Московская Государственная академия тонкой
реклама
Московская Государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова Кафедра Биотехнологии Реферат на тему: «Ферменты-протеазы и их ингибиторы» Выполнил асп. Баранов А. В. кафедра БТ Москва 2006 Содержание 1 Ферменты и их ингибиторы 3 1.1 Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.2 Химические механизмы ферментативного катализа . . . . . . . . . . . . 5 1.3 Теория переходного состояния в ферментативном катализе . . . . . . . 5 1.4 Структура активного сайта стабилизирует переходное состояние . . . . 10 1.5 Стратегии для стабилизации переходного состояния . . . . . . . . . . . 12 1.6 1.5.1 Аппроксимация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.5.2 Ковалентный катализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.5.3 Кислотно-основные взаимодействия . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.5.4 Конформационные изменения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Обратимые ингибиторы ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2 Классы протеолитических ферментов и механизмы их действия 19 2.1 Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2 Терминология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3 Классификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4 Механизмы катализа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.4.1 Остаток серина в качестве нуклеофила . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.4.2 Остаток цистеина в качестве нуклеофила . . . . . . . . . . . . . 24 2.4.3 Остаток серина или цистеина в качестве нуклеофила . . . . . . . 28 2.4.4 Сериновый, цистеиновый или треониновый остаток в качестве нуклеофила . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.4.5 Молекула воды в качестве нуклеофила . . . . . . . . . . . . . . . 29 3 Протеаза вируса герпеса и цитомегаловируса 3.1 3.2 Ингибиторы 34 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.1.1 Ингибиторы, основанные на механизме . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.1.2 Ингибиторы-пептидомиметики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.1.3 Другие ингибиторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Итоги . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 4 Протеаза ВИЧ 42 4.1 Вирусная протеаза — ключевой белок жизненного цикла ВИЧ . . . . . 42 4.2 Молекулярная архитектура фермента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.3 Ингибиторы протеазы ВИЧ как примеры успешного Drug Design . . . . 44 1 4.4 Разработка резистентных вариантов под давлением селекции ингибитора: пластичность вирусной протеазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 5 Заключение 46 Список литературы 47 2 1 Ферменты и их ингибиторы 1.1 Введение Любой аспект клеточной биологии, от метаболизма до синтеза белков, должен привлекать химию процессов образования и разрыва химических связей на различных стадиях. Однако, большинство этих реакций протекают при скоростях, слишком низких для поддержания жизни. Таким образом, все живые системы полагаются на каталитическую силу ферментов для увеличения скоростей реакций и, таким образом, поддерживая жизнь. Тогда как важность ферментативного катализа в нормальной физиологии не может быть переоценена, аберрантный катализ также может играть важную роль в различных человеческих заболеваниях. Значительное число генетических расстройств, к примеру, приводят к повышенной экспрессии основанному на мутации выигрышу в функционировании ключевых ферментов метаболических путей. Другие расстройства, такие как различные формы рака, воспалительные процессы, включают аберрантную гиперпролиферацию специфических клеточных типов. Все метаболические пути, которые управляют клеточной пролиферацией, всегда используют ферментативный катализ, делая ферменты этих путей привлекательными мишенями для хемотерапевтического вмешательства. Ферментативный катализ требуется не только человеку, но также и для поддержания жизни микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы, способные заразить человека. Таким образом, важные ферментативные функции в этих организмах также являются привлекательными мишенями для лечения вызываемых ими заболеваний. Не удивительно, таким образом, что устранение нежелательной ферментативной активности при помощи небольших молекул-ингибиторов фермента, является обычной стратегией для фармацевтического вмешательства в человеческие расстройства. На самом деле, недавние исследования показали, что примерно 30% всех лекарственных препаратов, находящихся в данный момент в клинической практике, проявляют свои фармакологические эффекты в качестве ингибиторов специфических ферментов-мишеней. В качестве новых лекарств для борьбы с болезнями можно прогнозировать лишь увеличение доли фармакологических препаратов, являющихся ингибиторами определенных ферментов. Следовательно, значительные попытки прикладываются для определения ключевых ферментов для ингибирования малыми по размеру перорально вводимых лекарств. В табл. (1) приведены примеры использования лекарств-ингибиторов [1], [2]. 3 Соединение Фермент-мишень Клиническое применение Ацетазоламид Ацикловир AG7088 Аллопуринол Аргатробан Аспирин Амоксицилин Каптропил, Эналаприл Карбидофа CELEBREX, VIOXX Клавулинат Карбоновая ангидраза Вирусная ДНК-полимераза 3С протеаза риновируса Ксантиноксидаза Тромбин Циклооксигеназы Пенициллин-связывающие белки Ангиотенсин-конвертирующий фермент Дофа-декарбоксилаза Циклооксигеназа-2 Глаукома Герпес Обычная простуда Подагра Сердечные расстройства Воспалительные процессы Бактериальные инфекции Повышенное кровяное давление Болезнь Паркинсона Воспалительные процессы β-Лактамаза Дигоксин Эфавиренц, Невирапин Эпристерид, Финантерид Na,K-АТФаза Обратная транскриптаза ВИЧ-1 Резистентность к бактериям Сердечные расстройства СПИД Флуороурацил Лефлюномид Ловастатин Тимидилатсинтетаза Дегидрооротатдегидрогеназа HMG-CoA редуктаза Метотресат Дигидрофолятредуктаза Нитекапон Норфлоксасин Катехол-O-метилтрансфераза ДНК-гираза Омепразол H + , K + -АТФаза PALA Сорбинол Аспартаттранскарбамолаза Альдозоредуктаза Триметоприм Бактериальная дигидрофолятредуктаза Фосфатидилэстераза ВИАГРА Стероидная 5α-редуктаза Доброкачественная гиперплазия простаты, бесплодие у мужчин Рак Воспалительные процессы Понижение содержания холестерина Рак, воспалительные процессы Болезнь Паркинсона Восполения мочеполовой системы Язва желудка и двенадцатиперстной кишки Рак Диабетическая ретинопатия Бактериальные инфекции Дисфункция эрекции Таблица 1: Некоторые примеры ферментов, являющихся мишенями для действующих и экспериментальных лекарственных препаратов. 4 Главный шаг на пути к идентификации и оптимизации небольших молекул-ингибиторов специфичных ферментов — это глубокое понимание механизмов происходящих реакций, а также химического и структурного базиса для взаимодействия лигандов с ферментом. Ниже приведены основы ферментативного катализа, являющегося основой для энзимологического подхода к эффективному поиску новых лекарственных препаратов. 1.2 Химические механизмы ферментативного катализа Скорость и направленность химических превращений — вот те обязательные условия, предъявляемые к биохимическим процессам для поддержания жизни. Ферменты в значительной степени увеличивают скорость таких реакций, взаимодействуя с определенными для данного фермента молекулами (носящими в таком контексте название «субстраты»). Ниже рассмотрены структурные и химические механизмы, при помощи которых ферменты ускоряют химические реакции и достигают субстратной специфичности. Важно отметить, что ферменты, как и любые другие катализаторы, не изменяют термодинамику реакции, они лишь способны ускорять химические процессы. Следует помнить, что свободная энергия Гиббса не зависит от направления и пути процесса, а зависит только от начального и конечного состояний. ∆Guncatalyzed = ∆Genzyme−catalyzed (1) Таким образом, как было сказано выше, каталитическая сила ферментов проявляется в их способности распознавать специфические субстраты и ускорять скорость, при которой эти молекулы превращаются в продукты. Эти главные особенности ферментативного катализа могут быть поняты в терминах реакционного пути, по которому протекают ферментативные реакции, и главным образом в терминах переходного состояния реакции. 1.3 Теория переходного состояния в ферментативном катализе Все химические реакции протекают через образование коротко-живущего высокореакционноспособного состояния, часто называемого переходным состоянием реакции. Эта концепция хорошо иллюстрируется реакцией алкилгалогенида с гидроксид ионом с образованием спирта (рис 1). По мере протекания реакции связь углерод– галоген разрывается, и новая связь углерод–кислород образуется. Можно предста5 вить, что в определенный момент в ходе процесса реагирующий атом углерода будет находиться в псевдо-пятивалентном состоянии, в котором частичные связи существуют как с атомом галогена, так и с атомом кислорода; это состояние и определяется как переходное состояние. Ясно, что такое состояние будет крайне неустойчивым, обладая очень большим значением свободной энергии, и за очень короткое время (обычно время жизни переходного состояния составляет приблизительно 10−13 с.) распадаясь. Но чтобы продукты реакции образовались, реакции необходимо пройти через это состояние. Как показано на диаграмме свободной энергии (рис 1), образование переходного состояния является самым энергетически затратным процессом во всем реакционном пути, и таким образом лимитирует скорость, при которой система переходит из исходного в конечное состояние. Все ферменты ускоряют скорости химических реакций при помощи общего механизма: они понижают энергетический барьер реакции. Если представить обычную ферментативную реакцию, в которой одна молекула субстрата превращается в единственный продукт. Фермент, катализирующий реакцию, проходит через ряд промежуточных состояний. Во-первых, молекулы свободного фермента (E) и субстрата (S) должны встретиться друг с другом K S E+S * ) ES при помощи зависимого от диффузии столкновения, и затем связаться друг с другом с образованием начального комплекса. Этот бинарный комплекс называют ESкомплексом, или комплексом Михаэлиса. В состоянии равновесия образование ESкомплекса регулируется концентрациями свободного фермента и субстрата в растворе, а также зависит от значения константы диссоциации бинарного комплекса KS . KS = [E][S] [ES] (2) В физиологических и большинстве лабораторных условий равновесие смещено в сторону образования ES-комплекса, поскольку при этом происходит стабилизация системы. Этот прирост в энергии в процессе связывания может частично восполнить энергетические затраты при преодолении переходного состояния. После образования комплекса Михаэлиса происходят структурные изменения активного сайта фермента (то есть связывающей полости, где связывается субстрат), включающие изменения в связывании субстрата, трансформировании молекулы субстрата в структуру переходного состояния. Переходное состояние, связанное с ферментом, сильно стабилизировано по сравнению со свободной формой. Общий эффект, однако, приводит 6 H + !