Регуляция свободнорадикальных процессов как проявление

УДК 612.017.1: 577.151.05
РЕГУЛЯЦИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
КАК ПРОЯВЛЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ
АКТИВНОСТИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА
Г. П. Ежова, А. Ю. Рутницкий, М. В. Гладышева
Нижегородский госуниверситет
Т. А. Крайнова
Нижегородское госпредприятие
по производству бактерийных препаратов «ИМБИО»
Исследовано влияние препаратов церулоплазмина (Ср) на свободнорадикальные процессы в тесте определения перекисного окисления липидов
(ПОЛ). Интенсивность ПОЛ оценивали хемилюминесцентным методом. Изучена
иммуномодулирующая активность препаратов Ср по реакции воздействия его на
фагоцитарную активность клеток крови и на выделенные нейтрофилы. Установлено, что препараты Ср способны снижать интенсивность ПОЛ, проявлять
антиоксидантную активность. Ср в определенных дозах работает как активатор фагоцитоза.
Введение
Снижение иммунной реактивности организма лежит в основе многих острых и
хронических заболеваний, поэтому научно-практический интерес представляют
новые проблемы в иммунологии – иммуномодуляция, которая позволяет проводить коррекцию иммунной системы. В настоящее время ведется активный поиск
препаратов, способных избирательно воздействовать на различные звенья иммунной системы (Сенюк и др., 1994; Бердинских и др., 1994; Закирова и др., 1994), а
также обоснование современных адекватных методов для оценки иммунореактивности.
Известная высокая активность белков сыворотки крови, особенно гликопротеинов, является обоснованием для включения их в важнейший ряд иммуномодуляторов, что и будет сделано в настоящей работе. Установлена выраженная регулирующая активность препаратов альбумина, различных иммуноглобулинов, однако молекулярно-биохимические механизмы этого неспецифического эффекта не
выяснены (Анастасиев, 1998).
Изучение биохимических основ регуляторной функции белков сыворотки крови человека является важным фундаментом для использования их в клинической
практике с целью иммуномодуляции и коррекции реактивности организма человека в условиях все нарастающего пресса иммунодефицитов различной этиологии.
Целью настоящей работы является выявление иммуномодулирующей активности нового препарата сыворотки человека – церулоплазмина (Ср); особенностью
исследования была оценка сравнительных эффектов при действии разных биотехнологических форм Ср (нативного и лиофильно высушенного).
138
Ср – многофункциональный медьсодержащий гликопротеин, фактор естественной защиты организма; оксидаза окисляет ароматические амины, фенолы,
аскорбиновую кислоту (Добротина и др., 1998) регулирует уровень норадреналина, адреналина, серотонина участвует в мобилизации сывороточного железа; Ср с
трансферрином образует антиоксидантную систему плазмы крови.
Применение Ср сопровождается коррекцией антиоксидантного потенциала и
уменьшением накопления продуктов ПОЛ, наблюдается выраженный иммунопротекторный эффект в виде увеличения потенциала фагоцитирующих нейтрофилов.
Установлено его иммуномодулирующее влияние на популяцию Т-клеток, при
котором увеличивается количество цитотоксических клеток, состоящих из цитотоксических Т-лимфоцитов, цитотоксических макрофагов и NK-клеток (Бердинских и др., 1994; Сенюк и др., 1994).
Материалы и методы
В работе использовалась кровь практически здоровых людей, получаемая из
Нижегородской областной станции переливания крови. Препараты церулоплазмина (Ср) предоставлялись Нижегородским предприятием по производству бактерийных препаратов, за что приносим большую благодарность.
Исследование влияния церулоплазмина на свободнорадикальные процессы
проводили в тесте определения перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы
крови здоровых людей хемилюминесцентным методом (ХЛ) с последующим внесением в систему различных доз препаратов Ср. В систему определения вносили
0.1 мл плазмы крови, 0.4 мл фосфатного буфера, 0.4 мл 0.05 М раствора сульфата
железа, 0.2 мл 2% раствора перекиси водорода. Интенсивность ПОЛ оценивали по
величине светосуммы ХЛ. Затем в реакционную смесь вносили раствор Ср различных концентраций и по измененной величине светосуммы ХЛ оценивали антиоксидантную активность Ср.
