FISH-анализ как метод определения хромосомных

FISH анализ как метод FISH‐анализ
как метод
определения хромосомных аберраций (возможности и б
й(
области применения)
р
)
Пилип Л.Я. Л.Я.
(зав. лабораторией цитогенетики, Клиника Репродуктивной Медицины «Надия»)
• FISH (fluorescence in situ hybridization) молекулярно‐цитогенетический метод; был разработан в 1980‐х для определения наличия или отсутствия последовательностей ДНК на хромосоме Преимущества FISH
Преимущества FISH
Эффективность, быстрота и относительная простота метода FISH
относительная простота метода FISH
делают его полезным инструментом для диагностики хромосомных аномалий как в й
постнатальном, так и в пренатальном
периоде, включая предимплантационный
•
•
•
•
Типы проб для FISH
Центромерные ‐ CEP
Теломерные ‐ Tel
Пробы на всю хромосому‐ WCP
Пробы на всю хромосому
Локус‐специфические ‐ LSI
Centromeric (satellite) probes
Locus specific p
probes
Whole chromosome Whole
chromosome
painting probes
Области применения FISH
Области применения FISH
Предимплантационная
генетическая диагностика
• Предимплантационный
генетический скрининг (определение анеуплоидий хромосом й
13,15,16,17,18,21,22,X,Y)
• Предимплантационная
генетическая диагностика (
(исследование дериватных хромосом у носителей хромосомных перестроек)
Пренатальная диагностика
• Скрининг основных анеуплоидий некультивированных клеток амниотической й
жидкости
• Уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследования
Постнатальная диагностика
• Уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследования
• Скрининг анеуплоидий сперматозоидов
• Исследование сегрегации хромосом у носителей й
структурных перестроек
• Исследование природы маркерных хромосом
• Исключение сложных перестроек ‐ тройных и более сложных транслокаций, инсерций
• Исследование хромосомных перестроек в онкогематологии
• Диагностика солидных Д
д
опухолей
Пример использования FISH в онкологии
• Характеристика чувствительности рака молочной железы к химиопрепаратам (герцептин)
Хромосома
17
Ген
Her2
Нормальная клетка
Клетка с полисомией
177
Амплификация
диагностируется при
соотношении количества
копий гена Her2 к
количеству
центромер(хромосом) 17
Клетка с амплификацией Her2
>2,2
© Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011
Паттерны гибридизации с пробами Her2/CEP17
A
B
C
D
E
F
© Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011
Хромосомные перестройки у супружеских пар с бесплодием
Транслокации – наиболее частые структурные хромосомные перестройки, определяемые у супружеских пар с бесплодием, поскольку фенотипически не проявляются у носителей
Типы транслокаций
р
Робертсоновские транслокации
46,XY,der(13;14)(q10;q10)
Частота 0 12 %*
Частота 0,12 %
Реципрокные транслокации
46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)
Частота 0 14%*
Частота 0,14%
*Nielsen, J. and Wohlert, M. (1991) Chromosomes abnormalities found among 34 910 newborn children: results from 13‐year incidence study in Aarhus, Denmark. Hum. Genet., 87, 81–83.
Схема распределения хромосом в гаметах носителей транслокаций
В мейозе I дериватные
хромосомы и их нормальные гомологи могут сегрегировать с образованием б
несбалансированных гамет Последствия:
•Бесплодие
•Невынашивание
•Мертворождение или ранняя детская смертность
•Рождение
Рождение детей с детей с
хромосомными аномалиями
Huret JL, Leonard C, Savage JRK . Chromosomes, Chromosome Anomalies. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May, 2000 Подтверждение/уточнение результата кариотипирования
•
•
•
Пациент 1970 г.р.
Олигоастенотератозооспермия
У супружеской пары одно спонтанное у ру
р д
прерывание беременности в 12 нед.
