Pribori Oy РУКОВОДСТВО ПО БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОМУ ТЕСТИРОВАНИЮ НА ТОКСИЧНОСТЬ

Pribori Oy
РУКОВОДСТВО ПО БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОМУ ТЕСТИРОВАНИЮ НА
ТОКСИЧНОСТЬ
Практическое руководство по эффективному использованию системы BioTox.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение в экологию биолюминесценции.
Необходимость мониторинга токсинов окружающей среды
Использование биолюминесцентых бактерий для тестирования на токсичность
Сравнение тестов Микробной биолюминесценции и Острой летальности
Дополнительные способы токсикологического использования биолюминесцентных бактерий.
Система BioTox
Набор BioTox
Оборудование
Необходимое дополнительное оборудование и расходные материалы
Проведение теста
1. Подготовка препарата
2. Подготовка
Проведение теста
1. Подготовка образца.
2. Подготовка ряда растворенных образцов.
3. Процедура тестирования
Вычисление результатов.
Пример данных, полученных при помощи системы BioTox
Данные о продукте.
Литература
Введение в экологию биолюминесценции
Биолюминесценция – это свет, выделяемый живыми организмами в результате их биохимической
(ферментной) активности. Термин также относится к тем реакциям, которые производятся с экстрактами
ферментов в пробирке.
Биолюминесценция довольно редка в наземных экосистемах, организмы способные излучать свет – в
основном насекомые и грибы. В пресноводной среде обитания, биолюминесценция практически
отсутствует. Однако, «биологический свет» в морских средах обитания широко распространен и
представлен многими видами. Биолюминесцентные организмы могут преобладать в морских
экосистемах, например, рядом с Бермудами 97% всех форм жизни, согласно исследованию, обладают
биолюминесценцией, это включает 75% всех видов рыбы.
Преобладание биолюминесцентных организмов в океанах возможно связано с их глубиной, которая
предотвращает проникновение света. При таких условиях, способность организмов давать свет может
дать некоторые преимущества. Однако, в настоящее время мало известно о точной функции
производимого света широким спектром морских организмов, у которых он встречается.
Биолюминесцентные бактерии встречаются в большом количестве океанов, и предполагается, что
феномен бактерий является побочным продуктом окислительного метаболизма (все биолюминесцентные
реакции требуют присутствие кислорода) этих организмов. Во многих случаях, биолюминесцентные
бактерии живут в тесном сотрудничестве с высшими организмами и наделяют их свойствами также
производить свет. Такие симбиотические отношения дают преимущества организму-хозяину и создают
в высшей мере благоприятные условия для бактерий. Способность высших организмов давать свет
(естественным путем, или благодаря симбиозу с бактериями) считается вовлеченной в отношения
хищника/дичи или для привлечения партнера.
Важность биолюминесценции в жизни глубин океана выявляется благодаря открытию, что визуальные
системы глубоководных существ созданы таким образом, что бы распознавать типичные длины
биолюминесцентных волн. Уровни выделения биологического света в морских экосистемах были
использованы для измерения экологических изменений. Уровни биолюминесценции в прибрежных
водах Индийского и Калифорнийского побережья значительно падали при наличии различных
загрязняющих веществ. Эти открытия привели к предположению, что естественные уровни
биолюминесцентных бактерий могут использоваться для мониторинга эффектов загрязнения в морских
экосистемах.
НЕОБХОДИМОСТЬ МОНИТОРИНГА ТОКСИНОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
За последние годы уровень информированности об экологических проблемах и необходимость защитить
окружающую среду выросла как среди ученых, так и среди населения. С введением более жестких
законов о выпуске вредных химикатов в окружающую среду, больше и больше предприятий вынуждены
тестировать сточные воды на предмет потенциально вредного влияния на экосистемы. Многие страны
принимают законы, заставляющие производства, которые спускают отработанные сточные воды в реки и
заливы, проверять сточные воды на наличие токсинов, которые оказывают влияние на окружающую
среду. Такими составляющими являются металлы, биоциды, моющие средства и устойчивые красители.
