Савинов Георгий Владимирович - Институт биоорганической
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) На правах рукописи Савинов Георгий Владимирович Структурно-функциональные исследования пептидомиметика N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина, поиск молекулярных мишеней 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2013 Работа выполнена в группе иммунохимии филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Научный руководитель: кандидат химических наук Ламан Александр Георгиевич, филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник группы иммунохимии Официальные оппоненты: доктор химических наук Шахпаронов Михаил Иванович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель группы мембранных биоэнергетических систем кандидат биологических наук Грановский Игорь Эдуардович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, заведующий лабораторией энзимологии генетических процессов Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Защита состоится «11» декабря 2013г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: ГСП-7, 117997, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Автореферат разослан «___» ____________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук Олейников В.А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Поиск новых регуляторов иммунной системы (активаторов) и особенно с адъювантной активностью является предметом исследования как представителей фундаментальной науки, чьи интересы лежат в области изучения процессов, связанных с развитием иммунных реакций, в том числе механизмов дифференцировки клеток иммунной системы, так и практических специалистов по вакцинам и аутоиммунным нарушениям. Это направление стало особенно актуальным в связи с созданием нового поколения вакцин, в которых используются не инактивированные бактериальные клетки или вирусные частицы, а полученные методами химического синтеза или молекулярной биотехнологии фрагменты антигенов, узнавание которых иммунной системой хозяина позволяет защитить организм от инфекции и при этом имеет минимальные побочные реакции. Как правило, такие вакцины слабо иммуногенны и требуются молекулы-помощники способные усилить и направить иммунный ответ. Это относится и к ДНК вакцинам. Необходимо отметить, что в современном понимании адъюванты - это не только соединения, активирующие гуморальный – антительный иммунный ответ, но и вещества, регулирующие клеточный иммунитет, способствуя созданию и возможности реализации пролонгированного ответа на антиген. Такой ответ невозможен без участия Т- и В- клеток памяти [Audibert et al., 2003]. Существующие в настоящее время адъюванты имеют значительные ограничения и недостатки, делающие необходимым поиск новых препаратов направленного действия с минимумом побочных реакций. Такими адъювантами, на наш взгляд, могут быть природные соединения – активаторы дендритных клеток, либо их аналоги, получаемые не только методом перебора структур известных соединений, часто и успешно используемого ранее, но и современными методами включающими поиски миметиков с помощью комбинаторной химии. Во многих лабораториях мира в качестве активаторов неспецифического иммунитета, иммунокорректоров и адъювантных препаратов активно исследуются фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий и синтетические аналоги этих фрагментов [Cipriano et al., 2003, Steiner, 2004]. В лаборатории иммунохимии ИБХ РАН были получены высокоспецифичные и высоко аффинные моноклональные антитела к ГМДП. Было показано, что один из типов рецепторов ГМДП имеет внутриклеточную локализацию [Golovina et al., 1999]. Используя моноклональные антитела против ГМДП и технику 3 пептидного фагового дисплея, в нашей лаборатории был найден 15-мерный пептид миметик-ГМДП [Ламан и др., 2007]. Пентадекапептид RVPPRYHAKISPMVN (RN-пептид) взаимодействует с моноклональными антителами Е6/1.2 против ГМДП и обладает адъювантной, но не пирогенной активностью, в отличие от ГМДП. Он также увеличивает экспрессию антигенов гистосовместимости II класса на поверхности макрофагов. Весьма часто миметики соединений оказываются более узко специфичными и более активными, чем исходное соединение [Monzavi-Karbashi et al., 2002]. Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлся поиск молекулярной мишени ГМДП с использованием его пептидного миметика RN-пептида. Для того чтобы достичь поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи: 1. Проанализировать функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида). 2. Провести анализ адъювантной активности RN-пептида. 3. 4. 5. Исследовать спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом по сравнению с ГМДП. Клонировать белок, взаимодействующий с RN-пептидом. Получить антитела против белка, взаимодействующего с RN- 6. пептидом для характеристики связывания. Определить Kd комплекса RN-пептида с данным белком и провести конкурентный анализ с целью исследовать взаимодействие RNпептида и ГМДП с одним и тем же белком и одним и тем же участком белка. Научная новизна работы. Впервые были проанализированы функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида). Впервые было показано, что спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом и ГМДП в целом совпадает, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства. Впервые был клонирован белок, взаимодействующий с RN-пептидом. В результате анализа первичной структуры клонированного белка была показана его идентичность белку YB-1 позвоночных. Было также показано, что ГМДП и RN-пептид конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка YB-1. Впервые к белку YB-1 получены рекомбинантные антитела с иcпользованием библиотеки scFv человека и мышиные моноклональные антитела. Впервые была показана колокализация ГМДП, NOD2 и YB-1 в одном компартменте клетки, что 4 позволяет сделать вывод о том, что белок YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП и его пептидного миметика RN-пептида. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75летию со дня рождения Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 2 в сборниках тезисов научных конференций. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы. Диссертация содержит 25 рисунков и 3 таблицы СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ RN-пептид представляет собой пентадекапептид: RVPPRYHAKISPMVN. Он не содержит кислых (Asp, Glu), но богат основными (Arg, Lys) аминокислотными остатками и остатками пролина. Особенно богата основными аминокислотными остатками и остатками пролина N-концевая часть пептида. Cконцевая половина содержит гидрофобные и нейтральные аминокислоты. 1. Данные Ala- scan и проверка адъювантной активности Для подробного выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в проявлении адъювантного эффекта и связывания с антителами были синтезированы аналоги RN-пептида с заменами аминокислотных остатков на остаток аланина (Ala-scan) (Рис.1). Для измерения адъювантной активности аланиновых вариантов RN-пептида использовали мышей линии BALB/С. В качестве иммуногена использовался овальбумин. Индекс адъювантности определяли как отношение титра антител против овальбумина после иммунизации животных в присутствии адъюванта к титру антител после иммунизации белком без адъюванта. 5 Рис.1. Адъювантная активность аналогов RN-пептида, полученных в результате Ala-scan. За 1 принимали титр сыворотки против овальбумина после иммунизации без адъюванта. Введение остатка Ala в положения 1, 3, 4, 5, 6, 9, 10 и 11 RN-пептида приводит к значительному снижению или потере адъювантной активности в диапазоне 1-10 мкг/животное. А5-модифицированый пептид проявляет адъювантную активность в дозе 100 мкг/животное, а А6-производное 10 и 100 мкг/животное. При замене остатка гистидина (H7) на аланин (A) адъювантная активность сохранялась в дозе 1 мкг/животное, но отсутствовала в больших дозах. Замена остатка валина на аланин (V2 → A) приводила к сдвигу максимума адъювантности до 10 мкг/животное, а V14 → A и N15 → A не влияли существенно на биологический эффект (рис. 1). Белки и пептиды могут быть нестабильными в клетке ввиду быстрого гидролиза, карбоксипептидазами. Исходя из полученных данных, очевидно, что С-концевые аминокислотные остатки RN-пептида можно модифицировать во избежание гидролиза