Рекомендованное Gardner применение сред G
реклама
Руководство Рекомендованное Gardner применение сред G-5 для культивирования™ Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Руководство Рекомендованное Gardner применение сред G-5 для культивирования™ Издание 3, апрель 2009 г. © 2002–2009 Vitrolife Sweden AB. Все права защищены. Только для внутреннего использования, не публиковать. Логотип Vitrolife является торговой маркой Vitrolife Sweden AB, зарегистрированной в Европе, США и других странах. Vitrolife Sweden AB Box 9080 SE-400 92 Göteborg Sweden (Швеция) Тел.: +46-31-721 80 00 Vitrolife Inc. 3601 South Inca Street Englewood Colorado 80110 USA (США) Тел.: +1-866-VITRO US (866-848-7687) G5, G5 Series�������������������������������������������������������� ™������������������������������������������������������� , логотип G5, GIII, GIII Series������������������������ ™����������������������� , логотип GIII, G-MM��� ™��, ���� HSAsolution����������������� ™���������������� , G-IVF��������� ™�������� , G-IVF ������������������ PLUS�������������� ™������������� , G-1�������� ™������� , G-1�� ™� ����������������� PLUS, G-2�������� ™������� , G-2�� ™� ������ PLUS, G-GAMETE�������������������� ™������������������� , G-MOPS����������� ™���������� , G-MOPS�� ™� ������������������������������������ PLUS, G-RINSE����������������������� ™���������������������� , G-FreezeKit Blast��� ™��, G-ThawKit Blast����������������������� ™���������������������� , G-PGD��������������� ™�������������� , SpermGrad��� ™��, �������������������������������� HYASE��������������������������� ™�������������������������� , ICSI�������������������� ™������������������� и V-Tip����������� ™���������� являются торговыми марками Vitrolife Sweden AB. EmbryoGlue® является зарегистрированной торговой маркой Vitrolife Sweden AB. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Содержание Введение 4 Общая информация 5 Вскрытие продуктов Vitrolife 5 Уравновешивание CO2 6 Обогащение сред 6 Рекомендуемое применение среды G-MOPS™8 Измерение pH 10 ЭКО и система культивирования 12 Подготовка спермы Метод флотации (swim-up) Метод центрифугирования в градиенте плотности 13 14 16 ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 19 Аспирация фолликулов 19 Идентификация яйцеклетки 20 Культивирование и оплодотворение яйцеклетки 21 Инсеминация 22 Оценка оплодотворения 22 Оценка человеческих эмбрионов в пронуклеарной стадии 23 Выбор системы культивирования 24 Подготовка системы культивирования 25 Культивирование эмбрионов 26 Оценка эмбрионов 28 Критерии оценки человеческих бластоцист 29 Система оценки 30 Таблица для оценки бластоцист 31 План культивирования бластоцист 32 Перенос эмбрионов 33 Размещение эмбрионов 33 Установка катетера 35 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции Денудация яйцеклеток перед ICSI Процедура ICSI Сложные случаи ICSI Биопсия яичка Биопсия эмбриона 37 38 40 42 43 43 Криоконсервация эмбрионов Перечень оборудования Криоконсервация эмбрионов на стадии дробления Пример программы замораживания для эмбрионов на стадии дробления Программа оттаивания эмбрионов на стадии дробления Криоконсервация эмбрионов на стадии бластоцисты Пример программы замораживания для эмбрионов на стадии бластоцисты Программа оттаивания эмбрионов на стадии бластоцисты 45 45 Программа контроля качества 55 Среды G5 Series™ и сопутствующие товары от Vitrolife 59 Состав среды G5 Series™ 61 Инструменты Swemed от Vitrolife 62 Предостережения и меры предосторожности 64 Переписка 65 Содержание 47 47 48 50 50 52 Введение Увеличение доли успешных попыток Деятельность компании Vitrolife посвящена увеличению доли успешных попыток вспомогательной репродукции человека. Долговременные исследования в области репродуктивной физиологии и изучение развития эмбриона сделали доступными наиболее продвинутые среды для ЭКО. В настоящем руководстве доктором Дэвидом К. Гарднером (David K. Gardner) описано применение сред G5 Series™ компании Vitrolife. Мы осознаем, что существует множество способов осуществления вспомогательных репродуктивных технологий. Методы, описанные ниже, в сочетании с нашими продуктами привели к высокому показателю доли успешных попыток. Продукты Vitrolife для оплодотворения Среды для ЭКО Vitrolife предлагает высокоэффективные и безопасные среды для ЭКО (экстракорпорального оплодотворения). Перед реализацией заказчику каждая партия проходит строгий контроль качества, который включает тест на мышиных эмбрионах (MEA). К каждой реализуемой партии прилагается сертификат анализа. Контроль качества наряду с мероприятиями по обеспечению качества (ISO 13485:2003 и 21 CFR Part 820:QSR) гарантирует единообразие продукта во всех партиях. Все сырье, используемое при производстве продуктов Vitrolife для оплодотворения, является лучшим из доступного на мировом рынке. Все сырье перед применением для производства наших сред тестируется и оценивается в индивидуальном порядке путем прохождения строгого контроля качества и процедур MEA. Инструменты Swemed для ЭКО от Vitrolife Vitrolife предлагает также ряд инструментов для манипуляций ЭКО, таких как аспирационные иглы, пипетки для денудации, пипетки для ICSI (внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку) и биопсии эмбриона, а также катетеры для переноса эмбриона. Так же как и среды, инструменты проходят строгий контроль качества и производятся в соответствии с теми же стандартами качества. Уверены, что вы согласитесь с тем, что “сотворение” новой человеческой жизни достойно наилучшего окружения. Мы обязуемся предоставлять вам продукты наивысшего качества. Введение Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Общая информация Вскрытие продуктов Vitrolife Когда вы получите продукты Vitrolife, то можете отметить особый способ их упаковки. На то есть особые причины: • Все продукты Vitrolife запечатываются наклейкой для защиты от несанкционированного вскрытия. Такая упаковка исключает возможность вскрытия флакона без видимых доказательств. • Все материалы упаковки нетоксичны, поэтому ничто не может оказать воздействие на готовый продукт. Флаконы из PETG (полиэтилентерефталатгликоля), завинчивающиеся колпачки, особая маркировка и запечатывание продуктов – все составляющие протокола для защиты от несанкционированного вскрытия. Среды G5 Series™ PLUS, за исключением G-IVF™ PLUS, содержат 5 мг HSA (человеческий сывороточный альбумин) на 1 мл. Среда G-IVF™ PLUS содержит 10 мг HSA /мл. Все остальные среды G5 не содержат белка (если не указано иначе) и требуют добавления G-MM™ (рекомбинантного человеческого альбумина) или HSA-solution™ (человеческого сывороточного альбумина) в соответствии с данными на етикетке флакона. См. таблицу на стр. 7. Основные моменты • Перед началом работы с любым продуктом вымойте и продезинфицируйте руки. • Соблюдайте необходимые меры предосторожности при работе с любыми биологическими жидкостями, такими как кровь, фолликулярная жидкость и сперма. Практические рекомендации 1 Вскрывайте все продукты в чистом помещении с ламинарным воздушным потоком (LAF). 2 Перед тем как занести флаконы в помещение с LAF, убедитесь в их внешней чистоте. Рекомендуется протереть флаконы безворсистой тканью, смоченной этиловым спиртом. 3 Идентифицируйте продукт и проверьте срок годности. Сломайте и удалите защитную пломбу. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Общая информация 4 Снимите колпачок и поместите его на стерильную чашку Петри резьбой вниз. 5 Наберите требуемый объем стерильной, нетоксичной пипеткой. Поместите крышку на место и плотно закройте флакон. Не прикасайтесь к внутренней поверхности колпачка. 6 Сохраняйте среду по возможности холодной. Приготовьте чашки незамедлительно после извлечения флаконов из холодильника. Флаконы со средой не должны находиться при температуре окружающей среды в течение более продолжительного времени, чем требуется для подготовки чашек или пробирок. Соблюдение правил асептики подразумевает работу при отсутствии микроорганизмов, способных вызвать инфекцию или загрязнение. Внимание Никогда не наливайте содержимое из флакона, поскольку его горлышко после вскрытия может быть нестерильным. Уравновешивание CO2 Оптимальный уровень pH для культивирования человеческих эмбрионов составляет 7,2-7,4. Для достижения необходимого уровня pH все среды G5 Series™ (за исключением G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS, G-PGD™, G-Freezekit Blast™ и G-Thawkit Blast™), необходимо уравновесить при 6 % CO2. Это общая рекомендация для лабораторий, находящихся примерно на уровне моря. Для лабораторий, расположенных выше уровня моря, содержание CO2 следует увеличить примерно на 0,6 % CO2 на каждые 1000 м. Следует всегда контролировать уровень pH путем его измерений. См. стр. 10. Обогащение среды с помощью G-MM™ или HSA-solution™ В настоящем руководстве часто используется термин “обогащение”. Обогащенными считают среды с добавлением G-MM™ или HSA-solution,™ как описано в настоящем разделе, или продукты G5 Series™ PLUS. Среды G5 Series™ PLUS, G-RINSE™, G-GAMETE™ и EmbryoGlue® не требуют обогащения альбумином. Общая информация Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Все остальные культуральные среды, G5 Series ™, не помеченные значком PLUS, не содержат белка и требуют добавления G-MM™ или HSA-solution™ в соответствующей концентрации согласно приведенной ниже таблице. При выборе добавочного белка следует помнить, что человеческий сывороточный альбумин (HSA) произведен из крови и может содержать патогенные для человека вещества, в том числе не известные или не идентифицированные до настоящего времени. Поэтому при использовании HSA не может быть полностью исключен риск переноса таких инфекционных агентов. В G-MM™, содержащем рекомбинантный человеческий альбумин вместо HSA, может присутствовать крайне малое количество антигенов дрожжевых грибков (менее чем 0,15 ppm) как следствие процесса производства. Поскольку в процессе производства рекомбинантного человеческого альбумина не используется сырье человеческого или животного происхождения, в нем не содержатся инфекционные агенты человеческого или животного происхождения ввиду биосинтетического характера продукта. К средам G5 Series™, за исключением G-IVF™, следует добавлять 5 % G-MM™ или раствора HSA™ (0,5 мл на 9,5 мл среды). Конечная концентрация G-MM™ должна составлять 2,5 мг/мл, конечная концентрация HSA – 5 мг/мл. К среде G-IVF™ следует добавлять 10 % G-MM™ или HSA-solution™ (1,0 мл на 9,0 мл среды). Конечная концентрация G-MM™ должна составлять 5 мг/мл, конечная концентрация HSA – 10 мг/мл. Подлежащую обогащению среду следует разделить на аликвоты в стерильные градуированные пробирки или колбы из нетоксичного для культуры ткани материала. Все емкости следует предварительно промыть с использованием раствора G-RINSE™ для удаления механических частиц и токсичных веществ. Обогащение сред G-MOPS™, G-1™, G-2™, G-PGD™. бъем среды О [мл] 9,5 19,0 28,5 38,0 47,5 57,0 66,5 76,0 85,5 95,0 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Объем G-MM™ или HSA-solution™ [мл] 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Окончательный объем [мл] 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Общая информация Обогащение среды G-IVF™ бъем среды О [мл] 9,0 18,0 27,0 36,0 45,0 54,0 63,0 72,0 81,0 90,0 Объем G-MM™ или HSA-solution™ [мл] 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,5 8,0 9,0 10,0 Окончательный объем [мл] 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Для сред G-FreezeKit Blast™ и G-ThawKit Blast™ требуется следующее обогащение (см. стр. 50 и стр. 52): 9,0 мл раствора для замораживания/оттаивания + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA‑solution™ Обогащение растворов для криоконсервации можно проводить непосредственно в чашках. Просто поместите по 900 мкл каждого раствора для криоконсервации в разные лунки чашки + 100 мкл G-MM™ или 100 мкл HSA-solution™. Рекомендуется обогащать то количество среды, которое будет израсходовано в течение одного дня. Рекомендации по использованию сред G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS Среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS предназначена для проведения манипуляций с половыми клетками и эмбрионами вне инкубатора CO2. Основные моменты Для уменьшения негативного воздействия на яйцеклетки и эмбрионы во время манипуляций вне CO2 инкубатора, очень важно работать как можно быстрее. Поскольку при переносе яйцеклеток и эмбрионов с одной чашки в другую и при проведении ICSI с чашек снимаются крышки, спустя некоторое время возможно изменение показателей pH, температуры и осмоляльности. Это свойственно всем средам, в том числе и G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS. Общая информация Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Важное значение pH G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS – это среды, буферизированные MOPS (3-[N-морфолино]п ропансульфоновой кислотой), предназначенные для применения при температуре +37 °C в атмосферном воздухе. Не помещайте эту среду в окружение с содержанием СО2, поскольку в этом случае будет отмечаться снижение pH ниже нормативного предела. Кроме того, не используйте жидкий парафин, сбалансированный в условиях с содержанием CO2, для покрытия сред G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS. Важное значение температуры Яйцеклетки и эмбрионы должны постоянно находиться при температуре +37 °C. Для обеспечения достижения средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS температуры +37 °C внутри пробирки/чашки рекомендуется валидировать манипуляцию с помощью сертифицированного термометра, помещенного внутрь пробирки/чашки с образцом среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS, расположенной в термоблоке (для пробирки) или на термостолике (для чашки). Целью является достижение средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS температуры +37 °C перед использованием. Для достижения этой цели следует в индивидуальном порядке настроить обогревающее оборудование. Важное значение осмоляльности Во избежание изменения осмоляльности следует максимально наполнять и плотно закрывать пробирки. Чашки следует покрывать маслом или закрывать крышкой, если они не используются. Среда G-MOPS™ для аспирации яйцеклеток Среда G-MOPS™ для аспирации яйцеклеток не подлежит обогащению. Для достижения средой G-MOPS™ должной температуры +37 °C перед использованием ее предварительно подогревают путем помещения плотно закрытого флакона со средой G-MOPS™ в инкубатор без CO2. Флакон должен быть плотно закрыт во избежание изменения осмоляльности. Достижение флаконом с G-MOPS™ температуры +37 °C может занять до 4 часов. Каждый раз при извлечении флакона из инкубатора и использовании среды следите за тем, чтобы флакон был плотно закрыт. Утилизируйте среду G-MOPS™, которая была подогрета и не использована в течение рекомендованного промежутка времени, т. е. в тот же самый день при хранении в плотно закрытой пробирке или через 60 минут, если в чашке содержится минимум 1 мл среды, не покрытой маслом. Чашка, покрытая маслом, может быть использована в течение 2 часов, если на термостолике поддерживается должная температура. Среда G-MOPS™ для обработки половых клеток и эмбрионов Среду G-MOPS™ для обработки половых клеток и эмбрионов следует обогащать. В боксе с ламинарным потоком воздуха пипеткой перенести среду G-MOPS™/G‑MOPS™ PLUS в стерильные аналитические пробирки из нетоксичного материала. Если используется среда G-MOPS™, ее следует обогатить соответствующим количеством G-MM™ или HSA-solution™. Пробирка должна быть заполнена и плотно закрыта во избежание изменения осмоляльности. Поместите пробирку в инкубатор без CO2 или в соответствующим образом откалиброванный термоблок. Пипеткой перенесите предварительно подогретую среду G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS в предварительно подогретую чашку для культивирования. Во избежание изменения осмоляльности следует использовать среду как можно быстрее после приготовления, т. е. в течение 60 минут, если чашка не покрыта маслом (минимум 1 мл среды), или в течение 2 часов, если чашка покрыта маслом. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Общая информация Перенести пипеткой предварительно подогретую среду G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS в чашку для культивирования с крышкой, помещенную в инкубатор без CO2 или на термостолик. Во избежание изменения осмоляльности покройте чашку маслом или используйте ее в течение 60 минут после приготовления. Это положение справедливо для объема среды 1 мл и более. Для обеспечения температуры +37 °C внутри чашки для культивирования рекомендуется валидировать манипуляцию с помощью сертифицированного термометра, помещенного внутрь чашки для культивирования со средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS, помещенной на термостолик. Температуру термостолика следует откорректировать так, чтобы добиться температуры среды внутри чашки для культивирования, равной +37 °C. Важно Следите за тем, чтобы перенос среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS из чашки G-MOPS™ в чашку для культивирования осуществлялся без вводных этапов отмывания между чашкой G-MOPS™ и чашкой для культивирования. Процедура отмывания должна включать минимум два этапа по 1 мл среды на каждый этап. Чашки для отмывания следует менять каждые 5 яйцеклеток или эмбрионов. Измерение pH Введение Измерение pH с помощью электрода со стеклянной мембраной и современного прибора – простой процесс. Однако существует несколько ловушек, которых следует избегать, когда требуется достичь наивысшей точности. Это особо касается случаев, когда нужно измерить pH в растворах с газом или высоким содержанием белка. Основные моменты 10 • Используйте полумикроскопический или микроскопический электрод со встроенным электродом сравнения и термометром. • Установите прибор для автоматической температурной компенсации. • Используйте свежие буферные растворы, уровень pH по крайней мере одного из которых близок к анализируемому раствору. Заменяйте буферный раствор между анализами. • Ежедневно проверяйте собственную функцию электрода путем тестирования его крутизны и сдвига. • Смените электрод сразу после ухудшения его эксплуатационных показателей. pHэлектрод редко служит более 12 месяцев и часто требует замены каждые два или три месяца. • Храните электрод в нейтральном буферном растворе или в специальном растворе для хранения. • Калибровку прибора следует проводить перед каждой серией анализов. Общая информация Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Практические рекомендации – предлагаемый порядок измерения pH (Точный порядок может варьировать в зависимости от оборудования и свойств образца) 1 Извлеките электрод из раствора для хранения, промойте его и поместите в буферный раствор с pH 7,00. Удалите пробку или трубку, блокирующую воздушный клапан электрода. 2 Оставьте электрод в буферном растворе с pH 7,00 на один-два часа. Это время может быть сокращено, если электрон в течение ночи хранился в буферном растворе с pH 7,0. 3 Откалибруйте электрод с помощью двух свежих буферных растворов, один с pH около 7,00, другой, например, с pH 10,0. 4 Убедитесь в том, что склон и сдвиг электрода находятся в нормативных границах, установленных производителем электрода. Нами рекомендовано значение склона 95-102 % от теоретического уровня; сдвиг при pH 7,00 не должен отличаться более чем на ±4 мВ от уровня, полученного при прошлой калибровке. 5 Убедитесь в правильности проведения калибровки путем тестирования буферного раствора с pH около 8,00. Сравните полученный и нормативный pH при фактической температуре. Полученный уровень pH не должен отличаться от нормативного более чем на ± 0,05 единиц pH. 6 Поместите электрод в дистиллированную воду примерно той же температуры, что и тестировавшийся образец. 7 Уравновесьте образец при требуемых показателях температуры и газового состава. Уравновешивание с CO2 может занять до 16 часов! 8 Извлеките электрод из дистиллированной воды; слегка просушите его наконечник мягкой чистой тканью, чтобы удалить воду. Незамедлительно поместите электрод в уравновешенную Измерение PH среду. Стеклянная колба и контактная точка электрода для сравнения должны быть покрыты уравновешенной средой (см. а) и б) ниже). а) а) Окно диска, изготовленного методом спекания б) б) Соединительная муфта ФЛОТАЦИЯ В а) б) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Общая информация 11 9 После стабилизации pH снять показания с прибора. Если тестируемая среда уравновешена с CO2, тест должен быть полностью завершен за 30 секунд от момента извлечения среды из инкубатора. Если тест длится больше указанного времени, CO2 из образца рассеивается в атмосфере, и pH среды увеличивается. 10 Для перестраховки параллельно с образцом можно провести тестирование имеющейся в наличии среды с известным уровнем pH. Это даст возможность делать заключение о правильности проведения теста. 11 Запишите все данные теста, в том числе данные калибровки, в соответствующие протоколы или регистрационные журналы. ЭКО и система культивирования Мы знаем, что когда речь заходит о системе культивирования для ЭКО, существует множество вариантов на выбор. В настоящем руководстве изложена предлагаемая методика, подтвердившая свою результативность с нашими продуктами. Основные моменты 12 • Выберите свою систему культивирования по эффективности, простоте и воспроизводимости. • Организуйте вашу работу и подготовьтесь заранее. • Используйте для культивирования эмбрионов только нетоксичные стерильные одноразовые материалы, прошедшие контроль качества, ведите учет всех материалов и проводимых манипуляций. • Следуйте вашим протоколам для соблюдения единообразия. • Убедитесь, что ваше оборудование правильно настроено, регулярно проверяйте и калибруйте его. • Все манипуляции следует проводить в чистом специализированном помещении (кабинете LAF). • Соблюдайте правила асептики. • Обучите персонал обращению со средами, постоянно ведите учебные протоколы. • При контакте с биологическими жидкостями всегда надевайте перчатки из нетоксичного материала. • Перед началом работы проверьте идентификационные данные пациента и промаркируйте все материалы. Общая информация Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Подготовка спермы Перед использованием для ВМИ (внутриматочной инсеминации), ЭКО и ICSI подвижные сперматозоиды отделяются от семенной жидкости, мертвых сперматозоидов и других клеток. Это может быть достигнуто различными методами. Решение о методе подготовки спермы принимается на основании анамнеза пациента, данных предыдущей спермограммы, а также результатов анализа данного образца. Помимо этого следует учитывать, каким методом осуществляется оплодотворение – ЭКО или ICSI. В случае ЭКО для инсеминации потребуется больше спермы. Выбор сперматозоидов при подготовке осуществляется на основании их подвижности (в идеале отбираются только живые клетки) или плотности (в идеале отбираются только зрелые сперматозоиды). Если количество и подвижность сперматозоидов достаточные, подходит метод флотации (миграции). Если качество спермы низкое и она содержит большое количество других клеток, предпочтительнее центрифугирование в градиенте плотности. Восстановление спермы методом центрифугирования в градиенте плотности является более эффективным по сравнению с методом флотации, в пересчете на суммарный выход. Однако в некоторых случаях удельный вес подвижных сперматозоидов бывает выше после подготовки методом флотации. Основные моменты • Подготовку спермы следует проводить в чистых асептических условиях. При работе с образцами спермы следует надевать неталькованные перчатки из нетоксичных материалов и защитные очки. • Все образцы следует собирать в подходящие стерильные сосуды из нетоксичных материалов. Рекомендуется собирать образцы спермы не позднее чем за час до подготовки. Следует избегать охлаждения и нагревания образцов спермы. • Соблюдайте все лабораторные методики, в том числе точно следуйте идентификационному протоколу пациента. • Стерильные пробирки, иглы и пипетки из нетоксичных материалов следует промыть в растворе G-RINSE™ перед их использованием для подготовки спермы. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Подготовка спермы 13 Метод флотации (swim-up) Практические рекомендации Этот метод следует применять для образцов спермы с хорошими показателями количества и подвижности сперматозоидов. 1 Оставьте образец спермы примерно на 20 минут для разжижения. Если разжижение не произойдет, следует пропустить сперму через иглу 23 калибра или узкую пастеровскую пипетку. 20 Оставьте для разжижения на 20 минут 2 Проведите микроскопическую оценку образца для выбора оптимального метода обработки спермы. Измерение PH а) б) 3 Промаркируйте аналитическую пробирку идентификационным номером пациента. В случае сомнений в качестве спермы пробирок может быть несколько. 4 Пипеткой перенесите 1,0 мл спермы в промытую пробирку. В зависимости от объема спермы заполните 2-4 пробирки. Осторожно покройте предварительно уравновешенной обогащенной средой G-IVF™/G-IVF™ PLUS объемом 2,0 мл. Поместите флотационную пробирку в наклонном положении в инкубатор при ФЛОТАЦИЯ В температуре +37 °C и концентрации 6 % CO2 на 30-60 минут. а) б) Инкубируйте при +37 °C, 6 % CO2 в течение 30-60 минут. а) Среда G-IVF™ / G-IVF™ PLUS б) Сперма ФЛОТАЦИЯ Г/Д 14 Подготовка спермы Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife а) б) 5 Не затрагивая сперму, аспирируйте среду сверху и перенесите в чистую пробирку. Добавьте 5,0 мл ФЛОТАЦИЯ Г/Дуравновешенной обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS, смешайте и центрифугируйте 10 минут при 300-600 g. Удалите среду сверху. Разбавьте средой G-IVF™ / G-IVF™ PLUS. Центрифугируйте. 6 Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок в 5,0 мл уравновешенной обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS, повторно центрифугируйте 10 минут при 300-600ПЛОТНОСТИ g. ГРАДИЕНТ А GIII А Удалите надосадочную жидкость. Повторно отмойте. а) б) в) Удалите надосадочную жидкость. Повторно отмойте. 7 Удалите надосадочную жидкость и объедините все осадки. Ресуспендируйте ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ, Б, В, Г, GIIIобогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS, осадок в 0,5–1,0 мл уравновешенной в зависимости от качества образца. Б В Ресуспендируйте в небольшом объеме среды G-FERT™. Г а) Ресуспендируйте в небольшом объеме среды G-IVF™ / G-IVF™ PLUS. 8 Определите подвижность и концентрацию сперматозоидов в отмытом образце. 9 Разбавьте отмытый образец уравновешенной обогащенной средой G-IVF™/G-IVF™ ПОДГОТОВКА К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ А, Б подвижных сперматозоидов/мл. PLUS до конечной концентрации 75 000-200 000 А а) а) Б б) б) МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б А а) Vitrolife Руководство 3.0™ среды G5 Series е) б) Подготовка спермы а) б) 15 10 Подготовьте чашки для инсеминации с 0,5-1,0 мл суспензии сперматозоидов иуравновешивайте их при +37 °C и 6 % CO2 минимум в течение 2 часов. Второй вариант: Добавьте уравновешенную суспензию спермы в уравновешенные чашки с уже перенесенными яйцеклетками. Если используется масляное покрытие, рекомендуется объем капель не менее 100 мкл. Метод центрифугирования в градиенте плотности Этот метод может использоваться для отмывания всех образцов спермы, независимо от их качества. SpermGrad™ представляет собой изотонический сбалансированный физиологический солевой буферный раствор, содержащий покрытые силаном коллоидные частицы кремния. При приготовлении различных разведений раствора SpermGrad™ наблюдаются растворы с разной плотностью. Осторожное наслоение этих растворов с разной плотностью на центрифужную пробирку создает градиент плотности. Клетки и другие частицы с различной плавучей плотностью седиментируют до достижения раствора с более высокой плотностью. Центрифугирование ускоряет эту седиментацию. Обычно применяется двойной градиент 90 % и 45 % растворов SpermGrad™. Поскольку зрелые сперматозоиды с плотно упакованной ДНК имеет более высокую плотность, чем 90 % раствор SpermGrad™, они седиментируют через этот слой и попадают на дно пробирки, в то время как другие клетки, в том числе незрелые и мертвые, прекращают седиментировать на поверхности раздела 90 % и 45 % растворов. Мы рекомендуем разбавлять раствор SpermGrad™ средой G-IVF™/ G-IVF™ PLUS для достижения 90 % или 45 % градиентов. Среду G-IVF™ следует обогатить с помощью G-MM™ или HSA-solution™. Среда G-IVF™/G-IVF™ PLUS должна быть обогащена при +37 °C и 6 % CO2 перед применением. Практические рекомендации 1 Смешайте раствор SpermGrad™ с обогащенной средой G-IVF™/G-IVF™ PLUS в отдельных пробирках для получения 90 % 45 % матричных растворов. Для получения 90 % матричного раствора смешайте 9,0 мл раствора SpermGrad™ с 1,0 мл обогащенной среды G-IVF™. Для получения 45 % матричного раствора смешайте 4,5 мл раствора SpermGrad™ с 5,5 мл обогащенной среды G-IVF™. Тщательно смешайте растворы и храните в стерильных пробирках из нетоксичных материалов или стерильных колбах для культивирования тканей. Промаркируйте и поместите в холодильник до использования. Для переноса аликвотных количеств, необходимых для каждой подготовки спермы, всегда