratase and nitrilase were developing. It is shown that adsorption of cells on porous and highly dispersive materials and covalent attachment of enzyme to activated support are the most promising and allows getting active and stable heterogeneous biocatalyst. Биотехнология как наука сформировалась на стыке различных специальностей, среди которых биология, химия, математика, механика, инженерия. Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии является биокатализ, представляющий собой высокоэффективный специфичный процесс трансформации органических веществ, который в отличие от химического катализа происходит в мягких условиях, при нормальной температуре и давлении. Успешным опытом использования биокатализа в промышленности является получение акриламида с помощью нитрилгидратазы бактерий рода Rhodococcus, которая катализирует гидратацию нитрилов с образованием амидов [1]. Бактериальные клетки Alcaligenes denitrificans, содержащие нитрилазу – фермент, осуществляющий прямой гидролиз нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты, используются компанией «Биоамид» (Саратов) в качестве промышленного биокатализатора трансформации акрилонитрила в акрилат аммония [2]. Интенсификация биотехнологических процессов может быть достигнута за счет перехода от гомогенного катализа к гетерогенному. Гетерогенный биокатализ – это ферментативный катализ, протекающий на границе раздела фаз. В качестве катализаторов такого процесса могут выступать иммобилизованные ферменты, клетки микроорганизмов, а также отдельные органеллы клеток. Иммобилизация ферментов – основанное на физикохимических принципах ограничение подвижности их молекул. Целью иммобилизации является сохранение каталитической активности биомолекулы в течение длительного времени без нарушений ее конфигурации [3]. В случае если фермент внутриклеточный, возможна иммобилизация целых клеток микроорганизмов. Применение иммобилизованных биокатализаторов имеет ряд несомненных преимуществ, среди которых их стабилизация, 311 возможность внедрения непрерывных технологий, упрощение процедуры выделения и очистки конечных продуктов [4]. Цель настоящей работы – создание гетерогенных биокатализаторов гидролиза акрилонитрила (НАК) на основе бактериальных клеток, адсорбционно иммобилизованных на различных носителях, и иммобилизованного ферментного препарата, содержащего нитрилгидратазу, а также изучение свойств этих биокатализаторов. Материал и методы исследования. В данной работе использовали штаммы нитрилутилизирующих бактерий, изолированных и селекционированных в лаборатории химического мутагенеза (ИЭГМ УрО РАН): Rhodococcus ruber gt1 (ИЭГМ 612, Региональная профилированная коллекция www.iegm.ru/iegmcol/index.html), алканотрофных обладающий микроорганизмов, нитрилгидратазной акроним ИЭГМ, активностью и Pseudomonas fluorescens C2, содержащий нитрилазу. Штаммы выращивали на минимальной среде N [5] c 0,1% глюкозой в качестве источника углерода и 10 мМ хлоридом аммония (для R. ruber gt1), либо 0,5% ацетонитрилом (для P. fluorescens C2) в качестве источника азота. Клетки бактерий иммобилизовали адсорбционно на углеродных адсорбентах и каолине. Ферментный препарат, содержащий нитрилгидратазу либо нитрилазу, иммобилизовали адсорбционно на углеродсодержащих носителях и ковалентно на активированном хитозане. Активность иммобилизованных биокатализаторов изучали в реакциях трансформации раствора НАК в калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) при 22°С. Удельную ферментативную активность определяли как количество акриламида (акриловой кислоты) в мкмоль, образуемое за 1 мин биомассой бактерий, соответствующей 1 мг сухих клеток, либо 1 мг белка. Концентрацию акриламида (акриловой кислоты) определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC–10 «Shimadzu» (Япония) с диодно-матричным УФ– и флуоресцентным детектором и колонкой Synergi 4u Hydro–RP 80A (250х4,6 мм), заполненной силикагелем (фракция 4 мкм). В качестве подвижной фазы использовали раствор 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°С. Операционную стабильность иммобилизованных биокатализаторов оценивали по сохранению нитрилгидратазной (нитрилазной) активности при последовательном проведении реакции трансформации НАК, отмывая биокатализатор после каждого цикла реакции калий-фосфатным буфером. Результаты и их обсуждение. Показано, что наибольшую нитрилгидратазную активность сохраняют клетки, адсорбционно иммобилизованные на активированных углеродных материалах, и ферментный препарат нитрилгидратазы, ковалентно связанный с предварительно активированным хитозаном (таблица 1). 