отенциальная энергия R H Br OH- H H H HO C Br + BrHO R H R S S P !уть реакции Рис. 1: Реакция галогеналкана с гидроксид-ионом и изменение свободной энергии системы в ходе реакции к снижению энергетического барьера (носящего название энергии активации, ∆G‡ . Из переходного состояния система может либо сразу, либо через ряд промежуточных состояний, перейти в состояние фермента, связанного с продуктом (EP ), и, наконец, происходит высвобождение молекулы продукта и возвращение молекулы фермента в первоначальное состояние. Каждое последующее состояние после образования ES-комплекса представляет собой микроравновесие, характеризуемое соотношением скоростей прямого и обратного процессов. Эти индивидуальные шаги часто очень сложно измерить экспериментально, поэтому используется единая константа kcat , используемая для общего представления о скорости прямого процесса от ES-состояния к конечному высвобожденному продукту и свободному ферменту. Таким образом, минимальная схема реакции для простой, одномолекулярной с точки зрения субстрата ферментативной реакцией является: K S kcat E+S * E+P ) ES −→ Термин KS представляет константу диссоциации бинарного комплекса «фермент– субстрат» и может быть выражена в терминах свободной энергии связывания ∆GES : 1 (3) ∆GES = −RT ln KS где R — универсальная газовая постоянная, T — температура в Кельвинах. Тер 7 мин kcat отражает скорость превращения связанного субстрата в переходное состояние и может быть отнесен как разность в свободных энергиях этих двух состояний: ∆Gkcat kB T = RT ln h ! ! − ln(kcat ) (4) где kcat — постоянная Больцмана, h — постоянная Планка. Общая энергия активации есть разница в энергиях состояния свободного фермента и субстрата и переходного состояния, которая получается комбинированием уравнений (3) и (4): kcat ∆G = −RT ln KS ! ‡ kB T + RT ln h ! (5) Из уравнения (5) видно, что отношение kcat /KS , относящееся к реакции второго порядка, является хорошей мерой общей скорости ферментативно катализируемой реакции. Эффективность катализатора, таким образом, измеряется отношением kcat /KS kuncat и для некоторых ферментативных реакций может достигать значения 1017 . Также из уравнения (5) видно, что энергия связывания, имеющая отношение к образованию ES комплекса, используется для частичной компенсации энергетических затрат на преодоление переходного состояния. Стратегия, по которой ферменты снижают энергетический барьер реакции, состоит в том, что энергия распределена по нескольким комплексам, включая ES, EP , а также множество переходных состояний (рис. 2). Как будет описано далее, ферменты, однако, используют также специфические химические подходы к стабилизации переходного состояния. Суммарный эффект от комбинации указанных факторов приводит к значительному снижению !+#&,)*'-$,'. /,&%0*. энергии активации реакции, как это схематично показано на рис. 2. S S ES EP ES E+P !"#$ %&'()** Рис. 2: Диаграмма изменения свободной энергии системы в простой ферментативной реакции 8 В лабораторных условиях наиболее часто ферментативные реакции изучаются при низких концентрациях фермента и высоких концентрациях субстрата ([S] >> [E]). В таких условиях образование продукта линейно со временем в начале реакции, пока приблизительно 10–20% субстрата не прореагирует. В течение этого начального период зависимость скорости реакции от времени представляет собой наклонную прямую. Скорость реакции зависит от концентрации ES комплекса в системе. На начальной стадии реакции скорость является величиной постоянной, поскольку скорость образования ES комплекса равна скорости его распада. Поскольку система не находится в состоянии равновесия при этих условиях, термодинамическая константа диссоциации в указанных ранее уравнениях должна быть заменена на стационарную кинетическую постоянную KM , также известную как константа Михаэлиса. Если измерить стационарную скорость как функцию от концентрации субстрата для простой ферментативной реакции в описанных лабораторных условиях, получатся результаты, показанные на рис. (3). При низких концентрациях субстрата скорость увеличивается квази-линейно с ростом концентрации субстрата. Однако, система насыщается при высоких концентрациях субстрата, при этом достигается максимальная скорость реакции Vmax , при бесконечно большой концентрации субстрата. Это насыщенное гиперболическое поведение было впервые описано Михаэлисом и Ментеном и позже адоптировано для стационарного состояния Бриггисом и Халданом. Следующее уравнение описывает зависимость стационарной скорости фермента от концентрации субстрата и известно как уравнение Михаэлиса-Ментена: v= Vmax [S] KM [S] (6) Величина KM , как и KS , имеет размерность молярности, как и у концентрации субстрата. Если преобразовать уравнение (6), мы получим: v= Vmax [S] 1 = Vmax 2[S] 2 (7) Уравнение (7) показывает смысл величины KM : это такая концентрация субстрата, при которой скорость равна половине максимальной скорости в стационарных условиях. Следовательно, кинетическая величина имеет взаимосвязь с концентрацией субстрата, требуемого для половинного насыщения системы в стационарных условиях, даже несмотря на то, что она не может быть выражена при помощи настоящей равновесной константы диссоциации. 9 A B 1/v Vmax 1/2Vmax KM [S] 1/[S] Рис. 3: (А) Скорость реакции как функция от концентрации субстрата для простой ферментативной реакции; (В) зависимость 1/v от 1/[S] Величина Vmax в предыдущих уравнениях может быть заменен на kcat : kcat = Vmax [E] (8) Таким образом, ферментативные реакции могут быть описаны в терминах кинетических параметров kcat , KM и kcat /KM . Эти кинетические константы получают экспериментальным измерением скорости реакции как функции от концентрации субстрата при фиксированной, известной концентрации фермента. Полученные данные подставляют в уравнение Михаэлиса-Ментена (6) и путем нелинейного регрессионного анализа получают значения KM и Vmax . Другим способом является построение графика зависимости 1/v от 1/[S], являющейся линейной функцией. Угол наклона этого графика позволяет вычислить отношение KM /Vmax , тогда как пересечение прямой с осью y дает значение 1/Vmax (рис. 3). Как было показано выше, кинетическая константа KM дает представление о величине аффинности субстрата к ферменту, тогда как величина kcat /KM дает величину эффективности переходного состояния по сравнению с некатализируемой реакцией, выражая таким образом степень эффективности всей каталитической реакции в целом. 1.4 Структура активного сайта стабилизирует переходное состояние Практически все ферменты в биологии являются белками и следовательно состоят из полипептидных цепей. Специфика трехмерного строения фермента определяется 10 не только третичной структурой полипептидной цепи, но и зависит от структурных особенностей связывающей области, в которую попадает субстрат и превращается в продукт. Химически реакционноспособная связывающая область фермента называется активным сайтом фермента. Подробная структура активного сайта определена размерами лигандов и типами происходящих химических превращений. Обычно, активные сайты ферментов — это малые по объему гидрофобные полости, тщательно защищенные от молекул растворителя (воды). Изначальное связывание субстрата с активным сайтом обычно является обратимым процессом, включающим в себя взаимодействия аминокислотных остатков фермента с функциональными группами молекулы субстрата; эти взаимодействия включают образование водородных связей, гидрофобные взаимодействия, силы ван дер Вальса и т. п. Топология и природа аминокислотных остатков, содержащихся в активном сайте, также определяют реакционную способность фермента. Во многих случаях активный сайт фермента содержит небелковые кофакторы (гемы, флавины, ионы металлов, пироксидальфосфат, и т. д.). Эти кофакторы дают дополнительные электрофильные, нуклеофильные и редокс компоненты для катализа. Одной из особенностей ферментов является то, что они катализируют только одну очень узкоспециализированную реакцию для определенного набора молекулсубстратов. Эта высокая степень субстратной специфичности была уже давно подмечена в ходе становления энзимологии и привела к мнению, что существует комплементарное структурное соответствие между молекулой субстрата и строением активного сайта фермента. Наиболее ранняя версия этой гипотезы была