используйте стерильные пипетки из нетоксичных материалов. Маточные растворы следует промаркировать датой и хранить в течение рекомендованного промежутка времени (см. срок годности на флаконах). Перед использованием дайте растворам нагреться до комнатной температуры. Перед использованием уравновесить растворы при 6 % CO2 до достижения требуемого значения pH. 16 Подготовка спермы Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife а) б) 2 Градиент плотности необходимо наслоить в 2-4 стерильные и ополоснутые конические центрифужные пробирки из нетоксичных материалов (в зависимости от объема образца спермы), промаркированные идентификационным номером пациента. Вначале пипеткой нанесите на стенку пробирки 1,5 мл 90 % раствора, затем медленно ФЛОТАЦИЯ Г/Дповерх наслоите пипеткой 1,5 мл 45 % раствора. Наконец, осторожно наслоите поверх 1,0 мл спермы (A). Приготовьте 2-4 градиентные пробирки. Поверх градиента можно наслоить до 2 мл спермы. Если образец ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ А GIIIее количество может быть уменьшено. Добавление спермы нормального качества, слишком большого количества спермы может привести к плохому разделению. А а) б) в) A. Слои градиентных растворов и спермы в конической центрифужной пробирке. Центрифугирование в течение 20 минут при 300-600 g. а) Сперма б) 45 % в) 90 % ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ А GIII ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ, Б, В, Г, GIII 3 Затем центрифугируйте пробирки 10-20 минут при 300-600 g. А Б два верхних слоя, стараясь Г В не оставлять осадка на стенках 4 Удалите пробирки (Б). Перенесите осадок с минимально возможным количеством 90 % раствора а) в стерильную коническую пробирку, содержащую 5 мл уравновешенной б) обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS. в) 5 Центрифугируйте 10 минут при 300-600 g. а) 6 Аспирируйте, удалите надосадочную жидкость и повторно отмойте (В). После второго отмывания объедините осадки и ресуспендируйте в 1 мл уравновешенной ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ, Б, В, Г, GIII обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS (Г). Выполните проверку отмытого образца на подвижность и концентрацию. ПОДГОТОВКА К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ А, Б Б а) А а) Г В а) Б б) Б. Удалите верхние слои и перенесите осадок в чистую пробирку. а) Осадок В. Отмойте осадок средой G-IVF™ / G-IVF™ PLUS. ПОВТОРИТЕ. б) Г. Ресуспендируйте осадок в небольшом объеме среды G-IVF™ / G-IVF™ PLUS. МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б ПОДГОТОВКА К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ А, Б 7 Разбавьте отмытый образец уравновешенной обогащенной средой G-IVF™/G-IVF™ PLUS до конечной сперматозоидов 75 000-200 000/мл. а) а) концентрации подвижных А Б А а) е) б) б) а) в) б) б) г) в) д) г) МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б Б Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife А а) б) а) Подготовка спермы 17 8 Подготовьте чашки для инсеминации, содержащие 0,5-1,0 мл суспензии сперматозоидов, и уравновешивайте их при +37°С и 6 % CO2 минимум в течение 2 часов. 18 Второй вариант: Добавьте уравновешенную суспензию спермы в уравновешенные чашки с уже перенесенными яйцеклетками. Рекомендуется проводить инсеминацию в растворе объемом 0,5-1,0 мл без масляного покрытия. Если используется масляное покрытие, рекомендуется использовать объем капель не менее 100 мкл. Подготовка спермы Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (ivf-et) Компания Vitrolife разработала среды для культивирования для отдельных стадий эмбрионального развития. Среда G-IVF™/G-IVF™ PLUS используется для оплодотворения in vitro. Для культивирования эмбрионов на стадии дробления и ранних стадиях развития используйте среду G-1™/G-1™ PLUS. Для культивирования эмбрионов с 3 дня до стадии бластоцисты используйте среду G-2™/G-2™ PLUS. После выполнения ICSI поместите эмбрионы непосредственно в среду G-1™/G-1™ PLUS. Независимо от стадии, переносить эмбрионы в полость матки следует с использованием среды EmbryoGlue® или обогащенной среды G2™ или G-2™ PLUS. Аспирация фолликулов Цель процедуры сбора яйцеклеток - как можно быстрее собрать как можно больше яйцеклеток и минимизировать воздействие на них нефизиологичных условий. Важными параметрами являются температура, осмоляльность и pH. Любые отклонения от физиологических условий могут губительно сказаться на способность яйцеклетки к нормальному оплодотворению и нормальному предимплантационному развитию эмбриона. Основные моменты • • • • • День 0 определяется как день сбора яйцеклеток. Идентифицируйте пациента и проверьте маркировку с идентификационным номером на чашках для культивирования и пипетках перед началом работы. Убедитесь, что все поверхности нагреты и все материалы, которые могут контактировать с яйцеклетками, стерильны, нетоксичны и пригодны для культивирования тканей, желательно, прошли тест на мышиных эмбрионах. Аспирация яйцеклеток проводится одно- или двухпросветной иглой под ультразвуковым контролем. Рекомендации по выбору иглы для аспирации см. раздел “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Иглы для аспирации фолликулов V-Tip™”. Отрицательное давление в просвете иглы создается регулируемым аспирационным насосом. Высокое или неконтролируемое отрицательное давление может повредить яйцеклетки. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 19 • • • • • • В качестве жидкости для промывания для процедуры используется предварительно нагретая среда G-MOPS™. G-MOPS™ представляет собой модифицированную среду G-1™, содержащую MОPS в качестве буферного вещества, и бикарбонат натрия для поддержания pH в условиях окружающей атмосферы. Для сбора аспирата и промывания фолликулов может использоваться предварительно нагретая среда G-MOPS™, не содержащая белка, поскольку фолликулярная жидкость содержит большое количества белка. Для отмывания яйцеклеток перед инкубацией в обогащенной среде G-IVF™/G‑IVF™ PLUS следует использовать предварительно нагретую обогащенную среду G‑MOPS™/G-MOPS™ PLUS. Среда G-GAMETE™, уравновешенная при +37 °C и 6 % CO2, может использоваться как вариант замены обогащенной среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS. Рекомендуется готовить одну чашку для промывания максимально для пяти фолликулов. Практические рекомендации 1 Предварительно уравновесьте среду G-RINSE™ при 37 °C и 6 % CO2. 2 Подогрейте среду G-MOPS™ PLUS для отмывания яйцеклеток: перенесите среду пипеткой в промытые пробирки. Плотно закройте пробирки и поместите их в инкубатор без CO2 при температуре +37 °C. 3 Подогрейте необогащенную среду G-MOPS™ для промывания фолликулов: перенесите среду пипеткой в промытые пробирки. Плотно закройте пробирки и поместите их в инкубатор без CO2 при температуре +37 °C. Перед использованием убедитесь, что температура среды равна +37 °C. 4 Промойте просвет иглы и трубку средой G-RINSE™ и утилизируйте жидкость для промывания. 5 Аспирация фолликулов может выполняться как по отдельности, так и совокупно. Аспирированную фолликулярную жидкость следует собрать в промытую стерильную пробирку для культивирования тканей из нетоксичных материалов. Среду G-MOPS™ можно дополнить прошедшим проверку качества гепарином фармацевтической категории (2,5-10,0 единиц/мл) для уменьшения свертывания крови, содержащейся в аспирированной фолликулярной жидкости. 6 Аспирированную фолликулярную жидкость необходимо собрать в стерильные одноразовые пробирки для культивирования тканей из нетоксичных материалов и немедленно провести ее лабораторное исследование. Если нет возможности провести исследование немедленно, пробирки необходимо плотно закрыть и хранить при +37 °C. Идентификация яйцеклетки Основные моменты 20 • наденьте перчатки из нетоксичных материалов • перед началом работы проведите идентификацию пациента • во избежание охлаждения работайте быстро ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Практические рекомендации 1 Аспирированную фолликулярную жидкость следует хранить при температуре +37 °C. Эту задачу может облегчить использование термоблока для аналитических пробирок рядом с микроскопом. Микроскопическое исследование аспирированной фолликулярной жидкости следует проводить в стерильных чашках Петри для культивирования тканей. 2 При необходимости промывания фолликула следует использовать предварительно нагретую до +37 °C среду G-MOPS™. 3 Перенесите аспирированную фолликулярную жидкость в пустую чашку. Идентифицируйте яйцеклетки, предварительно ополосните стерильную пипетку обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS и незамедлительно удалите яйцеклетки из фолликулярной жидкости, возможно контаминированной кровью. 4 Отмойте яйцеклетки вначале предварительно подогретой обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS, а затем уравновешенной обогащенной средой G-IVF™/ G‑IVF™ PLUS. Отмывание должно включать минимум два этапа с использованием 1,0 мл среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS на каждом этапе. Перенесите яйцеклетки на чашки с уравновешенной обогащенной средой G-IVF™/G-IVF™ и незамедлительно верните их в инкубатор. Культивирование и оплодотворение яйцеклетки Основные моменты • Решающее значение для обработки половых клеток и оплодотворения играют температура, pH и осмоляльность. • Снижение температуры возникает быстро и относится к промежутку времени, когда емкость с культуральной средой находится вне инкубатора или нагревательной поверхности, такой как при микроскопии на термостолике. • Изменение осмоляльности зависит от объема, температуры, а также наличия или отсутствия масляного покрытия. Осмоляльность изменяется медленно и часто становится нераспознанным параметром. Систему культивирования следует увлажнить должным образом и желательно покрыть маслом. • Изменения pH наступают быстро и, подобно изменениям температуры, касаются промежутка времени, когда емкость с культурой находится вне инкубатора, и времени воздействия воздуха. • Убедитесь, что все поверхности нагреты и все материалы, которые могут контактировать с яйцеклетками, стерильны, нетоксичны и пригодны для культивирования тканей, желательно, прошли тест на мышиных эмбрионах. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 21 Инсеминация Практические рекомендации 1 Перенесите яйцеклетки в чашки для инсеминации, содержащие 75 00020 0000 сперматозоидов/мл, и оставьте на ночь при температуре +37 °C и 6 % CO2. Второй вариант: Добавьте уравновешенную суспензию спермы в уравновешенные чашки с уже перенесенными яйцеклетками. В одной емкости можно инсеминировать несколько яйцеклеток. Если используется масляное покрытие, рекомендуется объем капель не менее 100 мкл. Оценка оплодотворения Основные моменты • Оплодотворение инсеминированных методом ЭКО яйцеклеток оценивается приблизительно через 15-20 часов после добавления спермы (день 1). Оплодотворение яйцеклеток методом ICSI можно оценивать через 12-18 часов, поскольку в этом случае пронуклеусы (PN) могут появиться раньше. • Оплодотворенные яйцеклетки чувствительны к изменениям температуры и pH, поэтому следуют свести к минимуму такие изменения путем использования предварительно подогретой обогащенной среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS в качестве среды для обработки вне инкубатора. • Среда G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS содержит MОPS в качестве буферного вещества для стабилизации pH при обработке в атмосфере помещения и не требует уравновешивания в атмосфере с CO2 перед использованием. Наоборот, эта среда предназначена для поддержания pH на уровне 7,2-7,4 вне атмосферы, содержащей CO2. • Среда G-GAMETE™ может использоваться в качества варианта замены обогащенной среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS. Среду G-GAMETE™ следует уравновешивать при температуре +37 °C и 6 % CO2 перед использованием. • Рекомендуется работать быстро и использовать подогрев на всех стадиях микроскопии. Для достижения температуры +37 °C внутри чашек следует установить на термостолике максимальную температуру, обычно 39-41 °C. Для того чтобы убедиться в правильности температуры внутри чашек, используйте сертифицированный термометр или откалиброванный электронный термометр с термоэлементом, который можно поместить на столик и внутрь чашки. Практические рекомендации – оценка оплодотворения 1 Перенесите яйцеклетки в чашку с предварительно нагретой обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS. 2 Удалите кумулюсные клетки и клетки лучистого венца с яйцеклеток при температуре +37 °C, используя пипетку для денудации (см. “Инструменты Swemed от Vitrolife”, стр. 62). Часто кумулюсные клетки и клетки лучистого венца хорошо 22 ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife рассеиваются под действием гиалуронидазы, содержащейся в сперме. Если кумулюсные клетки плохо рассеиваются, для выделения яйцеклетки из лучистого венца могут использоваться иглы. Клетки следует удалять лишь до четкой визуализации полярных телец и пронуклеусов. 3 Оцените микроскопически и запишите количество пронуклеусов, полярных телец и возможное наличие герминативного пузырька. Рекомендуется выполнять микроскопию при высоком увеличении (минимум 200X) на инвертирующем микроскопе с оптикой Nomarski или Hoffman. При использовании малого увеличения трудно с точностью оценить оплодотворение. Как только из нормально оплодотворенной яйцеклетки (2 PN) образуются эмбрионы, следует принять решение о культивировании эмбрионов и перенести их. Неоплодотворенные или дегенеративные яйцеклетки, яйцеклетки с 1 или более чем с 2 PN следует удалить из культуры. Оценку пронуклеусов см. на следующей странице. 4 После оценки оплодотворенные яйцеклетки следует отмыть несколькими каплями уравновешенной обогащенной среды G-1™/G-1™ PLUS и культивировать в уравновешенной обогащенной среде G-1™/G-1™ PLUS, желательно под слоем масла. Оценка человеческих эмбрионов в пронуклеарной стадии Источник: Scott L, Alvero R, Leondires M and Miller B. 2000. The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation. Hum Repr 15, No 11, pp 2394-2403 Основные моменты • Морфология зиготы оказывает влияние на развитие бластоцисты, имплантацию и вынашивание беременности • Система оценки выявляет потенциал развития зигот и основывается на морфологии двух пронуклеусов (2PN) • Оценка пронуклеусов сочетается с оценкой на 3-й день и/или оценкой бластоцисты • Во избежание осложнений многоплодной беременности рекомендуется переносить не более двух эмбрионов. Практические рекомендации • Оценку зигот следует проводить в инвертирующем микроскопе, поддерживая физиологические показатели pH и температуры. • Оценка проводится через 16-20 часов после инсеминации или через 12-18 часов после ICSI, поскольку пронуклеусы в инъецированных яйцеклетках могут появиться и исчезнуть раньше, чем в инсеминированных. • Для этой манипуляции рекомендуется использовать обогащенную среду G‑MOPS™/G-MOPS™ PLUS или G-GAMETE™. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 23 б) Система оценки ФЛОТАЦИЯ Г/Д • Ядра должны быть одинакового размера • Ядрышки должны быть упорядочено выстроены у линии соединения пронуклеусов • Количество ядрышек в каждом ядре должно составлять три-семь, с различиями между ядрами не более чем на одно ядрышко • Ядрышки должны быть одинакового размера • Для обеспечения оптимальных результатов имплантации и вынашивания для переноса желательно выбирать эмбрионы с хорошим морфологическим качеством, то есть эмбрионы на стадии пронуклеусов категории Z1. Категории ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ А GIII Z1 Z2 Z3 : : Z4 А а) б) в) : : Выбор системы культивирования ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ, Б, В, Г, GIII В целом, для культивирования половых клеток и эмбрионов существуют на выбор две системы: Б Г В A Большие объемы (0,5-1,0 мл) в пробирках или лунках с масляным покрытием или без него Б Малые объемы (капли 0,05-0,1 мл) с масляным покрытием Площадь поверхности систем для культивирования, не покрытая маслом, достаточно а) большая для изменения осмоляльности в течение нескольких дней. Поэтому мы рекомендуем использовать масло в качестве защиты от изменений температуры и осмоляльности, а также как барьер для частиц пыли и микроорганизмов из атмосферы. По высокой степени очистки и вязкости лучший выбор – парафиновое масло. OVOIL™ –ПОДГОТОВКА легкое парафиновое масло фармацевтической категории, стерилизованное путем К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ А, Б фильтрации через стерильный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. А а) а) Б б) A. Многолуночный планшет с OVOIL™ а) OVOIL™ б) Среда б) Б. Капли, покрытые маслом а) OVOIL™ б) Капли среды объемом 10–100 мкл МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б Во время культивирования эмбрионов среду следует менять каждые 48 часов А 24 а) б) ЭКО се)подсадкой эмбриона (IVF-ET) а) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife б) Подготовка системы культивирования Идеальными параметрами для всех сред для культивирования эмбрионов является содержание 6 % CO2 и 5 % O2. Такое газовое окружение можно получить при использовании трехгазового инкубатора или модульной инкубаторной камеры/ Isolette и поддержании газовой смеси (6 % CO2, 5 % O2 и 89 % N2). Применение окружения с низким содержанием кислорода имеет значительные преимущества. Если применение окружения с низким содержанием кислорода невозможно, используйте атмосферный воздух с содержанием 6 % CO2. Практические рекомендации 1 Все чашки для культивирования (лунки или пробирки) следует ополоснуть средой G-RINSE™ и подготовить перед началом работы. 2 После полудня в день забора яйцеклеток промаркируйте чашки диаметром 60 мм идентификационным номером пациента. Рекомендуется использовать чашки наивысшего качества. С помощью предварительно ополоснутого стерильного наконечника поместите в чашку минимум 6 капель по 25 мкл обогащенной среды G-1™/G-1™ PLUS. Ополаскивают наконечники путем набора требуемого объема среды (25 мкл) с последующим выпуском этого объема в чашку для утилизации среды. Четыре капли следует расположить на 3, 6, 9 и 12 часах условного циферблата (для культивирования эмбрионов), остальные капли следует поместить в центра чашки (капли для промывания). Во избежание испарения незамедлительно покройте капли маслом OVOIL™. Одновременно приготовьте не более 2 чашек. Используйте новый наконечник для каждой капли, вначале промойте его, а затем добавьте по 25 мкл среды к каждой имеющейся капле. Такая техника позволяет каплям не растекаться. 3 Незамедлительно поместите чашку в инкубатор при 6 % CO2 и температуре +37 °C. Аккуратно снимите крышку и поставьте ее под углом на стенку чашки. Это обеспечит надлежащее уравновешивание чашки. Уравновешивание чашек с полуоткрытой крышкой следует проводить в течение минимум 6 часов (минимальный срок, необходимый для достижения необходимого значения pH средой, покрытой маслом) и максимум 18 часов. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 25 Культивирование эмбрионов Основные моменты • • • • • • • • Решающее значение для культивирования эмбрионов играют температура, pH и осмоляльность. Снижение температуры возникает быстро и относится к промежутку времени, когда емкость с культурой находится вне инкубатора. Рекомендуется выполнять манипуляции на нагревательных поверхностях, например, на термостолике микроскопа. Осмоляльность изменяется медленно и часто становится нераспознанным параметром. Систему культивирования следует увлажнить должным образом и желательно покрыть маслом. Изменения pH развиваются быстро при воздействии на среду воздуха. Старайтесь, чтобы чашки со средой находились вне инкубатора как можно меньше времени. Высоких показателей имплантации и вынашивания можно достичь путем переноса бластоцист. Культивирование и перенос бластоцист не избавляет от проблем 2-3 дня программы IVF-ET. Культивирование бластоцист для переноса и криоконсервации требует строгого соблюдения лабораторных условий. Необходимым условием для успешного продолжительного культивирования является достаточное количество инкубаторов. В идеале следует использовать два инкубатора для не более чем 5 заборов в неделю. Один инкубатор следует использовать для культивирования эмбрионов, а второй – для предварительного уравновешивания чашек со средой. Инкубаторы для культивирования не следует использовать для предварительного уравновешивания чашек со средой с целью минимизации открывания дверцы инкубатора. Практические рекомендации: Культивирование эмбрионов на стадии дробления 1-й день – культивирование в среде G-1™/G-1™ PLUS 1 После удаления кумулюсных клеток все манипуляции следует проводить с помощью вытянутой пастеровской пипетки, см. раздел “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Пипетки для переноса”. При использовании вытянутой пастеровской пипетки контроль объема жидкости осуществляется с помощью шприца, присоединенного к пипетке силастиковой трубкой. Важно использовать пипетку с наконечником, диаметр которого чуть больше размера эмбриона. Во избежание повреждения эмбриона очень важно, чтобы диаметр наконечника был не меньше размера эмбриона. Например, для эмбриона возрастом 1-3 дня подойдет наконечник диаметром 150-200 мкм. Использование соответствующего диаметра наконечника способствует уменьшению объема среды, который переносится вместе с эмбрионом; этот объем должен быть меньше одного микролитра. Такое внимание к коррекции объема среды является предпосылкой к успешному культивированию. 2 После удаления кумулюсных клеток и оценки оплодотворения эмбрионы с пронуклеусами следует перенести в однолуночную чашку и промыть предварительно нагретой обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS или уравновешенной средой G-GAMETE™. Промывание подразумевает 2-3-кратный забор эмбриона с минимальным объемом среды и перемещение по кругу в лунке. Затем эмбрионы 26 ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife необходимо последовательно промыть в двух центральных каплях, находящихся в чашке для культивирования. Обратите внимание, что рекомендуется промыть эмбрионы минимум в двух каплях. Более активное промывание уменьшает риск переноса среды из старой чашки в свежую. Уменьшение содержания буфера MOPS в каплях культуры может привести к снижению pH ниже нормативного. 3 Поместите до 5 эмбрионов в каждую каплю объемом 50 мкл уравновешенной обогащенной среды G-1™/G-1™ PLUS. В одной капле следует культивировать не более пяти эмбрионов из расчета их потребности в питательных веществах. Размещение в одной капле более 5 эмбрионов может привести к существенному сокращению их объема питания. В качестве меры предосторожности можно приготовить две чашки для культивирования, если у пациента более 10 эмбрионов. Незамедлительно верните чашку для культивирования в инкубатор. Рекомендуется культивировать эмбрионы группами минимум по 2. Например, если у пациента 6 эмбрионов, оптимально культивировать их 2 группами по 3, а не группами 4 и 2 или 5 и 1. 4 На 3-й день эмбрионы можно переносить в полость матки в уравновешенной среде EmbryoGlue® или в уравновешенной обогащенной среде G-2™/G-2™ PLUS. В качестве альтернативы, на 3-й день эмбрионы можно перенести в уравновешенную обогащенную среду G-2™/G-2™ PLUS для дальнейшего культивирования до стадии бластоцисты. Практические рекомендации: Культивирование эмбрионов на стадии бластоцисты 3-й день – культивирование в среде G-2™/G-2™ PLUS 1 Утром 3-го дня промаркируйте чашки диаметром 60 мм идентификационным номером пациента. С помощью предварительно промытого стерильного наконечника вначале промойте чашку, а затем поместите в нее 9 капель по 25 мкл обогащенной среды G-2™/G-2™ PLUS. Незамедлительно покройте маслом OVOIL™. Во избежание изменения осмоляльности никогда не готовьте одновременно больше 2 чашек. Используйте новый наконечник для каждой капли, промойте его, а затем добавьте по 25 мкл среды к каждой имеющейся капле. Незамедлительно поместите чашку в инкубатор при 6 % CO2 и температуре +37 °C. Минимальное время уравновешивания среды перед использованием составляет 6 часов. Аккуратно снимите крышку и поставьте ее на одну из сторон чашки для уравновешивания. Если у пациента более 10 эмбрионов, приготовьте две чашки для культивирования. В качестве альтернативы, можно приготовить чашки для культивирования бластоцист после полудня во 2-й день и оставить на ночь для уравновешивания при 6 % CO2 и +37 °C. 2 Для каждого пациента приготовьте одну чашку для промывания с предварительно нагретой обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS или уравновешенной средой G-GAMETE™ на каждые 10 эмбрионов. Поместите 1 мл среды G-MOPS™/ G‑MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ в лунку однолуночной чашки. Поместите 2 мл среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ на ободок чашки. Поместите на термостолик. 3 Для каждого пациента приготовьте по одной сортировочной чашке. Поместите 1 мл среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ в лунку однолуночной чашки. Поместите 2 мл среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ на ободок чашки. Поместите на термостолик. Среду G-MOPS™ не следует помещать в инкубатор CO2, предпочтительнее предварительно нагреть ее в герметичном контейнере в инкубаторе без CO2 или в термоблоке для пробирок. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 27 4 Днем 3-го дня эмбрионы, дробление которых оценивалось утром, переносят в уравновешенную обогащенную среду G-2™/G-2™ PLUS. Эмбрионы остаются в обогащенной среде G-2™/G-2™ PLUS при 6 % CO2 и температуре +37 °C до оценки пригодности для переноса утром 5-го дня. В случае сомнений относительно скорости дробления об этом необходимо уведомить медицинский и обслуживающий персонал. 5 Промойте эмбрионы в чашке для промывания (этот этап важен для удаления EDTA из среды G-1™/G-1™ PLUS). Промывание подразумевает 2-3-кратный забор эмбриона с минимальным объемом среды и перемещение по кругу в лунке. После промывания перенесите эмбрионы в чашку для сортировки и сгруппируйте подобные эмбрионы. Промойте в пяти каплях уравновешенной обогащенной среды G-2™/G‑2™ PLUS в чашке для культивирования и вновь поместите до пяти эмбрионов в каждую из четырех капель культуры. Незамедлительно верните чашку в CO2 инкубатор. 6 На 4-й день приготовьте три чашки с обогащенной средой G-2™/G-2™ PLUS. Промаркируйте чашки “Перенос”, “Замораживание” и “Удержание” (для культивирования до 6-го дня). Чашки следует уравновешивать в течение ночи при температуре +37 °C и 6 % CO2. Чашки следует уравновешивать не менее 6 и не более 18 часов перед использованием. 7 Перенос осуществляется либо в уравновешенной среде EmbryoGlue®, либо в уравновешенной обогащенной среде G-2™/G-2™ PLUS. Уравновешивайте чашки для переноса при температуре +37 °C и 6 % CO2 не менее 6 часов (не более 18 часов) перед использованием. 8 На 5-й день следует провести оценку эмбрионов и отобрать для переноса одну или две лучшие бластоцисты. Не перенесенные бластоцисты хорошего качества могут быть подвергнуты криоконсервации. Если к 5-му дню бластоциста не сформировалась, эмбрион необходимо культивировать в свежей капле уравновешенной обогащенной среды G-2™/G-2™ PLUS в течение 24 часов и оценить на 6-й день. 9 Поместите отобранную(-ые) бластоцисту(-ы) в обогащенную среду G-2™/G-2™ PLUS и оставьте при температуре +37 °C и 6 % CO2 на 10-30 минут перед переносом. Оценка эмбрионов Основные моменты 28 • Эмбрионы можно переносить в полость матки на 2-й день (40-48 часов после инсеминации) или 3-й день (66-74 часов после инсеминации), либо на стадии бластоцисты на 5-6-й день (120-144 часа после инсеминации). • Оценку морфологии эмбриона следует проводить как можно ближе ко времени переноса. • Эмбрионы на ранних стадиях оценивают по общему количеству бластомеров, их однородности, присутствию и удельному весу фрагментаций, гранулярности бластомеров и скорости дробления. Для оценки бластоцист см. “Критерии оценки человеческих бластоцист” на последующих страницах. • Поместите отобранный(-ые) для переноса эмбрион(-ы) на свежую чашку с уравновешенной средой EmbryoGlue® или уравновешенной обогащенной средой G-2™/ G‑2™ PLUS, независимо от стадии. ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Критерии оценки человеческих бластоцист Источник: Gardner DK and Schoolcraft WB (1999) In-vitro culture of human blastocysts. in Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. eds. Jansen, R. and Mortimer, D. Parthenon Press, Carnforth, pp 378-388. Основные моменты • Система оценки выявляет потенциал развития бластоцист и основывается на их морфологии, и, таким образом, облегчает выбор эмбрионов для переноса и криоконсервации. • Оценку бластоцист следует проводить в инвертирующем микроскопе, поддерживая физиологические показатели pH и температуры. • Большинство бластоцист должно развиться к 5-му дню (см. ниже). • Бластоцисты, отобранные для переноса (максимум две), следует поместить на чашку, маркированную как “Перенос”, бластоцисты,отобранные для криоконсервации, – в чашку, маркированную как “Замораживание”. • Во избежание осложнений многоплодной беременности рекомендуется переносить не более одной бластоцисты. Предпочтение следует отдавать бластоцистам 3-й категории и выше. Желательно отобрать лучшие бластоцисты, т. е. AA. Практические рекомендации 1 Бластоцисты получают буквенно-цифровую оценку от 1 до 6 в зависимости от их экспандирования и хэтчинга (“выклева”), а также две буквенные оценки для внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофэктодермального слоя. 2 Первую фазу оценки можно проводить с помощью препаровальной лупы. 3 Второй этап оценки бластоцист следует проводить в инвертирующем микроскопе. Развитие внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофэктодермального слоя можно оценивать у бластоцист 3-6-й категории (т. е. полных бластоцист). Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 29 Система оценки Степень экспандирования и хэтчинга (“выклева”): 1 2 3 4 1 Ранние бластоцисты бластоцель занимает меньше половины объема эмбриона. 2 Бластоциста бластоцель занимает половину объема эмбриона или больше. 3 Зрелая бластоциста бластоцель занимает весь объем эмбриона. 4 Экспандированная бластоциста объем полости больше, чем у раннего эмбриона, блестящая оболочка истончается. 5 Бластоциста в процессе хэтчинга (“выклева”) трофэктодермальный слой начинает выпячиваться через блестящую оболочку. 6 Вылупившаяся бластоциста бластоциста полностью покинула блестящую оболочку. Классификация внутренней клеточной массы (ВКМ): A Плотно упакована, содержит много клеток B Несколько рыхло сгруппированных клеток C Единичные клетки Классификация трофэктодермального слоя: A Много клеток формируют плотный эпителий 30 B Несколько клеток формируют рыхлый эпителий. C Единичные клетки ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Пример бластоцисты 4AA. В фокусе: Внутренняя клеточная масса В фокусе: Трофэктодермальный слой Таблица для оценки бластоцист Степень экспандирования/ хэтчинга Наименование Внутренняя клеточная масса Классификация трофэктодермального слоя Плотно упакован, содержит много клеток Несколько рыхло сгруппированных клеток Единичные клетки Много клеток формируют плотный эпителий Несколько клеток формируют рыхлый эпителий Единичные клетки A B C A B C 3 Зрелая бластоциста; бластоцель занимает весь объем эмбриона 4 Экспандированная бластоциста; объем полости больше, чем у раннего эмбриона, блестящая оболочка истончается 5 Бластоциста в процессе хэтчинга; трофэктодермальный слой начинает выпячиваться через блестящую оболочку 6 Вылупившаяся бластоциста; бластоциста полностью покинула блестящую оболочку Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 31 План культивирования бластоцисты (пример) План культивирования бластоцист отличается от рутинного плана 2-го дня / 3-го дня ЭКО. Ниже представлена ежедневная сводка. Мы предлагаем ознакомить с данной страницей весь персонал лаборатории. При использовании продуктов с пометкой PLUS обогащение не требуется. В других случаях проведите обогащение всех сред рекомбинантным человеческим альбумином (G-MM™) или раствором сывороточного человеческого альбумина (HSAsolution™), за исключением сред EmbryoGlue®, G-GAMETE™ и G-RINSE™. 32 -1-й день 0-й день 1-й день (день перед сбором яйцеклеток) Приготовьте среды G-RINSE™, G-MOPS™ и G-IVF™ для сбора яйцеклеток и инсеминации, как в рутинном протоколе ЭКО. Для ICSI приготовьте также чашки со средой G-1™. При использовании среды GGAMETE™ приготовьте чашки для отмывания яйцеклеток. Сбор яйцеклеток и инсеминация в среде G-IVF™. При проведении ICSI яйцеклетки следует поместить в среду G-1™ незамедлительно после инъекции. Приготовьте чашки со средой G-1™ во второй половине дня для использования в 1-й день. Приготовьте чашки со средой G-MOPS™ для отбора яйцеклеток. Оценка оплодотворения ЭКО и ICSI. Промойте в среде G-MOPS™/G-GAMETE™ и поместите в среду G-1™ для культивирования. 2-й день 3-й день 4-й день Необязательная оценка эмбрионов. Оценка дробления эмбрионов. Вскоре после полудня отмойте эмбрионы в среде G-MOPS™/ G­GAMETE™, ополосните лунку и перенесите эмбрионы в среду G-2™ для культивирования. Необязательная оценка эмбрионов. Во второй половине дня приготовьте чашки со средой EmbryoGlue® или G-2™ для переноса и чашки со средой G-2™ для замораживания и сохранения до 6-го дня. 5-й день 6-й день Оценка морфологии бластоцист. Используйте критерии оценки для переноса, заморозки и удержания. Перед переносом в полость матки перенесите бластоцисты в среду EmbryoGlue® или свежую среду G-2™. Оценка морфологии бластоцист. Используйте критерии оценки для переноса и заморозки. Не подвергайте криоконсервации бластоцисты, получившие на 6-й день оценку 3BB или ниже. Перенесите бластоцисты в среду EmbryoGlue® или свежую среду G-2™ перед переносом в полость матки. ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Перенос эмбрионов Перенос эмбриона (ПЭ) – это процесс размещения эмбриона в полости матки. Обычно он проводится трансцервикально, без обезболивания. Основные моменты • При манипуляциях с катетером следует надевать неталькованные перчатки из нетоксичного материала. • Следует постоянно соблюдать осторожность во избежание контаминации наконечника катетера. • Обычно пациентке переносят один или два эмбриона. • Большой объем (60 мкл) среды для переноса и большая площадь соприкосновения с воздухом могут спровоцировать экспульсию эмбриона в шеечный канал или за пределы катетера. Удаление столбика воздуха может минимизировать такие осложнения. Поэтому рекомендуется заполнить катетер, подсоединенный к герметичному шприцу объемом 1 см3, непрерывным столбиком (примерно 30 мкл) уравновешенной среды EmbryoGlue® или уравновешенной обогащенной среды G-2™/G-2™ PLUS. Желательно размещать эмбрионы ближе к началу столбика среды для переноса, как можно ближе к отверстию катетера. Размещение эмбрионов Практические рекомендации для гинекологов 1 Заранее договоритесь с пациенткой, чтобы на процедуру ПЭ она пришла с частично наполненным мочевым пузырем. В большинстве случаев это помогает достичь положения матки, удобного для простого введения мягкого атравматичного катетера. В случае загиба матки назад разрешите пациентке опорожнить мочевой пузырь. 2 Следует использовать одноразовый атравматичный катетер из нетоксичного материала, прошедший контроль качества. 3 Рекомендуется проводить перенос эмбрионов под ультразвуковым контролем. 4 Положите пациентку в позицию для камнесечения. Осмотрите шейку матки с помощью влагалищного зеркала, промытого уравновешенной средой G-RINSE™ с добавлением антибиотиков. При необходимости удалите шеечную слизь с помощью стерильного шприца. 5 Настоятельно рекомендуется проведение ультразвукового исследования (абдоминального) во время ПЭ для контроля над продвижением катетера через цервикальный канал. Для оценки простоты продвижения можно использовать пробный катетер. Если продвижение не вызывает затруднений, можно поместить эмбрионы в чистый катетер и провести ПЭ. Если на пути пробного катетера встретится какое-либо препятствие, можно предпринять несколько вариантов действий. Можно использовать обтуратор, обладающий некоторой гибкостью, для направления катетера в полость матки. В любом случае следует следить, чтобы травма цервикального канала и полости матки была минимальной. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 33 6 Оператор, выполняющий ПЭ, должен соблюдать осторожность, чтобы не потерять и не повредить эмбрион в результате сгибания или пережатия катетера. 7 Катетер должен пройти цервикальный канал за внутренний зев. Для этого врачу может быть достаточно тактильных ощущений. Катетер должен иметь четкую разметку, что поможет определить глубину его введения. Для подтверждения положения катетера следует использовать ультразвуковое исследование. 8 Выпустите эмбрион(-ы) в полость матки примерно в 30 мкл среды для переноса и медленно извлеките катетер, сохраняя постоянное давление на поршень шприца. 9 Проведите заключительное микроскопическое исследование катетера. Более полный обзор по этой теме см. в статье: Schoolcraft, Surrey and Gardner (2001) Embryo transfer: techniques and variables affecting success. Fertil. Steril.76; 863-870. 34 ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Установка катетера Практические рекомендации для лаборантов 1 Перенос эмбрионов может осуществляться либо в уравновешенной среде EmbryoGlue®, либо в уравновешенной обогащенной среде G-2™/G-2™ PLUS. 2 Добавьте примерно 1 мл среды EmbryoGlue® в центральную лунку ополоснутой однолуночной чашки. 3 Добавьте примерно 2 мл среды EmbryoGlue® на ободок однолуночной чашки. 4 Предварительно уравновесьте чашку при +37 °C и 6 % CO2 в течение 4-18 часов. 5 Перед переносом отобранные для переноса эмбрионы следует предварительно уравновесить в лунке со средой EmbryoGlue® минимум в течение 10 минут в атмосфере с 6 % CO2. Максимально рекомендованное время нахождения в среде EmbryoGlue для эмбрионов на 2-й день составляет 30 минут. Максимально рекомендованное время нахождения в среде EmbryoGlue для эмбрионов на 3-й день и бластоцист составляет 2 часа. 6 Промойте шприц из нетоксичных материалов емкостью 1 мл, набирая и выпуская среду с ободка лунки несколько раз, до тех пор пока в шприце не останется пузырьков воздуха. Наберите примерно 0,5 мл среды с ободка лунки. 7 Прочно присоедините катетер для переноса к шприцу из нетоксичных материалов емкостью 1 мл. Промойте катетер, набирая и выпуская по 0,5-1,0 мл уравновешенной среды для переноса с ободка чашки. 8 После промывания наберите около 0,1 мл среды EmbryoGlue® из центральной лунки и выпустите на ободок, пока в шприце не останется приблизительно 20 мкл среды. 9 Под микроскопическим контролем аккуратно наберите эмбрионы в катетер в примерно 5-10 мкл дополнительной среды EmbryoGlue®, после чего добавьте небольшое количество воздуха. (Небольшая воздушная полость в наконечнике позволяет лучше его визуализировать при ультразвуковом контроле переноса.) Для осуществления переноса эмбрионов введите наконечник катетера в полость матки приблизительно на 1 см от ее дна и выпустите эмбрионы вместе с 25-30 мкл среды. Медленно извлеките катетер, сохраняя постоянное давление на поршень шприца. Проведите заключительное микроскопическое исследование катетера. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) 35 Эта страница намеренно оставлена пустой. 36 ЭКО с подсадкой эмбриона (IVF-ET) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микро­ манипуляции Микроманипуляции включают процедуры ICSI (внутрицитоплазматической инъекция сперматозоида в яйцеклетку), вспомогательный хэтчинг и биопсию эмбриона. Основные моменты • Все оборудование для микроманипуляций должно быть правильно размещено и ориентировано для максимальной стабильности. Рекомендуется располагать его вдали от дверей лифтов, которые могут вызвать вибрацию, воздушных потоков и маршрутов движения, провоцирующих стрессовые перебои и шум. • Инвертирующий микроскоп должен быть оборудован термостоликом, правильно отрегулированным для поддержания температуры жидкости в чашке на уровне +37 °C. Очень важно во время манипуляций поддерживать температуру на постоянном уровне. • Осмоляльность контролируется путем покрытия капель среды уравновешенным маслом. • Для соблюдения единообразия и контроля за качеством все манипуляции следует проводить высококачественными микроинструментами из нетоксичных материалов, см. “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Пипетки для ICSI и фиксирующие пипетки”. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции 37 Денудация яйцеклеток перед ICSI Для проведения ICSI необходимо удалить кумулюсную массу и лучистый венец с яйГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ А GIIIденудацией. цеклеток. Этот процесс называется Ее можно выполнить методом больших объемов без масляного покрытия, с использоА ванием многолуночных чашек, или капельным методом под масляным покрытием. Раствор HYASE™ (гиалуронидаза) применяется для облегчения рассеивания кумулюса и лучистого а) венца. С помощью стеклянной пипетки (см. “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Пипетки для денудации”) удалите клетки путем аккуратного пипетирования верх и вниз. б) Диаметрв)пипетки должен быть немного больше, чем размер яйцеклетки (примерно 130-175 мкм). При использовании стеклянных пипеток могут понадобиться несколько разных размеров. При использовании слишком узких пипеток или пипеток с зазубренными краями возможно повреждение яйцеклетки. Передерживание в растворе HYASE™, грубая обработка, выдерживание при pH и температуре ниже физиологических также могут вызвать повреждение яйцеклетки. ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ, Б, В, на Г, GIII Особенно чувствительны яйцеклетки стадии зародышевого пузырька. Вследствие перечисленных выше причин важно использовать правильную концентрацию HYASE™ и соблюдать рекомендованное время воздействия. Раствор HYASE™ концентрирован в 10 раз, и его следует Б Г В разводить 1:10 обогащенной средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS или средой G-GAMETE™. Внимание Воздействие раствора HYASE™ дольше 30 секунд может вызвать повреждение яйцеклетки. а) Практические рекомендации 1 Разведите раствор HYASE™ обогащеннойА, средой G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS или ПОДГОТОВКА К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ Б средой G-GAMETE™. а) а) А Б 2 Приготовьте ополоснутые чашки для денудации с разведенным раствором HYASE™ и обогащенной средой G-MOPS™/G-GAMETE™ для отмывания яйцеклеток. 3 Для каждой лунки, содержащей разведенный раствор HYASE™, подготовьте три лунки для отмывания, содержащих приблизительно 1 мл или 6 капель (50-100 мкл) б) б) обогащенной среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™, покрытых маслом (А, Б). Если используется среда G-MOPS/G-MOPS PLUS, уравновесьте ее при +37 °C в атмосфере помещения в течение примерно 15 минут. Если используется среда G-GAMETE, следует уравновесить МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б ее при 6 % CO2 до достижения необходимого pH, желательно в течение ночи. Одновременно приготовьте чашки для ICSI (см. ниже “ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ - ПРИГОТОВЛЕНИЕ”). А а) е) б) а) в) б) г) в) д) г) A. Капли, покрытые маслом. Б а) Раствор HYASE™ б-е) Капли среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ для отмывания б) 38 а) Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции г) в) в) г) в) д) г) Б б) а) г) в) Б. Многолуночная чашка. С масляным покрытием и без него. а) Раствор HYASE™ б-г) Капли среды G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™ для отмывания 2 С помощью пипетки с широким просветом (см. “Инструменты Swemed от Vitrolife” ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, яйцеклеток Б (стр. 62), “Пипетки для переноса”) поместите 3-5 в разбавленный раствор HYASE™. Аккуратно пипетируйте гиалуронидазу и яйцеклетки. Кумулюсные клетки начнут рассеиваться. Важно не передерживать яйцеклетки в растворе А Б гиалуронидазы дольше 30 секунд. а) а) 1 3 Перенесите частично денудированные яйцеклетки для отмывания, 4 1 в первую лунку 6 2 следя за тем, чтобы захваченное количество раствора гиалуронидазы было мини2 мальным. С помощью пипеткиб)для денудации с узким просветом5(см. “Инструменты 6 3 Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Пипетки для денудации”) аспирируйте и выпускайте 3 б) 5 яйцеклетки для 4 удаления лучистого венца. Ополосните яйцеклетки в нагретой обогащенной среде G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS или в уравновешенной среде G‑GAMETE™. Повторите в новых чашках до денудации всех яйцеклеток. 