312 Таблица 1 – Активность и стабильность иммобилизованных биокатализаторов Биокатализатор Носитель E N/t R. ruber gt1 P. fluorescens C2 углеродные активированные носители 100-400 0,5-4,0 8/3,3 5/216 каолин 1,0-3,5 5/288 Нитрилаза Нитрилгидратаза углеродсодержащие носители 0,4-1,3 1/192 2,0-19,0 5/2 активир. хитозан 20-160 50/8,3 Примечание: E – активность биокатализатора, мкмоль/мг/мин при температуре 22°С; N/t – количество циклов реакции с сохранением 50% первоначальной активности / время работы биокатализатора, ч Адсорбированная на углеродсодержащих носителях нитрилгидратаза проявляет на порядок более низкую активность, чем ковалентно присоединенная к носителю, и в 10 – 200 раз более низкую, чем целые клетки, иммобилизованные на активированных углеродных носителях. Среди изученных иммобилизованных биокатализаторов с нитрилгидратазной активностью наибольшей операционной стабильностью обладает изолированная нитрилгидратаза, ковалентно связанная с активированным хитозаном, что проявляется в увеличении времени работы биокатализатора и большем количестве реакционных циклов с сохранением 50% первоначальной активности. Известно, что активность нитрилгидратазы бактерий во много раз превышает активность нитрилазы [6], поэтому нецелесообразно сравнивать между собой биокатализаторы на основе нитрилгидратазы и нитрилазы (либо клеток с этими ферментативными активностями). Наиболее активными из изученных иммобилизованных нитрилазных биокатализаторов были целые адсорбированные клетки P. fluorescens. Ферментный препарат на основе адсорбированной нитрилазы обладал более низкой активностью и стабильностью, а наибольшее время работы биокатализатора наблюдалось при адгезии целых клеток к каолину. Таким образом, для создания биокатализатора с нитрилгидролизующей активностью наиболее перспективными из изученных являются следующие подходы: 1) адсорбция целых бактериальных клеток на носителе, обладающем пористостью, либо высокой дисперсностью; 2) ковалентное присоединение фермента грубой очистки к активированному носителю. Работа финансировалась программой поддержки междисциплинарных исследований УрО РАН. Литература 1. Вейко В.П. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous M8 / В.П. Вейко, А.С. Яненко, М.Г. Алексеева и др. // Биотехнология. – 1995. – № 5– 6. – С. 3-5. 313 2. Глинский С.А. Сравнительный анализ штаммов, используемых в процессе получения акрилата аммония / С.А. Глинский, С.В. Козулин, Т.Н. Козулина и др. // Биотехнология. – 2010. – № 1. – С. 17–24. 3. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 1: Проблемы и перспективы / Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов. М.: Высш. шк., 1987. 159 с. 4. Синицин А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицин, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов // М.: Изд-во МГУ, 1994. – 288 с. 5. Максимов А.Ю. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1 / А.Ю. Максимов, М.В. Кузнецова, Г.В. Овечкина, С.В. Козлов, Ю.Г. Максимова, В.А. Демаков // Прикл. биохим. микробиол. – 2003. – Т. 39. – № 1. – С. 63–68. 6. Максимова Ю.Г. Гидролиз акрилонитрила клетками нитрилконвертирующих бактерий, иммобилизованными на волокнистых углеродных адсорбентах / Ю.Г. Максимова, А.Ю. Максимов, В.А. Демаков и др. // Биотехнология. – 2010. - № 4. – С. 51–58. РОЛЬ БИОХИМИИ В РАЗВИТИИ НАУКИ О ПИТАНИИ Э.К. Мухамеджанов, О.В. Есырев, С.С. Ерджанова, А.Б. Джумагулова РГП Научный центр противоинфекционных препаратов, Алматы, Казахстан На основании исследования путей транспорта углеродного скелета и этапов взаимосвязи между процессами образования и утилизации энергии АТФ при различной обеспеченности организма энергией предложена концептуальная метаболическая модель. Данная модель позволяет понять необходимость соблюдения в рационе определенного соотношения между нутриентами и открывает пути разработки рационов питания для профилактики и лечения обменных заболеваний человека. BIOCHEMISTRY ROLE IN DEVELOPMENT OF FOOD SCIENCE E.K.Muhamedjanov, O.V.Esyrev, S.S.Erdjanova, A.B.Jumagazyeva RSOE Scientific Center for Anti-infectious Drugs, Almaty, Kazakhstan On the basis of transport ways of a carbon skeleton and interrelation stages between processes of formation and recycling of ATF energy at various energy security of an organism offers conceptual metabolic model. The given model allows to understand necessity of observance for a diet of a certain parity between nutrients and opens ways of working out of food allowances for preventive maintenance and treatment of human metabolism diseases. 314 Все модели сбалансированного питания строятся на принципе установления потребностей организма в основных пищевых веществах и энергии, полученных в результате обширных эпидемиологических и наблюдениях на людях и экспериментальных исследованиях на животных. Они, в основном, представляют собой таблицы усредненных норм потребности человека в зависимости от пола, возраста и характера трудовой деятельности [2]. Процессы ассимиляции и диссимиляции белков, жиров и углеводов представляют собой метаболические конвейера направленность которых зависит от периода питания и включения соответствующих регулирующих систем организма (таблица 1). Таблица 1 – Характер метаболических процессов и систем их регуляции при использовании экзогенного (ЭКПП) или эндогенного (ЭНПП) пищевых потоков Метаболические процессы и системы их регуляции Медиатор нервной системы Гормон Метаболическая направленность Обмен белков Обмен жиров