Озабоченность не останавливается на прямом экологическом вреде процесса очистки воды, который
основан на биологической активности. Вред этим процессам, вызванный токсинами, может иметь
прямые и серьезные последствия для человеческого сообщества.
Токсичные вещества влияют на живые организмы, главным образом, ингибируя ферментные системы,
вовлеченные в процесс метаболизма. Токсичные эффекты часто измеряются при помощи биотестов,
когда живой организм подвергается действию исследуемого токсина. В данных целях используются
различные организмы, включая микроорганизмы, высших животных и растений плюс ряд клеточных
линий.
Наиболее часто встречающиеся тесты ставят своей целью измерить, предсказать и контролировать
выброс субстанций, которые могут оказаться вредоносными для водных организмов. Такие тесты
измеряют эффект исследуемого образца на ряде организмов, обычно находящихся в большинстве
водных сред. Они включают в себя форель, толстоголова и водяную блоху (Daphnia). Данные тесты
известны как тесты на острую летальность, так как они измеряют количество организмов в культуре,
которые умирают от воздействия образца. Тесты на острую летальность часто дорогие, требуют больших
количеств образца и обычно требуют более 24 часов инкубации. Соответственно, эти тесты обычно
проводятся специалистами в лабораториях анализа воды. Тесты на острую летальность, основанные на
многоклеточных организмах, обычно не подходят для тестирования сточных вод все возрастающим
количеством различных промышленных предприятий. Таким образом, использование микро-организмов,
в частности биолюминесцентных бактерий, дает множество преимущества в качестве скрининг теста на
наличие токсинов. Для него требуются намного меньшие объемы образца, время тестирования
уменьшается до менее 30 минут, и с вводом в использование высушенных сублимацией организмов,
таких как используемые в реагенте BioTox, отпадает необходимость содержать запасные культуры.
Биолюминесцентные бактерии дают возможность гораздо большему количеству неспециалистов и
организаций проводить токсикологические скрининг тесты.
2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ТОКСИЧНОСТЬ.
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ
БАКТЕРИЙ
ДЛЯ
ТЕСТОВ
НА
Фермент, вовлеченный в образование бактериологической биолюминесценции называется люцифераза.
Реакция, катализатором для которой служит этот фермент, включает окисление длинноцепочечного
альдегида и коэнзима, флавинмононуклеотида (FMNH2 ) согласно следующей формуле реакции:
Люцифераза
FMNH2 + O2 +R-CO-H ⇒ FMN + R-COOH + H2O + СВЕТ
Вмешательство в любую часть метаболизма клетки, которое влияет на выделение любого компонента,
будет немедленно отмечено благодаря уменьшению светового излучения. Токсины, влияющие на
экспрессию генов или специальные реакции, катализаторами для которых служат ферменты, таким
образом, будут обнаружены.
Тесты на токсичность с биолюминесцентными бактериями – это очень простая процедура.
Приготавливается серия растворов тестируемого образца и каждый раствор добавляется в эмульсию
бактерий в пробирке. Затем они инкубируются 30 минут (5 и 15 минутные инкубации могут быть
разрешены стандартными протоколами) и затем измеряется световое излучение клеток люменометром.
Любое токсичное соединение, присутствующее в начальном образце, будет иметь неблагоприятное
влияние на метаболизм клеток, приводящий к уменьшению их естественного светоизлучения.
Интенсивность излучения в каждом случае сопоставляется с контрольным образцом, дающим
максимальное излучение. Эти данные используются для составления кривой ингибирования. По этой
кривой возможно определить коэффициент разбавления, который дал 50% подавление при сравнении с
контрольным образцом. Это значение называется EC50 и используется в качестве показателя
токсичности образца.