Кариотип –
45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)
C‐banding
GTG‐banding
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с использованием метода FISH
использованием метода FISH
Tel5p
Tel5q
T l5 SO
Tel5p SO
CEP15 (satellite III) SO
CEP15 (α‐satellite) SA
5
Tel5p SO
Tel5qSG
Tel5qSG
15 der(5;15)
15
5
der(5;15)
Результат стандартного цитогенетического
исследования ‐
45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)
45,ХУ,der(5;15)t(q35.3; q10)
CEP15
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)
р (
, y
)
8
8
15
12
3
17
21
12
22
11
9
9
22
13
10
5
14
18
6
X
14
18
20
19
7
10
20
16
1
4
11
13
16
19
3
15
1
21
17
2
2
6
4
5
7
X
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)
7
10
10
10
5
5
7
q24
13
2
2
20
20
13
13
q14
46,XX,?t(10;13)
46,XX,t(10;13)(q24;14)
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)
X
q13.3
19
q27
46,XX,der(19)?t(19;?)
46,Х,t(X;19)(q27;q13.3)
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования
р
р
с использованием WCP‐проб р
(OctoChrome,Cytocell)
Кариотип пациента:
46,XY,?t(6;10)
11
9
9
22
22
d (6)
der(6
11
5
7
7
10
der(11)
10
5
der(6)
der(10)
X
Y
6
Установление происхождения маркерных хромосом
Маркерная хромосома представляет собой изохромосому по
коротким плечам с центромерным участком 21 хромосомы.
Многоцветная FISH в постанатльной и пренатальной
диагностике позволяет (с учетом результатов позволяет (с учетом результатов
стандартного цитогенетического исследования)
• подтвердить наличие хромосомной перестройки; й
й
исключить наличие более сложной перестройки у носителей реципрокных транслокаций;
р ц р
р
ц ;
• выявить или подтвердить хромосомы, вовлеченные в перестройку;
• уточнить точки разрыва хромосом;
• определить происхождение маркерных хромосом;
р д
р
д
р р
р
Использование метода FISH для исследования уровня анеуплоидий сперматозоидов
анеуплоидий сперматозоидов
18
Х
18
Y
Y‐ несущий сперматозоид
Х – несущий сперматозоид
18
Х
Анеуплоидные сперматозоиды
X
Y
Y
Y
18
Х
18
Дисомия хромосом 18,Х
18
18,Х,Y
18,Y,Y
С
Скрининг анеуплоидий хромосом сперматозоидов (n=350)
й
( 350)
Результаты спермограммы
К‐во пациентов с повышенным уровнем анеуплоидий сперматозоидов,%
нормозооспермия
6,5%
астенозооспермия
23,8%
олигоастенотератозооспермия
78,3%
Пациентам с повышенным уровнем анеуплоидий рекомендовано проведение ИМСИ
рекомендовано проведение ИМСИ (интрацитоплазматическая инъекция морфологически отобранных сперматозоидов)
x200
ICSI
x6300
IMSI
Исследование сегрегаций хромосом у носителей структурных перестроек методом FISH
Уровень хромосомных аномалий у носителей транслокаций варьирует от 18 до 82%,
в зависимости от типа перестройки и хромосом, вовлеченных в перестройку
Кариотип пациента
46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)
2
17
der(2)
der(17)
27,3% сбалансированных сперматозоидов ‐ прогноз для проведения цикла ICSI/IMSI/PGD
Сигнал
% сперм а
тозоидов
д
27,3
Хромосомный дисбаланс (ожидаемый)
Сбалансированный набор
AOOG
2,17 или der(2), der(17)
AOG
17, der(2)
23,9
Делеция 2q31‐2qter, дупликация 17р13‐17pter
AOOOG
2 der(17)
2, der(17)
16,2
Дупликация 2q31‐2qter,
Дупликация 2q31
2qter, делеция