карбоксипептидазами. Когда большая ароматическая группа (FITC) присоединилась к карбоксильному концу RN-пептида через остаток лизина, образовалось высокоактивное соединение проявляющая адъювантный индекс равный 17.7 при дозе 10 mkg/животное. Адъювантной активностью обладает и амидированный по С-концу RN-пептид. Гораздо более драматично влияние замены остатков аргинина на аланин (R1 → A и R5 → A). При замене R1 → A наблюдалось ингибирование образование антител против овальбумина в диапазоне 1 – 100 mkg/животное. Это может свидетельствовать о том, что он взаимодействует с мишенью in vivo, 6 но каким-то образом передача сигнала блокируется. Подобный эффект наблюдается для пептидов A5 и A9. Таким образом, можно предположить, что для формирования функционально-активной формы RN-пептида важны взаимодействия R1, R5 и K9 (положительно заряженные), а также I10 и M13. Таким образом, для проявления адъювантной активности RN-пептида необходимым является область RVPPRYH, а также K9, I10, S11 и M13. 3. Анализ адъювантной активности RN-пептида Мы проверили адъювантную активность пептида-миметика ГМДП в диапазоне концентраций от 1 нг до 100 мкг/животное. Полученные результаты продемонстрированы на рис. 2. Оказалось, что пептид обладает двумя пиками колоколообразной зависимости в дозах от 2 нг до 5 нг на животное (мышь весом 20 г) и в дозах от 100 нг до 100 мкг на животное. Наличие двух пиков адъювантной активности позволяет нам предположить, что RN-пептид в разных концентрациях связывается с разными типами рецепторов. Рис. 2. Адъювантная активность RN-пептида. 4. Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях Были проведены эксперименты по стимуляции лимфоцитов периферической крови человека. В опыте использовали RN-пептид в концентрациях 2 нг/мл, 10 мкг/мл и ГМДП в концентрации 10 мкг/мл. 7 Выбранные концентрации соответствовали концентрациям анализируемых веществ, в которых они проявляют биологическую активность. Определяли изменение концентраций лимфокинов, принимающих активное участие в гуморальном и клеточном ответе: фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), гамма-интерферон (γ-INF), интерлейкин-1 (IL-1), IL-4 и IL-10. Увеличение уровня секреции именно этих лимфокинов характерно для ГМДП. Результаты представлены в таблице 1. Табл.1. Уровень секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека при стимуляции RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях. После 18 часов стимуляции обнаруживалось значительное возрастание концентрации TNF-α в случае ГМДП и RN-пептида при концентрации 10 мкг/мл и незначительная продукция в случае концентрации RN-пептида 2 нг/мл. Через 24 часа продукция TNF-α увеличивалась при концентрации RN-пептида 10 мкг/мл, а при концентрации RN-пептида 2 нг/мл уменьшалась до фонового уровня. Через 48 часов TNF-α детектировался лишь в случае пептида 10 мкг/мл. Аналогичная картина характерна и для γ-INF, за исключением того, что при дозе пептида 2 нг/мл через 24 часа концентрация γ-INF составляла 200пкг/мл. Наиболее выраженной оказалась стимуляция IL-4. Через 18 часов его концентрация вырастала до 160 пкг/мл, а к 48 часу снижалась до 100 пкг/мл. В случае ГМДП максимальная концентрация IL-4 составляла 140 пкг/мл. Для RNпептида, как и для ГМДП характерна стимуляция синтеза IL-1, причем пептид и в дозе 10 мкг/мл и 2 нг/мл вызывает возрастание концентрации IL-1 до 150 пкг/мл, как и ГМДП. Однако, в отличие от ГМДП, RN-пептид и не стимулирует секрецию IL-10. 8 Таким образом, спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом и ГМДП, в целом схож, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства. В настоящее время в литературе нет данных о пептидах, мимикрирующих мурамилпептиды, однако молекулярные механизмы действия последних интенсивно изучаются. На клеточном уровне в ответ на обработку мурамилпептидами происходит стимуляция синтеза TNF-α и IL-1 макрофагами и индукция синтеза γ-INF Т-клетками [Monzavi-Karbassi, et al., 2002]. Одновременно синтезируется также IL-12. Далее продуцируется еще ряд лимфокинов, что, в частности, приводит к повышению экспрессии антигенов MHC-II, созреванию В-клеток и продукции