выдвинута Эмилем Фишером и относится к модели ферментативного катализа «ключ-замок». В этой модели активный сайт фермента рассматривается как статическая структура, которая полностью комплементарна строению субстрата. Оригинальная версия этой модели рассматривает активный сайт фермента с точки зрения абсолютной комплементарности по отношению к исходному состоянию молекулы субстрата, поскольку модель была выдвинута до возникновения теории переходного состояния. Сегодня, однако, ясно, что структура активного сайта субстрата наиболее подходит для строения переходного состояния, хотя и проявляет хорошую аффинность по отношению к исходному состоянию молекулы-субстрата. Эти данные хорошо согласуются с исследованиями по субстратной специфичности для ряда ферментов. Например, в табл. (2)1 приведены результаты по измерению начальных стадий пептидного гидролиза 1 В таблице используются однобуквенные обозначения аминокислот. Cbz — бензилоксикарбонил, OEt и OMe — этиловый и метиловый эфиры карбоксильной группы боковой цепи. 11 протеазой пепсином для ряда синтетических пептидов с различной пептидной последовательностью [10]. Из этих данных видно, что KM изменяется очень незначительно в ряду изученных структур, тогда как разница в эффективности собственно катализа может изменяться в тысячи раз. Пептид KM (mM) kcat (s−1 ) kcat /KM (mM −1 s−1 ) Cbz-GHFF-OEt Cbz-HFW-OEt Cbz-HFF-OEt Cbz-HFY-OEt Cbz-HYF-OEt Cbz-HYY-OEt CbzHFL-OMe 0.8 0.2 0.2 0.2 0.7 0.2 0.6 2.4300 0.5100 0.3100 0.1600 0.0130 0.0094 0.0025 3.04000 2.55000 1.55000 0.80000 0.01860 0.04700 0.00417 Таблица 2: Субстратная специфичность пепсина по отношению к синтетическим пептидам Из этих данных видно, что фермент осуществляет распознавание этих субстратов не на основании начального состояния, а основываясь на данных о наилучшем соответствии активного сайта и переходного состояния субстрата. Таким образом, активный сайт фермента структурно лучше всего адаптирован под разрыв и образование связей в субстрате, что приводит к сильному связыванию фермента с субстратом в переходном состоянии. Для достижения этой комплементарности в переходном состоянии фермент использует ряд структурных и химических подходов. Основные из них описаны ниже. 1.5 Стратегии для стабилизации переходного состояния Существует ряд стратегий, используемых ферментом для стабилизации переходного состояния и, соответственно, для ускорения реакции. Четыре основных подхода, обсуждаемых ниже, это аппроксимация, ковалентный катализ, кислотно-основный катализ и конформационные изменения. 1.5.1 Аппроксимация Термин «аппроксимация» относится к сближению друг с другом молекулы субстрата и функциональными группами активного сайта фермента таким образом, чтобы благоприятствовать катализу. Представим реакцию, в которой происходит образование связи между двумя молекулами субстрата А и В, давая единственный продукт А-В. Для этой же реакции, но протекающей в растворе, две молекулы субстрата 12 должны подойти друг к другу посредством диффузионных взаимодействий. Но молекулы субстрата не только должны приблизиться друг к другу, они еще должны сделать это в правильной геометрической ориентации по отношению друг к другу таким образом, чтобы появилась возможность возникновения переходного состояния. В растворе обе молекулы субстрата сольватированы, и хотя бы в незначительной степени должна произойти энергетически невыгодная десольватация, чтобы эти молекулы смогли прореагировать. Нековалентное взаимодействие молекул субстрата с активным сайтом фермента приводит к обезвоживанию молекул субстрата. Акт связывания молекул субстрата внутри активного сайта приводит также к правильной ориентации реагирующих функциональных групп этих молекул, особенно в момент переходного состояния. Энергия, затрачиваемая на удаление молекул растворителя (воды) компенсируется за счет связывания молекул субстрата с функциональными группами активного сайта фермента при помощи различных нековалентных взаимодействий. 1.5.2 Ковалентный катализ Другим механизмом для поддержания переходного состояния является образование ковалентных связей между молекулой субстрата и функциональными группами активного сайта фермента. Подобное связывание также помогает преодолеть энергетический барьер в момент образования переходного состояния. Во многих случаях ковалентного ферментативного катализа наблюдается, что лимитирующей стадией является либо стадия образования ковалентных связей между ферментом и субстратом, либо стадия их разрыва. Таким образом, ковалентные интермедиаты имеют относительно большое время жизни и часто могут быть выделены и изучены кристаллографическими и другими биофизическими методами. Ковалентный катализ обычно управляется нуклеофильным и электрофильным катализом и реже — при помощи окислительно-восстановительных превращений. Нуклеофильный катализ протекает в случае, когда электроны отдаются нуклеофилом активного сайта атому субстрата, приводя к образованию ковалентной связи. Боковые радикалы следующих аминокислот могут служить нуклеофилами: серин, цистеин, аспартат, лизин, гистидин и тирозин. Хорошим примером нуклеофильного катализа является механизм действия гидролитических ферментов, входящих в класс сериновых протеаз. Эти ферменты ответсвенны за разрыв амидных связей в пептидах и белках при помощи механизма, включающего в себя стадии ацилирования и деацилирования остатка серина активного сайта фермента. Серин сам по себе 13 не является хорошим нуклеофилом, но сериновые протеазы привлекают специфический механизм для усиления нуклеофильности этого остатка аминокислотной цепи. Внутри активного сайта всех сериновых протеаз находится триада из аспарагиновой кислоты, гистидина и серина, как это показано для α-химотрипсина на рис. (4). Гидроксигруппа серина образует водородную связь с одним из атомов азота остатка гистидина. Другой атом азота гистидинового остатка образует водородную связь с остатком аспарагиновой кислоты. В такой ситуации атом кислорода бокового остатка серина становится более нуклеофильным и способен атаковать амидную связь субстратного пептида. Рис. 4: Каталитическая триада Ser, His, Asp в активном сайте сериновой протеазы α-химотрипсин Электрофильный катализ включает образование ковалентных интермедиатов между катионным электрофилом в активном сайте фермента и электронодонорными 14 атомами молекулы кофактора или субстрата. Ни одна из природных аминокислот не является хорошим электрофилом, поэтому электрофильные свойства фермента обуславливаются либо определенными кофакторами, особенно ионами металлов. Другими кофакторами обычно являются пирадоксальфосфат или образование in situ лизин-субстратных Шиффовых оснований. Так же как и в случае нуклеофильного катализа, главной причиной образования аддукта является тот факт, что результирующий интермедиат облегчает преодоление переходного состояния субстрата. В некоторых случаях ферментативный электрофил не атакует напрямую молекулу субстрата, но служит для усиления нуклеофильности атакующего кофактора. Такова главная стратегия многих цинковых металлоэнзимов, где координированная при помощи катиона металла молекула воды служит атакующим фрагментом. В матричных металлопротеиназах, к примеру, ион цинка активного сайта играет сразу две роли, по которым усиливает нуклеофильность координационной молекулой воды, при помощи которой производится атака пептидного субстрата, и кроме того, ион цинка помогает нейтрализовать образование оксоаниона в процессе разрыва связей путем образования частично координированной связи, как это показано на рис. (5). 1.5.3 Кислотно-основные взаимодействия Ферментативные реакции часто требуют шаги переноса протонов, и эти шаги осуществляются при помощи групп активного сайта, обладающих кислотными и основными свойствами. Наиболее часто этими кислотно-основными функциональными производными служат боковые радикалы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, гистидина, цистеина, тирозина и лизина, а также свободные N- и Cконцы белка. Эти группы также могут играть более сложные, нежели обычная отдача/прием протона, функции, такие как стабилизация переходного состояния путем поляризации определенных химических связей, как это показано, например, для остатка глутаминовой кислоты, входящего в состав активного сайта матричной металлопротеиназы (рис. 5). 