ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ EGF И VEGF У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО И ЯИЧНИКОВ Н.Н.Чакова1, Е.П.Михаленко1, Е.Н.Шлома2, Э.В. Крупнова1, Ю.Е.Демидчик2, Н.В.Чебатарева1, А.А.Жилко3 1 Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск Белорусский государственный медицинский университет, г.Минск 3 Минский городской клинический онкологический диспансер, Минск 2 Целью данной работы было изучение полиморфизма G+405С в гене VEGF и полиморфизма А+61G в гене EGF у больных раком легкого и яичников. Обнаружена ассоциация изучаемых полиморфизмов и клинических характеристик опухолей. Ключевые слова: рак легкого, рак яичников, гены EGF и VEGF EGF AND VEGF GENE POLYMORPHISMS IN LUNG AND OVARIAN CARCINOMAS N.N.Chakova, E.P.Mikhalenko, E.N.Shloma, E.V.Krupnova, Yu.E.Demidchik, N.V.Chebotareva, A.A.Zhilko The aim of the study was to investigate polymorphism G+405C in VEGF gene and polymorphism A+61G in EGF gene for lung cancer and ovarian carcinomas patients. The impact of mentioned polymorphisms on clinical characteristics of tumors was revealed. Key words: lung cancer, ovarian carcinomas, EGF and VEGF genes 1 ВВЕДЕНИЕ Ежегодно в мире диагностируется более 10 миллионов больных первичными злокачественными новообразованиями [1]. Рак яичников и карциномы легкого представляют собой наиболее частые и в большинстве случаев трудноизлечимые опухолевые заболевания [2 – 6]. Несмотря на усовершенствование уже имеющихся и внедрение новых методов диагностики, в 60-80% случаев эти заболевания выявляются в III-IV стадии [7, 8], что в свою очередь, негативно сказывается на прогнозе. В настоящее время огромное число фундаментальных исследований сфокусировано на поиске генетических маркеров предрасположенности к возникновению карцином для осуществления ранней диагностики, с одной стороны, и выявлении факторов, позволяющих прогнозировать развитие заболевания и оптимизировать методы лечения [9 – 11]. К настоящему моменту накоплено множество данных, подтверждающих участие факторов роста, в частности VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и EGF (эпидермальный фактор роста), ответственных за митогенную активность злокачественных перспективными клеток, новообразований мишенями при в развитии и, и прогрессировании следовательно, использовании Зарубежными исследователями обнаружены являющихся таргетной терапии. функционально значимые полиморфизм G+405С в гене VEGF [12] и полиморфизм А+61G в гене EGF [13]. EGF представляет собой один из лигандов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), экспрессирующегося на поверхности как нормальных, так и трансформированных эпителиальных клеток и являющегося решающим трансмембранным тирозин-киназным рецептором в регуляции клеточного роста и дифференцировки. EGF/EGFR взаимодействие – функционально важный аутокринный путь, который является промотором развития опухоли. Повышенная экспрессия EGF усиливает инвазию и метастазирование опухоли, запуская целый каскад внутриклеточных процессов, 2 инициирующих клеточную пролиферацию и ряд других биологических эффектов, ответственных за опухолевую прогрессию: адгезию и инвазию трансформированных клеток, включение антиапоптотических механизмов [14, 15]. EGF может также индуцировать процессы опухолевого ангиогенеза за счет гиперэкспрессии VEGF [16, 17], который представляет собой гликопротеин и является одним из самых важных стимуляторов ангиогенеза в разнообразных по характеристикам здоровых и поражѐнных раком тканях [18]. Свои функции VEGF выполняет через тирозин-киназные рецепторы, расположенные в мембране эндотелиальных клеток. Целью данной работы было изучение влияния полиморфизма генов EGF и VEGF на риск возникновения и развития рака легкого и яичников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование включено 79 больных РЛ и 36 больных РЯ, проходивших лечение в Минском городском клиническом онкологическом диспансере. По результатам гистологического исследования у 49 (62,0%) больных РЛ установлен плоскоклеточный РЛ, у 23 (29,1%) – аденокарцинома, в 7 (8,9%) случаях – мелкоклеточный РЛ. Все случаи заболеваний РЛ были классифицированы по системе TNM в соответствии с требованиями Международного Противоракового Союза (UICC, версия 2002 года). Распределение больных по стадиям было следующим: I стадия – 44 (55,6%) пациента, II стадия – 6 (7,7%), III стадия – 20 (25,3%) и IV стадия – 9 (11,4%). Преобладающим гистологическим вариантом РЯ был серозный тип, установленный в 23 (63,9%) случаях, муцинозная аденокарцинома выявлена у 3 (8,3%) больных, эндометриоидная – у 6 (16,7%), светлоклеточный рак – у 2 (5,6%), другие виды – у 2 (5,6%) пациенток. При оценке степени распространения опухоли по классификации FIGO, в 28 (77,8%) наблюдениях выявлена III и IV стадия заболевания. 3 Сопутствующие заболевания диагностированы у большинства онкологических больных. У всех больных чаще всего встречались болезни сердечно-сосудистой системы, на втором месте у пациенток с РЯ были заболевания желудочно-кишечного тракта, а у больных РЛ – заболевания органов дыхания. Контрольная группа была представлена выборкой из 124 человек без онкологических заболеваний (49 мужчин и 75 женщин), проживающих в г. Минске. Для элиминации влияния факторов, заведомо изменяющих вероятность развития заболевания, при формировании контрольных групп был использован метод направленного подбора с учетом возраста, пола, статуса курения, профессиональной принадлежности. Исследование полиморфизма генов EGF (А+61G) и VEGF (G+405С) проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа. Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли методом Mathew [19]. Для амплификации гена EGF использовали праймеры и условия ПЦР, предложенные Shahbazi et al [13]. Полученные фрагменты амплификации длиной 242 п.н. обрабатывали эндонуклеазой AluI. Генотипы, выявляемые в ходе анализа гена EGF, идентифицировали по длине полученных в ходе рестрикции фрагментов: GG (193 п.н.), GA (193 п.н.+102 п.н.+ 91 п.н.), AA (102 п.н.+ 91 п.н.) (рисунок 1). 4 Рисунок 1. – Электрофореграмма фрагментов амплификации полиморфных аллелей гена EGF: 1 – до рестрикции; 2,3,4 – после обработки рестриктазой AluI Праймеры для амплификации VEGF взяты из работы Lee et al. [20], условия ПЦР подбирались экспериментально. Для определения G+405С полиморфизма амплифицированные фрагменты длиной 273 п.н. подвергали рестрикционному расщеплению эндонуклеазой BsmFI. Продукты рестрикции фракционировали в 2,2% агарозном геле с бромистым этидием и визуалировали в УФ-свете. Генотипы VEGF идентифицировали по длине полученных в ходе рестрикции фрагментов: GG (166 п.н. + 107 п.н.), GC (273 п.н. + 166 п.н.+ 107 п.н.), CC (273 п.