Биолюминесцентный тест очень подходит для проверок, так как это быстро, просто, дешево,
используются маленькие количества образца и процесс легко автоматизировать. По этим причинам, он
все чаще используется, и ряд национальных и международных постоянно действующих инструкций по
эксплуатации был опубликован (ISO, DIN, US. EPA и Министерство по охране окружающей среды
Канады). Эти стандарты основаны на использовании одного организма, Vibrio fischeri (NRRL B-11177).
Система BioTox, описанная в этом руководстве, была создана в соответствии с этими стандартами.
Система BioTox является самодостаточной, предлагая также люминометр с регулируемой температурой,
реагенты, и программное обеспечение для удобства тестирования.
СОПОСТАВЛЕНИЕ ТЕСТОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И ТЕСТА НА
ОСТРУЮ ЛЕТАЛЬНОСТЬ
Чувствительность биолюминесцентного теста схожа с чувствительностью тестов на острую летальность
с использованием рыбы. Сравнение биолюминесцентного теста с тестом на острую летальность с
использованием форели, толстоголова и водяной блохи (Daphnia) показало, что чувствительность к
чисто органическим соединениям, бытовым отходам и производственным сточным водам одинакова.
Однако, тест в некоторых случаях может быть более или менее чувствительным чем некоторые виды
рыб или другой многоклеточный организм. В общем, микро-организмы являются наиболее
чувствительными видами в водных экосистемах, и они были рекомендованы для постоянного
использования при оценке токсичности.
Так как Vibrio fischeri является морским организмом, тест должен проводиться при 2% минерализации.
Это привело к некоторой озабоченности по поводу использования организмов для тестирования
3
токсичности образцов пресной воды. Однако, обширные исследования показали, что наиболее часто
встречающиеся токсины имеют одинаковую токсичность для морских и пресноводных организмов,
которые тестируются каждый в своей среде.
Преимущества биолюминесцентных бактерий для тестирования на токсичность можно кратоко описать в
следующих положениях:
• С тестами на бактериях не связаны никакие этические проблемы
• Они по большому счету обладают теми же биохимическими путями метаболизма, что и высшие
организмы
• Бактерии играют жизненно важную роль в пищевой сети экосистемы. Нарушение токсинами
бактериальной активности будет иметь очень серьезные последствия для экосистемы.
• Поставка лиофилизированных бактерий (тест BioTox) полностью исключает необходимость
дорогого и трудоёмкого содержания тестовых организмов.
• Бактериальные анализы, как правило, гораздо более быстрые, чем те, в которых вовлечены
высшие организмы.
• Для бактериологических анализов требуются меньшие объемы образца.
• Бактериальные анализы дают статистическое преимущество перед анализами с высшими
организмами, так как можно легко использовать большее количество клеток.
Несмотря на множество плюсов, некоторые токсичные соединения могут быть высоко специфичны для
эукариотных организмов. Таким образом, широко признано, что сами по себе тесты на бактериях не
должны заменять тестов на высших организмах. Обычно рекомендуется проводить комплекс тестов на
ряде организмов, занимающих разные уровни трофической цепи. Все регулярно используемые тесты на
токсичность были сравнены в широкомасштабном процессе сравнения, известном как проект MEIC
(Bondesson, и др., 1989). Это сравнение сопоставило 50 избранных химических веществ, включая
тяжелые металлы, пестициды, инсектициды, органические углеводороды и растворители, и их действие
на различные организмы, включая люминесцентные бактерии.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ.
СПОСОБЫ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Биолюминесцентный тест применялся к различным типам водных образцов, включая:
•
•
•
•
•
Сточные воды
Водные вытяжки и продукты выщелачивания
Пресная вода (как наземные так и грунтовые воды)
Соленая и слабоминерализованная вода
внутрипоровая вода
Однако, тест можно использовать не только на водных загрязнителях. Он использовался для
тестирования образцов ила и тины из загрязненных мест сброса отходов. Подобным образом, тест может
использоваться для измерения прогресса детоксификации или биодеградации токсичных соединений.