1.5.4 Конформационные изменения Как уже обсуждалось, разрыв и образование связей требует, чтобы молекула субстрата из основного состояния перешла в переходное состояние, являющего собой наибольший энергетический барьер на пути всего процесса в целом. Связавшись с активным сайтом фермента, молекула субстрата в своем основном состоянии должна быть активизирована, чтобы принять структуру переходного состояния. Одним 15 Рис. 5: Роль катиона цинка в активном сайте матричной металлопротеиназы 16 из путей, по которым ферменты делают это, являются конформационные изменения в устройстве активного сайта. Самой стабильной формой фермента является та, в которой топография активного сайта наиболее комплементарна переходному состоянию реакции (то есть в наименьшей по запасу энергии конформации фермента достигается наилучшая комплементарность активного сайта фермента переходному активированному состоянию субстрата). Субстрат связывается с активным сайтом в своем начальном состоянии. Чтобы связать такой лиганд, фермент немного изменяет свою конформацию для максимально возможного комплементарного сходства активного сайта с субстратом в его начальном (не переходном) состоянии. Однако, это изменение пространственного строения фермента приводит к вынужденному повышению энергии молекулы фермента. Поэтому фермент возвращается в исходное состояние, при этом происходит переход субстрата из основного в переходное состояние, после чего следует образование и высвобождение продукта, и фермент возвращается в конформацию с минимальной энергией. Эта концепция схематично показана на рис. (6). Рис. 6: Схематическое представление конформационных изменений, происходящих в ферменте 17 1.6 Обратимые ингибиторы ферментов Большинство ингибиторов ферментов, которые используются в качестве лекарственных препаратов в медицине, являются простыми обратимыми ингибиторами соответствующих ферментов. Термин «обратимый ингибитор» предполагает, что существует обратимое равновесие, установленное между ферментом и ингибитором, которое может характеризоваться константой скорости для диссоциации бинарного комплекса и равновесной константой диссоциации для комплекса фермент-ингибитор. Константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор обычно обозначается символом Ki и показывает, что мы имеем дело с лигандом-ингибитором. Если мы рассмотрим простую реакцию фермента с одним субстратом, мы обнаружим, что существует ряд потенциальных путей, по которым ингибитор может реагировать с ферментами. Различные уравнения, ассоциирующиеся с этими потенциальными взаимодействиями, суммированы на рис. 7. Рис. 7: Схема равновесия для фермента в присутствии и отсутствии ингибитора На рис. 7 фермент (E) может комбинироваться с субстратом образуя комплекс ES с соответствующей константами диссоциации KS . Комплекс EI потенциально может связывать субстрат с образованием тройного комплекса ESI. Константа диссоциации для освобождения субстрата из комплекса ESI, однако, не является столь необходимой, как для освобождения из комплекса ES. Следовательно, в нашей схеме константа диссоциации субстрата из комплекса ESI обозначена символом α. Тройной комплекс ESI может также образовываться при связывании ингибитора с бинарным комплексом ES. В этом случае константа также будет обозначаться символом α. Ес- 18 ли комплекс ESI будет распадаться до продукта при пониженной относительной скорости ингибированного фермента, такая ситуация будет называться частичным ингибированием. Однако, большинство ингибиторов ферментов, используемых в качестве лекарственных препаратов, не являются ингибиторами этого типа, но можно предположить, что насыщение соответствующих видов ферментов ингибиторами приводит к полной потере каталитической активности. Таким образом, Ki представляет константу диссоциации ингибитора для комплекса EI, в то время как αKi представляет константу диссоциации ингибитора для комплекса ESI. Различные уравнения, приведенные на рис. 7, приводят к трем кинетическим моделям ферментного ингибирования: конкурентное ингибирование; неконкурентное ингибирование; и аконкурентное ингибирование (рис. 8, с. 20). 2 Классы протеолитических ферментов и механизмы их действия Протеазы являются важным классом ферментов. Ниже дана классификация и терминология этих ферментов. Разделенные по природе нуклеофила, эта глава дает общее представление о разнообразии каталитических механизмов, осуществляемых протеазами. 2.1 Введение Исследование протеолитических ферментов имеет долгую историю. Еще в конце 18 века было показано, что специфические белки ответственны за расщепление других белков. Ферменты, такие как пепсин, или трипсин, которые были среди первых изученных представителей данного класса, являются на сегодняшний день, таким образом наиболее хорошо изученными ферментами. В течение прошлого века число ферментов, обнаруживавших протеолитическую активность, резко возросло, и на сегодняшний день собраны обширные данные по этому классу ферментов. Параллельно с возросшим объемом знаний возникла также необходимость классификации данной группы ферментов. Ниже приводится терминология и классификация пептидаз и последующий обзор различных каталитических механизмов этих классов ферментов. 19 Рис. 8: Три главные модели взаимодействия ингибитора с ферментом: (A) конкурентное ингибирование; (B) неконкурентное ингибирование; (C) аконкурентное ингибирование 20 2.2 Терминология В химических терминах, ферментативное расщепление пептидных связей представляет собой гидролиз, который обычно называют протеолизом. Ферменты, ответственные за катализ протеолиза, были названы «протеазами», термином, встречавшимся в германских книгах по физиологической химии 19 века. Из-за распространения двух различных систем номенклатуры, возникали неясности в терминологии (см. рис. 9), которые были устранены введением современной классификации, введенной Комитетом по номенклатуре международного союза биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB 1992) [21]. Рекомендуется употреблять термин «пептидаза» для любых ферментов, разрывающих пептидные связи. В качестве синонима этого слова попрежнему допускается использовать термин «протеаза». Пептидазы далее делятся на экзопептидазы, действующие лишь вблизи концов полипептидной цепи, и эндопептидазы, разрывающие связи внутри полипептидной молекулы. Термин «протеиназа» был заменен на «эндопептидаза» (см. табл. 3). Рис. 9: Схемы номенклатур. Конфликт между схемами А и В привел к появлению схемы С. 21 Подкласс Активность Экзопептидазы Аминопептидазы Расщепляют вблизи концов пептидов или белков Удаляют единственный аминокислотный остаток с N-конца Удаляют дипептид со свободного N-конца Удаляют трипептид со свободного N-конца Удаляют единственный аминокислотный остаток с С-конца Удаляют дипептид со свободного С-конца Расщепляют дипептиды Удаляют концевые остатки, которые являются замещенными, циклическими или связанными изопептидными связями Осуществляют расщепление внутри полипептидной цепи Расщепляют преимущественно субстраты, меньшие по размерам, чем белки Дипептидилпептидазы Трипептидилпептидазы Карбоксипептидазы Пептидилдипептидазы Дипептидазы Омегапептидазы Эндопептидазы Олигопептидазы Таблица 3: NC-IUBMB определения для подклассов пептидаз 2.3 Классификация Ранние попытки классификации пептидаз в соответствии с их молекулярным весом, зарядом или субстратной специфичностью не увенчались успехом из-за экспоненциального роста открываемых ферментов. Наблюдая за тем, что пептидазы действуют при помощи различных механизмов катализа, Хартли (1960) предложил более рациональную систему, основанную на каталитическом механизме гидролиза. Эта концепция выделения четырех групп ферментов на «сериновые», «цистеиновые», «аспарагиновые» и «металло» пептидазы по-прежнему остаются действенными, хотя позже и возник класс «треониновых» пептидаз. Каталитическим нуклеофильным центром в сериновых, треониновых и цистеиновых пептидазах является гидроксигруппы остатков серина и треонина, а также сульфогидрильная группа цистеина соответственно, входящих в активный сайт. В пептидазах аспарагинового типа нуклеофилом является молекула воды, связанная водородными связями с двумя остатками аспарагиновой кислоты. Металлопептидазы содержат один или два иона металла (чаще всего цинка, но также и кобальта, никеля или магния), которые обычно связаны с тремя аминокислотными остатками. Нуклеофилом в них является молекула воды, как и в аспарагиновых пептидазах [24], [25]. 22 2.4 Механизмы катализа Активные сайты пептидаз обычно характеризуются по природе нуклеофила и помогающих групп, оксианионной полости и других специфических полостей. Деление на субстратную специфичность дается по структуре специфических полостей. В некоторых случаях, как в случае с экзосайтом тромбина, даже вторичные связывающие сайты привносят вклад в связывание субстрата. Ниже приведены примеры ферментов, сгруппированные по их нуклеофилам. 2.4.1 Остаток серина в качестве нуклеофила Рис. 10: Механизм катализа, предполагаемый для сериновых пептидаз с каталитической триадой из Ser, His, Asp. (Нумерация остатков приведена по хемотрипсину) Каталитическая триада, состоящая из Ser, His и Asp. Классический механизм сериновых пептидаз основан на каталитической триаде из серина, гистидина и аспартата [30]. Механизм используется сериновыми пептидазами клана PA (каталитические остатки расположены в порядке His, Asp, Ser), клана SB (Asp, His, Ser) и SC (Ser, Asp, His). Во всех случаях механизм гидролиза идентичен. После образования комплекса Михаэлиса карбонильный атом углерода разрываемой связи атакуется 23 остатком Ser (рис. 10). Нуклеофильность серинового гидроксила усиливается близостью гистидинового остатка, служащего основанием. Образование ацил-ферментного комплекса достигается через тетраэдрический интермедиат, который разрушается с образованием ацилированного фермента и параллельным расщеплением пептидной связи. Отщепление протекает через те же стадии. В данном случае нуклеофильная атака осуществляется молекулой воды, приводя к высвобождению пептида и восстановления серинового гидроксила. Существует несколько точек зрения по поводу роли остатка аспарагиновой кислоты[36]. Ранее предполагалось, что Asp принимает на себя заряд протона в переходном состоянии. Однако позже данная гипотеза была опровергнута новыми экспериментальными и теоретическими данными (ссылка). По новой теории Asp участвует в стабилизации ориентации имидазольного кольца, а также в стабилизации локальной структуры вокруг активного сайта. Было также выдвинуто предположение, что водородная связь между Asp и His является «низкоуровневой» водородной связью, принимающей участие в стабилизации переходного состояния. Однако, и эта модель была опровергнута. Из-за непостоянства положения Asp была выдвинута теория, согласно которой лишь пары Ser–His и Ser–Asp являются ответственными за катализ. Каталитическая диада, состоящая из Ser, и Lys. После того, как каталитические триады стали практически догмой в отношении к сериновым пептидазам, были обнаружены ферменты, механизм гидролиза у которых осуществляется при помощи лишь двух аминокислотных остатков: серина и лизина (см. рис. 11. Этот механизм используют два клана ферментов: SE и SF. В некоторых ферментах класса SF остаток лизина заменен на гистидин [38]. 