делеция 17р13
17р13‐17pter
17pter
AO
der(17)
5,9
Делеция 2pter‐2321, делеция 17р13‐17pter
GOO
2
6,8
Моносомия 17
GO
der(2)
1,7
Делеция 17p13‐17qter, делеция 2q31‐2qter
A
17
0,9
Моносомия 2
Другие комбинации
Другие комбинации
17,3
Другие несбалансированные наборы
Исследование сегрегаций хромосом у носителей количественных аномалий методом FISH
количественных аномалий
методом FISH
Кариотип 47,XYY
Олигоастенотератозооспермия
47,XYY
Х
Y
XY
YY
XX
XXY
XYY
43.7
44.8
0.88
4.7
0.3
0.1
‐
11.5% аномалий половых хромосом + ~3% диплоидных сперматозоидов
Результаты ПГД; кариотип супруга 47,XYY
Прогноз: 14% анеуплоидных сперматозоидов
Цикл IMSI/PGD
ET 2‐хх эмбрионов
ET 2
эмбрионов
Наступила беременность ‐ двойня
Эмбрион
пол
13
18
21
комментарии
1
ХХ
2
2
2
Normal ET
2
ХХ
2
2
2
Normal ET 3
ХХ
2
1
1
18,21 monosomy
4
XY
2
2
2
Normal Cryo
5
XX
2
2
3
21 t i
21 trisomy
6
XX
2
2
2
Normal Cryo
7
XXX
3
3
3
triploid
p
Использование метода FISH в предимплантационной
генетической диагностике
• На сегодня ПГД – единственный возможный способ
выявления хромосомных нарушений у эмбрионов.
эмбрионов
• 56% морфологически нормальных эмбрионов женщин
после 35 имеют хромосомные аномалии.
Показания для проведения предимплантационной
генетической диагностики (PGD)
•
Наличие подтвержденных
подтвержденных структурных хромосомных перестроек
Показания для проведения предимплантационного
генетического скрининга (PGS)
• Возраст женщины, проходящей IVF, более 37 лет
• Бесплодие неустановленной й
этиологии
• Многократные неудачные попытки IVF
• Привычное невынашивание
беременности невыясненной р
этиологии
• Высокая частота анеуплоидий сперматозоидов (тяжелые формы
сперматозоидов (тяжелые формы мужского бесплодия)
• Наличия в анамнезе беременности или рождения ребенка с
или рождения ребенка с хромосомной патологией
¾ циклов ПГД ¾ циклов
ПГД – скрининг анеуплоидий
Вопросы:
1. Что биоптировать?
2 Как фиксировать?
2.
3. Сколько хромосом анализировать?
хромосом анализировать?
4. Как учитывать результаты?
5. Какие зонды использовать?
Что биоптировать и сколько?
• Биопсия 1 и 2 полярного тельца • Биопсия бластомера (6‐8 клеток, 3‐ее сутки)
3
сутки)
• Трофэктодермальная биопсия бластоцисты (5
(5‐6
6 сутки)
сутки)
Биопсия бластомера
Биопсия бластомера
Е
Если биопсия бластомера ‐
б
б
б
биопсия ОДНОГО бластомера !!!
ОДНОГО б
!!!
Сколько хромосом анализировать?
Сколько хромосом анализировать?
Наиболее частые анеуплоидии на стадии 8 клеток
22, 16, 21, 15
«Синдромальные» анеуплоидии
13, 18, 21, XY
Минимальный стандарт 8 хромосом: хромосом:
13,15,16,18,21,22,XY
ESHRE PGD consortium best practice guidelines for fluorescence in situ hybridization –based PGD //Human Reproduction. ‐ 2010
Варианты преимплантационного генетического скрининга методом FISH
5
5 хромосом (13,18,21,XY) (13 18 21 XY)
• 28‐31% анеуплоидий 9 хромосом (13,15,16,17,18,21,22,XY) • 70
70‐72%
72% анеуплоидий
анеуплоидий
12 хромосом (8,13,14,15,16,17,18,20,21,22,XY) • 79‐80% анеуплоидий
Munne s. et al. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes // Fertility Sterility 2010. – Vol. 94
Как учитывать результаты FISH исследования на одной клетке?
•
1.
2.
3.