Фармакопея США сочла, что это тест для материалов, используемых в контейнерах для лекарств, и
медицинской аппаратуры. Также он применялся для определения пикомолярных концентраций
загрязнений в лекарственных препаратах и компонентах пищи.
СИСТЕМА BIOTOX
Система BioTox – цельная система для биолюминесцентного тестирования, основанного на Vibrio
fischeri. Система была разработана в соответствии со всеми технологическими стандартами проведения
биолюминесцентных тестов на токсичность. Она включает высокочувствительный люминометр Lumitester PD 20 или Lumitester C-110 (Kikkoman). Люминометр может быть соединен с персональным
4
компьютером, на котором установлено программное обеспечение BioTox. Это обозначает, что данные
автоматически получаются с люминометра, чертятся кривые ингибирования
и автоматически
высчитываются значения EC50. Система дополняется набором BioTox. Он содержит пробирки с
лиофилизированными Vibrio fischeri. для проведения теста, бактерии просто восстанавливают и
уравновешивают до 15oC. Затем клетки готовы к использованию, нет необходимости культивировать
тестовые организмы. Все что нужно для теста – это подготовка тестового раствора. Затем они
инкубируются при 15oC с восстановленным реагентом вплоть до 30 минут и светоизлучение
считывается с каждой пробирки. Измеряя образцы в заранее заданном порядке, программное
обеспечение BioTox затем установит значения EC50 для каждого образца.
НАБОР BIOTOX
Набор BioTox состоит из:
Реагент BioToxTM 6 пробирок. Лиофилизированные. Содержат лиофилизированные Vibrio fischeri со
стабилизаторами для защиты бактерий в период хранения.
Реагент Растворитель, 6 пробирок 12.5 ml/пробирка
Растворитель образец, 1 бутылка, 50 ml
Восстановление реагента
Реагент BioToxTM растворяется путем добавления 1 бутылочки Реагент Растворитель в пробирку с
Реагентом BioToxTM. Для лучшего результата используйте холодный (+4°C) Реагент Растворитель.
Восстановленный реагент уравновешивают до 15°C перед использованием.
После восстановления Реагент BioToxTM необходимо использовать в течение 8 часов.
ОБОРУДАВАНИЕ
Для проведения теста в соответствии с установленными стандартами ISO и DIN люминометр должен
правильно работать при 15oC. Люминометр PD 20 необходимо использовать при температуре
окружающей среды в 15°C. В добавление, требуется охлаждающий блок, установленный на значение
15oC, он прилагается как часть системы BioTox.
ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.
Твердый NaCl (качества для анализов)
Регулируемые пипетки на 200 µl и 1 мл и наконечники для пипеток
Кюветы для люминометра
ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА
1. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА
Образцы необходимо собирать в химически инертные, чистые контейнеры. Образцы можно хранить
в стеклянных бутылках в темном месте при температуре 2 и 5 oC до 48 часов, или на 7 дней при -
5
20oC. Консервирующие химические компоненты не должны быть добавлены в образцы.
Предпочтительно тестировать образцы как можно быстрее после сбора. Модификации (pH или
соленость) должны производиться прямо перед тестированием.
Всегда измеряйте pH образцов. Если pH находится в интервале между 6 и 8,5, вносить изменения не
требуется. Желательно избегать изменения pH, но в случаях, когда это необходимо, используйте
соляную кислоту или гидроокись натрия для того, чтобы pH равнялся 7.0 (± 0.2). Выберите
концентрацию кислоты или щелочи, позволяющую получить требуемый уровень pH в минимальном
объеме.
При использовании пресноводных образцов или образцы с низкой осмолярностью, важно
скорректировать осмоляроность. Это делается путем добавления твердого NaCl до конечной
концентрации 2% вес/объем. для образцов с высоким уровнем минерализации уменьшите уровень
добавляемого NaCl.
