Серотонин в биологических жидкостях ИФА (Serotonin Research
реклама
Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 1 ___________________________________________________________________________________________ Серотонин в биологических жидкостях ИФА (Serotonin Research ELISA) Иммуноферментный тест ультрачувствительный для количественного определения серотонина в различных типах и объемах биологических жидкостей. Номер по каталогу: ВА E-5900 Набор рассчитан на 96 определений НАЗНАЧЕНИЕ Набор Serotonin Research ELISA – диагностическая in vitro иммуноферментная (ИФА) тест-система для количественного ультрачувствительного определения серотонина в различных типах и объемах биологических жидкостей. 1. ВВЕДЕНИЕ И ПРИНЦИП МЕТОДА До проведения иммуноферментного анализа проводится количественное ацилирование серотонина. Набор Serotonin Research ELISA основан на твердофазном конкурентном варианте иммуноферментного анализа. На поверхности лунок планшета (твердой фазе) иммобилизованы молекулы антигена. Молекулы модифицированного серотонина, содержащиеся в стандартах, контролях и исследуемых образцах, и молекулы, иммобилизованные на твердой фазе, конкурируют за ограниченное число центров связывания специфичных антител. После того, как реакция связывания достигнет равновесия, несвязавшиеся с твердой фазой антигены и комплексы «антиген-антитело» удаляются промывкой. Антитела, связавшиеся с иммобилизованным на твердой фазе антигеном, выявляются с помощью конъюгата — антител к IgG кролика, меченных пероксидазой. В качестве субстрата используется тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность цветовой реакции измеряют при длине волны 450 нм. Количество серотонина в исследуемых образцах рассчитывается по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям в стандартах. 2. ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ Все реагенты необходимо хранить при температуре 2 – 8оС в течение всего срока годности. Не используйте компоненты набора по истечении срока годности, указанного на этикетке. Не смешивайте компоненты из наборов разных серий в одном исследовании. 3. МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА Набор Serotonin Research ELISA содержит реагенты, достаточные для выполнения 96 количественных определений (включая стандарты) серотонина. ВА R-8901 STANDARD A Стандарт А (C – 0 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8902 STANDARD B Стандарт B (C – 0,015 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8903 STANDARD C Стандарт C (C – 0,05 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8904 STANDARD D Стандарт D (C – 0,15 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8905 STANDARD E Стандарт E (C – 0,5 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8906 STANDARD F Стандарт F (C – 2,5 нг/мл) 1х4 мл концентрат* ВА R-8951 CONTROL 1 Контроль 1 1х4 мл концентрат* ВА R-8952 CONTROL 2 Контроль 2 1х4 мл концентрат* BA E-5934 ACYL-PLATE Планшет для ацилирования BA E-5937 ASC-ACID 10% Аскорбиновая кислота 1х4 мл BA E-5941 DIL-CONC 20 Концентрат раствора для разведения 1х50 мл ВА E-0030 WASH-CONC 50 Концентрат промывочного буфера 1х20 мл 1х96 лунок готов к использованию, покрыт ацилирующим реагентом готова к использованию Концентрат. Разведите содержимое флакона дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл Концентрат. Разведите содержимое флакона дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 2 ___________________________________________________________________________________________ ВА E-0040 CONJUGATE Ферментный конъюгат 1х12 мл готов к использованию, конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgG кролика ВА E-0055 SUBSTRATE Субстрат 1х12 мл готов к использованию, содержит ТМБ ВА E-0080 STOP-SOLN Стоп-реагент 1х12 мл готов к использованию, содержит 0,25 M серную кислоту BA D-0090 FOILS Пленка для заклеивания стрипов 1х4 шт. готова к использованию ВА E-5910 SER-AS Антисыворотка к Серотонину 1х6 мл Кроличья, готовая к использованию, синего цвета, синяя крышка ВА E-5911 ACYL-BUFF Ацилирующий буфер 1х30 мл готов к использованию ВА E-0931 UU SER-5-HIAA Планшет с иммобилизованным серотонином – 5-ГИУК 12 стрипов 8-луночных (разделяемых 1х96 лунок на отдельные лунки), покрытых серотонином – 5-ГИУК * 4. НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕ ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА Откалиброванные автоматические пипетки переменного объема (например, 10-100 мкл/100-1000 мкл) Устройство для промывки планшет Планшетный спектрофотометр, способный измерять оптическую плотность при длине волны 450 нм Орбитальный шейкер (со скоростью около 600 об/мин; амплитуда встряхивания 3 мм) Абсорбирующий материал (фильтровальная бумага, бумажные полотенца) Дистиллированная вода Вортекс 5. ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Данный набор предназначен для работы с любыми биологическими образцами, такими как гомогенаты, диализаты тканей и др. Хранение: не более 6 часов при температуре 2 – 8 С, для длительного хранения (до 6 месяцев) образцы следует заморозить при - 20 С. Внимание! Чтобы предотвратить разложение серотонина в результате окисления образцы должны содержать 0,1% (w/v) аскорбиновой кислоты. 6. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ Перед использованием дайте всем реагентам прогреться до комнатной температуры и тщательно перемешайте, аккуратно переворачивая. Рекомендуется постановка анализа в дубликатах. 6.1. Подготовка образцов Набор Serotonin Research ELISA гибкая высокочувствительная тест-система, рассчитанная на исследование различных типов и объемов биологических жидкостей. Нет универсальных рекомендаций, как готовить тот или иной образец к исследованию. Однако ниже приведены основные условия, которые помогут исследователю адаптировать протокол анализа для своих нужд и типа используемого образца. при комнатной температуре (20-25ºС) Серотонин в образцах стабилен при рН 6-7,4 и содержании 0,1% (w/v) аскорбиновой кислоты. раствор для разведения, поставляемый вместе с набором, может использоваться для разведения образцов. Серотонин быстро разлагается в кислом растворе (при рН<3,0) при комнатной температуре при использовании кислых растворов предотвратить разложение серотонина возможно, поддерживая низкую температуру (2-8ºС). Используйте предварительно охлажденные Буферы и Материалы. Скорректируйте уровень рН до 6-7,4. во избежание разложения серотонина к образцам следует добавить аскорбиновую кислоту (см. пункт 5. ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ). рекомендуется провести «Подтверждение метода» для определения открытия серотонина с помощью методики, разработанной для определенного типа исследуемого образца. Для этого приготовьте стоковый раствор серотонина. Добавьте небольшое известное количество стокового раствора (чтобы минимально изменить концентрацию) к нативному образцу (нативный образец должен быть того же типа, что и исследуемые образцы, но не должен содержать серотонина) и проверьте открытие. _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 3 ___________________________________________________________________________________________ результат измерения серотонина зависит от объема образца используемого в тесте. Подобрать объем образца, требуемый для определения серотонина, можно последовательно проводя постановки с различными объемами. При необходимости поддержки в разработке протокола для специфических целей или типов исследуемого образца, вы можете связаться непосредственно с производителем набора! 6.2. Приготовление реагентов Раствор для разведения Разведите 50 мл Концентрата раствора для разведения дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. Готовый раствор для разведения содержит 0,1% (w/v) аскорбиновой кислоты. Храните разведенный буфер не более 12 месяцев при температуре 4 – 8 С. Промывочный буфер Разведите 20 мл Концентрата промывочного буфера дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. Храните разведенный буфер не более 6 месяцев при температуре 4 – 8 С. Стандарты Разведите Стандарты и контроли в соотношении 1+1000 готовым Раствором для разведения или буфером*. Например: 10 мкл стандарта + 10 мл Раствора для разведения или буфера*. * - Буфер использующийся для конкретного эксперимента и варианта образца, но обязательно содержащий 0,1% (w/v) аскорбиновой кислоты. Стандарты должны быть приготовлены непосредственно перед анализом. Была проведена оценка с буферами Рингера, PBS и 0,9% раствором NaCl. Другие буферы могут также быть оценены и применяться в работе с данной тест-системой. В процессе экстракции рекомендуемый уровень рН 7-8,5. 6.3 Ацилирование образцов 1. Внесите в соответствующие лунки Планшета для ацилирования* по 100 мкл разведенных стандартов, по 100 мкл разведенных контролей и 1-100 мкл исследуемых образцов. 2. Доведите все исследуемые образцы Раствором для разведения или буфером* (см. пункт 6.1) до конечного объема 100 мкл. 3. Внесите во все лунки по 25 мкл Ацилирующего буфера. 4. Ацилируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (20-25°С) на орбитальном шейкере (около 600 об/мин). Внимание! Отберите по 100 мкл ацилированных стандартов, контролей и образцов для определения Серотонина. * Лунки Планшета для ацилирования закрыты пластиковой пленкой, которую нужно удалить перед использованием планшета. 6.4 Иммуноферментный анализ – Серотонин 1. Внесите в соответствующие лунки Планшета с иммобилизованным серотонином– 5-ГИУК по 100 мкл ацилированных стандартов A – F, контролей и исследуемых образцов. 2. Внесите во все лунки по 25 мкл Антисыворотки к Серотонину. 