Иммуномодулирующую активность препаратов Ср оценивали по результатам
воздействия его различных концентраций на фагоцитирующую активность клеток
крови здоровых людей и на выделенные нейтрофилы. Фагоцитарную активность
клеток определяли с помощью люминолзависимой хемилюминесценции. К 0.1 мл
цельной крови или нейтрофилов, разведенных раствором Хенкса, добавляли
0.1 мл люминола и 0.1 мл цеолита. По величине светосуммы (S) регистрировали
фагоцитарную активность и затем в систему вносили растворы Ср. В течение 27′
регистрировали показания S.
Результаты и обсуждение
Ср как лечебный препарат в перспективе может быть получен из остатков крови человека, образующихся при производственном получении γ-глобулина. Нами
проведена поисковая работа по получению препарата Ср, обладающего активным
иммуномодулирующим эффектом (Добротина и др., 1998). На отдельных стадиях
биотехнологического процесса можно получить Ср неодинакового молекулярного
состава, что связано с различной очисткой белка, выходом форм Ср разной молекулярной массы, со стабилизацией препарата путем лиофильной сушки. Представляет интерес оценка функциональной активности Ср на разных стадиях биотехнологической очистки.
139
Установлено, что лиофилизация существенно изменяет молекулярное соотношение компонентов Ср, что обнаружено по профилям элюции Ср на сефадексе
G-200 образцов нативного Ср и лиофильно высушенного. Профиль элюции нативного Ср отличался меньшим количественным содержанием в нем высокомолекулярных компонентов. Профиль элюции после лиофилизации содержит дополнительный пик высокомолекулярных компонентов. В нативном препарате содержание Ср составляло 95.3±0.05%, высокомолекулярных компонентов – 4.7±0.05%, а
лиофилизированный содержал 84.3±0.08% Ср и 15.7±0.03% высокомолекулярных
компонентов. Лиофилизация оказывала влияние и на снижение активности Ср:
нативный препарат имел активность 17±2.2 усл. ед., а лиофильный – 9±1 усл. ед.
Но независимо от метода его производственного получения Ср сохраняет все
основные свойства.
С целью выявления антиоксидантной активности полученных препаратов Ср
проводили определение интенсивности ПОЛ в сыворотке крови здоровых людей с
последующим внесением в систему определения различного количества нативного и лиофилизированного Ср. Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови оценивали
по регистрирующему значению светосуммы (S). В норме уровень ПОЛ сыворотки
крови отмечался в пределах 20–22 ед. S (21.38±0.9). Добавление в систему определения нативного Ср снижает интенсивность ПОЛ, причем отмечено, что высокие концентрации Ср менее эффективны. Как видно из табл. 1, снижение ПОЛ
более существенно при добавлении Ср в концентрации 62.5 мкг/мл, оно приводит
к снижению ПОЛ на 22.4%, что статистически достоверно (р<0.001), т. е. в этой
концентрации антиоксидантные свойства Ср достаточно активно проявляются.
При увеличении добавляемой концентрации Ср в систему от 2 до 4 раз (концентрации 125–250.0 мкг/мл) антиоксидантная активность практически не увеличивалась, при этом уровень ПОЛ снижался только на 5.8–8.3%.
Антиоксидантные свойства сохраняются у Ср лиофильно высушенного в такой
же зависимости: меньшие концентрации проявляют более высокие антиоксидантные свойства; действие больших концентраций к достоверному снижению ПОЛ не
приводят (табл. 1).
При изучении влияния Ср на фагоцитарную активность клеток крови или выделенные нейтрофилы, информативным показателем фагоцитоза является
S-светосумма ХЛ-сигнала, по величине которой оценивают количество образованных активных форм кислорода, которое пропорционально бактерицидной и
фагоцитарной активности клеток. Важное значение имеет время наступления трех
максимальных вспышек ХЛ. Первая вспышка соответствует стадии адгезии, наступающей на 5–6 минуте регистрации ХЛ. Вторая вспышка отражает стадию
опсонизации – на 9–11 минуте. Самая максимальная вспышка на 20–22 минуте –
суммарный ответ.
Установлена линейная зависимость между интенсивностью фагоцитоза и вносимой в систему концентраций Ср (табл. 2). Под влиянием раствора Ср с концентрацией 300 мкг/мл происходило достоверное усиление фагоцитоза (на 48.3%).