н.) (рисунок 2). Рисунок 2. – Электрофореграмма фрагментов амплификации полиморфных аллелей гена VEGF: 1 – до рестрикции; 2,3,4 – после обработки рестриктазой BsmFI Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ “Statistica for Windows 6.0”. РЕЗУЛЬТАТЫ Результаты генотипирования EGF у больных с различными гистологическими вариантами РЛ представлены в таблице 1. Анализ данных показал отсутствие достоверных различий по частоте встречаемости 5 генотипов между группой больных РЛ и контролем. Однако было обнаружено, что количество носителей генотипа АА в группе больных (17,7%) в 1,7 раза ниже, чем в контрольной группе (29,0%), а у больных плоскоклеточным РЛ этот генотип встречался еще реже (12,2%), при этом отличие от контроля было достоверным (χ2=5,91, р<0,05). Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей гена EGF у больных РЛ Группа GG Генотип GA Аллель AA G A Больные РЛ, n=79 24 (30,3%) 41(52,0%) 14 (17,7%) 89(56,3%) 69 (43,7%) Плоскоклеточный, n=49 17(34,6%) 26(53,2%) 6(12,2%)* 60 (61,2%) 38 (38,8%) Аденокарцинома,n=23 4(17,6%) 12(52,1%) 7(30,4%) 20 (43,4%) 26 (56,6%) Мелкоклеточный, n=7 3(43%) 3(43%) 1(14%) 9 (64,0%) 4 (56,0%) Контроль, n=124 34 (27,4%) 54(43,5%) 36(29,0%) 122 (49,2%) 126 (50,8%) Примечание: * – р < 0.05, р – уровень значимости различий по критерию 2 в сравнении с контрольной группой Интересные данные были выявлены у больных аденокарциномой: генотип АА встречался с той же частотой, что и в контроле, а вот процент носителей генотипа GG (17,6%) был снижен в 1,5 раза по сравнению с контролем (27,4%). Полученные данные, вероятно, указывают на то, что формирование определенного гистологического типа опухоли, в частности плоскоклеточного рака легкого или аденокарциномы, в какой-то мере обусловлено генотипом EGF. Действительно, среди носителей генотипа GG плоскоклеточная форма РЛ была выявлена у 81% пациентов, в группе больных с генотипом GА такой гистологический тип обнаруживался у 68%, и только у 56% больных с генотипом АА была диагностирована эта форма РЛ (рисунок 3). 6 Кол-во больных, % 100 80 60 40 20 0 GG GA плоскоклеточный РЛ AA аденокарцинома Рис. 3. Влияние генотипа на вероятность развития гистологической формы РЛ Можно предположить, что вероятность заболеть какой-либо формой из двух находится в зависимости от генотипа: у больных с генотипом GG вероятность возникновения плоскоклеточной формы рака в 4 раза выше, чем аденокарциномы (χ2=13,05, р=0,0003), при генотипе GA вероятность заболеть плоскоклеточным раком легкого или аденокарциномой соответствует пропорции 2:1 (χ2=7,93, р=0,048), при наличии генотипа АА возможность заболеть той или иной формой становится равновероятной (χ2=0,08, р=0,7). Однако обнаруженные тенденции носят все же предварительный характер, и требуют более тщательной проверки. Оценка зависимости размера опухоли от генотипа показала, что в целом в группе больных РЛ с размером опухоли менее 3 см (индекс Т1 по классификации ТNM) частота носителей генотипа АА (25%) была в 2 раза выше, чем у пациентов с размером опухоли более 3 см (12%) (рисунок 4). Кол-во больных,% 70 60 50 40 30 20 10 0 GG GA размер опухоли < 3 см AA размер опухоли > 3 см 7 Рисунок 4. – Частота распределения генотипов у больных РЛ с различным размером опухоли Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии полиморфизма А+61G гена EGF на предрасположенность к возникновению РЛ, и некоторые клинические характеристики опухоли и согласуются с результатами других исследователей. Из литературных источников известно, что мононуклеарные клетки с генотипом АА in vitro продуцируют достоверно меньший уровень эпидермального фактора роста, чем клетки, имеющие аллель G [13]. Показано также, что при ряде опухолей эпителиальной природы, в частности при раке печени и кишечника, пациенты с генотипом АА имели меньший уровень экспрессии EGF в тканях по сравнению