IgG. Вероятно, в механизм адъювантного действия вовлечена активация NOD2 и NF-kB [Meshcheryakova et al., 2007]. При этом основными субклассами секретируемых Ig является IgG1 и IgG2b, как и в случае с RN-пептидом. Под действием мурамилпептидов периферические лимфоциты крови секретируют TNF-α, IL-1-β, IL-10 [Beynon et al., 2008]. При действии мурамилпептидов на NK-клетки индуцируется синтез γINF, являющегося индуктором синтеза IgG2b [Athié-Morales et al., 2008]. Вообще для мурамилпептидов характерна активация NOD2 и индукция IL-1-β и TNF-α. В случае RN-пептида по сравнению с ГМДП стимуляция IL-1-β более выражена, стимуляция γ-INF на таком же уровне, а IL-10 вовсе не индуцируется. Видимо, в отличие от мурамилпептидов, в частности ГМДП, имеющего множество мишеней действия, RN-пептид действует более избирательно и активирует не все пути клеточного ответа. Oтсутствие пирогенного эффекта у RN-пептида в отличие от ГМДП может быть связано с пониженной активацией пирогенных лимфокинов, в частности TNF-α, в ответ на обработку клеток пептидом. В целом полученные нами результаты хорошо согласуются с данными мировой литературы. Однако в настоящее время общепризнанным является лишь участие NOD2 в реализации воздействия мурамилпептидов на клетки. Предполагается, что в дальнейшем в процесс передачи сигнала вовлекается NF-kB. 6. Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП В связи с тем, что биологические свойства ГМДП и RN-пептида близки, мы предположили, что они взаимодействуют с одним и тем же рецептором, и тогда RN-пептид можно использовать в качестве зонда для поиска рецептора ГМДП. 9 При анализе экспрессирующих библиотек необходимо большое количество рекомбинантных клонов. Поэтому мы решили сначала обогатить препарат РНК целевыми последовательностями мРНК. Для этого мРНК выделяли из фракции РНП, обогащенной полисомами, синтезирующими предполагаемый рецепторный белок. Рис.3 Схема выделения полисом с использованием аффинной хроматографии Полисомы выделяли с помощью аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным RN-пептидом (рис. 3). На рисунке представлена принципиальная схема выделения полисом с использованием аффинной хроматографии. В основе применения аффинной хроматографии для выделения полисом, синтезирующих рецепторный белок, лежит предположение о том, что белок становится доступным для взаимодействия с RN-пептидом еще до того, как синтез белковой молекулы на рибосоме будет завершен. Поэтому дополнительным фактором, обеспечивающим успех экспериментов по использованию полисом, было естественное котрансляционное приобретение белком свойственной ему конформации. Данные о том, что модификация Сконца существенно не влияет на биологическую активность пептида, а Nконцевая последовательность важна для функционирования, позволило нам 10 проводить аффинную хромотографию полирибосом, выделенных из макрофагальной мышиной линии WEHI3, непосредственно на пептиде, который был синтезирован с использованием гидрофильного носителя TENTА-GEL сразу после снятия защитных групп с боковых остатков аминокислот пептида. Образовавшиеся комплексы RN-пептида с целевыми последовательностями разрушали с помощью гуанидинтиоцианата. После аффинной хроматографии мы применили стратегию синтеза кДНК, схематически представленную на рисунке 4. Эта схема позволяет максимально использовать кэпированные и полиаденилированные мРНК для поиска лиганда RN-пептида. В основе этого подхода лежит удаление кэп-структуры с помощью пирофосфатазы, присоединение «якоря» на место удаленной кэп-структуры и далее синтез кДНК с последующей ее ПЦР-амплификацией. Рис. 4: Выделение и амплификация кДНК на основе полноразмерных мРНК. 1 – полноразмерная матрица; 2 – матрица у которой отсутствует полиаденилированнный участок; 3 - матрица у которой отсутствует кэпструктура; 4 - матрица у которой отсутствует и полиаденилированнный участок, и кэпструктура. Фрагменты ДНК, кодирующие белок, пептидом, были лигированы с вектором pHEN-1 рестрикции SfiI и NotI. Условия лигирования чтобы ее эффективность составляла не 11 взаимодействующий с RN(Pharmacia Biotech) по сайтам подбирались таким образом, менее 90% по данным электрофоретического анализа продуктов. Для клонирования был использован штамм E.coli TG1 с эффективностью трансформации не менее 109 к.