4 Определите степень зрелости ооцитов по присутствию (М2) или отсутствию (М1) КРИОСОЛОМИНКА 1 полярных телец, либо присутствию зародышевого пузырька (GV). Поместите все зрелые ооциты (М2) в подготовленные капли среды для ICSI, если их необходимо инъецировать немедленно. Если денудированные яйцеклетки нужно инкубировать в течение определенного времени перед инъекцией, их следует поместить в обогащенную среду инъекции. а) б) G-1™/G-1™ в) г)PLUSд)до времени е) ж) з) Незрелые и) ооциты (М1 и GV) могут быть помещены в питательную среду для дальнейшей инкубации и созревания. Практические рекомендации - приготовление a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г) FS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см 1 Предварительно нагреть обогащенную G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS и OVOIL™ е) FS 2 + эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздухасреду 1/4 см з) FS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка при +37 °C примерно 15 минут или уравновешивать G-GAMETE™ при +37 °C и 6 % CO2 не менее 4 часов. 2 Нагрейте ICSI™ (вязкий КРИОСОЛОМИНКА 2 раствор для иммобилизации сперматозоидов) до температуры +20 ±5 °C. а) б) в) г) д) е) ж) з) и) a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г) BFS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см е) BFS 2 + эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) BFS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции 39 а) г) в) 3 Чашки для ICSI следует готовить быстро. Поместите каплю объемом 1-10 мкл раствора ICSI™ в центр чашки и капли объемом 6-10 мкл обогащенной среды G‑MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™, покройте маслом OVOIL™. Не следует готовить более одной чашки за один раз, чтобы испарения капель. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А,избежать Б Необходимо работать быстро и расположить все объекты работы под рукой (А, Б). Подготовьте по две чашки на каждого пациента. А Б 1 6 а) а) 2 б) 3 5 1 4 2 5 3 6 б) 4 A. Вариант 1 а) Капли 1-6 среды для яйцеклеток (G-MOPS™/G-GAMETE™) б) ICSI™ КРИОСОЛОМИНКА 1 Б. Вариант 2 a) Капли 1-6 среды для яйцеклеток (G-MOPS™/G-GAMETE™) б) ICSI™ 4 Подогревайте чашки при +37 °C не менее 15 минут, если используется среда G‑MOPS™. Если используется среда G-GAMETE™, уравновешивайте чашки при +37 °C и 6 % CO2 не менее 4 часов. а) б) в) г) д) е) ж) з) и) Процедура ICSI a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г) FS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см FS 2 процедура + эмбрионы, инъекции 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) FS 2, яйцеклетки. 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка ICSI е) – это сперматозоидов внутрь ICSI делает возможной беременность у пар с серьезным мужским фактором бесплодия. При выполнении ICSI часто2используют поливинилпирролидон (PVP) из-за его вязкости. Он КРИОСОЛОМИНКА уменьшает подвижность сперматозоидов и упрощает их “захват”, обеспечивая необходимую иммобилизацию и “разрушение” мембраны хвоста сперматозоидов перед инъекцией. Кроме того, он позволяет контролировать инъекцию спермы путем замедления скорости вводимой жидкости. а) б) в) г) д) е) ж) з) и) Он помогает стабилизировать процесс микроинъекции и минимизировать объем жидкости, вводимой в яйцеклетку. Все эти факторы способствуют успеху манипуляции. Основные моменты 40 • Иммобилизуйте сперматозоид, захватив его инъекционной сразу за воздуха 1/4 см a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г)пипеткой BFS 2, 2 см д) Пузырек е) BFS 2 +(“разрушение эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) BFS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка шейкой хвоста”). • Введите сперматозоид глубоко (на 50-75 % диаметра яйцеклетки) в цитоплазму и проследите, чтобы он не извлекся вслед за инъекционной пипеткой. Микроманипуляции Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife • Для предотвращения экспульсии сперматозоида в перивителлиновое пространство убедитесь в том, что оболочка яйцеклетки разорвана, путем аспирации небольшого количества цитоплазмы. • Минимизируйте объем раствора ICSI™ (PVP), вводимого в яйцеклетку. Информацию о пипетках для ICSI и фиксирующих пипетках см. в разделе “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62). Практические рекомендации 1 Поместите небольшой объем (1-2 мкл) подготовленной суспензии спермы в центр капли раствора ICSI™. Нагревайте чашки в течение нескольких минут на термостолике для миграции сперматозоидов к внешнему периметру капли. 2 Заполните пипетку раствором ICSI™ для уменьшения риска склеивания сперматозоидов внутри пипетки. 3 Поместите денудированные яйцеклетки в обогащенную среду G-MOPS™/G-MOPS™ PLUS/G-GAMETE™, по одной в каждую каплю, максимум 4 яйцеклетки за один прием. 4 Иммобилизуйте отдельный сперматозоид с помощью инъекционной пипетки для “разрушения” мембраны его хвоста. Важно не повредить область шейки сперматозоида, поскольку там содержится центриоль, играющая важную роль в расхождении хромосом при делении клеток. Недостаточное “разрушение” хвоста приводит к снижению показателей оплодотворения. Аспирируйте отдельный иммобилизованный сперматозоид. 5 Переместите каплю с яйцеклеткой в поле зрения. Для фиксации яйцеклетки во время инъекции используйте фиксирующую пипетку. Разместите яйцеклетку так, чтобы ее полярные тельца находились на 7 или 1 часах условного циферблата. Чтобы снизить риск повреждения веретена деления, проведите инъекцию сперматозоида на 4 часах условного циферблата. Инъецируйте сперматозоид с минимально возможным количеством среды ICSI™ и после инъекции убедитесь в прекращении тока жидкости в инъекционной пипетке. Контролируйте время, в течение которого чашки находятся вне инкубатора. В случае возникновения сложностей или неопытности лаборанта следует подготовить меньшее количество яйцеклеток. 6 После инъекции всех яйцеклеток промойте несколькими каплями обогащенной среды G-1™/G-1™ PLUS и поместите их в подготовленные системы для культивирования G-1™ на ночь. 7 На следующий день проводится оценка оплодотворения яйцеклеток по наличию двух пронуклеусов (PN) и двух полярных телец. Неоплодотворенные или дегенеративные яйцеклетки, яйцеклетки с менее или более чем с 2 PN следует удалить из культуры. После оценки зигот следует промыть уравновешенной обогащенной средой G-1™/G-1™ PLUS и переместить затем в новую чашку с уравновешенной обогащенной средой G-1™/G-1™ PLUS для культивирования. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции 41 Сложные случаи ICSI Уровень сложности случая, в основном, определяется тремя факторами: • Оператор • Оборудование • Образец спермы Первый фактор определяется подготовкой, опытом, выдержкой и умениями оператора. Очень важным в подготовке к ICSI, особенно в сложных случаях, является достаточное количество времени и ресурсов. Оборудование должно быть простым в использовании и обеспечивать оператору устойчивость для концентрации в сложных ситуациях, наблюдающихся при поиске и захвате сперматозоидов. Эргономичная рабочая станция для ICSI обеспечивает плавность работы и увеличивает выдержку оператора. Образец спермы также может представлять трудности. Например, суспензия спермы, приготовленная из биоптата яичка, также как полученная в тяжелых случаях олигоастенотератоспермии, обычно содержит малое количество малоподвижных и вялых сперматозоидов с наличием продуктов распада и других клеток. Проблемы могут возникнуть также с образцами замороженной и оттаянной эпидидимальной спермы. Может выжить только небольшая фракция сперматозоидов, и эти выжившие сперматозоиды могут демонстрировать очень медленные поступательные движения или не двигаться вообще. Третьим примером сложного случая ICSI является сперма, полученная с помощью электроэякуляции. В этом случае количество клеток может быть очень высоким, а подвижность очень низкой. Кроме того, могут присутствовать другие клетки и продукты распада. Малое количество сперматозоидов, низкая подвижность и поступательные движения Используйте среду SpermGrad™ для восстановления сперматозоидов (см. “Подготовка спермы”). Добавьте суспензию спермы к капле уравновешенной обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS. Перенесите сперму в среду ICSI™ перед началом работы. Следует отметить, что в случаях крайне малого количества сперматозоидов образец спермы можно отмыть в уравновешенной обогащенной среде G-IVF™/G-IVF™ PLUS и центрифугировать при 300-600 g в течение 10 минут без предварительного центрифугирования в градиенте плотности. Ресуспендируйте сперматозоиды в 200-500 мкл уравновешенной обогащенной среды G-IVF™/G-IVF™ PLUS и используйте как можно скорее. 42 Микроманипуляции Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Биопсия яичка Для сбора образца используйте среду G-MOPS™ PLUS. Перенесите ткань в стерильную чашку Петри из нетоксичных материалов и измельчите на мелкие кусочки. Перенесите измельченный материал в маленькие конические аналитические пробирки и центрифугируйте 5 минут при 300-600 g. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок в среде G-MOPS™ PLUS. Может потребоваться повторное отмывание. Поместите капли материала биоптата яичка объемом 5-10 мкл в маленькую чашку Петри и покройте маслом OVOIL™. Восстановите тестикулярные сперматозоиды и соберите их в отдельные чистые капли среды G-MOPS™ PLUS до инъекции. Если подготовленный материал будет использоваться на следующий день, инкубируйте его в обогащенной среде G-IVF™/G-IVF™ PLUS при +37˚C и 6 % CO2. Биопсия эмбриона Биопсия эмбриона – это процедура удаления бластомера из эмбриона для проведения предимплантационной генетической диагностики (ПГД). Основные моменты • Биопсию эмбриона обычно проводят утром 3-го дня, до начала сжатия бластомеров. • Отверстие в блестящей оболочке может быть получено с помощью раствора Тироде, лазера или путем ее частичного иссечения. • Для удаления бластомера, подлежащего биопсии, понадобится отдельная пипетка. См. “Инструменты Swemed от Vitrolife” (стр. 62), “Пипетка для биопсии бластомера”. Внимание В среде G-PGD™ в качества буфера использован MOPS, поэтому ее можно использовать наряду со средой G-MOPS™ (см. стр. 8). Среду G-PGD™ запрещается помещать в CO2 инкубатор, но следует нагревать в термоблоке для пробирок или в инкубаторе без CO2. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Микроманипуляции 43 Практические рекомендации 1 Приготовьте чашки с каплями предварительно нагретой обогащенной среды G‑PGD™, покрытой маслом OVOIL™. 2 Отмойте эмбрион в нескольких каплях обогащенной среды G-PGD™ для удаления среды для культивирования. 3 Поместите эмбрион в среду G-PGD™ (содержащую MOPS в качестве буфера и не содержащую Ca2+ и Mg2+) при температуре +37 °C. 4 Удерживайте эмбрион фиксирующей пипеткой. 5 Сделайте отверстие в блестящей зоне. Введите в отверстие чистую пипетку для биопсии и аккуратно аспирируйте один или два бластомера для анализа. 6 После активного промывания в среде G-2™/G-2™ PLUS для удаления среды G‑PGD™ поместите эмбрионы в уравновешенную обогащенную среду G-2™/G-2™ PLUS для культивирования до получения результатов анализа биопсии эмбриона. Незатронутые эмбрионы могут быть отобраны для переноса в свежем виде на 5-й день или для криоконсервации, если они имеются в избытке. Перенос эмбриона обычно осуществляется на 5-й день, после завершения генетической диагностики. Внимание • Потратьте время на то, чтобы удержать эмбрион фиксирующей пипеткой так, чтобы четко идентифицировать и взять биопсию бластомера, содержащего ядро. • Если наблюдается уплотнение, между бластомерами появляются соединения, затрудняющие их удаление. Терпеливо тяните и двигайте пипетку из стороны в сторону для облегчения удаления бластомера. • Зазубренные края пипетки для биопсии могут вызвать лизис клетки, взятой для биопсии. Поэтому используйте только пипетки высочайшего качества. 44 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов Основные моменты • Результаты криоконсервации зависят от исходной доли успешных попыток ЭКО в клинике. Если результаты свежего ЭКО низкие, это будет отражено и в результатах криоконсервации. • Результаты зависят от надлежащего состояния и точной калибровки оборудования для замораживания, бережного обращения и пристального внимания при выборе исключительно эмбрионов с хорошей морфологией. Перечень оборудования Это лишь предлагаемый список, возможны варианты замены. 1 Система криоконсервации: Решение о покупке должно основываться на стоимости, наличии доступного места и возможности технического обслуживания. 2 Сосуд для хранения: Это должен быть сосуд, предназначенный только для хранения человеческих эмбрионов. Традиционным методом является погружение в жидкий азот. При криоконсервации эмбрионов пациентов с инфекционными заболеваниями следует использовать отдельные сосуды. 3 Криосоломинки или пластиковые криопробирки для замораживания: Они должны быть стерильными, изготовленными из нетоксичных высококачественных материалов. 4 Количество используемого жидкого азота (LN2) зависит от выбора оборудования и системы для хранения. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов 45 Криоконсервация – это замораживание и оттаивание клеток с минимальными повреждениями. Это достигается применением криопротектора, который обезвоживает клетки и препятствует кристаллизации воды во время охлаждения. Выбор подходящего профиля температуры в процессе охлаждения способствует максимальному обезвоживанию клеток. Криопротектор вводится таким образом, чтобы снизить риск осмотического разрыва и токсического воздействия на клетки высокой осмоляльности и высоких концентраций криопротектора. Выбор применяемого криопротектора зависит от развития клеток эмбрионов. Для эмбрионов в стадии дробления обычно используется пропанедиол, а для эмбрионов на стадии бластоцисты – глицерол. Важно знать, что на этапе хранения в жидкой фазе жидкого азота повреждения клеток не наблюдается. Для выживания клеток решающее значение имеет процесс замораживания и оттаивания. Эмбрионы помещают в растворы криопротекторов, а затем в емкости – криосоломинки или криопробирки. Затем биологический замораживатель понижает температуру вокруг этих емкостей с точно контролируемой скоростью. В точке замерзания раствора путем прикосновения к емкостям пинцетом, погруженным в жидкий азот, индуцируется образование кристаллов льда. Этот процесс называется сидингом или индукцией льдообразования. Если он будет пропущен или неправильно проведен, возможно серьезное повреждение клеток вследствие недостаточного обезвоживания и образования льда внутри клеток. Образование внеклеточного льда является решающим моментом запуска контролируемого обезвоживания эмбриона. Поскольку повышается концентрация непроникающих растворенных веществ снаружи и вода замерзает вне эмбриона, вода устремляется наружу, вызывая таким образом обезвоживание эмбриона. Этот процесс продолжается до достижения эмбрионом точки замерзания. Если охлаждение проводится слишком быстро, эмбрион остается недостаточно обезвоженным. При слишком медленном оттаивании эмбриона после замораживания переохлажденная вода в процессе медленного нагревания кристаллизуется, а внутриклеточный лед вызывает повреждение. Скорость оттаивания обычно зависит от применяемого криопротектора и скорости охлаждения после достижения -40 °C. Если эмбрион заморожен с помощью быстрой заморозки, т. е. с высокой скоростью охлаждения после достижения -40 °C, оттаивание также следует проводить быстро, т. е. погружением в водяную баню при +30 °C (500 °C/мин). Напротив, если замораживание было медленным, т. е. с низкой скоростью охлаждения до -80 °C, то оттаивание следует проводить в морозильной камере со скоростью около +10 °C /мин. Глицерол требует быстрого оттаивания. Более подробная информация о протоколах криоконсервации бластоцист находится в следующих источниках: • Gardner DK, Maybach J, Lane M (2001) Hyaluronan and RHSA increase blastocyst cryosurvival. Proc 17th World Congress on Fertility and Sterility, Melbourne. pp 226 •Lane et al (2003) Cryo-survival and development of bovine blastocysts are enhanced by culture with recombinant albumin and hyaluronan. Mol Reprod Dev 64:70-78 • 46 Gardner DK et al (2003) Changing the start temperature and cooling rate in a slowfreezing protocol increases human blastocyst viability. Fertil and Steril 79 (2): 407-410 Криоконсервация эмбрионов Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов на стадии дробления Этот метод криоконсервации может применяться для яйцеклеток, яйцеклеток пронуклеарной стадии вплоть до эмбрионов, состоящих из 8 клеток. Это метод, адаптированный у Тестара с соавторами (1986); в качестве проникающего криопротектора применяется 1,2-пропандиол (PrOH). В качестве не проникающего криопротектора также применяется сахароза. Сахароза – это большая молекула, вызывающая своей осмоляльностью обезвоживание во время охлаждения и защищающая клетки от лизиса в процессе оттаивания эмбрионов. Поскольку в качестве буфера применяется раствор с фосфатом, все этапы можно проводить вне инкубатора и при комнатной температуре. FREEZE-KIT1™ Раствор Cryo-PBS = Раствор, забуференный фосфатом, с 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина (HSA) Раствор для замораживания 1 = FS1 = 1,5 M PrOH в растворе Cryo-PBS Раствор для замораживания 2 = FS2 = 1,5 M PrOH + 0,1 M сахарозы в растворе Cryo-PBS Пример программы замораживания для эмбрионов на стадии дробления Продолжительность процедуры замораживания, включая уравновешивание криопротектора, составляет примерно 2 часа. Исходная температура +18.0 до +25 °C Этап 1 Снизить температуру со скоростью -2,0 °C /мин до -7,0 °C Этап 2 ВЫДЕРЖАТЬ при температуре -7,0 °C в течение 10 минут, ИНДУЦИРОВАТЬ через 2 минуты Этап 3 Снизить температуру со скоростью -0,3 °C /мин до -30,0 °C Этап 4 Снизить температуру от -30,0 °C до -80,0 °C и ниже (минимальная скорость 10 °C/мин) Выньте криосоломинки и окуните в LN2, хранить криосоломинки погруженными в LN2 (не в газовой фазе). Основные моменты • Подвергайте криоконсервированию только эмбрионы хорошего качества, поскольку уровень выживаемости при оттаивании зависит от исходного качества эмбриона. • Перед началом процедуры сверьте идентификационные данные пациента и оформите все документы. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов 47 ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОМАНИПУЛЯЦИИ А, Б Практические рекомендации А Б а) а) 1 1 Промаркируйте чашки для растворов для замораживания, внесите пипеткой 1 6 количество Cryo-PBS, 2 нужное FS1 и FS2 в соответствующие чашки.4 Уравновесьте при комнатной температуре. б) 5 2 2 Подробно изучите и запишите морфологию эмбрионов. Промойте 6 подлежащие 3 3 б) 5 замораживанию эмбрионы в растворе Cryo-PBS. 4 3 Аккуратно поместите эмбрионы в раствор FS1 на 10 минут (ни в коем случае не больше чем на 20 минут). Во время этого этапа клетки эмбриона сморщиваются, а затем повторно уравновешиваются. КРИОСОЛОМИНКА 1 4 Перенесите эмбрионы в раствор FS2, а затем наберите в криосоломинки путем присоединения их к шприцу емкостью 1 мл (присоединение осуществляется с помощью силастиковой трубки длиной 1 см). Отсоедините и герметично закройте криосоломинки во избежание попадания внутрь жидкого азота. а) б) в) г) д) е) ж) з) и) а) Шприц е) Раствор FS 2 + эмбрионы, 2-3 см б) Пластиковая трубка ж) Пузырек воздуха 1/4 см a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г) FS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см в) Герметизирующая ватная пробка з) Раствор FS 2, 1 см е) FS 2 + эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) FS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка г) Раствор FS 2, 2 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка д) Пузырек воздуха 1/4 см 5 Поместите в камеру для КРИОСОЛОМИНКА 2 замораживания при комнатной температуре и запустите программу замораживания. 6 Вручную индуцируйте льдообразование при температуре –7 °C прикосновением а) б) в) (LN ),г)к криосоломинке д) е) вблизи ж) ватной з) и) пинцета, охлажденного жидким азотом пробки. 2 Не индуцируйте льдообразование вблизи эмбрионов. Не роняйте и не встряхивайте криосоломинку. Наличие пузырьков воздуха в криосоломинке может снизить выживаемость клеток. Продолжите программу замораживания. 7 Замораживание длится примерно 2 часа. Следует уделить внимание обращению Шприц б) Пластиковая трубка в) ватная пробка г) 2, 2 см д) сa)криосоломинками при низкихГерметизирующая температурах, поскольку они BFS очень легкоПузырек могут воздуха 1/4 см е) BFS 2 + эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) BFS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка лопнуть. Погрузите в жидкий азот и оставьте для хранения при -196 °C. Программа оттаивания эмбрионов на стадии дробления Thaw-kit 1™ Раствор для оттаивания 1 = TS1 = 1,0 M PrOH + 0,2 M сахарозы в растворе Cryo-PBS Раствор для оттаивания 2 = TS2 = 0,5 M PrOH + 0,2 M сахарозы в растворе Cryo-PBS Раствор для оттаивания 3 = TS3 = 0,2 M сахарозы в растворе Cryo-PBS 48 Криоконсервация эмбрионов Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Основные моменты • Оттаивайте криосоломинки по одной. • Все этапы проводите при комнатной температуре. • Тщательно проверьте идентификационные данные пациента и соответствующим образом оформите документы. Практические рекомендации 1 Идентифицируйте пациента и расположение криосоломинки. Подготовьте все документы. Держите криосоломинки покрытыми LN2 в небольшом сосуде Дьюара до момента оттаивания. Промаркируйте чашки для растворов для оттаивания и внесите пипеткой необходимое количество TS1, TS2, TS3 и Cryo-PBS. 2 Достаньте криосоломинку и оттаивайте ее на воздухе в течение 30 секунд. В течение этого времени осторожно держите криосоломинку, убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха, трещин или протечек LN2. 3 Поместите криосоломинку в водяную баню с температурой +30 °C на 30 секунд. Выньте и аккуратно вытрите ее. Отрежьте запаянный конец криосоломинки стерильными ножницами и присоедините к шприцу емкостью 1 мл. Осторожно отрежьте другой конец криосоломинки; не встряхивать криосоломинку, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. 4 Осторожно перенесите эмбрионы в раствор TS1. Осмотрите вышедшие из криосоломинки эмбрионы и, если не увидите их всех, вновь быстро наберите раствор в криосоломинку и осторожно промойте. Иногда эмбрионы прилипают к стенками криосоломинки. 5 Инкубируйте эмбрионы в растворе TS1 в течение 5 минут. 6 Аккуратно перенесите эмбрионы в раствор TS2 приблизительно на 5 минут. Помните, что эти эмбрионы подверглись осмотическому СТРЕССУ и нуждаются в ОЧЕНЬ БЕРЕЖНОМ обращении. 7 Перенесите эмбрионы в раствор TS3 на 5-10 минут. Эмбрионы подверглись действию стрессовых факторов, и их мембраны очень хрупкие. 8 Поместите эмбрионы в раствор Cryo-PBS комнатной температуры на 6 минут, а затем на 4 минуты на термостолик при температуре 37 °C. Не помещайте их в инкубатор CO2, поскольку буферной емкости раствора Cryo-PBS достаточно для поддержания атмосферы 5 % CO2. 9 Можно поместить эмбрионы в уравновешенную обогащенную среду G-1™/G-1™ PLUS (или G-2™/G-2™ PLUS, если эмбрионы подверглись криоконсервации на 3-й день). Оцените и запишите выживаемость и морфологию в сравнении с состоянием перед замораживанием. Эмбрионы можно перенести незамедлительно, а можно оставить для дальнейшего культивирования. Яйцеклетки на стадии пронуклеусов следует культивировать в течение ночи в среде G-1™/G-1™ PLUS и переносить только при наличии нормального дробления. 10 Цикл оттаивания очень важен для успешности криоконсервации эмбрионов. Убедитесь, что перенос эмбриона проводится в соответствующий день цикла. Подсадку эмбрионов можно осуществлять как в естественном, так и в искусственном цикле. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов 49 Криоконсервация эмбрионов на стадии бластоцисты G-FreezeKit Blast™ Проведите обогащение рекомбинантным человеческим альбумином (G-MM™) 50 мг/мл или раствором сывороточного человеческого альбумина (HSA-solution™) 100 мг/мл: Среды для инкубации бластоцист (BIM) = 9,0 мл BIM + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™. Раствора для замораживания бластоцист 1 (BFS 1) = 9,0 мл BFS 1 + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™. Раствора для замораживания бластоцист 2 (BFS 2) = 9,0 мл BFS 2 + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™. В основе среды BIM лежит модифицированная среда G-2™ с MOPS в качестве буфера, не содержащая сахарозу и глицерол. Раствор BFS1 содержит 100 мM сахарозы и 5 % глицерола Раствор BFS2 содержит 200 мM сахарозы и 10 % глицерола Пример программы замораживания для эмбрионов на стадии бластоцисты Исходная температура -6 °C Этап 1 Индуцируйте льдообразование через 2 минуты Этап 2 ВЫДЕРЖАТЬ в течение 10 минут Этап 3 Охладите со скоростью 0,5 °C/мин до -32 °C Выньте криосоломинки и окуните в LN2, храните погруженными в LN (не в газовой фазе). 2 Основные моменты 50 • Подвергайте криоконсервированию только эмбрионы хорошего качества (≥ 3BB), поскольку уровень выживаемости при оттаивании зависит от исходного качества эмбриона. • Перед началом проведения процедуры проверьте идентификационные данные пациента и оформите все документы. Криоконсервация эмбрионов Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife А Б а) а) 1 1 4 б) 2 5 3 5 Практические рекомендации 3 6 6 2 б) 4 1 Промаркируйте чашки для BIM, BFS 1 и BFS 2. Внесите пипеткой по 800 мкл BIM, BFS 1 и BFS 2 в соответствующие чашки. Уравновешивайте до температуры +20 ±5 °C. 2 Подробно изучите и запишите морфологию эмбрионов. Промойте бластоцисты, КРИОСОЛОМИНКА 1 предназначенные для замораживания, средой BIM. 3 Аккуратно поместите эмбрионы в раствор BFS 1 на 10 минут. 4 Перенесите эмбрионы в раствор BFS 2 на 7 минут. а) б) в) г)минимальные д) е)объемыж)среды. з) 5 При перемещении эмбрионов используйте и) 6 В течение 7 минут промойте криосоломинку раствором BFS 2 в отдельной чашке/ лунке. 7 Через 7 минут перенесите бластоцисты в новую лунку с раствором BFS 2 для a) Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая ватная пробка г) FS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см заполнения криосоломинок. е) FS 2 + эмбрионы, 2-3 см ж) Пузырек воздуха 1/4 см з) FS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка 8 Наберите бластоцисты в предварительно промытые криосоломинки путем присоединения их к шприцу емкостью 1 мл (присоединение можно осуществить с помощью силастиковой трубки длиной 1 см). Отсоедините и герметично закройте КРИОСОЛОМИНКА 2 криосоломинки во избежание попадания внутрь жидкого азота. Время нахождения в растворе BFS 2 не должно превышать 15 минут. а) б) в) г) д) е) ж) з) и) а) Шприц е) Раствор BFS 2 + эмбрионы, 2-3 см б) Пластиковая трубка ж) Пузырек воздуха 1/4 см Шприц б) Пластиковая трубка в) Герметизирующая в)a)Герметизирующая ватная пробка з) Раствор BFS 2, 1 см ватная пробка г) BFS 2, 2 см д) Пузырек воздуха 1/4 см BFS 2 +BFS эмбрионы, воздухакрышка: 1/4 см з) BFS 2, 1 см и) Герметичная крышка: пластиковая пробка г)е)Раствор 2, 2 см 2-3 см ж) Пузырек и) Герметичная пластиковая пробка д) Пузырек воздуха 1/4 см 9 Незамедлительно перенесите в камеру для замораживания при температуре -6 °C. 10 Подождите 2 минуты. 11 Вручную индуцируйте льдообразование при температуре –6 °C прикосновением пинцета, охлажденного LN2, к верхушке столбика, содержащего эмбрионы. Не индуцируйте льдообразование вблизи эмбрионов. Не роняйте и не встряхивайте криосоломинку. Наличие пузырьков воздуха в криосоломинке может снизить выживаемость клеток. Выдержите при заданной температуре еще 10 минут и запустите программу замораживания. 12 Замораживание длится примерно 50 минут. Следует уделить внимание обращению с криосоломинками при низких температурах, поскольку они очень легко могут лопнуть. Погрузите в жидкий азот и оставьте для хранения при -196 °C. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов 51 Программа оттаивания эмбрионов на стадии бластоцисты G-FreezeKit Blast™ Проведите обогащение рекомбинантным человеческим альбумином (G-MM™) 50 мг/мл или раствором сывороточного человеческого альбумина (HSA-solution™) 100 мг/мл: Раствор для оттаивания бластоцист 1 (BTS 1) = 9,0 мл BTS 1 + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™ Раствор для оттаивания бластоцист 2 (BTS 2) = 9,0 мл BTS 2 + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™ Раствор для оттаивания бластоцист 3 (BTS 3) = 9,0 мл BTS 3 + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™ Среды для инкубации бластоцист (BIM) = 9,0 мл BIM + 1,0 мл G-MM™ или 1,0 мл HSA-solution™ Раствор BTS 1 содержит 200 мM сахарозы и 10 % глицерола Раствор BTS 2 содержит 100 мM сахарозы и 5 % глицерола Раствор BTS 3 содержит 100 мM сахарозы. В основе среды BIM лежит модифицированная среда G-2™ с MOPS в качестве буфера, не содержащая сахарозу и глицерол. Практические рекомендации Все процедуры проводятся при комнатной температуре. 