Обмен гликогена Обмен углеводов Пищевой поток ЭКПП Ацетилхолин Инсулин Анаболизм Синтез Синтез Синтез Распад ЭНПП Норадреналин Глюкагон Катаболизм Распад Распад Распад Синтез Как видно из таблицы 1, при утилизации ЭКПП преобладают процессы анаболизма, однако для обмена углеводов характерно окисление (катаболизм) глюкозы, что способствует обеспечению процесса синтеза белка энергией АТФ, то есть отмечается сопряжение экзергеничекой и эндергенической реакций [1]. В качестве регуляторных систем в этот период включается парасимпато-инсулиновое звено. В постабсорбтивный период в период утилизации ЭНПП отмечается катаболизм белков, жиров и гликогена, а в качестве анаболического процесса на данном этапе выступает процесс глюконеогенеза, который в энергетическом отношении обеспечивается за счет окисления жиров. Регулируется этот этап симпато-адреналовой системой. Основным энергетическим материалом для организма является глюкоза. Это обусловлено тем фактом, что головной мозг и клетки крови в качестве источника энергии используют исключительно глюкозу [3] .В мозг глюкоза поступает по градиенту концентрации и при понижении ее уровня ниже градиента поступает недостаточно энергии, что ведет к отключению мозга (потеря сознания), а через пять минут происходит гибель мозга и смерть, поэтому в поддержании гомеостаза глюкозы участвуют все виды обмена, все регуляторные системы. В абсорбтивный период (при использовании ЭКПП) глюкоза обеспечивает процесс синтеза белка энергией АТФ, а процесс синтеза жиров – за счет углеродного скелета. В 315 постабсорбтивный период синтез глюкозы в энергетическом отношении осуществляется за счет жиров, а углеродный скелет на этот процесс – за счет аминокислот. Хотя в динамическом аспекте эти процессы разделены по времени, но в функциональном отношении они тесно связаны. В связи с этим, с учетом транспорта углеродного скелете и процессов образования и утилизации энергии при использовании ЭКПП или ЭНПП нами разработана метаболическая модель (рисунок 1). ГЛЮКОЗА БЕЛКИ ЭКПП ЭНПП АТФ АМИНО КИСЛОТЫ АТФ ЖИРЫ Рисунок 1 – Метаболическая модель На рисунке 1 показана модель взаимосвязи между обменом белков, жиров и углеводов в зависимости от путей транспорта углеродного скелета и процессов образования и утилизации энергии при использовании экзогенного пищевого потока (ЭКПП – сплошные линии) или эндогенного пищевого потока (ЭНПП – пунктирные линии). На верху модели находится глюкоза в связи с ее ключевой ролью в энергетическом обмене, в центре модели находятся белки, которые координируют обмен углеводов и жиров в абсорбтивный и постабсорбтивные периоды. Внизу модели расположены жиры, которые представляют собой буферные системы по сохранению энергетического гомеостаза. При приеме пищи (абсорбтивный период) катаболизм глюкозы обеспечивает энергией АТФ процесс синтеза белка. АТФ в данном случае выступает как один из ключевых регуляторов этих процессов. Если снижена скорость утилизации АТФ на синтез белка в результате дефицита субстрата, например при малобелковом питании, или в результате ухудшения деятельности белоксинтезирующего аппарата (на этапах транскрипции или трансляции), то автоматически снижается и величина образования АТФ, то есть происходит ингибирование утилизации глюкозы за счет снижения активности гексокиназы [4]. Снижение величины утилизации глюкозы приводит к ее накоплению в крови – развивается гипергликемия, что стимулирует сброс углеродного скелета глюкозы в жиры – развивается липидемия. Следовательно, преобладание в рационе углеводов над белками 316 будет способствовать развитию метаболических нарушений в виде гипергликемии и липидемии. Если в рационе преобладают белки, то отмечается обратная картина – не хватит энергии на включение всех аминокислот в белок и произойдет их накопление – развивается гиперацидемия. Таким образом, при нарушении соответствия в рационе соотношения между углеводами и белками происходит развитие различных метаболических нарушений, что негативно сказывается на протекании метаболических процессов. Так как характер метаболических процессов среди отдельных индивидуумов различается, то, проведя метаболический скрининг при даче стандартного завтрака, можно скорректировать соотношение в рационе доли белков и углеводов. Такую коррекцию необходимо проводить при изменении характера трудовой деятельности человека, при изменении климатических и экологических факторов. Такой принцип можно использовать при разработке компьютерной программы – индивидуальный рацион питания, так как все программы представляют собой усредненные нормы, а необходимо применять индивидуальные. Предложенная нами модель позволяет по-новому взглянуть на проблему сахарного диабета, особенно 2 формы – инсулинрезистентной. Как видно из модели, усвоение глюкозы зависит от скорости утилизации энергии АТФ, в частности на процесс синтеза белка. Поэтому развитие гипергликемии при диабете в значительной степени обусловлено или недостаточным субстратным обеспечением процесса синтеза белка, или снижением активности белоксинтезирующего