о.е. на 1 мкг pHEN-1. Была получена библиотека представленностью 105 клонов. Библиотека была рассеяна на чашки Петри с плотностью 200 колоний на чашку диаметром 9 см. Был проведен скрининг библиотеки на среде 2хYT, содержащей 1мМ IPTG. После лизиса колоний в парах хлороформа детекцию проводили с использованием биотинилированного по С-концу RN-пептида. Всего было проанализировано 20000 независимых клонов. Клоны, давшие наиболее яркий сигнал, использовались для дальнейшего анализа. Типичная картина скрининга приведена на рисунке 5. Рис.5 Нитроцеллюлозный фильтр – реплика, проявленная с помощью биотинилированного RN-пептида. На рисунке 5 стрелками указаны колонии, давшие наиболее яркий сигнал, которые были отобраны для дальнейшего анализа. 7. Данные анализа первичной структуры. Были отобраны клоны, дававшие наиболее выраженный сигнал, а также «подозрительные» клоны. По данным секвенирования ДНК оказалось, что около 20% отобранных клонов составляют белки «домашнего хозяйства» и при повторном скрининге не давали положительного сигнала. Оставшиеся клоны кодировали высокогомологичные или идентичные белковые последовательности. 12 Исходя из данных структурного анализа кДНК, было показано, что белок, взаимодействующий с RN-пептидом, идентичен Y-box-связывающему белку (YB-1) позвоночных. Один из 5 отобранных клонов кодировал полноразмерный белок YB-1, а остальные - различные укороченные варианты YB-1. Представленность мРНК большинства белков, за исключением мРНК, кодирующих белки «домашнего хозяйства», составляет 0,1 – 0,01% от общего репертуара мРНК. В нашем случае предполагаемое обогащение было не менее 200х. На рисунке 6 показана гомология белка, взаимодействующего с RNпептидом, с мышиным Y-box-связывающим белком. YB-1 принадлежат к доменному семейству белков холодового шока и участвуют в контроле транскрипции и трансляции. Рис.6. Структура белка YB-1 и кДНК, показывающие степень сродства отдельных клонов (Cl) и гомологию их нуклеотидов (nt) и аминокислотных последовательностей (aa) с кодирующими последовательностями мышиного YB-1. A/P-домен аланин/пролин-богатый домен; CSD - домен холодового шока в YB1; CTD – С-концевой домен 8. Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа При определении Kd желательно, чтобы взаимодействие белок-лиганд происходило в растворе. Поэтому для детекции образовавшегося комплекса необходимы антитела против YB-1. С этой целью были получены рекомбинантные scFv с использованием наивной библиотеки scFv человека с репертуаром 6х109 [Ulitin et al., 2005]. После проведения двух раундов аффинной селекции были отобраны положительные клоны, которые были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга (рис.7). Чувствительность полученных scFv в фаговом формате составляла 5 нг YB-1 в миллилитре. В непрямом иммуноферментном анализе чувствительность 13 5 нг/мл является высокой. Работа по получению антител проводилась совместно с группой регуляции биосинтеза белка (Институт белка РАН, г.Пущино). Рис.7. Иммуноблоттинг рекомбинантного YB-1 с использованием При определении константы диссоциации этого белка использовался метод непрямого иммуноферментного анализа ELISA (рис. 8). Рис. 8. Схема иммуноферментного анализа для определения Kd 14 Нами было показано, что модификация С-концевой аминокислоты RNпептида не влияет на его биологическую активность. Напротив, модификация N-концевой части пептида приводит к потере биологической активности. Поэтому для определения константы аффинности мы использовали биотинилированный по С-концу RN-пептид. Взаимодействие пептида с YB-1 происходило в растворе, что обеспечивало корректность определения Kd. Далее образовавшийся комплекс взаимодействовал с сорбированным на иммунопланшет стрептавидином. Детекцию комплекса YB-1-RN-пептид осуществляли с использованием моноклональных фаговых scFv и конъюгата пероксидазы хрена с антителами против фага М13. В качестве хромогена использовался ортофенилендиамин. После окраски с помощью хромогена интенсивность окраски