2.4.2 Остаток цистеина в качестве нуклеофила Каталитическая триада, состоящая из Cys, His, Asn/Asp. Архетипом цистеиновых пептидаз является папаин, растительный фермент, входящий в клан CA и является родоначальником семейства C1. Основной каталитический механизм имеет сходство с сериновыми пептидазами, за исключением того, что остаток серина заменен на остаток цистеина [40]. После образования комплекса Михаэлиса образуется ацилированный ферментный интермедиат (рис. 12). Расщепленный пептид высвобождается при помощи деацилирования. Так же как и в случае с сериновыми пептидазами, полагают, что стадии ацилирования и деацилирования протекают через тетраэдрический интермедиат. Роль третьего остатка триады, как полагают, 24 Рис. 11: Каталитический механизм, предполагаемый для сериновых пептидаз, содержащих остатки серина и лизина 25 такая же, как и для Asp в случае сериновых пептидаз. Рис. 12: Механизм катализа, предполагаемый для цистеиновых пептидаз с каталитической триадой из Cys, His, Asn/Asp (нумерация остатков приводится по папаину) Каталитическая диада, состоящая из Cys, His. Пептидазы, осуществляющие катализ при помощи остатков цистеина и гистидина, сгруппированы в клан CD. Этот клан содержит на сегодняшний день четыре семейства пептидаз: каспазы, гингипаины, клострипаины и легумаины. Все пептидазы клана CD обладают высокой специфичностью к аминокислотам в положении P1 . Предположительный каталитический механизм для каспазы приведен на рис. 13. Особенностью данного механизма является тот факт, что расстояние между остатками Cys и His слишком велико для депротонирования цистеина остатком гистидина. Cys в качестве каталитического остатка. Домен автопроцессинга протеина ежа представляет собой совершенно отличный от предыдущих механизм действия. Белки ежа синтезируются как прекурсоры и подвергаются внутримолекулярному процессингу, давая новый C-фрагмент и новый N-фрагмент с холестериновым остатком, ковалентно связанным с его карбоксильным концом. Цистеин, входящий в активный сайт, действует в качестве нуклеофила, атакуя карбонильную группу пред26 Рис. 13: Механизм катализа, предполагаемый для цистеиновых пептидаз с каталитической диадой из Cys и His 27 шествующего аминокислотного остатка (рис. 14). Это приводит к образованию тиоэфирной связи. Высвобождение N-концевого остатка катализируется нуклеофильной атакой 3β гидроксилом холестеринового остатка. Рис. 14: Каталитический механизм, предполагаемый для цистеиновых пептидаз с Cys в качестве каталитического остатка 2.4.3 Остаток серина или цистеина в качестве нуклеофила В клане PA присутствуют сейчас пептидазы, обладающие в качестве нуклеофильного центра остатки серина или цистеина. Каталитический механизм является классическим для сериновых пептидаз, как это описывалось выше. Единственное различие между сериновыми и цистеиновыми пептидазами данного клана заключается в выборе нуклеофила. Все члены этого клана имеют химотрипсин-подобный фолдинг. 28 2.4.4 Сериновый, цистеиновый или треониновый остаток в качестве нуклеофила Недавно открытый каталитический механизм треониновых пептидаз включает необычный нуклеофил. Главной особенностью нового механизма, с другой стороны, является использование боковой цепи аминотерминального остатка, включенного в β-складчатую структуру. Таким образом было введено название Ntn гидролаза (Nтерминирующий нуклеофил). Нуклеофилом в случае протеосомы является треонин, в случае глутаминовой PRPP амидотрансферазы — цистеин, а в случае пенициллиновой ацилазы — серин. Четыре треониновых семейства, два цистеиновых семейства и одно сериновое семейство сгруппированы в этот клан, клан PB. Каталитический механизм Ntn гидролаз с использованием единичного нуклеофильного центра было описано для пенициллиновой ацилазы (рис. 15). 2.4.5 Молекула воды в качестве нуклеофила Вода, связанная с двумя остатками аспарагиновой кислоты. Существует мнение, что гидролиз в случае аспарагиновых пептидаз протекает по обычному кислотно-основному каталитическому механизму. Из-за повышенного интереса к аспарагиновой пептидазе ВИЧ-1 каталитический механизм этого фермента наиболее хорошо понят среди представителей данного класса. В аспарагиновой протеазе ВИЧ1 только один из двух остатков Asp протонирован в фермент-субстратном комплексе (рис. 16). Один из остатков Asp действует в качестве основания, активирующего молекулу воды. После асимметричного присоединения субстрата, нуклеофильная атака молекулой воды приводит к образованию геминального диола а амидный атом азота меняет свое строение на тетраэдрическое. Последующее протонирование этого атома азота, сопровождаемое удалением протона с диола, приводит к разрыву пептидной связи. Вода, связанная с единичным ионом металла. Только один ион металла вовлечен в механизм действия протеаз кланов MA, MB, MC, MD и ME. В течение какого-то времени каталитический механизм термолизина оставался прототипом для данного класса металлопептидаз. Однако, недавно было доложено об отличном механизме для термолизина. Этот новый механизм уточняет каталитическое действие только термолизина, а старый может быть использован для большинства остальных металлопептидаз. Ниже приведены оба механизма (рис. 17 и 18) 29 Рис. 15: Каталитический механизм, предполагаемый для клана PB (нумерация приведена по пенициллиновой ацилазе) 30 Рис. 16: Каталитический механизм, предполагаемый для аспарагиновых пептидаз 31 Рис. 17: Один из предположительных механизмов для металлопептидаз с молекулой воды, связанной с одним ионом металла 32 Рис. 18: Недавно предложенный механизм каталитического действия металлопептидаз с молекулой воды, соединенной с одним ионом металла 33 Вода, связанная с двумя ионами металла. Четыре клана, как теперь известно, содержат два иона металла в своем каталитическом центре. Клан MF и клан MH содержат по два иона цинка, клан MG содержит два иона кобальта или магния и клан MJ содержит два иона никеля. Одним из наиболее важных различий между этим классом ферментов и классом, в котором лишь один ион металла удерживает молекулу воды, является пирамидальная координация ионов металла. Нуклеофилом является гидроксид-ион, симметрично связанный с двумя ионами металла. Этот атом кислорода также удерживает два иона металла в переходном состоянии. Пример действия пептидазы данного класса приведен на рис. 19. 3 Протеаза вируса герпеса и цитомегаловируса Восемь вирусов герпеса человека вызывают все многообразие различных болезней и характеризуются своей способностью вступать в латентное состояние в организме хозяина, а реагировать позднее, вызывая текущее заболевание. В 1991 году сериновая протеаза, закодированная в вирусе, была найдена в простом вирусе герпеса типа 1 [41]. Характеристика протеазы выявила ряд свойств, которая делает их привлекательными в качестве цели для потенциально новых противовирусных агентов: гомологи протеазы встречаются во всех вирусах герпеса; белки не имеют последовательностей, гомологичных любым другим протеазам; протеолитическая активность жизненно важна для генерирования инфекционных вирусных частиц. Кристаллические структуры протеаз некоторых вирусов герпеса при растворении приводят к новому кристаллическому механизму с открытым поверхностно-активным сайтом. Действующий механизм основывается на том, что ингибиторы и пептидомиметические ингибиторы были разработаны и синтезированы и их механизм ингибирования охарактеризован. Ингибиторы были также получены путем тщательного скрининга библиотек соединений, включая естественные продукты ингибиторов [42]. В клеточном анализе некоторые соединения проявляли способность ингибировать протеолитический процессинг в клетках, инфицированных вирусом. Некоторые соединения проявляли эффективную антивирусную активность в клеточной культуре. Потенциал, стабильность, клеточное проникновение и цитотоксичность ингибиторов — параметры, которые необходимо учитывать в анализе реально используемых в терапии ингибиторов протеазы герпеса. 34 Рис. 19: Предположительный каталитический механизм для металлопептидаз с молекулой воды, связанной с двумя ионами металла 35 3.1 Ингибиторы Основные ингибиторы сериновых протеаз проявляют только слабую активность против протеаз герпеса [43]. Низкая каталитическая эффективность, неглубокий активный сайт и высокие требования к субстрату семейства этих протеаз привели к тому, что разработка и открытие сильнодействующих ингибиторов весьма затруднено. Это отражено всего в нескольких докладах о действительно сильнодействующих (< 50nM ) ингибиторах, несмотря на значительную заинтересованность в этой цели фармацевтической промышленности. Некоторые ранние статьи об ингибиторах протеазы герпеса в основном описывают тиол-реактивные агенты, которые образуют дисульфидные связи с цистеином вокруг активного сайта цитомегаловирусной протеазы, или о других тиол-активных агентах [44]. Большинство ингибиторов основано на дизайне стратегий, основанных на механизме, или на аналогах переходного состояния пептидомиметиков. Другие классы ингибиторов были обнаружены путем тщательного скрининга коллекций синтетических и природных веществ. Димерный интерфейс, как предполагают, является потенциальной целью для ингибирования, но не было найдено ингибиторов с таким механизмом действия. 