3. Закройте планшет Пленкой и инкубируйте 15-20 часов (в течение ночи) при температуре 2 – 8оС. 4. Снимите пленку, удалите содержимое лунок и тщательно промойте 3 раза, добавляя по 300 мкл разведенного Промывочного буфера в каждую лунку. После цикла промывки удалите остатки жидкости из лунок, постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге. 5. Внесите во все лунки по 100 мкл Ферментного конъюгата. 6. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (20-25°С) на орбитальном шейкере (около 600 об/мин). 7. Удалите содержимое лунок и тщательно промойте 3 раза, добавляя по 300 мкл разведенного Промывочного буфера в каждую лунку. После цикла промывки удалите остатки жидкости из лунок, постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге. _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 4 ___________________________________________________________________________________________ 8. Внесите во все лунки по 100 мкл Субстрата и инкубируйте в течение 20-30 минут при комнатной температуре (20-25°С) на орбитальном шейкере (около 600 об/мин) в темноте. Внимание! Избегайте воздействия прямых солнечных лучей! 9. Добавьте во все лунки по 100 мкл Стоп-реагента (в той же последовательности и с той же скоростью, что и субстрат) и встряхните планшет для обеспечения гомогенного распределения раствора. 10. Измерьте оптическую плотность раствора не позже, чем через 10 минут с момента внесения стопреагента при помощи планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм и референсной длине волны 620 – 650 нм. 7. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Концентрации стандартов Стандарт A B C D E F Серотонин (нг/мл) 0 0,015 0,05 0,15 0,5 2,5 Серотонин (нмоль/л) 0 0,085 0,28 0,85 2,8 14 Серотонин (пг/объем образца) 0 1,5 5 15 50 250 Серотонин (пмоль/объем образца) 0 8,5 28,4 85 284 1418 Серотонин (пг/мл) × 5,67 = серотонин (пмоль/л) Серотонин (пг/объем образца) × 5,67 = Серотонин (пмоль/объем образца) Перевод единиц Рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого стандарта, контроля или исследуемого образца. На миллиметровой бумаге постройте калибровочную кривую зависимости средней оптической плотности стандартов (по оси Y, линейная) от log концентрации адреналина в стандартах в нг/мл (по оси X, логарифмическая). Для построения кривой можно использовать различные типы нелинейной регрессии (напр., сплайн, 4х парам. логистику, Акима). По калибровочной кривой определите концентрацию адреналина в контролях и исследуемых образцах, сопоставляя значения их средней оптической плотности с соответствующими концентрациями аналита. Внимание! Концентрации, определенные для образцов по калибровочной кривой, должны быть умножены на величину корректирующего фактора! Корректирующий фактор= 100 мкл (объем стандартов) Объем образца (мкл) Например: Взяли 10 мкл образца для ацилирования, концентрация определенная по калибровочной кривой – 0,02 нг/мл серотонина. Корректирующий фактор=100/10=10 Концентрация в образце=0,02 нг/мл × 10 =0,2 нг/мл серотонина 7.1. Контроль качества Рекомендуется использовать контрольные образцы в соответствии с государственными и федеральными нормативами. Используйте контроли как с нормальными, так и с патологическими уровнями концентраций определяемого вещества. Концентрации аналита в контролях, прилагающихся к набору, и других коммерческих контролях не должны выходить за рамки заданных диапазонов. Заданные диапазоны контролей, прилагающихся к набору, указаны в листе контроля качества (QC Report). 7.2. Калибровка Связывание антисывороток и конъюгатов фермента, а также активность использованного фермента термозависимы, поэтому значения оптических плотностей могут изменяться, если не используется термостат. Чем выше температура, тем будут выше значения оптических плотностей. Сходные колебания связаны и с изменением времени инкубации. Оптимальная температура при иммуноферментном анализе – 20 – 25оС. _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 5 ___________________________________________________________________________________________ Примечание: при превышении максимальных значений оптической плотности, измеряемых прибором при длине волны 450 нм, можно измерить оптическую плотность в лунках не более чем через 10 минут, используя длину волны 405 нм. 8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 8.1 Специфичность (Перекрестная реактивность) Соединение Серотонин Триптамин Мелатонин 5-гидроксииндолуксусная кислота Фенилаланин Гистидин Тирамин 5-гидрокситриптофан Перекрестная реакция (%) 100 0,19 0,03 <0,002 <0,002 <0,002 <0,002 <0,002 8.2. Чувствительность (Предел обнаружения) Адреналин 0,05 нг/мл ×С* С*= Корректирующий фактор (см. пункт 7) 9. ЗАМЕЧАНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 9.1 Надежность результатов анализа Для того чтобы обеспечить надежные результаты анализа, его следует проводить в соответствии с прилагающимися инструкциями, а также с текущими правилами и нормативами (GLP, RILIBÄK и т.