Файл целиком - Кафедра генетики, биотехнологии, селекции и
advertisement
Резюме проекта (НИР, ОКР/ОТР), выполняемого/выполненного в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007 – 2013 годы» по этапу № 2 Номер контракта: 14.518.11.7043 Тема: «Проведение научно-исследовательских работ по поиску новых источников соле- и засухоустойчивости зерновых культур методами сравнительной и функциональной геномики с использованием УСУ «Комплекс для проведения междисциплинарных исследований в области сравнительной и функциональной геномики растений»» Приоритетное направление: Живые системы Критическая технология: Геномные, протеомные и постгеномные технологии Период выполнения:19 июля 2012 г. – 24 июля 2013 г. Плановое финансирование проекта: 2,4 млн. руб Бюджетные средства - 2,4 млн. руб., Внебюджетные средства - 0 млн. руб. Исполнитель: ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева Ключевые слова: злаковые культуры, солеустойчивость, засухоустойчивость, отдаленная гибридизация, пшенично-пырейные гибриды, молекулярные маркеры, DREB, Nax, PLUG, ISSR, RAPD, SSR 1. Цель исследования, разработки 1.1. Целью данного проекта является: используя мировой научный потенциал и накопленные в Научно образовательном центре молекулярной биотехнологии на базе УСУ «Комплекс для проведения междисциплинарных исследований в области сравнительной и функциональной геномики растений» знания и опыт работы по геномике растений и ДНКтехнологиям, осуществить поиск новых источников повышения соле- и засухоустойчивости у злаковых культур для практического применения полученных результатов в агропромышленном комплексе РФ 1.2. Целью так же является выявить новых доноров факторов устойчивости к абиотическим факторам присутствующим у дикорастущих сородичей пшеницы, что в итоге позволит повысить степень устойчивости злаковых культур к засухе и засолению почв. Выявление и понимание генетических механизмов увеличение степени устойчивости к засухе позволит осуществлять направленное улучшение этого показателя, как методами традиционной селекции, так и путем отдаленной гибридизации и трансгеноза. Повышения общего уровня устойчивости злаковых культур к засухе и засолению почв позволит расширить спектр земель пригодных для сельскохозяйственного использования и повысить стабильность получения урожаев в зонах с риском возникновения засухи. 2. Основные результаты проекта Проведены исследования и осуществлен анализ по дифференциации солеустойчивости у образцов пшенично-пырейных гибридов с использованием УСУ. Группировку образцов: образцы 1876, Тулайковская золотистая, ЗП-26, 2087 может быть как устойчивым при одних условиях, так и терять устойчивость при других условиях засоления. Номера Лютесценс 715, Тулайковская 100, 5542 встречаются только среди устойчивых образцов на 100-150 μM. Образец ППГ 4015 во всех проведенных экспериментах был в группе лидеров по показателям солеустойчивости. Образцы М3202, 5542, 548 и Лютесценс 715, Тулайковская 100 в отдельных опытах показывали высокие степени устойчивости к засолению. Следовательно, эти образцы могут служить донорами солеустойчивости для пшеницы. Проведены исследования и осуществлен анализ по дифференциации засухоустойчивости у образцов пшенично-пырейных гибридов с использованием УСУ. На основании попадания в группу 1 (относительно устойчивые), а так же абсолютных и относительных показателей приведенных в разделе, можно выделить образцы М-12, ЗП-26, 2087 и 5542, показавшие более высокую адаптивность к условиям дефицита влаги. При этом образец 5542 является наиболее выдающимся из них. С учетом того, что данный образец создавался и подвергался искусственному и естественному отбору в условиях Нечерноземной зоны (не испытывающей, как правило, водного дефицита), то потенциал, заложенный в нем, огромен. Перенос генетических факторов обеспечивающих его засухоустойчивость в сорта селекции зон дефицита влаги позволит создать сорта устойчивые, как в воздушной так и почвенной засухе. Проведены исследования и осуществлен анализ по молекулярно-генетической оценке образцов пшенично-пырейных гибридов дифференцированных по соле- и засухоустойчивости с помощью различных систем молекулярных маркеров. В ходе проведение исследований по молекулярно-генетической оценке образцов пшенично-пырейных гибридов дифференцированных по соле- и засухоустойчивости с помощью систем молекулярных маркеров PLUG нами было протестировано 23 молекулярных маркера. Из них 11 оказались информативны в выделение и дифференциации различных типов пырейных хромосом у ППГ. Образцы ППГ по маркерам PLUG, а соответственно и по типу имеющихся у них пырейных хромосом, можно разделить на несколько групп близких друг к другу. Группа 1. Образцы серии тулайковские (Лютесценс 715, Тулайковская 10, Тулайковская золотистая, Тулайковская 100). Группа 2. Образцы ППГ – 1876, 548, М3202. Так же к ним близок образец 2087 вариативный по 2 и 5 гомеологичной группе пырейных хромосом. Группа 3. Образцы ППГ ЗП-26, М-12 и 4044. К ним близок образец 5542, расщепляющийся по 2, 4 и 6 гомеологичным группам. Группа 4. Образец 4015, стоящий особняком от всех остальных образцов и выделяющийся по типу своих пырейных хромосом определенных с помощью системы PLUG. В результате