аппарата. При диабете 1 формы – инсулинзависимом, когда отмечается дефицит гормона, происходит растормаживание метаболических конвейеров, протекающих при использовании ЭНПП. Так как запасы жира намного превышают количество утилизируемого белка (это то количество белка, которое организм может использовать при голодании), то происходит развитие несоответствия между величиной окисления жиров и потребностью в энергии АТФ процесса глюконеогенеза. Это приводит к торможению окисления жиров на этапе дальнейшего превращения ацетил-КоА. Происходит его конденсация в ацето-ацетат и далее в оксибутират и ацетон, то есть развивается кетоацидоз (диабетическая кома), который может приводить к смерти больного диабетом. Обычно для выхода из комы дают инсулин для блокирования метаболических конвейеров этапа ЭНПП, однако можно снять кетоацидоз и посредством дачи субстрата для глюконеогенеза, в частности аланина, что будет способствовать соответствию на этапе использования ЭНПП величины образования АТФ (окисление жиров) с величиной ее утилизации (глюконеогенез). Предложенная модель позволяет по-новому подойти к разработке питания при ожирении. Обычный подход при этом заболевании основывается на снижении величины 317 потребления калорий и повышения их трат, но такой подход приводит к ухудшению метаболических процессов на этапе использования ЭКПП и, напротив, к активации процессов этапа использования ЭНПП. Такой подход приводит к снижению величины синтеза белка и, напротив, повышению скорости его катаболизма. Так как белки являются генетическими программами всех функций организма, то нарушение процессов обмена белков приводит к развитию различных функциональных нарушений, поэтому необходимо использовать диетические подходы, способствующие предотвращению развития нарушений со стороны белкового обмена. В период использования ЭКПП необходимо обеспечить процесс синтеза белка субстратами (аминокислотами) и активаторами белоксинтезирующего аппарата (например, аминокислота лейцин способствует агрегации рибосом и усилению синтеза белка на этапе трансляции), следует также вводить в рацион витамины группы В и кальций. В постабсорбтивный период, когда используется ЭНПП необходимо давать субстраты для глюконеогенеза, в частности аланин и фруктозу. Это будет способствовать: а) улучшиться процесс окисления жиров и, соответственно, не произойдет накопление в крови кетоновых тел; б) улучшиться обеспечение мозга глюкозой, что будет способствовать снижению аппетита и предотвратить развитие различных психологических расстройств; в) снизится величина катаболизма белка, что предотвратит развитие различных функциональных нарушений. Таким образом, биохимический подход в вопросах разработке питания человека в норме и при заболеваниях открывает новые перспективы в повышении работоспособности человека и профилактики и лечения обменных заболеваний, в частности диабета и ожирения, которые по своим масштабам приняли размах эпидемии. Литература 1. Биохимия / под редакцией Е.С.Северина. – М. «Гэотар-Медиа». – 2009. – 739 с. 2. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации / Методические рекомендации МР 2.3.1.2432-08 утвержденные 18 декабря 2008 г. Глав.сан.врачом Г.Г.Онищенко. 3. Suh SW, Aoyama K, Chen Y, Garnier P, Matsumori Y, Gum E, Liu J, Swanson RA. Hypoglycemic neuronal death and cognitive impairment are prevented by poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors administered after hypoglycemia. J Neurosci. 2003. – V.23. – P. 10681–10690. 4. Марра Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Том.1 // М. Мир. 1993. 381 с. 318 ОСОБЕННОСТИ СЕЗОННОЙ ДИНАМИКИ СОДЕРЖАНИЯ СУММЫ АЛКАЛОИДОВ В РАСТЕНИЯХ ВИДА THALICTRUM MINUS L. В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО И ЗАСУШЛИВОГО ГОДА Л.Ю. Самойлова1, О.И. Михайленко2, Я.О. Гуркова1, Г.В. Шендель1 1 Институт биологии УНЦ РАН 2 Уфимский государственный нефтяной технический университет Проанализирована сезонная динамика содержания суммы алкалоидов в растениях Thalictrum minus L. в нормальный и засушливый годы. В условиях нормального увлажнения в надземной части растений содержание алкалоидов было наибольшим на стадии цветения, а в период засухи – на стадии плодоношения при возобновлении их роста после дождей. PECULIARITY OF SEASONAL DYNAMICS OF THE CONTENT OF SUM OF ALKALOIDS IN PLANTS OF THALICTRUM MINUS L. UNDER CONDITIONS OF NORMAL AND DRY YEARS L.Y. Samoylova1, O.I. Mihaylenko2, Y.O. Gurkova1, G.V. Shendel1 1 Institute of Biology of Ufa Scentiefic Center of Russian Academy of Sciences 2 Ufa State Petroleum Technical University Seasonal dynamics of the content of sum of alkaloids in plants of Thalictrum minus L. under conditions of normal and dry years have been analyzed. Under conditions of normal humidity the content of alkaloids in the aboveground plant parts was greatest at the stage of flowering, while during the period of drought – at the stage of fruiting under growth resumption after the rains. Вид Thalictrum minus L. (сем. Ranunculaceae) является одним из