д.). Особое внимание следует обращать на контрольные исследования точности и правильности во время проведения анализа; результаты этих контрольных исследований не должны выходить за рамки нормальных диапазонов. В случае значительных расхождений в характеристиках анализа, указанных производителем и реально полученных Вами, пожалуйста, свяжитесь с производителем набора для получения дальнейших инструкций. Рекомендуется каждой лаборатории выработать собственные референcные интервалы. Значения, приведенные в данной инструкции ориентировочные. При постановке диагноза нельзя полагаться только на результаты полученные с помощью этого набора. Только в случаях, когда результаты данных исследований коррелируют с результатами других анализов и соответствуют общей клинической картине пациента, они имеют клиническую значимость. 9.2.Рекламации В случае рекламации, пожалуйста, прилагайте письменный отчет, содержащий все данные по проведению анализа, полученным результатам, а также копии оригиналов распечаток. Пожалуйста, свяжитесь с Labor Diagnostika Nord для получения формы рекламации и верните эту форму полностью заполненной производителю. 9.3. Гарантии Набор произведен в соответствии с последними достижениями в технологии и подвергается обязательным внутренним и внешним проверкам контроля качества. Любые изменения в наборе или в процессе постановки анализа, а также использование реагентов непредусмотренного назначения могут отрицательно сказаться на результатах анализа и, таким образом, не подпадают под действие гарантии. Производитель не отвечает за повреждения, произошедшие при транспортировке. 9.4 Утилизация отходов Остатки материалов и/или все остатки реагентов и готовых к использованию растворов являются специальными отходами. Обращение с ними регулируется местными и государственными нормативами. Об удалении специальных отходов имеется информация соответствующих структур органов власти. Утилизация набора должна быть проведена в соответствии с действующими на территории страны нормативами. Законодательной базой утилизации специальных отходов является пакет социально-экономических законов. Данные по безопасности набора можно найти на домашней страничке компании LDN. Данные по безопасности соответствуют стандарту ISO 11014-1. 9.5 Возможные отклонения Не используйте в одном анализе реагенты и растворы из разных серий набора. Учитывайте разные условия транспортировки и хранения набора. Отступления от инструкции при обработке образцов и работе с набором могут привести к получению искаженных результатов. Не используйте компоненты набора по истечении срока годности. Избегайте микробной контаминации реагентов и промывочного раствора. Соблюдайте указанные в инструкции режимы инкубации и промывки. _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Serotonin Research ELISA, Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG 6 ___________________________________________________________________________________________ 9.6 Меры предосторожности 1. Соблюдайте указанные в инструкции режимы инкубации и промывки. 2. Никогда не пипетируйте ртом и избегайте контакта реагентов и образцов с кожей. 3. Не курите, не ешьте и не пейте в зоне работы с образцами или тестовыми пробирками к набору. 4. При работе с компонентами набора или с образцами всегда используйте одноразовые перчатки, тщательно мойте руки сразу после окончания работы. 5. Избегайте разбрызгивания реагентов и образцов! 6. Избегайте контактов реагентов с кожей, используйте защитные перчатки и одежду. 7. Все стадии необходимо выполнять согласно протоколу. Необходимо точно соблюдать объемы всех реагентов и образцов, указанные в различных разделах инструкции (объемы при отборе пипеткой или в процессе подготовки). 8. Правильные результаты также зависят от использования поверенных откалиброванных пипеточных дозаторов. 9. Азид натрия может взаимодействовать свинцом и медью пробирок с образованием взрывчатых соединений, для предотвращения этого необходимо промывать их большим объёмом воды. 10. Все реагенты набора, содержащие человеческую или животную сыворотку или плазму протестированы и имеют подтвержденный отрицательный результат по ВИЧ (I/II), HbsAg, HCV. Тем не менее, все реагенты должны рассматриваться как потенциально инфицированные и соответственно утилизироваться. Внимание! Актуальная литература, информация о клиническом значении и другая информация могут быть предоставлены по запросу производителем или официальным дистрибьютором. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СИМВОЛЫ Температура хранения Производитель Для проведения <n> анализов Использовать до Серия Только для in vitro диагностики См. инструкцию по применению Состав CE маркировка Внимание! Номер по каталогу Только в исследовательских целях! Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см. внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо руководствуйтесь оригиналом инструкции. Оригинал Revision: 04.05.2009 _____________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]