2. ПОДГОТОВКА РЯДА РАСТВОРЕННЫХ ОБРАЗЦОВ
Подготовьте ряд растворенных образцов в соответствии с таблицей 1, используйте в десять раз
растворенный Растворитель образцов или 2% раствор NaC для растворения образцов. После растворения
образец должен быть уравновешен до +15°C.
Ряд растворений, представленный ниже соответствует стандарту DIN 38 412. Подходящее растворение
можно выбрать в соответствии с ожидаемой токсичностью образца.
Растворение
Уровень
растворения
(G)
Объем
(µl)
образца добавление 2%
NaCl (µl)
1:1,25
1:2
1:3
1: 4
1: 6
1: 8
1: 12
1: 16
1: 24
1: 32
1
2
3
4
6
8
12
16
24
32
800
500
333,3
250
166,7
125
83,3
62,5
41,7
31,3
167,7
250
333,3
375
416,7
437,5
458,3
468,7
200
500
500
500
500
500
500
500
500
500
-----
800
500
200
500
Контрольные
образцы
для G=1
для G>2
Люминесцентные
бактерии (µl)
Таблица 1. Примеры ряда растворенных образцов для использования в тесте BioTox. Уровень
растворения G = 1 используется в образцах с низким уровнем токсичности. Если уровень растворения
образцов G=1 не используется, соответствующий контрольный образец также исключается.
3. ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ
6
А) Восстановите реагент BioTox в соответствии с инструкцией выше. Оставьте бактерии
стабилизоваться не менее чем на 30 минут при температуре +15°C.
B) Подготовьте ряд растворенных образцов и уравновесьте температуру до +15°C.
С) Накапайте пипеткой 0.5 ml бактериального раствора в пробирки, в которых Вы собираетесь проводить
тест. Рекомендуется приготовлять все растворы и контрольные образцы в двойном экземпляре.
D) Определите интенсивность люминесценции (I0) из первого кювета (№. 1), содержащий
бактериальный раствор, затем, добавьте 0.5 ml образца в кювет. Повторите процедуру для всех образцов,
через равные интервалы времени между каждым образцом.
E) Определите интенсивность люминесценции первого образца (кювет №1) снова, ровно через 30 минут
после первого измерения (I30). Повторите процедуру для всех образцов, используя в точности такие же
интервалы времени между каждым образцом, как и при первом измерении.
ПРИМЕЧАНИЕ
•
•
•
•
Изменения температура в ходе тестирования могут повлиять на результаты. Удостоверьтесь, что
все реагенты уравновешены до +15oC
Время контакта должно быть в точности одинаковым для всех образцов и контрольных образцов.
Наиболее часто используемое время контакта 5, 15 или 30 минут.
Контрольный образец (только NaCl) должен быть в наличии при каждом тестировании. Затем он
используется для корректировки естественных изменений в световом излучении в процессе
тестирования. Контрольный образец обозначается как IC, и значения излучения при начале и
окончании периода измерения используются для вычисления поправочного коэффициента (KF)
см. ниже
Данные на выходе при использовании люминометра Сириус приводятся в Относительных
световых единицах (RLU).
ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Программное обеспечение BioTox автоматически производит все необходимые вычисления. Если
программное обеспечение не используется, ингибиция % (INH%) вычисляется следующим образом ( в
данном примере время контакта 30 минут)
IC30
KF = -------IC0
IT30
INH% = 100 - ----------- x 100
KF x IT0
Где:
KF = поправочный коэффициент
7
IC30 = интенсивность люминесценции контрольного образца после времени контакта (30мин) в RLU.
IC0 = изначальная интенсивность люминесценции контрольного образца в RLU
IT 30 = интенсивность люминесценции тестового образца после времени контакта (30мин) в RLU.