перспективных источников изохинолиновых алкалоидов, обладающих болеутоляющей, противовоспалительной, гипотензивной и противоопухолевой активностью, на основе которых уже получены или находятся в стадии разработки высокоэффективные медицинские препараты [7]. Содержание алкалоидов в растениях Т. minus зависит от ряда факторов, в том числе от стадии сезонного развития. В благоприятный по климатическим условиям год наибольшее содержания алкалоидов в растениях этого вида было выявлено в период цветения [2]. Однако для Башкирского Предуралья характерны периодические засухи, а в литературе нет данных о влиянии экстремальных погодных условий на сезонную динамику содержания алкалоидов. Цель работы – анализ особенностей сезонной динамики содержания 319 суммы алкалоидов в растениях Т. minus в нормальный и засушливый годы в Башкирском Предуралье. Материал и методы исследования. Сбор материала для анализа сезонной динамики содержания суммы алкалоидов в растениях вида Т. minus проводили в 2003 и 2010 годах. В 2003 году на участке луговой степи в Туймазинском районе Республики Башкортостан. В 2010 году на этом участке из-за засухи растительность засохла, поэтому сбор материала проводили на участке остепненного лугового сообщества, приуроченного к верхней трети южного склона увала в Кушнаренковском районе Республики Башкортостан. По данным метеостанции г. Уфы в период от начала вегетации до завершения плодоношения растений Т. minus (с мая до конца августа) выпало в 2003 году 267 мм осадков, а в 2010 году 93,6 мм осадков, что в 3 раза меньше их среднегодичного количества за этот период [5]. В течение этого отрезка времени осадки выпадали очень неравномерно (таблица 1). Таблица 1 – Подекадное распределение осадков в 2003 и 2010 году Месяцы Май Июнь Июль Август Декады 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Количество осадков, мм 2003 г 2010 г 35,1 0,4 16,1 4,9 23,3 15,1 6,8 4,5 52,4 2,7 68,0 3,3 31,0 0,1 2,8 24,8 0 0,8 5,2 0 11,0 5,6 15,5 31,4 Для определения содержания суммы алкалоидов в растениях отбирали случайным образом 15–20 генеративных растений, у которых отделяли корни и надземную часть. Сбор образцов растений проводили на следующих стадиях сезонного развития: начало вегетации, вегетации (начало формирования соцветий), бутонизации, цветения, плодоношения. Сухие образцы измельчали до частиц размером не более 0,2 мм. Для анализа на содержание суммы алкалоидов из перемолотых средневыборочных образцов отбирали по 10 г измельченной надземной части и по 5 г измельченных корней. Из образцов дважды экстрагировали липиды путем настаивания в 150 мл гексана. Далее проводили извлечение алкалоидов. В связи с присутствием у этого вида алкалоидов берберинового типа, трудно извлекаемых из водных растворов, извлечение алкалоидов из сырья проводили последовательно двумя методами: сначала в аппарате Сокслета этиловым спиртом, а затем 10%-ным раствором серной кислоты. Образцы экстрагировали в аппарате Сокслета 96%-ным этиловым спиртом до максимально полного извлечения алкалоидов, которое контролировали качественными 320 реакциями с кремневольфрамовой кислотой и реактивом Драгендорфа [1]. Полученный экстракт отфильтровывали на воронке Шотта, затем отгоняли этиловый спирт на роторном испарителе. Оставшееся после спиртовой экстракции сырье обрабатывали 20 мл 10%-ного раствора серной кислоты и настаивали в течение 30 минут с тремя перемешиваниями. Образовавшийся кислотный экстракт отфильтровывали на воронке Шотта и объединяли с упаренным спиртовым экстрактом. Из объединенного экстракта (pH=1–3) хлороформом экстрагировали органические соединения неалкалоидного характера. Далее полученный водный раствор, содержащий соли алкалоидов, подщелачивали 50%-ным раствором NaOH до pH=12–13 для перевода алкалоидов в основания. Алкалоиды в виде оснований исчерпывающе экстрагировали смесью хлороформа со спиртом в отношении 9:1 [3]. Полученный экстракт содержал воду (образующую азеотропную смесь с хлороформом), которую удаляли с помощью безводного сульфата натрия. Растворенную в смеси хлороформа со спиртом сумму алкалоидов упаривали на роторном испарителе. Остатки растворителей откачивали на высоковакуумном насосе до вспенивания и постоянного веса. Сумму алкалоидов взвешивали на аналитических весах Acculab ATL – 220 г (d=0,1 мг). Результаты исследования и их обсуждение. В целом, на всех стадиях сезонного развития содержание суммы алкалоидов в надземной части растений было выше, чем в других регионах [4] (таблица 2). Содержание алкалоидов может быть более высоким в отдельных органах в период их интенсивного роста [6]. Вероятно, с этим связано то, что в условиях нормального увлажнения в 2003 году наибольшее содержание суммы алкалоидов в надземной части растений было в период цветения, когда у растений этого вида еще продолжается рост побегов в высоту и одновременно идут ростовые процессы в генеративном аппарате. При этом содержание суммы алкалоидов в корнях несколько снижалось, что может быть связано с их частичным переходом в надземную часть. На стадии плодоношения