анализа коллекции пшенично-пырейных гибридов и пшениц по RAPD-, ISSR, iPBS-маркерам для каждого образца есть возможность выявить уникальные бэнды амплифицирующиеся только у него. Данные бэнды могут быть ассоциированы с локусами засухо- или солеустойчивости. Так же есть бэнды позволяющие провести группировку сортов кластерным анализом. Нами был произведен кластерный анализ через расчет отдаленности по Дайсу. Можно выделить три больших кластера. Кластер 1 – образцы серии Тулайковские кластеризующие близко с пшеницами. Кластер 2 – образцы 1876, 548 М3202, 2087 и 4015, подразделяющиеся внутри на два достаточно отдаленных подкластера. Кластер 3 – 5542, ЗП-26, 4082, 4044 и несколько отстоящий от них образец М-12. Выявлены потенциальные молекулярные маркеры, связанные с генами и генетическими системами пырейного происхождения, обеспечивающими повышения соле- и засухоустойчивости в геномах злаков с помощью методов ассоциативной генетики. Были получены частичные нуклеотидные последовательности для генов-кандидатов DREB пырейного происхождения. В общей сложности с разных пар праймеров было получено: для Thinopyrum ponticum – 10 гаплотипных последовательностей; Thinopyrum intermedium – 6 гаплотипных последовательностей; для Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria spicata, Pseudoroegneria stipifolia – по одной последовательности. У всех полученных гаплотипных последовательностей по сравнению с пшеницей и друг с другом наблюдались в основном только SNP различия. Что свидетельствует о высокой консервативности данного типа генов у злаков. Несмотря на наличие лишь SNP различий, судя по литературным данным, они могут приводить к существенному усилению или ослаблению реакции растения на абиотические стрессы. Нами были разработаны два CAPS маркера, P18F/P18R/FokI и Р22F/PRa/PvuII позволяющие отличить гены-кандидаты DREB пырейного происхождения от DREB генов мягкой пшеницы в их присутствии. Анализ изучаемых образцов ППГ показал, что в 10 образцах (5542; 2087; 548; 1876; 4082; ЗП-26; М 3202; 4044; 4015; М12), присутствует генкандидат DREB пырейного происхождения. У образца М-12 был обнаружен аллель гена DREB пшеничного происхождения, отличный от пшеничных генов у всех остальных изучаемых образцов. В ходе выполнения работ нами были получены частичные нуклеотидные последовательности для генов-кандидатов NAXTh пырейного происхождения. В общей сложности с разных пар праймеров было получено: для Thinopyrum ponticum – 9 гаплотипных последовательностей; Thinopyrum intermedium – 10 гаплотипных последовательностей. На основе полученных нуклеотидных последовательностей нами были разработаны два STS-маркера (Nax1_3F/R, Nax2_1F/R) и один CAPSмаркер (Nax2_2F/R/FokI) позволяющие отличить гены-кандидаты солеустойчивости пшеничного и пырейного происхождения при их совместном присутствии. С помощью разработанных нами молекулярных маркеров были проанализированы изучаемые образцы ППГ. Было установлено, что образцы 2087, М12 и 4015 несут ген-кандидат NAXTh. У образцов 5542, 1876, 4082 было выявлено расщепление по данному признаку. Ген-кандидат NAXTh выявленный у образца 2087 отличался от генов-кандидатов выявленных у других образцов. В результате проведенного анализа с помощью молекулярного маркера Nax1_3F/R было выявлено, что у образцов ППГ 2087 и 4015 присутствует ген-кандидат NAXTh. У двух образцов (5542 и 4082) наблюдалось расщепление. С помощью праймеров CK2050775 были получены частичные нуклеотидные последовательности генов-кандидатам «potassium transporter » пырейного происхождения (PTK+_Th). Данные праймеры могут быть рекомендованы, как STS-маркер для отличия генов пшеницы и пырея при их одновременном присутствии. Образцы ППГ были проанализированы с помощью микросателлитного маркера gwm312, сцепленного с геном Nax1, и выделено две группы образцов по аллельным вариантам данного маркера 3. Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках исследования, разработки На данном этапе выполнения НИР создание РИД не предусмотрено 4. Назначение и область применения результатов проекта 1) Выявленные образцы, выдающиеся по показателям солеустойчивости, могут быть использованы, как доноры в селекции по этому признаку. 2) Выявленные образцы, выдающиеся по показателям засухоустойчивости, могут быть использованы, как доноры в селекции по этому признаку. 3) Созданные молекулярные маркеры могут быть использованы в маркерассоциированной селекции на соле- и засухоустойчивость, что позволит значительно сократить время направленного переноса этих признаков в коммерческие сорта. 4) Полученные частичные нуклеотидные последовательности генов DREB-типа, Nax-типа и PTK+_Th могут быть использованы в фундаментальных исследованиях для понимания функционирования для данных типов генов и эволюции злаков, так и в прикладном аспекте для создания широкого спектра молекулярных маркеров. 5. Эффекты от внедрения результатов проекта Эффект от внедрения на данном этапе выполнения НИР не предусмотрен. 6. Формы и объемы коммерциализации результатов проекта Коммерциализация на данном этапе выполнения НИР не предусмотрена И.о. ректора ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева В.И. Нечаев Руководитель Центра молекулярной биотехнологии Г.И. Карлов М.П.