IT 0 = изначальная интенсивность люминесценции тестового образца в RLU
Значение EC50 устанавливается, используя стандартный линейный регрессивный анализ. Если диапазон
пар значений нельзя линеаризовать, значение EC50 можно вычислить графически, используя двойную
логарифмическую систему координат. INH% наносится на ось y а концентрация (в мг/л, моль/л или %)
на ось х, см. рис.1
ПРИМЕР ДАННЫХ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ПОМОЩИ СИСТЕМЫ BIOTOX
Следующие примеры показывают, как значения EC50определяются, используя метанол как справочный
токсин. В данном примере был использован инкубационный период 30 минут. Обратите внимание, что
значения RLU, приведенные здесь, были разделены на независимую переменную 1000
Концентрация
метанола мг/л
IT0
RLU x 10
-3
IT30
RLU x 10-3
INH%
Без метанола (IC)
587
476
10,000
586
440
7.5
20,000
613
406
18
3o,000
596
329
32
40,000
619
286
43
50,000
604
203
59
75,000
618
64
87
100,000
611
15
97
Таблица 2.
Ингибиция светоизлучения из реагента BioTox с повышением концентрации метанола.
В данном примере значения контрольного образца были 587 в точке отсчета времени 0 (IC0 ) и 476 спустя
30 минут (IC30). Таким образом, поправочный коэффициент получается:
KF = IC30/IC0 = 587/476 = 0.811
8
Данные были использованы для построения кривой ингибиции на рис.1. Отсюда было вычислено EC50
значение для метанола, которое оказалось равным 42000 мг/л.
Рис1. График ингибиции для метанола, построенный с использованием данных из таблицы 1.
Значения EC50 , определенные используя систему BioTox для ряда токсических химических соединений,
приведены в таблице 2.
Справочное химическое соединение
железа (II) сульфат
Метанол
Этанол
Фенол
фтористый натрий
меди (II) сульфат
ртути (II) хлорид
хлороформ
формальдегид
асцетон
цинка (II) сульфат
3,5-дихлорфенол
Cr IV
цетилтриметиламмониумбромид
параоксиацетанилид
амитриптилин
Этилен гликоль
изопропиловый спирт
1,1,1-трихлорэтан
Хлористый натрий
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
никотин
теофиллин
Пропанол HCl
паракват
SDS
EC50 мг/л
160
42000
23000
180
12000
0.85
0.3
1450
9.5
22500
6.0
5.8
4.5
0.38
1800
18
85000
19000
330
39000
210
600
1900
125
1230
4.25
Таблица 2. значения EC50 полученные BioTox для ряда токсинов.
9
ИНФОРМАЦИЯ О ПРОДУКТЕ.
Доступны следующие товары:
Люминометр PD 20 или Люминометр С 110
Набор BioTox
Реагент Vibrio fischeri.
BioTox Chiller минихолодильник.
Кюветы для люминометра.
ЛИТЕРАТУРА:
Bondesson, I., Ekwall, B., Hellberg, S., Romber, L., Stenberg, K. and Walum, E. MEIC - A New International
Multicenter Project to Evaluate the Relevance to Human Toxicity of in vitro Cytotoxicity Tests. Cell Biol.
Toxicol. 5: 331-348.
Kahru, Anne, In vitro Toxicity Testing Using Marine Luminescent Bacteria (Photobacterium phosphoreum): the
BioTox test; ATLA 21, 210-215, 1993
Kahru, Anne and Borchardt Barbara, Toxicity of MEIC Chemicals to Bioluminescent Photobacteria (the Biotox
TM test): Correlation with other test systems.
DIN 38 412 Standard, Teil 341, 1991, Testverfahren mit Wassreorganismen (Gruppe L)
ISO/CD (draft) 11348, 1994-09, Determination of the Inhibitory Effect of Water Samples on the Light Emission
of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test)
Pribori Oy
Россия, 109028 г. Москва
Певческий пер. 4, стр.1
Тел.: +7 495 937 45 94
Факс: +7 495 937 45 92
www.pribori.com
10