рост надземной части растений замедлялся, и, поэтому, содержание суммы алкалоидов в ней снижалось. Одновременно увеличивалось содержание алкалоидов в корнях. Таблица 2 – Сезонная динамика содержания суммы алкалоидов в растениях Thalictrum minus L. в обычный (2003) и засушливый (2010) годы (% сухой массы) Фаза сезонного развития Начало вегетации Вегетация (до бутонизации) Бутонизация Цветение Плодоношение Корни 2003 2010 2,21 -* 2,73 1,85 2,56 2,99 3,37 2,66 Примечание: *- образцы растений не анализировались 321 Надземная часть 2003 2010 1,22 1,07 1,78 1,05 0,97 1,30 1,70 В июне 2010 года, когда происходило цветение растений изучаемого вида, количество выпавших осадков было в 12 раз меньшим по сравнению с 2003 годом. Растения развивались медленнее. При этом было более высоким содержание суммы алкалоидов в корнях. В середине июля в течение трех дней выпало 25 м осадков, после которых уже на стадии плодоношения растения стали заметно более зелеными и возобновили рост в высоту. При этом увеличилось содержание суммы алкалоидов в надземной части и уменьшилось в корнях. Таким образом, при торможении роста растений Т. minus в период засухи несколько снижается содержание суммы алкалоидов в надземной части и увеличивается в корнях, а при возобновлении роста снижается в корнях и увеличивается в надземной части. Выявленные закономерности необходимо учитывать при заготовке надземной части растений этого вида для производства медицинских препаратов. Литература 1. Гольдина О.А., Кузнецова Ю.С., Иванова Т.Г., Зеличонок С.А., Абхази Н.Л. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. – М.: Химия, 1990. – 688 с 2. Михайленко О.И., Федоров Н.И. Сезонная динамика содержания суммы алкалоидов в растениях василистника малого // Материалы 2-ой Всероссийской научной INTERNET-конференции. Уфа, 2003. С. 33-34. 3. Орехов А.П. Химия алкалоидов растений СССР. – М.: Наука, 1965. – 391 с. 4. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Magnoliaceae-Limoniaceae. Л.: Наука, 1985. Т. 1. 460 с. 5.Специализированные массивы для климатических исследований. URL: http://meteo.ru/climate/sp_clim.php 6. Федоров Н.И. Род Delphinium L. на Южном Урале: экология, популяционная структура и биохимические особенности. – Уфа: Гилем, 2003. – 149 с.. 7. Юнусов М.С. Химия изохинолиновых алкалоидов: Учеб. пособие. - Уфа: Изд-во УГНТУ, 2007. 53 с. О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ РАДИАЦИИ ПРИ ДЕПРЕССИВНЫХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА Б.В. Тестов, Л.Н. Баранова Естественнонаучный институт федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет», testov@ psu.ru Депрессия считается социальным заболеванием, этиология которого до сих пор непонятна. От депрессии страдают ежегодно 15 миллионов американцев. Клиническая депрессия может продолжаться много месяцев. В статье предложен механизм возникновения депрессии молодых и 322 старых людей. Показана возможность профилактики этого заболевания при помощи малых доз радиационного облучения. ABOUT THE OPPORTUNITY OF APPLICATIONOF RADIATION AT DEPRESSIONS OF THE ORGANISM B.V. Testov, L.N. Baranova Natural Science Institute, testov@ psu.ru Depression is considered social disease which reason till now is not clear. From depression suffer annually 15 million Americans. Clinical depression can proceed many months. In article the mechanism of occurrence of depression of young and old people is offered. The opportunity of preventive maintenance of this disease by means of small dozes of a radiating irradiation is shown. Депрессивное состояние бывает у всех людей, независимо от возраста, пола и расовой принадлежности. Оно, как правило, быстро проходит, как только человек займется играми, спортом или просто интересным делом, которые требуют расхода энергии. Поэтому депрессию часто называют «психическим насморком» [2]. Ежегодно от депрессии страдают 15 миллионов американцев. Около половины больных не знают, что у них депрессия, поскольку депрессивное состояние характеризуется разной глубиной. Заболеваемость депрессией у людей родившихся после второй мировой войны значительно выше. Медики считают, что большинство форм депрессии излечимы. Легкие формы депрессии в психотерапии известны как адаптационные расстройства, и они легко излечиваются. Однако клиническая депрессия выводит людей из строя на месяцы и даже годы. Депрессия – это синдром или совокупность определенных симптомов, для которых по данным Американской психиатрической ассоциации характерны следующие критерии: 1) Подавленное состояние духа и раздражительность; 2) Апатия, общая неудовлетворенность, почти ежедневная пониженная активность; 3) Значительная потеря или прибавление веса без перехода на новую диету; 4) Хроническая бессонница или патологическая сонливость; 5) Психомоторное возбуждение или торможение; 6) Почти хроническая усталость и потеря энергии; 7) Ощущаемое состояние никчемности, неуместное чувство вины; 8) Пониженная способность к мышлению, невозможность сосредоточиться; 9) Навязчивые мысли о смерти, о самоубийстве. [2]. 