с пациентами, имеющими генотипы GG и GA [21, 22]. Меньший уровень экспрессии EGF при наличии генотипа АА, по-видимому, и обеспечивает протективное действии данного генотипа в предрасположенности к возникновению РЛ и в отношении прогноза развития заболевания. В настоящий момент нами начато изучение генетического полиморфизма EGF у больных РЯ. Данные результатов генотипирования EGF в этой группе пациентов представлены в таблице 2. Таблица 2. – Распределение частот генотипов и аллелей гена EGF у больных РЯ Группа Больные РЯ, n=36 Контроль, n=75 GG 9 (25,0%) Генотип GA 23 (63,9%) 23 (30,7%) 33 (44,0%) Аллель AA 4 (11,1%) G 41(56,9%) A 31 (43,1%) 19(25,3%) 79 (52,6%) 71 (47,4%) Частота генотипов распределилась следующим образом: GG – 25,0%, GA – 63,9%, АА – 11,1%. Количество носителей генотипов GG и GA у больных злокачественной карциномой яичников (88,9%) была несколько выше, чем в контрольной группе (74,7%), а частота встречаемости носителей 8 благоприятного генотипа АА в группе больных была в 2,2 раза ниже по сравнению с контрольной. При этом у больных с III-IV стадией заболевания генотип GG встречался в 2 раза чаще, чем у больных на ранних стадиях развития опухоли. Таким образом, при сравнение частоты встречаемости генотипов у больных РЯ с контрольной группой, были обнаружены те же тенденции, что и у больных РЛ. Одним из основных факторов выживания и распространения опухолевых клеток является ангиогенез. Ключевую роль в формировании новой сосудистой сети при развитии опухоли играет семейство эндотелиальных факторов роста сосудов – VEGF [18]. Появление новых сосудов способствует прогрессированию заболевания, увеличивая темпы роста опухоли и ее способность к метастазированию. Оценка ангиогенеза опухоли является важной для прогнозирования течения болезни и назначения химиотерапии при многих злокачественных опухолях. Анализ данных по генотипированию VEGF (позиция G+405С) у больных раком легкого, представленный в таблице 3, не выявил различий в распределении частоты встречаемости генотипов GG/GС/СС гена VEGF между группой пациентов (0,31:0,56:0,13) и контролем (0,31:0,53:0,16). Однако существовали заметные различия в распределении генотипов между группами больных плоскоклеточным раком легкого и аденокарциномой: среди больных с аденокарциномой генотип GG встречался в 2 раза чаще, чем у пациентов с плоскоклеточным РЛ, а носителей генотипа СС у больных аденокарциномой в нашей группе обследованных пациентов не было обнаружено. Было также показано, что генотип СС встречается в 2 раза чаще у больных РЛ с наличием метастазов (N1-3) по сравнению с пациентами, имеющих опухоли без метастазов (N0). Таблица 3. – Распределение частот генотипов и аллелей гена VEGF у больных РЛ Группа GG Генотип GC Аллель CC G C 9 Больные РЛ, n=39 Плоскоклеточный, n=25 Аденокарцинома, n=11 Мелкоклеточный,n=3 Контроль, n=55 I-II стадии, n=27 III-IV стадии, n=12 N0, n=26 N1-3, n=13 12 (30,8%) 6 (24,0%) 6 (54,5%) 0 17(31%) 9 (33,4%) 3 (25%) 9(34%) 3 (23%) 22 (56,4%) 14 (56%) 5 (45,5%) 3 (100%) 29(53%) 14(51,8%) 8 (66,8%) 13 (50%) 9 (70%) 5(12,8%) 5 (20%) 0 0 9(16%) 4 (14%) 1 (8,2%) 4 (16%) 1 (7%) 46 (59,0%) 26 (52,0%) 17 (77,2%) 3 (50,0%) 63(57%) 32 (59%) 14 (58%) 31 (59%) 15 (57%) 32 (41,0%) 24 (48,0%) 5 (22,8%) 3 (50,0%) 47 (43%) 22 (41%) 10 (42%) 21 (41%) 12 (43%) Данные молекулярного анализа гена VEGF у больных РЯ представлены в таблице 4. Распределение частот встречаемости генотипов GG/GС/СС гена VEGF было следующим: в группе пациентов – 0,45:0,52:0,03, в контроле – 0,31:0,58:0,11. Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей гена VEGF у больных РЯ Группа Больные раком яичников, n=33 Контроль, n=26 I-II n=7 III-IV n=25 Генотип GG GC CC 15(45,5%) 17(51,5%) 1(3,0%) G C 47(71,2%) 19(28,8%) 8(30,8%) 1(14%) 14(56%) 31(59,6%) 21(40,4%) 8(57%) 6 (43%) 38 (76%) 12 (24%) 15(57,7%) 3(11,5%) 6(86%) 0 10(40%) 1(4%) Аллель Было выявлено, что частота встречаемости носителей генотипа СC у больных злокачественной карциномой яичников (3%) была ниже, чем в контрольной группе (11,0%), а частота встречаемости носителей генотипа GG в группе больных была в 1,5 раза выше по сравнению с контрольной. При этом у больных с III-IV стадией заболевания генотип GG встречался в 4 раза чаще, чем у больных с I-II стадиями развития опухоли. Обнаруженные тенденции носят предварительный характер в связи с недостаточным количеством обследованных больных, однако они не противоречат результатам других исследователей [23 – 27]. Результаты нескольких работ выявили отсутствие ассоциации полиморфизма в позиции +405 гена VEGF с возникновением некоторых вариантов рака, включая РЛ 10 [23] и РЯ [25], однако показали его влияние на степень дифференцировки опухоли у больных меланомой [26], раком простаты [27], раком молочной железы [24], а также на выживаемость у больных РЛ и РЯ. Обнаруженное влияние полиморфизма в области +405 на развитие опухолевого процесса может быть обусловлено различиями в экспрессии VEGF у индивидов с разными генотипами. Watson et al. [12] в своих исследованиях показал, что наибольший уровень экспрессии белка VEGF был в мононуклеарных клетках периферической крови с генотипом GG, промежуточный уровень – в клетках с генотипом GС и наименьший – в клетках с генотипом СС. Имеются также сведения, что повышенный уровень экспрессии VEGF чаще наблюдается у больных с опухолями высокой степени злокачественности. Таким образом, проведенное исследование подтверждает функциональную значимость полиморфизмов G+405С в гене VEGF и А+61G в гене EGF в отношении прогноза развития РЛ и РЯ. В дальнейшем планируется изучение уровня экспрессии VEGF в тканях больных раком яичника для оптимизации лечении, т.к. VEGF считается важной терапевтической мишенью противоопухолевой терапии [18]. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Эпидемиология злокачественных новообразований в Беларуси / И.В. Залуцкий [и др.] – Минск: Зорны верасень, 2006. – 207с. 2. Давыдов, М.И. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных новообразований в 2005г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель // Вестник российского онкологического цента имени Н.Н, Блохина РАМН. – 2007. – том 18, №2 (прил. 1). – С. 90 – 136. 3. Up-Regulated Expression of Cytoplasmic Clusterin in Human Ovarian Carcinoma / Dan Xie [et al] // Cancer. – 2005. – Vol. 103, № 2. – P. 277 – 283. 4. Podratz, K. Advanced Ovarian Cancer: Surgical Management / К. Podratz, G. Aletti, W. Cliby // International congress «Ovarian cancer», Krakow, 18-21 11 June 2008 / Jagellonian University Faculty of Medicine; А. Basta. – Krakow, 2008. – Р. 7 – 8. 5. Ethnic Differences in Survival among Women with Ovarian Carcinoma / Jill S. Barnholtz-Sloan [et al] // Cancer. – 2002. – Vol. 94, № 7. – P. 1886 – 1893. 6. Клиническая онкология: справ. пособие / С.З. Фрадкин [и др.]; под ред. С.З. Фрадкина, И.В. Залуцкого. – Минск: Беларусь, 2003. – 784 с. 7. Опухоли женской репродуктивной системы / В. В. Баринов [и др.]; под общ. ред. М. И. Давыдова, В. П. Летягина, В. В. Кузнецова. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 376 с. 8. Давыдов, М.И. Заболеваемость злокачественными новообразованиями населения России и стран СНГ в 2005г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель // Вестник российского онкологического цента имени Н.Н, Блохина РАМН. – 2007. – том 18, №2 (прил. 1). – С. 52 – 89. 9. Бахидзе, Е.В. Значение методов исследований генома для диагностики и терапии рака яичника / Е.В. Бахидзе, А.В. Малек // Вопросы онкологии . – 2005. – Том 51, № 2. – С. 173 – 181. 10.Малек, А.В. Поиск генов-мишений для диагностики и терапии рака яичника / А.В. Малек, Е.В. Бахидзе // Вопросы онкологии. – 2005. – Том 51, №2. – С. 182 – 186. 11.Озолиня, Л.А. Перспективы ранней диагностики рака эндометрия и яичников / Л.А. Озолиня // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2005. – Том 5, №1. – С.32 – 35. 12.Identification of polymorphism within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production / C.J. Watson [et al] // Cytokine. – 2000. – Vol. 12. – P. 1232 – 1235. 13.Association between functional polymorphism in EGF gene and malignant melanoma / M. Shahbazi [et al] // Lancet. – 2002. – Vol. 359. – P. 397 – 401. 14.Bridges, A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of 12 tyrosine kinases / A.J. Bridges // Curr. Med. Chem. – 1999. – Vol. 6. – P. 825 – 843. 15.Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies / D.S. Salomon [et al] // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 1995. – Vol. 19. – P. 183 – 232. 16.Woodburn, J.R. The epidermal growth factor receptor and its inhibition in cancer therapy / J.R. Woodburn // Pharmacol. Ther. – 1999. – Vol. 82. – P. 241 – 250. 17.Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors / N. Ferrara, H.P. Gerber, J. Le Couter // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 669 – 676. 18.Mathew, C.C. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA / C.C. Mathew // in Walker JMNJ (ed): Methods in Molecular Biology, Clifton: Human Press, 1984. – Vol. 2. – P.31-34. 19.Vascular Endothelial Growth Factor Gene Polymorphisms and Risk of Primary Lung Cancer / S.J. Lee [et al] // Canc. Epid. Biom. and Prev. – Vol. 14. – P. 571 – 575. 20.Epidermal Growth Factor Gene Functional Polymorphism and the Risk of Hepatocellular Carcinoma in Patients With Cirrhosis / K.K. Tanabe [et al] // JAMA. – 2008. – Vol. 299, N 1 – P. 53 – 60. 21.Epidermal growth factor (EGF) A61G polymorphism and EGF gene expression in normal colon tissue from patients with colorectal cancer / K.L. Spindler [et al] // Acta Oncol. – 2007 – Vol. 46, N 8. – P. 1113 – 1117. 22.VEGF polymorphisms and survival in early-stage non-small-cell lung cancer / R.S. Heist [et al] // J. Clin. Oncol. – 2008. – Vol. 26, N 6. – P. 856 – 862. 23.Vascular endothelial growth factor polymorphisms in relation to breast cancerdevelopment and prognosis / Q. Jin [et al] // Clin. Cancer Res. – 2005. – Vol. 11, N 10. – P. 3647-3653. 24.Vascular Endothelial Growth Factor Gene Polymorphisms Are Associated with Prognosis in Ovarian Cancer / L.A. Hefler [et al] // Clin. Cancer Res. -2007. – Vol. 13. – P. 898 – 901. 13 25.Influence of vascular endothelial growth factor single nucleotide polymorphismson tumour development in cutaneous malignant melanoma / W.M. Howell [et al] // Genes. Immun. – 2002. – Vol. 3, N 4. P. 229 – 232. 26.Association of VEGF genetic polymorphisms with prostate carcinoma risk and clinical outcome / S. Sfar [et al] // Cytokine. – 2006. – Vol. 35, N 1 – 2. – P. 21 – 28. 14