3.1.1 Ингибиторы, основанные на механизме Механизм-основанные ингибиторы герпесных протеаз действуют путем ацилирования активного сайта серина с образованием относительно стабильного ацилферментного аддукта. В некоторых случаях второй механизм также имеет место, когда дополнительно проходит реакция с одним из остатков цистеина в активном сайте фермента [45]. Бенозоксазиноны. В первой статье о механизм-основанных ингибиторах протеазы герпеса были описаны бензоксазиноновые ингибиторы протеазы герпеса 1, проявляющие свойства при концентрациях в 1 µM . Взаимоотношение структураактивность было отмечено и показано, что образовывался фермент-ингибиторный комплекс в соотношении 1:1. Было также показано, что бензоксазиноны способны ингибировать протеазу цитомегаловируса с аффинностью до 0.24 µM (1) и была описана активность в клеточных культурах. Результатом для бензоксазинонов и других механизм-основанных ингибиторов является их стабильность в водных растворах и в плазме крови [46]. 36 Тиеноксазиноны. Дальнейшие разработки оксазиноновых ингибиторов привели к открытию тиено- ингибиторов. Тиено[3,2-d]оксазиноны (2) ингибируют протеазы HSV-1, HSV-2 и CMV со значениями IC50 ниже микромолярных. Эти соединения демонстрируют повышенную стабильность в водных растворах и селекивность по отношению к семейству хемотрипсиновых протеаз. Тионо[2,3-d]оксазиноновые изомеры также являются ингибиторами HSV-2, VZV и CMV протеаз. Присутствие метильного заместителя в кольце параллельно карбонильной группе значительно увеличивает стабильность в сыворотке крови и позволяет измерить ингибирование протеаз, происходящее в клеточной культуре. SAR изучения в этой серии соединений (3) дало наиболее мощные ингибиторы протеаз α-вируса герпеса со значениями IC50 для VZV протеазы ниже 10 nM . Определение скорости деацилирования ацилированных ферментов показало, что время полураспада комплексов составляет около суток [47]. Двойственный механизм оксазинонов. Серия ендионовых производных тиено[2,3-d]оксазинонов были отмечены как сильнодействующие и селективные ингибиторы протеазы цитомегаловируса. Эти соединия действуют не только ацилируя каталитический серин, но и алкилируя цистеин-161 по реакции присоединения Михаэля. Структуры, такие как (4), со значениями IC50 30 nM , являются самыми сильно37 действующими ингибиторами цитомегаловируса, описанными на сегодняшний день, но они не получили дальнейшего развития из-за неприемлемой цитотоксичности. Оксазолины и имидазолины. В противоположность бензоксазинонам, которые известны как класс основанных на механизме ингибиторов сериновых протеаз, эти ингибиторы, открытые с помощью прямого механизм-основного скрининга, представляют новый вид основанных на механизме ингибиторов сериновой протеазы. Оксазолины (5) имеют микромолярные значения IC50 против протеаз HSV-2 и CMV и, как было показано, ацилируют активный сайт серина. Имидазолин (6) — селективный ингибитор протеазы CMV. Массовые измерения и модельные изучения предполагают, что потеря сульфонилоксильной группы связана с перегруппировкой для получения нового стабильного продукта ацилирования фермента. Дальнейшее использование этого класса ограничивается относительно слабой стабильностью в водных растворах [49]. Лактамы. Было доложено о двух группах моноциклических β-лактамных ингибиторов протеазы цитомегаловируса. Серия ингибиторов, основанных на субстратах, включая β-лактамы, была оптимизирована к структуре (7), которая проявила себя в роли мощного ингибитора протеазы CMV со значением IC50 равным 70 nM . Попытки уменьшить пептидный характер и молекулярный вес с 4-карбо- или 3-тио-заместителями привело к заместителям с IC50 равным 1 µM и более высокой стабильностью к воде. Предполагалось, что образование ацил-ферментных аддуктов при помощи этих соединений является обратимым и что механизм «двойного удара» не включается. Введение метильной группы в (8) привело к увеличению действия и стабильности, но и к потере селективности против эластазы. Гетероциклические производные, такие как (9), имеют значение IC50 против протеазы CMV сниженное 38 примерно до 1 µM , но проявляют некоторую активность в клеточной культуре. Изучение 4-окса-β-лактамов идентифицировало (10) как лучшего ингибитора с IC50 17 µM и, что интересно, с противоположной С3-стехиометрией к (8); изучение механизма подтвердило, что происходит ацилирование активного сайта серина [50]. Запатентованное применение описывает бициклические γ-лактамы как ингибиторы протеазы герпеса. Эти соединения, имеющие значение IC50 протеазы CMV до 200 nM . (11) описываются как имеющие IC50 310 nM и антивирусную активность против CMV с антивирусной активностью в клеточной культуре. 3.1.2 Ингибиторы-пептидомиметики Оптимизация аминоацильных остатков привела к ацил трипептидным ингибиторам (12)–(14). Привлечение различных активированных карбонильных состояний аналогичных мотивов привела к снижению действия до 100 nM для фторалкилкетона (12) и α-кетоамина (13) и до 600 nM для гетероциклического кетона (14). В то время как 39 фторкетон селективен по отношению к остальным сериновым протеазам, гетероциклические кетоны ингибируют эластазу при подобных концентрациях. Ингибиторыпептидомиметики не показывают значительную антивирусную активность в клеточной культуре, возможно из-за проблем с клеточным проникновением и/или деградации [51]. 3.1.3 Другие ингибиторы Наиболее активными из этих ингибиторов протеазы герпеса является бензотиопиран4-оны. Приведенные соединения были открыты путем высокопроникающего экранирования и попыток оптимизации, что привело к (15), с IC50 60 nM. Трифторметилкетонный ингибитор (16) ингибирует протеазу CMV с IC50 5.3 µM , но механизм действия еще не определен. Докладывается, что соединение проявляет слабую противовирусную активность. Кобальтовый комплекс салкомина (17) и некоторые аналоги ингибируют протеазу CMV со значением IC50 ниже 1 µM и проявляют хорошую селективность по отношению к семейству хемотрипсиновых протеаз. Антивирусная активность также была обнаружена. 6 естественных продуктов ингибиторов протеаз герпеса были описаны, но все они имеют ограниченное действие [52]. Грибковый метаболит Sch 65676 (19) и стрептомицетовый естественный продукт брипиодионен (19) ингибируют протеазу 40 CMV со значениями IC50 24 µM и 30 µM соответственно. Два нафтасенеквеноновых гликозида, кванолироны I и II (20) и (21) были также выделены из стрептомицетов и, как было показано, имеют слабую активность против протеазы CMV со значением IC50 14 и 35 µM соответственно. Новый циклоартанольно-сульфатный метаболит (22), выделенный из зеленых водорослей, как было обнаружено, ингибирует протеазы CMV и VZV со значениями IC50 в области 4-7 µM [55]. 3.2 Итоги Протеаза герпеса является важным ферментом и потенциальной целью для новых противовирусных агентов. Однако, такие факторы как геометрия поверхностноактивного сайта и расширенная площадь взаимодействия с субстратом значительно увеличивают проблемы для открытия низкомолекулярных ингибиторов с лекарственными свойствами. Хотя уже доложено о ряде классов ингибиторов с ферментативной силой на субмолекулярном уровне, очень мало докладов об ингибиторов реальной силы (IC50 < 50nM ) появилось. В дополнение, сила противовирусной активности, которую можно отделить от цитотоксического эффекта соединений в кле41 точной культуре, до сих пор не описана. Увеличение стабильности в клеточной среде, обеспечивающее проникновение в клетку, и/или уменьшение цитотоксичности — свойства, которые необходимо обеспечить в новых ингибиторах. По мере того как эти параметры будут выполнены, реальная терапевтическая сила ингибиторов протеаз герпеса сможет быть оценена[56], [57]. 4 Протеаза ВИЧ 4.1 Вирусная протеаза — ключевой белок жизненного цикла ВИЧ Ретро-вирусы, такие как ВИЧ, представляют собой наименьшие реплицирующие единицы, известные человечеству. Состоя примерно из 15 белков и двух молекул РНК, ВИЧ способен проникать в клетки, реплицируя свой генетический материал и формируя ряд прогенных вирусов, способных заражать другие клетки. Все эти белки кодируются генами gag, pol и env, которые транскрибируются и транслируются в большие белки Gag, Pol и Env с использованием аппарата клетки-мишени. Полипротеин Gag содержит следующие структурные белки: матричный (MA), капсидный (CA) и нуклеокапсидный (NC), которые важны для вирусной сборки. Белок Pol содержит обратную транскриптазу (RT) и интегразу (IN), обязательных для процесса обратной транскрипции вирусной геномной РНК и интеграции образующейся ДНК в геном клетки-мишени, тогда как Env содержит поверхностные (SU) и трансмембранные (TM) гликопротеины [59]. Вирусная протеаза (PR) ответственна за созревание предшественников полипротеинов Gag и Pol в зрелые вирусные энзимы и структурные протеины. Этот процесс, названный созреванием вируса, связан с морфологическими изменениями вирусной частицы и делает вирусную репликацию инфекционной. Химическое ингибирование или инактивация посредством мутации этой протеазы блокирует инфекционность вируса. Таким образом, ретровирусные протеазы становятся главной мишенью для терапевтического вмешательства в такие заболевания, как СПИД и HTLV-зависимая лейкемия. Общими усилиями ученых HIV-1 PR сделалась одной из наиболее изученных молекул в природе, что привело к быстрой разработке многих эффективных ингибиторов, уже применяющихся при лечении указанных заболеваний. Существует множество причин, почему ретровирусные протеазы, даже после нескольких лет интенсивных и успешных исследований, по-прежнему являются вос- 42 требованными объектами исследований. Наиболее важным является тот факт, что СПИД остается серьезной медицинской проблемой и необходимость в эффективном и легко доступном виростатике по прежнему существует. Во-вторых, те объемы данных, которые были собраны по структуре, активности и регуляции этих ферментов сделали их превосходной моделью для анализа отношений «стуктура-свойство», механизма действия, фолдинга и эволюции протеолитических энзимов целом. Втретьих, некоторые достаточно простые вопросы по-прежнему остаются без ответа: как и когда активируется вирусная протеаза? Как регулируется ее активность и как энзим, после расщепления всех свойственных ему субстратов, деактивируется? 