323 В настоящее время людей в депрессивном состоянии лечат при помощи медицинских препаратов. Однако, по нашему мнению, возникновение депрессии связано с запасом энергии в человеческом организме. Известно, что биоэнергетика животного организма определяется интенсивностью метаболических процессов. При этом в клетках организма происходит окисление органических веществ (белков жиров, углеводов), в результате чего синтезируются молекулы АТФ, обеспечивающие энергетику биохимических реакций. Интенсивность окислительных реакций определяется скоростью потребления кислорода, которая изменяется в зависимости от энергетических потребностей организма. Однако давно известно, что в утреннее и вечернее время, работоспособность человека при одинаковой интенсивности потребления кислорода, сильно различается. Утром человек способен выполнить большой объем работы, тогда как в вечернее время его работоспособность очень низкая. В таком случае часто говорят о том, что у человека иссяк запас энергии и ему необходимо отдохнуть. Во время ночного сна организм человека снижает поток крови через головной мозг и мышцы, увеличивая поток энергии в лимфатической системе, где формируется запас энергии для следующего трудового дня. Формирование запаса энергии является острой необходимостью особенно для животных, которые должны самостоятельно передвигаться в поисках пищи или полового партнера, вести постоянную борьбу с конкурентами, спасаться от хищника. Энергетические запросы организма в экстремальных условиях многократно усиливаются и не могут быть удовлетворены повышением интенсивности окислительных реакций. Во время сна животные снижают интенсивность кровотока в головном мозге и мышцах, и часть энергии, полученной в процессе дыхания, накапливают в виде запаса молекул АТФ. Для создания необходимого запаса АТФ человеку требуется в среднем около 8 часов сна, однако после больших нагрузок или длительного бодрствования время сна может существенно увеличиваться. Следует отметить, что продолжительность сна и количество накопленной энергии, зависит от возраста. Наиболее продолжительный сон у детей в возрасте до года. Новорожденные спят почти круглые сутки с перерывами на кормление. Их энергия расходуется только на деление клеток, они очень быстро растут. С возрастом человек расходует энергии все меньше и меньше, поэтому снижается потребность в количестве запасаемой энергии. Снижение запаса энергии отражается на продолжительности сна. Старческая бессонница связана с тем, что организму нужно меньше времени для создания суточного запаса энергии. Одновременно изменяется режим жизнедеятельности человека. Молодой организм много спит и может активно работать целый день. Старый человек быстро устает и должен устраивать частые перерывы для отдыха, во время которых он 324 пополняет запас израсходованной энергии. Болезни у людей пожилого возраста, часто связаны с недостатком запаса энергии, необходимого для регенерации тканей в различных органах и системах. Доказательством являются свидетельства о том, что лучше себя чувствуют люди, ведущие активный образ жизни. Под активностью подразумевается большая подвижность человека, связанная с бегом, ходьбой, физическими нагрузками. Поэтому все рекомендации врачей, направленные на укрепление здоровья пожилых людей, включают физические нагрузки и более продолжительный сон. Ученые давно предполагали наличие у животных запаса энергии в виде депо молекул АТФ, которые в критические моменты доставляются работающим клеткам. Однако пока неизвестен способ доставки молекул АТФ клеткам, нуждающимся в дополнительной энергии. В кровотоке, по которому клеткам доставляется кислород и питательные вещества, молекулы АТФ не обнаружены. Мы считаем, что эти молекулы могут поставляться клеткам посредством щелевого контакта, открытого американскими учеными в 1958 году Исследования показали, что через образованную щель шириной около 3 мкм неорганические ионы и другие молекулы массой до 1500 дальтон могут переходить из одной клетки в цитоплазму другой. Переход осуществляется через коннексоны мембран соседних клеток, которые при соединении в стык образуют непрерывный водный канал сравнительно небольшого диаметра [1]. Через щелевые контакты клетки могут обмениваться молекулами АТФ, которые имеют массу около 500 дальтон. Таким способом остро нуждающиеся в энергии клетки могут получать молекулы АТФ непосредственно от других клеток, которые могут выполнять функции переносчиков энергии. Клетки, обеспечивающие перенос энергии, должны быть многочисленными, иметь небольшой диаметр и обладать системой митохондрий, способных синтезировать АТФ. Для выполнения такой миссии наиболее подходят малые лимфоциты, способные проникать практически в любые точки многоклеточного организма. Лимфоидные узелки появляются уже при развитии плода и присутствуют во всех тканях организма. Большинство клеток в ранних эмбрионах сообщается через щелевые контакты [1]. Закладка лимфоидного образования в костном мозге и тимусе эмбриона человека приходится на четвертую-пятую