измеряли при длине волны λ=492 нм. Константа диссоциации комплекса оказалась равной 4x10-9 (рис. 9) Рис. 9: Определение константы связывания RN-пептида с YB-1. Концентрация YB-1 - 150нг/мл Раститровка RN-пептида от 50 нг/мл Величина Kd составила 4x10-9 При проведении исследования конкуренции ГМДП и RN-пептида за связывание с клонированным белком были получены данные, что при концентрации 2х10-8М ГМДП вытесняет RN-пептид из комплекса с антителами на 50% при концентрации RN-пептида 1,6х10-9М (рис. 10). Таким образом RN15 пептид и ГМДП конкурируют за связывание с белком YB-1 в молярное соотношении 1:12. Это говорит о том, что RN-пептид и ГМДП конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка YB-1. Такой характер конкуренции дает основания предполагать, что данный белок участвует в реализации биологической активности как ГМДП, так и RN-пептида. Рис. 10.Конкурентный анализ RN-пептида и ГМДП. Концентрация пептида – 6 нг/мл Раститровка ГМДП от 150 нг/мл Концентрация YB-1 – 1 мкг/мл Белок YB-1 участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 выполняет свои функции как в цитоплазме, так и в клеточном ядре. YB-1 – это ДНК- и РНК-связывающий белок, который проявляет свойства шаперона нуклеиновых кислот, а также взаимодействует с большим количеством других белков. Связываясь с нуклеиновыми кислотами, YB-1 принимает участие практически во всех ДНК- и мРНК-зависимых процессах, включая репликацию и репарацию ДНК, транскрипцию, сплайсинг и 16 трансляцию мРНК. Он упаковывает и стабилизирует мРНК, а также осуществляет глобальную и специфическую регуляцию экспрессии генов на разных уровнях [Eliseeva et al, 2011]. Поскольку содержание YB-1 сильно возрастает в раковых клетках, этот белок рассматривается в качестве одного из наиболее ярких маркеров злокачественных опухолей. Переходя из цитоплазмы в клеточное ядро, YB-1 активирует транскрипцию генов ряда защитных белков, в том числе и белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость клеток. Вовлекаясь в процесс репарации ДНК в ядре, YB-1 также повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации. Поэтому ядерная локализация YB-1 является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости раковых клеток. Повышение концентрации YB-1 в цитоплазме препятствует онкогенной трансформации клеток по PI3K/Akt-киназному сигнальному пути, и вместе с тем, оно может способствовать превращению дифференцированных эпителиальных клеток в мезенхимальные, обладающие повышенной миграционной активностью. Это благоприятствует распространению клеток по организму и метастазированию опухолей. Таким образом, YB-1 может служить в качестве маркера метастазирования раковых опухолей в отдаленные органы. YB-1 участвует в иммунных процессах. Он способен секретироваться наружу клетки [Frye et al., 2009]. Семейство белков NF-kB (ядерный фактор-каппа B) включает в себя набор факторов транскрипции, являющихся главными регуляторами иммунных и воспалительных процессов в ответ на травмы и инфекции. В латентном состоянии, белки NF-kB находятся в цитозоле в неактивной форме. После стимуляции рецепторов, ответственных за протекание иммунных реакций, таких как Toll-подобных рецепторов или NLR-белков (например, NOD2), происходит ряд событий, приводящих высвобождению белков NF-kВ для ядерной транслокации и активации транскрипции генов, ответственных за активацию иммунитета [Ghosh et al., 1990]. Исходя из данных о том, что YB-1 способен секретироваться наружу клетки, а в ответ на стимуляцию Nod2 происходит индукция ядерного фактора NF-kB, индукция которого и запускает иммунные реакции [Ghosh et al., 2002], мы решили проанализировать изменение уровня экспрессии белков NF-kB1, NFkB2 и самого Nod2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду. 17 9. Изменение уровня экспрессии белка NF-kB2 в ответ на добавление RNпептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду. Рекомбинантный YB-1 инкубировали с клетками моноцитарномакрофагальной мышиной линии WEHI3 в присутствии или в отсутствие ГМДП или RN-пептида. ГМДП использовали в концентрации 10 мкг/мл. Концентрации RN-пептида соответствовали пикам адъювантной