4.2 Молекулярная архитектура фермента Структурные белки ретровирусов синтезируются как большие (длинные) предшественники, которые нуждаются в протеолитическом расщеплении, приводящем к зрелым белкам, обнаруженным в инфекционных вирионах. Кодирующая область для протеазы, ответственной за эти расщепления в ВИЧ кодированна к 5’-концу pol ORF и энзим был идентифицирован как аспарагиновая протеаза. Аспарагиновые протеазы — это протеолитические ферменты, найденные и охарактеризованные в животных, растениях и грибах. Структурной особенностью их последовательности является пара Asp-Thr/Ser-Gly триад, которые присутствуют в двух доменах фермента и составляют ядро активного сайта. Присутствие единичного мотива AspThr/Ser-Gly в первичной структуре предполагаемых ретровирусных протеаз приводит к мнению, что они относятся к аспарагиновым протеазам пепсинового семейства и что они действуют в качестве гомодимера. Ретровирусные протеазы представляют собой наименьшие из известных на данный момент протеолитических ферментов. Фермент представляет собой димер, состоящий из одинаковых субъединиц. Внутреннее ядро фермента (включая каталитическую триаду Asp-Ser/Thr-Gly) образует харатрерную Ф-петлю как это описано для схожих аспарагиновых протеаз. Карбоксильные группы остатков аспарагиновых кислот активного сайта из обеих субъединиц практически параллельны. Эта структура фиксируется при помощи сети водородных связей, известных как «пожарный захват» (“fireman’s grip”) в которой каждый атом кислорода боковой цепи, принадлежащий Thr, образует водородную связь с NH-фрагментом трипрофанов главной цепи на противоположной субъединице и отдает водородную связь карбонильному атому кислорода Leu, находящемся в основной цепи противоположной субъединицы, придавая таким образом значительную стабильность димеру протеазы ВИЧ. Другой важной структурной особенностью, по43 могающей удерживать обе субъединицы вместе, является наличие скрученной вчетверо антипараллельной β-складчатой структуры, включающей в себя как амино-, так и карбоксильный концы отдельных субъединиц. Полость для связывания субстрата находится между обеими субъединицами и покрыта «крышей» из двух β-шпилек (называемых flap), по одной с каждой субъединицы. Почти во всех комплексах ВИЧ-1, ВИЧ-2 или SIV протеаз с ингибитором найдена молекула воды, связывающая остатки Ile50 и Ile50’. Эта молекула воды отделена от остальных молекул воды, окружающих фермент, и много подходов к дизайну ингибиторов протеазы связанно именно с заменой этой молекулы воды. Аминокислотные остатки, критичные для активности фермента, были выявлены путем мутогенеза как in vitro, так и in vivo. Были найдены три области, критичные для активности фермента: каталитическое ядро фермента, мобильная flap-область и домен димеризации на N- и С-концах протеазы. 4.3 Ингибиторы протеазы ВИЧ как примеры успешного Drug Design Вскоре после идентификации, протеаза ВИЧ была использования в качестве главной мишени для рационального конструирования лекарственных препаратов, направленных на борьбу со СПИДом. Спустя семь лет после идентификации мишени, в 1995 году был опробован в клинической практике первый лекарственный препарат saquinavir, а позже — и ряд других. К 2004 году уже 8 лекарственных препаратов были разрешены для клинического применения: saquinavir (Invirase, 1995; Fortovase, 1997), ritonavir (Norvir, 1996), indinavir (Crixivan, 1996), nelfinavir (Viracept, 1997), amprenavir (Agenerase, 1999) and its prodrug fosamprenavir (Lexiva, 2003), lopinavir в комбинации с ritonavir (Kaletra, 2000) и atazanavir (Reyataz, 2003); (см. рис. (20). 4.4 Разработка резистентных вариантов под давлением селекции ингибитора: пластичность вирусной протеазы ВИЧ инфекция представляет собой стойкое, хроническое состояние, характеризуемое высокой степенью репликации вируса. Новые вирусные частицы продуцируются в инфицированных пациентах со скоростью от 108 до 109 в сутки. Такая высокая скорость репликации, совместно с высокой степенью ошибок обратной транскриптазы ВИЧ (1 ошибка на 10000 пар оснований, т. е., примерно одна мутация на один прогенный вирион ВИЧ) генерирует миллионы индивидуальных образцов ВИЧ в зараженном организме.Такое огромное число различных вариантов вируса наклады44 H N N N H O O N O OH N H O N H N O S O Ritonavir HO NH N O H N N N H O N N S H OH NH2 Saquinavir H N O O N H OH S O Indinavir HO N H O H N H OH H Nelfinavir NH2 O O O O N H N S O OR Amprenavir, R = H Fosamprenavir, R = P(O)(OH)2 O HN N N O O O N H H N O OH O N N H OH N H O O Lopinavir H N O O Atazanavir Рис. 20: Лекарственные препараты, направленные на ингибирование протеазы ВИЧ 45 вает определенные условия на быстрый поиск успешных лекарственных препаратов [60]. Быстрое появление нечувствительных к ингибиторам обратной транскриптазы вирусных штаммов является главным препятствием на пути к успешной терапии. Появление ингибиторов протеазы ВИЧ было встречено с надеждой на то, что небольшой размер кодирующей области протеазы вместе со строгими требованиями к субстратной специфичности вирусной протеазы дает узкий круг для возникающих без уменьшения активности протеазы ниже допустимого порога мутаций. К сожалению, резистентные мутанты часто обнаруживаются уже через несколько недель после начала курса лечения. В курсе лечения множественные мутации в протеазе ВИЧ аккумулируются в упорядоченную форму благодаря происходящей репликации неполностью супрессированного генетического материала ВИЧ. Эта последующая аккумуляция мутаций, локализованная часто в областях, далеких от активного сайта, дает вирусу широкую резистентность к различным ингибиторам протеаз и, в то же время, приводит к некоторому избытку ширины мутаций вируса. 5 Заключение В данной работе была дана краткая информация по классификации и номенклатуре протеолитических ферментов, а также приведены основные механизмы их действия. На примере протеаз ВИЧ и герпеса рассмотрены современные подходы к конструированию эффективных лекарственных препаратов. Также в работе даны краткие сведения о ферментативной кинетике и ингибированию ферментов. 46 Список литературы [1] Haley, T.M., Angler, S.J., Borthwick, A.D., Montgomery, D.S., Purvis, I.I., Smart, D.H. etal (1998) Investigation of the covalent modification of the catalytic triad of human cytomegalovirus protease by pseudo-reversible beta-lactam inhibitors and a peptide chloromethylketone. Journal of Mass Spectrometry, 33, 1246-1255. [2] Holwerda, B.C. (1997) Herpesvirus proteases: targets for novel antiviral drugs. Antiviral Research, 35, 1-21. [3] Hoog, S.S., Smith, W.W., Qiu, X., Janson, C.A., Hellmig, B., McQueney, M.S. etal (1997) Active site cavity of herpesvirus proteases revealed by the crystal structure of herpes simplex virus protease/inhibitor complex. Biochemistry, 36, 14023-14029. [4] Jarvest, R.L., Connor, S.C., Gorniak, J.G., Jennings, L.J., Serafinowska, H.T. and West, A. (1997) Potent selective thienoxazinone inhibitors of herpes proteases. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7, 1733-1738. [5] Jarvest, R.L., Pinto, I.L., Ashman, S.M., Dabrowski, C.E., Fernandez, A.V., Jennings, L.J. etal (1999) Inhibition of herpes proteases and antiviral activity of 2-substituted thieno[2,3-d]oxazinones. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 443-448. [6] LaPlante, S.R., Aubry, N., Bonneau, P.R., Cameron, D.R., Lagace, L, Massariol, M.J. etal (1998) Human cytomegalovirus protease complexes its substrate recognition sequences in an extended peptide conformation. Biochemistry, 37, 9793-9801. [7] McCrary, M.L., Severson, J. and Tyring, S.K. (1999) Varicella zoster virus. Journal of the American Academy of Dermatology, 41, 1—14. [8] Moore, P.S., Gao, S.-J., Dominquez, G., Cesarman, E., Lungu, O., Knowles, D.M. etal (1996) Primary characterization of a herpesvirus agent associated with Kaposi’s sarcoma. Journal of Virology, 70, 549-558. [9] Newcomb, W.W., Homa, F.L., Thomsen, D.R., Booy, P.P., Trus, B.L., Steven, A.C. etal (1996) Assembly of the herpes simplex virus capsid: characterization of intermediates observed during cell-free capsid formation. Journal of Molecular Biology, 263, 432-446. 47 [10] Ogilvie, W., Bailey, M., Poupart, M.-A., Abraham, A., Bhavsar, A., Bonneau, P. etal (1997) Peptidomimetic inhibitors of the human cytomegalovirus protease. Journal of Medicinal Chemistry, 40, 4113-4135. [11] Ash, E.L., Sudmeier, J.L., De Fabo, E.C. and Bachovchin, W.W. (1997) A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. Science, 278, 1128-1132. [12] Brady, K.D., Giegel, D.A., Grinnell, C, Lunney, E., Talanian, R.V., Wong, W. etal (1999) A catalytic mechanism for caspase-1 and for bimodal inhibition of caspase-1 by activated aspartic ketones. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 7, 621-631. [13] Hall, T.M., Porter, J.A., Young, K.E., Koonin, E.V., Beachy, P.A. and Leahy, D.J. (1997) Crystal structure of a Hedgehog autoprocessing domain: homology between Hedgehog and self-splicing proteins. Cell, 91, 85-97. [14] Hoog, S.S., Smith, W.W., Qiu, X., Janson, C.A., Hellmig, B., McQueney, M.S. etal (1997) Active site cavity of herpesvirus proteases revealed by the crystal structure of herpes simplex virus protease/inhibitor complex. Biochemistry, 36, 14023-14029. [15] Lau, E.Y. and Bruice, T.C. (1999) Consequences of breaking the Asp-His hydrogen bond of the catalytic triad: effects on the structure and dynamics of the serine esterase cutinase. Biophysical Journal, 77, 85-98. [16] Mangel, W.F., Toledo, D.L., Ding, J., Sweet, R.M. and McGrath, WJ. (1997) Temporal and spatial control of the adenovirus proteinase by both a peptide and the viral DNA. Trends in Biochemical Science, 22, 393-398. [17] Odagaki, Y., Hayashi, A., Okada, K., Hirotsu, K., Kabashima, T., Ito, K. etal (1999) The crystal structure of pyroglutamyl peptidase I from Bacillus amyloliquefaciens reveals a new structure for a cysteine protease. Structure, 7, 399-411. [18] Paetzel, M. and Dalbey, R.E. (1997) Catalytic hydroxyl/amine dyads within serine proteases. Trends in Biochemical Science, 22, 28-31. [19] Perler, F.B. (1998) Protein splicing of intcins and hedgehog autoproteolysis: structure, function, and evolution. Cell, 92, 1-4. [20] Pinitglang, S., Watts, A.B., Patel, M., Reid, J.D., Noble, M.A., Gul, S. etal (1997) A classical enzyme active center motif lacks catalytic competence until modulated electrostatically. Biochemistry, 36, 9968-9982. 48 [21] Qiu, X., Gulp, J.S., DiLella, A.G., Hellmig, B., Hoog, S.S., Janson, C.A. etal (1996) Unique fold and active site in cytomegalovirus protease. Nature, 383, 275-279. [22] Qm, X., Janson, C.A., Gulp, J.S., Richardson, S.B., Debouck, C., Smith, W.W. etal (1997) Crystal structure of varicella-zoster virus protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94, 2874-2879. [23] Singleton, M., Isupov, M. and Littlechild, I. (1999) X-ray structure of pyrrolidone carboxyl peptidase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis. Structure, 7, 237-244. [24] Tahirov, T.H., Oki, H., Tsukihara, T., Ogasahara, K., Yutani, K., Ogata, K. etal (1998) Crystal structure of methionine aminopeptidase from hyperthermophile, Perococcus furiosus. Journal of Mokcular Biology, 284, 101-124. [25] Urade, R., Oda, T., Ito, H., Moriyama, T., Utsumi, S. and Kito, M. (1997) Functions of characteristic Cys-Gly-His-Cys (CGHC) and Gln-Glu-Asp-Leu (QEDL) motifs of microsomal ER-60 protease. Journal of Biochemistry (Tokyo), 122, 834-842. [26] Vogel, J.-U., Scholz, M. and Cinatl, Jr. J. (1997) Treatment of cytomegalovirus diseases. Intervirology, 40, 357-367. [27] Walmsley, S. and Tseng, A. (1999) Comparative tolerability of therapies for cytomegalovirus retinitis. Drug Safety, 21, 203-224. [28] Watanabe, S., Konno, K., Shigeta, S. and Yokata, T. (1998) Inhibition of human cytomegalovirus proteinase by salcomine derivatives. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 9, 269-274. [29] New York: Raven Press, Ltd. Whitley, R.J., Cloud, G., Gruber, W., Storch, G.A., Demmler, G.J., Jacobs, R.F. etal (1997) Ganciclovir treatment of symptomatic congenital cytomegalovirus infection: results of a Phase II study. Journal of Infectious Diseases, 175, 1080-1086. [30] Wutzler, P. (1997) Antiviral therapy of herpes simplex and varicella-zoster virus infections. Inter-virology, 40, 343-356. [31] Yoakim, C., Ogilvie, W.W., Cameron, D.R., Chabot, C., Grand-Maitre, C., Guse, I. etal (1998) Potent (3-lactam inhibitors of human cytomegalovirus protease. Antiviral Chemistry & CJiemother- apy, 9, 379-387. 49 [32] Yoakim, C., Ogilvie, W.W., Cameron, D.R., Chabot, C., Guse, I., Hache, B. etal (1998) |3-Lactam derivatives as inhibitors of human cytomegalovirus protease. Journal of Medicinal Chemistry, 41, 2882-2891. [33] Ogilvie, W.W., Yoakin, C., Do, F., Hache, B., Lagace, L, Naud, J. etal (1999) Synthesis and antiviral activity of monobactams inhibiting the human cytomegalovirus protease. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 7, 1521-1531. Patil, A.D., Freyer, A.J., Killmer, L., Breen, A. and Johnson, R.K. (1997) A new cycloartanol sulfate from the green alga Tuemoya sp.: an inhibitor of VZV protease. Natural Product Letters, 9, 209-215. [34] Pinto, I.L., Jarvest, R.L., Clarke, B., Dabrowski, C.E., Fenwick, A., Gorczyca, M.M. etal (1999) Inhibition of human cytomegalovirus protease by enedione derivatives of thieno[2,3-d]oxazinones through a novel dual acylation/alkylation mechanism. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 449-452. [35] Qian-Cutrone, I., Kolb, J.M., McBrien, K., Huang, S., Gustavson, D., Lowe, S.E. and Manly, S.P. (1998) Quanolirones I and II, two new human cytomegalovirus protease inhibitors produced by Streptomyces sp. WC76535. journal of Natural Products, 61, 1379-1382. [36] Qiu, X., Janson, C.A., Culp, J.S., Richardson, S.B., Debouck, C., Smith, W.W. etal (1997) Crystal structure of varicella-zoster virus protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 94, 2874-2879. [37] Rawlinson, W.D. (1999) Diagnosis of human cytomegalovirus infection and disease. Pathology, 31, 109-115. [38] Rettig, M.B., Ma, H.J., Vescio, R.A., Fold, M., Schiller, G., Belson, D. etal (1997) Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of bone marrow dendritic cells from multiple myeloma patients. Science, 276, 1851-1854. [39] Shu, Y.-Z., Ye, Q., Kolb, J.M., Huang, S., Veitch, J.A., Lowe, S.E. and Manly, S.P. (1997) Bripiodionen, a new inhibitor of human cytomegalovirus protease from Streptomyces sp. WC96599. journal of Natural Products, 60, 529-532. [40] Smith, I.L., Cherrington, J.M., Jiles, R.E., Fuller, M.D., Freeman, W.R. and Spector, S.A. (1997) High-level resistance of cytomegalovirus to ganciclovir is associated with alterations in both the UL97 and DNA polymerase genes, journal of Infectious Diseases, 176, 69-77. 50 [41] Smith, D.G., Cribble, A.D., Haigh, D., Ife, R.J., Lavery, P., Skett P. etal. (1999) The inhibition of human cytomegalovirus (hCMV) protease by hydroxylamine derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 3137-3142. [42] Tong, L., Qian, C., Massariol, M.-J., Deziel, R., Yoakim, C. and Lagace, L. (1998) Conserved mode of peptidomimetic inhibition and substrate recognition of human cytomegalovirus protease. Nature Structural Biology, 5, 819-826. [43] Campadelli-Fiume, G., Mirandola, P. and Menotti, L. (1999) Human herpesvirus 6: an emerging pathogen. Emerging Infectious Diseases, 5, 353-366. [44] Christophers, I., Clayton, I., Craske, I., Ward, R., Collins, P., Trowbridge, M. etal. (1998) Survey of resistance of herpes simplex virus to acyclovir in northwest England. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 42, 868-872. [45] Deziel, R. and Malenfant, E. (1998) Inhibition of human cytomegalovirus protease NO with mono-cyclic 7’lactams. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8, 14371442. [46] Dhanak, D., Keenan, R.M., Burton, G., Kaura, A., Darcy, M.G., Shah, D.H. etal (1998) Benzothio-pyran-4-one based reversible inhibitors of the human cytomegalovirus (HCMV) protease. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8, 3677-3682. [47] Dhanak, D., Burton, G., Christmann, L.T., Darcy, M.G., Elrod, K.C., Kaura, A. etal. (2000) Metal mediated protease inhibition: design and synthesis of inhibitors of the human cytomegalovirus (hCMV) protease. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 10, 2279-2282. [48] Ertl, P., Cooper, D., Alien, G., and Slater, M.J. (1999) 2-Chloro-3-substitutedl,4-naphthoquinone inactivators of human cytomegalovirus protease. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9. 2863-2866. [49] Flynn, D.L., Abood, N.A. and Holwerda, B.C. (1997) Recent advances in antiviral research: identification of inhibitors of the herpesvirus proteases. Current Opinion in Chemical Biology, 1, 190-196. [50] Fowler, K.B., McCollister, F.P., Dahle, A.J., Boppana, S., Britt, W.J. and Pass, R.F. (1997) Progressive and fluctuating sensorineural hearing loss in children with 51 asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Journal of Pediatrics, 130, 624630. [51] Gibson, W. and Hall, M.R.T. (1997) Assemblin, an essential herpesvirus proteinase. Drug Design and Discovery, 15, 39-47. [52] Greenblatt, R.M. (1998) Kaposi’s sarcoma and human herpesvirus-8. Infectious Disease Clinics o| North America, 12, 63-82. [53] Guo, B., Dai, J.-R., Ng, S., Huang, Y., Leong, C, Ong, W. etal. (2000) Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cetonaema species. Journal of Natural Products, 63, 602-604. [54] Chan, C.-C., Boyce, S., Brideau, C., Charleson, S., Cromlish, W., Ethier, D., Evans, J., Ford-Hutchinson, etal (1999) Rofecoxib [Vioxx, MK-0966; 4(4’-methylsulfonylphenyl)-3-phenyl-2-(5H)-furanone]: A potent and orally active cyclooxygenase-2 inhibitor. Pharmacological and biochemical profiles./. Pharmacol. Exp. Ther., 290, 551-560. [55] Copeland, R.A. (2000) Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis, 2nd edition. New York: Wiley-VCH. [56] Copeland, R.A., Williams, J.M., Giannaras, J., Nurnberg, S., Covington, M., Pinto, D., Pick, S. and Trzaskos, J.M. (1994) Mechanism of selective inhibition of the inducible isoform of prostaglandin G/H synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11202-11206. [57] Harris, G.S. and Kozarich, J.W. (1997) Steroid 5a-reductase inhibitors in androgendependent disorders. Current Opinion Chem. Biol., 1, 254-259. [58] Mathews, D.A., Dragovich, P.S., Webber, S.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Zalman, L.S., Hendrickson, T.F., Love, R.A., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Binford, S.L., Brothers, M.A., DeLisle, D.M. and Worland, S.T. (1999) Structure-assisted design of mechanismbased irreversible inhibitors of human rhinovirus 3C protease with potent antiviral activity against multiple rhinovirus serotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1100011007. [59] Jana Prejdova, Milan Soucek and Jan Konvalinka (2004) Determining and Overcoming Resistance to HIV Protease Inhibitors. Current Drug Targets – Infectious Disorders, 4, 137-152. 52 [60] Francois Clavel, M.D., and Allan J. Hance, M.D. (2004) HIV Drug Resistance. N Engl J Med, 350, 1023-35. 53