Критерии:
Размер сигнала
Интенсивность сигнала
Расстояние между сигналами
Обязательно 2 исследователя
X
21
21
13
13
Y
18
Использование NRR (no result rescue)
NRR – дополнительный раунд гибридизации с использованием пробы для той же хромосомы, но другого типа, желательно, другого цвета
NRR позволяет снизить частоту сомнительных результатов с 7,5% до NRR
позволяет снизить частоту сомнительных результатов с 7 5% до
3,1%
Технические ограничения метода FISH при проведении ПГС
проведении ПГС – Ограниченное
Ограниченное количество флуорохромов
количество флуорохромов
анализ ограниченного количества хромосом ( до 9‐12, “gold standard”) (13,15,16,17,18,21,22,X,Y)
– Наслоение сигналов, расщепление сигналов, низкая ,р щ
,
эффективность гибридизации, нарушения процесса фиксации бластомеров до 6‐10% эмбрионов
без диагностики
– Отсутствие возможности определить мозаицизм при работе с одной клеткой 34
Исспользования метода многоцветной FISH в пренатальной диагностике
1. уточнение/подтверждение результатов д р
ц
стандартного цитогенетического исследования;
2. «скрининговый» экспресс‐анализ анеуплоидий хромосом 13,18,21,XY на интерфазных ядрах некультивированных ядрах некультивированных
клеток амниотической жидкости;
Использование метода FISH для экспресс‐скрининга
анеуплоидий в пренатальной диагностике
анеуплоидий в пренатальной
21
21
13
Сроки стандартного кариотипирования
Сроки
стандартного кариотипирования – 21 день
21 день*
На практике – 10‐14 дней
13
21
AneuVysion ,Vysis
Vysis
LSI 21 SO, LSI 13 SG
X
Y
Скрининг анеуплоидий хромосом 13,18,21,X,Y (80% хромосомной патологии, определяемой пренатально) методом FISH – 24‐48 часов.
*МОЗ України. Стандарти аналізу препаратів хромосом людини (методичні рекомендації). – Київ 2003
18
18
AneuVysion ,Vysis
CEP 18 SA,, CEP X SG,, CEP Y SO
Пренатальная диагностика микроделеционных синдромов методом FISH
Комплекс сндромов CATCH 22
К
CATCH 22
(DiGeorge/Velo‐Cardio‐
Facial/ShprintzenSyndrome)
микроделеция
Ограничение метода: диагностика проводится на конкретную патологию, и не позволяет исключить аномалию в неисследуемых
у
уучастках. Для качественной Д
дифференциальной диагностики требуется значительная библиотека зондов
Использование метода FISH для исследования анеуплоидий клеток ворсин хориона неразвивающихся беременностей
Стандартное кариотипирование
Патология кариотипа
~ 45%
Низкая митотическая активность культуры клеток/ отсутствие жизнеспособных клеток ‐‐‐‐‐кариотип не получен
Патологии не обнаружено
~20% Привычное невынашивание
беременности
FISH (8 хромосом)
13,15,16,18,21,22,XY
~40%
Обнаружено анеуплоидии хромосом
анеуплоидии хромосом 13,15,16,18,21,22,XY
Исследование кариотипа
кариотипа родителей
~35%
~60%
Анеуплоидии не
не обнаружено
aCGH
Заключение
FISH служит полезным инструментом для д
диагностики хромосомных аномалий р
как в постнатальном, так и в пренатальном
периоде, включая доимплантационный
р д
д
ц
Современный уровень развития метода FISH
позволяет быстро и с высокой точностью идентифицировать практически любые аномалии кариотипа
• Н
На сегодня FISH –метод, позволяющий проводить FISH
й
скрининг предимплантационных эмбрионов по наиболее частым анеуплоидиям.
наиболее частым анеуплоидиям.
• Предимплантационная генетическая диагностика генетическая диагностика
методом FISH позволяет проводить исследование анеуплоидий хромосом, но не дает полного представления о кариотипе и не позволяет исключить мозаицизм.
Спасибо за внимание
l.pylyp@ivf.com.ua
www.ivf.com.ua