активности миметика - 3 нг/мл и 1 мкг/мл. YB-1 добавляли в концентрации 1 мкг/мл. Для определения уровня транскриптов был использован метод ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR). Оказалось, что ГМДП и RN-пептид не активируют экспрессию мРНК NOD2 и NF-kB1(р105), но увеличивают уровень экспрессии белка NF-kB2. Необходимо отметить, что активация NF-kB-опосредованного пути довольно быстро приводит к изменению локализации комплексов NF-kB. Но это не всегда связано с синтезом соответствующих мРНК. Кроме того, известно, что реализация альтернативного пути активации клеток иммунного ответа занимает более продолжительное время, нежели реализация классического пути иммунного ответа [Ghosh et al., 2002]. Необработанные клетки слабо экспрессируют мРНК NF-kB2 (рис.11, линии 4 и 5), в то время как и RN-пептид (в обеих концентрациях), и GMDP активируют индукцию синтеза мРНК NF-kB2 (рис. 11, линии 2, 6 и 7). Добавление же только YB- 1 не приводило к усилению индукции синтеза мРНК NF-kB2 (рис. 11, линия 3). Важно отметить, что совместное добавление GMDP и YB-1, а также RN-пептида (в концентрации 3 нг/мл) и YB-1 в культуральную среду приводит к заметному увеличению уровня индукции синтеза мРНК NFkB2 (рис.11, линия 1 и 8). В случае совместного добавления в культуральную среду RN-пептида (в концентрации 1 мкг/мл) происходит уменьшение уровня мРНК NF-kB2 (рис.11, линия 9). Совместное действие ГМДП, RN-пептида и YB-1 позволяет утверждать, что образование комплекса между ГМДП и YB- 1, а также между RN-пептидом и YB-1, опосредует биологическую активность ГМДП и RN-пептида. 18 Рис. 11. Индукция NF-kB2 с помощью ГМДП, RN-пептида и YB-1 1 – RN (3 нг/мл) + YB-1 (1 мкг/мл); 2 – RN (3 нг/мл); 3 – YB-1 (1 мкг/мл); 4, 5 – контроль; 6 – ГМДП (10 мкг/мл); 7 – RN (1 мкг/мл); 8 – ГМДП (10 мкг/мл) + YB-1 (1мкг/мл); 9 – RN (1 мкг/мл) + YB-1 (1 мкг/мл) Белок NOD2 участвует в активации как врожденного, так и адаптивного иммунитета, а ГМДП и RN-пептид усиливают индукцию синтеза мРНК NF-kB2, отвечающего за активацию адаптивного иммунного ответа. Мы предположили, что ГМДП, RN-пептид и YB-1 могут быть локализованы в одном компартменте клетки. Для подтверждения этого предположения мы решили установить локализацию ГМДП, YB-1 и NOD2 с помощью конфокальной микроскопии. 10. Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2. Для анализа внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2 были получены поликлональные антитела с использованием конъюгатов иммуногенных пептидов Nod2 с альбумином и овальбумином. Пептиды белка NOD2 были подобраны (http://www.sequilab.org): с помощью набора программ Sequilab 1. К15Е – KANGLAAFLLQHVRE 2. К10Т – KAEPHNLQIT В нашей лаборатории совместно с группой регуляции биосинтеза белка (Институт белка РАН, г. Пущино) были получены моноклональные антитела к белку YB-1. Данные антитела были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга (рис. 12). 19 Рис. 12 Иммуноблот-анализ моноклональных антител против YB-1 RLL, HeLa, 3T3 - лизаты клеток соответствующих линий Полученные моноклональные антитела и их комбинации обладали высокой специфичностью в иммуноблот-анализе, что позволяет использовать их в иммуноцитохимических исследованиях. Для установления внутриклеточной локализации NOD2, ГМДП и YB-1 использовались дендритные клетки, выделенные из костного мозга мыши линии AC57BL/6. Дендритные клетки являются антиген-представляющими клетками (АРС), которые играют важную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа. Основной функцией дендритных клеток является презентация антигенов Т-клеткам. Они захватывают антигены, процессируют их и представляют на своей поверхности совместно с главными комплексами гистосовместимости первого и второго класса. Кроме того дендритные клетки контролируют дифференцировку Т-лимфоцитов и регулируют активацию и супрессию иммунного ответа. С помощью конфокальной микроскопии были получены следующие результаты. С использованием флуоресцентно меченного ГМДП (ГМДП-LysFITC) и поликлональных антител против NOD2 было установлено, что ГМДП и NOD2 находятся в одном и том же компартменте клетки (рис.13, панель A). С помощью флуоресцентно меченных антител против YB-1 и антител против белка NOD2 была показана совместная локализация YB-1 и NOD2 (рис.13, панель B). Также была показана колокализация ГМДП и YB-1 внутри клетки с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител против YB1 и ГМДП-Lys-FITC (рис.13, панель C). Таким образом, нами было показано, что NOD2, ГМДП и YB-1 локализованы в одном компартменте клетки (рис. 24). 