недели эмбриогенеза, в селезенке и лимфатических узлах на пятую-шестую недели. Появление лимфоидных узелков, которые являются центрами размножения, наблюдается на шестнадцатой-двадцатой неделе эмбриогенеза. Масса лимфоцитов в теле взрослого человека равна примерно 1500 г, то есть не менее 8х1014 клеток [3]. До сих пор принято считать, что лимфоциты в организме выполнят только иммунную функцию. Тогда не совсем понятно, почему иммунная система развивается на ранних стадиях эмбриогенеза, когда развивающийся плод находится под защитой иммунной 325 системы материнского организма. Однако все легко объясняется, если принять, что лимфоциты могут обеспечивать энергетические потребности развивающегося организма. В период эмбриогенеза, когда энергетические запросы интенсивно делящихся клеток могут существенно опережать интенсивность формирования кроветворной системы, адресная передача энергии через щелевые контакты может быть весьма эффективной. Поэтому система энергообеспечения клеток организма может быть представлена следующим образом: – Основной метаболизм осуществляется в клетках, которые получают кислород и питательные вещества через кровь; – Дополнительная обеспечение клеток молекулами АТФ при острой необходимости осуществляется лимфоцитами, которые посредством щелевого контакта снабжают клетки молекулами АТФ. Запас энергии формируется во время сна и должен быть израсходован за период бодрствования организма. Он является достаточно большим у молодого организма и обеспечивает энергетические потребности делящихся клеток. После прекращения роста организма (в 20 лет) потребность организма в дополнительной энергии заметно снижается, что приводит к постепенному уменьшению количества лимфоузлов. К 70 годам количество лимфоузлов становиться очень маленьким, что создает большие проблемы с накоплением запаса энергии для старого человека. Создаваемый во время ночного отдыха запас энергии должен быть израсходован организмом. Успешная и быстрая реализация запаса энергии у ребенка приводит к тому, что ребенок дольше спит и накапливает больше энергии. Маленьким детям свойственна большая подвижность. Поэтому дети могут сосредоточенно заниматься только очень непродолжительное время. Об этом позаботилась сама природа, заставляющая детский организм находится в постоянном движении. Как только ребенок израсходовал запас энергии, он начинает засыпать, чтобы восполнить этот запас. Когда ребенку по ряду причин не позволяют двигаться (бегать, прыгать) он начинает капризничать, выражая свое недовольство. Ребенок в возрасте 7–8 лет уже понимает, что капризничать и выражать открыто свое недовольство нельзя, поскольку за этим последует наказание. У ребенка просто портится настроение, хотя причины он сам не понимает. Такое состояние называется депрессивным. У пожилых людей депрессия возникает гораздо реже и по другой причине. Депрессивное состояние у них возникает не из-за избытка, а от недостатка запасенной энергии. Запас энергии определяется продолжительностью сна, а старые люди часто страдают бессонницей. Бессонница вызвана тем, что с возрастом уменьшается число лимфатических узлов и старые люди не способны запасать много энергии. Поэтому 326 депрессивное состояние старых людей часто связано с хронической усталостью и быстрой утомляемостью. Единственной возможностью исправить это положение является увеличение физических нагрузок, что повысит потребность организма в количестве запасаемой энергии и несколько затормозит скорость снижения числа лимфоузлов в организме. Нами предложенная тепловая концепция действия радиационного излучения на организм. Поражение клеток и гибель организма вызывает не энергия потока излучения, а энергия самого организма. Проникающее в клетки организма рентгеновское и гаммаизлучение теряет энергию и превращается в ультрафиолетовое излучение, которое приводит к увеличению температуры за счет гидролиза молекул АТФ. При больших мощностях доз облучения повышение температуры достигает нескольких градусов и вызывает тепловой шок клеток. Небольшие дозы облучения вызывают небольшой нагрев, который организм легко переносит. Облучение приводит к резкому уменьшению энергии, накопленной в организме, то есть снижает запас энергии. Физические нагрузки также снижают запас энергии у человека и животных. Поэтому облучение небольшими дозами радиации будет легко снимать состояние депрессии у молодых энергичных людей. Пожилым людям, которым трудно получать физические нагрузки, можно их формировать путем облучения небольшими дозами радиации. Облучение будет создавать эффект дополнительной нагрузки за счет гидролиза АТФ и улучшит их сон. Таким образом, облучение людей небольшими дозами радиации позволит легко снимать депрессивное состояние. Литература 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки Т.2, Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. С 481-485. 2. Салманс С. Депрессия: Вопросы и ответы/ Пер. с англ.-М.: Крон-Пресс, 1997. 192 с. 3. Сапин М.Р., Этинген Л.Е. Иммунная система человека. – М.: Медицина, 1996. С. 304 327