При воздействии Ср с концентрацией 500 и 600 мкг/мл фагоцитарная активность
клеток крови возрастала на 87.2–88.5% (р<0.001). Нужно отметить, что в присутствии Ср изменялся характер кинетической кривой ХЛ. Ср оказывал торможение
на стадию адгезии в среднем на 10′, однако общий суммарный ответ резко усиливался. По-видимому, на первом этапе Ср выступает как антиоксидант, что и отражается на снижении ХЛ-сигнала. Спустя 9–12′ Ср встраивается в мембрану фаго140
цитов и начинает проявлять стимулирующее действие, усиливая активность ферментов «дыхательного взрыва».
Проведенные исследования установили антиоксидантное иммуномодулирующее действие Ср на фагоцитарную активность клеток крови. Действие препарата
имеет дозозависимый характер, сравнительно малые дозы Ср оказывают достаточно выраженный эффект. Ср может быть использован как препарат при лечении
патологических состояний, например, при ожоговой патологии с целью повышения активности антиоксидантной системы и стабилизации процессов перекисного
окисления липидов.
Таблица 1
Показатели свободнорадикальной активности сыворотки крови человека
под действием нативного церулоплазмина
Концентрация,
мкг/мл
Светосумма S (M±m)
62.5
125.0
250.0
Контроль
16.6 ± 8.1
20.2 ± 0.6
20.7 ± 0.6
21.4 ± 0.9
Показатели БХЛ
Достоверность, р
<0.001
<0.001
<0.001
Интенсивность
свечения
3.6 ± 0.2
4.4 ± 0.2
4.1 ± 0.1
4.5 ± 0.1
Таблица 2
Изменение светосуммы при ХЛ анализе фагоцитоза нейтрофилов
под влиянием Ср
Концентрация, мкг/мл
200
300
500
600
Контроль
S, имп. за 22′
530.5 ± 68.8
686.4 ± 63.1
866.5 ± 91.7
872.3 ± 101.3
462.7 ± 43.4
Достоверность, р
>0.05
<0.01
<0.001
<0.001
Важной закономерностью действия препарата Ср является зависимость от первоначального, базового, контрольного уровня иммуномодулирующих показателей.
В реакции ПОЛ следует учитывать не только концентрации экзогенного Ср, вносимого в опыте, но и естественный уровень в плазме крови. Метод биохемилюминесценции является достаточно информативным для изучения участия Ср в свободнорадикальных процессах. Исходя из регуляции ПОЛ, Ср выступает как антиоксидант. Его выраженная антиоксидантная способность наблюдается при значительном повышении уровня свободнорадикальных процессов: в этих реакциях он
проявляет себя как «ловушка радикалов». Ср в определенных дозах работает как
«активатор взрыва» фагоцитоза.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Минвуза Российской Федерации «Изучение биохимических механизмов иммуномодулирующей активности некоторых белков сыворотки крови и пептидов человека» (97-0-10.0-283).
141
ЛИТЕРАТУРА
Анастасиев В. В. Иммуноглобулин для внутривенного введения в терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Н. Новгород, 1998.
Бердинских Н. К., Савцова З. Д., Санина О. Л. и др. Антиоксидантное и иммуномодулирующее воздействия Ср при экспериментальной гриппозной инфекции // БЭБ и М. 1994.
№ 9. С. 285-287.
Добротина Н. А., Рутницкий А. Ю., Кузьмина Е. И. Иммуномодулирующая активность и полифункциональность церулоплазмина // Иммунология. 1998. № 5. С. 49.
Закирова А. Н., Мингазетдинова Л. Н., Камилов Ф. Х. и др. Антиоксидант Ср: влияние на перекисное окисление липидов, геморсологию и течение стенокардии // Тер. архив.
1994. Т. 66. № 9. С. 24-28.
Саенко Е. Л., Сиверина О. Б., Басевич В. В. и др. Кинетическое исследование оксидазной реакции Ср // Биохимия. 1986. Т. 51. Вып. 6. С. 1017-1022.
Сенюк О. Ф., Скоробокатько О. В., Тарасенко П. Д. и др. Исследования физиологических функций Ср человека // Биохимия. 1994. Т. 59. Вып. 10. С. 1503-1510.
142