20 Полученные нами результаты показывают, что YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП. Характер колокализации дает основания предположить, что белок YB-1 является первичным рецептором ГМДП и передача сигнала сопровождается образованием тройного комплекса между YB1, ГМДП и NOD2. Рис.13. Внутриклеточная колокализация ГМДП, Nod2 и YB-1 (A) ГМДП и Nod2: 1 – Hoechst окраска ядер; 2 – ГМДП-Lys-FITC; 3 – AlexaFluor 555-anti-Nod2; 4 – наложение 1-3. (B) YB-1 и Nod2: 5 – Hoechst окраска ядер; 6 – FITC-anti-YB-1; 7 – AlexaFluor 555-anti-Nod2; 8 – наложения 5-7. (С) ГМДП и YB-1: 9 – Hoechst окраска ядер; 10 – ГМДП Lys-FITC; 11 – AlexaFluor 555-anti-YB-1; 12 – наложения 9-11 Наши результаты хорошо сочетаются с результатами, описанными в мировой литературе. В сентябре 2013 г. вышла статья, в которой YB-1 называется ранним и центральным медиатором бактериального и стерильного воспаления in vivo [Hanssen et al., 2013]. 21 ВЫВОДЫ: 1. Проанализированы функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида). Для проявления адъювантной активности RN-пептида необходимыми компонентами являются область RVPPRYH, а также лизин (K-9), изолейцин (I-10), серин (S-11) и метионин (M-13). Модификация C-концевой аминокислоты не влияет на биологическую активность. 2. RN-пептид стимулирует синтез лимфокинов в культуре клеток периферической крови человека. Спектр лимфокинов, индуцируемых RNпептидом и ГМДП, в целом совпадает, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства. 3. Был клонирован белок, взаимодействующий с RN-пептидом. В результате анализа первичной структуры клонированного белка была показана его идентичность белку YB-1 позвоночных. 4. К YB-1 получены рекомбинантные антитела с иcпользованием библиотеки scFv человека и мышиные моноклональные антитела. 5. Определена Kd RN-пептида по отношению к YB-1, величина Kd составила 4x10-9. Показано, что ГМДП и RN-пептид конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка. Была показана колокализация ГМДП, NOD2 и YB-1 внутри клетки. 6. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что белок YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП и его пептидного миметика RNпептида. 22 Публикации автора по теме диссертации Статьи: 1. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Савинов Г.В., Бровко Ф.А.; Метод получения адъювантно активных пептидов-миметиков GMDP с использованием моноклональных антител и комбинаторных библиотек пептидов в формате фагового дисплея // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2010, том 36, № 1, с. 141–148 2. Laman A.G., Shepelyakovskaya A.O., Boziev Kh.M., Savinov G.V., Baidakova L.K., Chulin A.N., Chulina I.A., Korpela T., Nesmeyanov V.A., Brovko F.A.; Structural modification effects on bioactivities of the novel 15-mer peptide adjuvant. // Vaccine. 2011 Oct 13;29(44):7779-84. 3. Shepelyakovskaya A.O., Laman A.G., Lomonosova A.V., Fursova K.K., Savinov G.V, Vertiev Y.V., Brovko F.A., Grishin E.V.; Effect of the format of antibodies on their specificity. // Mol Immunol. 2011 Dec;49(3):433-40 Тезисы конференций: 4. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Савинов Г.В., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А.; «Поиск пептидомиметиков с помощью комбинаторных пептидных библиотек в формате фагового дисплея» // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009) 5. Ламан А.Г., Савинов Г.В., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Бровко Ф.А., Родионов И.Л., Чулин А.Н., Елисеева И.А., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П., Лябин Д.Н., Свирщевская Е.В., Иванов В.Т. ; «Пептидный миметик ГМДП и его молекулярные мишени» // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г.) 23