1 Промаркируйте чашки для BIM, BTS 1, BTS 2, и BTS 3. Внесите пипеткой по 800 мкл BIM, BTS 1, BTS 2, и BTS 3 в соответствующие чашки. Уравновешивайте до температуры +20 ±5 °C. 2 Наполните сосуд Дьюара LN2, быстро выньте стрежни из криохранилищ и поместите в сосуд Дьюара с LN2. 3 С помощью пинцета выньте криосоломинки из стержня и оттаивайте на воздухе 10 секунд. 4 Поместите соломинку в водяную баню с температурой +30 °C на 30 секунд. 5 Выньте криосоломинку и тщательно вытрите досуха. Срежьте ватный конец соломинки и вставьте отрезанный конец в шприц емкостью 1 мл. Шприц со вставленной соломинкой используется для выпускания эмбрионов. 52 Криоконсервация эмбрионов Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife 6 Отрежьте другой конец соломинки и поместите срезанный конец в раствор BTS 1. Выпустите эмбрионы в раствор BTS 1 с помощью шприца, контролируя процесс под микроскопом. Выпустите всю дополнительную жидкость в крышку чашки и сохраните на случай, если в растворе BTS 1 будут выявлены не все эмбрионы. Время, проходящее с момента вынимания соломинок из водяной бани до выпуска эмбрионов в раствор BTS 1, должно быть минимальным (менее 1 минуты). За один раз следует оттаивать только одну соломинку. 7 С помощью вытянутой пипетки диаметром чуть больше размеров эмбриона незамедлительно переместите эмбрионы в раствор BTS 2 на 5 минут. Старайтесь перенести как можно меньше среды. 8 Перенесите эмбрионы в раствор BTS 3 на 5 минут. 9 Перенесите эмбрионы в среду BIM на 5 минут. 10 Перенесите эмбрионы во вторую чашку со средой BIM, подогретой на термостолике при +37 °C, на 5 минут. 11 Промойте эмбрионы предварительно уравновешенной обогащенной средой G‑2™/G-2™ PLUS однократно в лунке однолуночной чашки и поместите эмбрионы в среду для культивирования. 12 Эмбрионы следует переносить в полость матки в уравновешенной среде EmbryoGlue® или в уравновешенной обогащенной среде G-2™/G-2™ PLUS. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Криоконсервация эмбрионов 53 Эта страница намеренно оставлена пустой. 54 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Программа контроля качества Все сырье, используемое в производстве продуктов Vitrolife, предназначено для медицинского применения у человека и соответствует требованиям к качеству Фармакопеи США (USP) и Европейской Фармакопеи (Ph Eur). Каждая партия сырья и готового продукта тестируется и оценивается с помощью строгих процедур контроля качества. Весь процесс производства проходит в асептических условиях под жестким контролем и наблюдением. Контроль качества наряду с мероприятиями по обеспечению качества (ISO 13485:2003 и 21 CFR Part 820:QSR) гарантирует единообразие продукта во всех партиях. В соответствии с характеристиками каждого продукта проводятся физико-химические, биологические и функциональные испытания. В дополнение к принятым стандартам проведения испытаний соблюдаются внутренние стандартные операционные процедуры в соответствии с “Руководством по качеству” компании Vitrolife. Программа контроля качества компании Vitrolife включает все необходимые тесты для обеспечения безопасности и эффективности сред. Все инструменты и стандартные растворы, применяющиеся в системе контроля качества, закупаются у квалифицированных производителей. Валидация и калибровка Все процедуры контроля качества, проводимые компанией Vitrolife, соответствуют мероприятиям по обеспечению качества (ISO 13485:2003 и 21 CFR Part 820:QSR) и осуществляются высококвалифицированным персоналом. Все применяемые методы и оборудование проходят программу непрерывной и тщательной валидации и калибровки. Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Программа контроля качества 55 Физико-химические испытания pH Измерение pH осуществляется валидированным методом согласно USP и Ph Eur. Диапазон приемлемости для каждого продукта удерживается на минимальном уровне, учитывая его происхождение и предполагаемое использование. Перед измерениями образцы инкубируют при подходящих температуре и составе атмосферы. Уравновешивание среды при 6 % CO2 достигается использованием газовой смеси со стандартизированным уровнем CO2. Осмоляльность Измерение осмоляльности проводится в соответствии с USP и Ph Eur с использованием валидированного метода, основанного на понижении точки замерзания. Диапазон приемлемости для каждого продукта удерживается на минимальном уровне, учитывая его происхождение и предполагаемое использование. Биологические испытания Бактериальный эндотоксин Все сырье и каждая партия произведенной продукции проверяются на отсутствие токсичных уровней эндотоксинов. Используемый компанией Vitrolife валидированный тест на бактериальные эндотоксины (тест LAL) является наиболее чувствительным из применяющихся методов для определения эндотоксинов; порог чувствительности равен 0,005 EU (единиц эндотоксина) или IU/мл. Валидированная процедура проводится в соответствии с USP, Ph Eur и руководством FDA “Guideline on validation of the limulus amebocyte lysate test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices” (“Руководство по валидации теста на лизаты амебоцитов мечехвоста как теста на эндотоксины конечных продуктов парентеральных лекарственных препаратов, биологических продуктов и медицинских устройств для людей и животных”). Тест на стерильность - мембранное фильтрование Стерильность всех сред подтверждается мембранным фильтрованием в соответствии с USP и Ph Eur. Период тестирования для сред составляет 2 недели, для масла – 3 недели. Не допускается поддающийся обнаружению рост бактерий и грибков ни в жидкой тиогликолевой среде, ни в триптон-соевом бульоне. Строгие требования к уровню гарантированной стерильности (SAL) обеспечивают безопасность применения сред пользователями. 56 Программа контроля качества Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Функциональные испытания Тест на мышиных эмбрионах Тест на мышиных эмбрионах (MEA) – это метод функциональных испытаний. Все среды, компоненты сред и ключевые устройства, применяемые при производстве сред, испытываются путем культивирования мышиных эмбрионов от стадии одной клетки до стадии бластоцисты. Стадии развития эмбриона записываются, исходя из особенностей каждого испытания. Безопасность и эффективность среды определяются путем подсчета количества эмбрионов, развившихся до определенной стадии развития с соответствующим количеством клеток в заведомо определенный промежуток времени. Кроме того, определение количества клеток и специфических пороговых значений для всех продуктов повышают чувствительность MEA, поскольку количество клеток бластоцисты сопряжено с ее последующей жизнеспособностью после переноса в полость матки. Валидация теста на мышиных эмбрионах для скрининга медицинских устройств для клинических вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) Биоанализ, такой как тест на одноклеточных мышиных эмбрионах (MEA), обязателен для сертификации лаборатории Коллегией американских патологов (College of American Pathologists), руководящей Клиниками репродуктивной медицины (Reproductive Clinics) в США. Все среды коммерческого частного происхождения перед клиническим применением должны обязательно пройти подобный анализ.1 MEA – это наиболее широко применяемый анализ для компонентов сред, сред для культивирования и оборудования, используемого в клинических ВРТ.2 Эффективность MEA подтверждена для скрининга на несколько потенциальных эмбриотоксинов, присутствующих в оборудовании, которое применяется в клинической практике, новых партиях масла, применяющегося для покрытия среды, расходных материалах и каждой новой партии среды. Для того чтобы максимально увеличить чувствительность MEA, необходимо много этапов. Например, при тестировании контактирующих материалов мы используем среду без альбумина, поскольку он может образовывать хелатные соединения с потенциальными эмбриотоксинами. Кроме того, мы используем 1-клеточные мышиные эмбрионы в отличие от 2-клеточных.3 Определение количества клеток в бластоцистах при MEA является показателем жизнеспособности эмбриона. Как показано на рисунке ниже, развитие плода пропорционально количеству клеток в бластоцисте.4 Использование MEA делает возможным количественный анализ свойств сред для культивирования, применяемых для клинических ВРТ. Развитие плода (%) Список справочной литературы 1. College of American Pathologists (1998), Reproductive Laboratory- Section 90 Proposed Checklist, p26 2. Gardner DK and Lane M (1999), Embryo culture systems. Handbook of In Vitro Fertilisation (Second Edition), Eds. Trounson AO and Gardner DK, CRC Press, Boca Raton p 205-264. 3.Davidson, A., Vermesh, M., Lobo, R.A., and Paulson, RJ (1998), Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilisation: the one-cell versus the two-cell model. Fertil. Steril., 49: 516-521. 4.Lane M. and Gardner DK (1997), Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. Reprod Fertil., 109: 153-164. Количество клеток в бластоцисте Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Программа контроля качества 57 Эта страница намеренно оставлена пустой. 58 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Среды G5 Series™ и сопутствующие товары от Vitrolife Продукт 510(k) Предназначение G-MM™ K021894 G-MM™ содержит раствор рекомбинантного человеческого альбумина (50 мг/мл) и предназначен для использования при проведении вспомогательных репродуктивных процедур, включая выполнение манипуляций с половыми клетками и эмбрионами. В указанных процедурах G-MM™ используется для обогащения сред для культивирования. Не использовать в качестве вещества для инъекций. HSA-solution™ K021896 HSA-solution™ содержит раствор человеческого сывороточного альбумина (100 мг/мл) и предназначен для использования при проведении вспомогательных репродуктивных процедур, включая выполнение манипуляций с половыми клетками и эмбрионами. В указанных процедурах HSA-solution™ используется для обогащения сред для культивирования. Не использовать в качестве вещества для инъекций. ВНИМАНИЕ: Все продукты полученные из крови следует рассматривать как потенциально инфицированные. Исходный материал, из которого был получен данный продукт, показал негативные результаты при тестировании согласно современным требованиям FDA на ВИЧ типов 1 и 2; вирус гепатита В (ВГВ), гепатита С (ВГС) и Т-лимфотропный вирус человека (ТЛВЧ) I и II типов. Ни один из известных методов не может дать гарантии, что продукт, полученный из крови человека, не является переносчиком инфекционных агентов. G-IVF™ G-IVF™ PLUS K022245 Среда для подготовки и обработки половых клеток и оплодотворения in vitro. G-1™ G-1™ PLUS K022244 Среда для культивирования эмбрионов с пронуклеарной стадии до 2-го или 3-го дня. G-2™ G-2™ PLUS K021890 Среда для культивирования эмбрионов с 3-го дня до стадии бластоцисты. EmbryoGlue® K031015 Среда для переноса эмбрионов. G-MOPS™ G-MOPS™ PLUS K021893 Среда для обработки и манипуляций с яйцеклетками и эмбрионами в атмосфере окружающей среды. G-GAMETE™ K021893 Для обработки и манипуляций с����������������� яйцеклетками �� и эмбрионами в атмосфере окружающей среды. продолжение на следующей странице Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Среды G5 Series™ и сопутствующие товары от Vitrolife 59 Продукт 510(k) Предназначение G-RINSE™ K022295 Раствор для ополаскивания контактирующих материалов и промывания шейки матки. Не предназначен для культивирования. G-FreezeKit Blast™ K032154 Среда для замораживания эмбрионов на стадии бластоцисты. G-ThawKit Blast™ K032155 Среда для оттаивания эмбрионов на стадии бластоцисты. G-PGD™ K033101 Среда для биопсии эмбрионов. SpermGrad™ K023403 Для разделения спермы в градиенте плотности. HYASE™ * K000627 Для удаления кумулюсных клеток. ICSI™ * K043116 Для иммобилизации и изоляции спермы перед внутрицитоплазматической инъекцией сперматозоида, ICSI. FREEZEKIT 1™ * K000623 Для замораживания эмбрионов на стадии дробления. THAWKIT 1™ * K000618 Для оттаивания эмбрионов на стадии дробления. OVOIL™ K991351 Для покрытия среды во время оплодотворения in vitro и микроманипуляций. Дополнительные продукты, поставляемые компанией Vitrolife IVF™ * K991348 Для оплодотворения in vitro, культивирования и переноса эмбрионов. ASP™ * K991345 Для восстановления и промывания яйцеклетки (промывания фолликула). SpermRinse™ * K000621 Для подготовки спермы. CCM™ * Только для использования в исследовательских целях Для культивирования с 3-го дня до стадии бластоцисты и переноса. * Недоступно в Австралии 60 Среды G5 Series™ и сопутствующие товары от Vitrolife Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife G5 Series™: Состав сред Среда Антибиотик MOPS NaHCO3 Аминокислоты Витамины Гиалуронан G-RINSE™ Гентамицин – Да – – – G-MOPS™ / Гентамицин Да Да Заменимые – – Гентамицин – Да Заменимые – – G-GAMETE™ Гентамицин Да Да Заменимые – – G-1™ / G-1™ PLUS Гентамицин – Да Заменимые – Да G-2™ / G-2™ PLUS Гентамицин – Да Заменимые + Да Да Да Да G-MOPS™ PLUS G-IVF™ / G-IVF™ PLUS незаменимые EmbryoGlue® Гентамицин – Да Заменимые + незаменимые G-FreezeKit Blast™ Гентамицин Да Да Заменимые – – G-ThawKit Blast™ Гентамицин Да Да Заменимые – – G-PGD™ Гентамицин Да Да Заменимые – – Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Состав среды G5 Series™ 61 Инструменты Swemed от Vitrolife Для получения дополнительных сведений и заказа посетите веб-сайт www. vitrolife.com Наличие этих инструментов может зависеть от национальных нормативных требований. 62 Продукт 510(k) Предназначение Иглы V-Tip™ для аспирации фолликула, одно-, двухпросветные и люэровские K991273 Иглы для аспирации фолликулов предназначены для получения половых клеток из организма и устроены особым образом для вымывания и/или аспирации яйцеклеток из фолликулов яичников. Пипетки для денудации, несколько вариантов диаметра K991700 Пипетки для денудации предназначены для удаления кумулюсных клеток с яйцеклетки. Пипетки для переноса, два варианта диаметра K991700 Пипетки для переноса предназначены для манипуляций и переноса яйцеклеток, эмбрионов и бластоцист, а также для проверки оплодотворения Пипетки для ICSI, несколько вариантов диаметра, угла наклона и длины K991700 Пипетки для ICSI предназначены для внутрицитоплазматической инъекции единичного сперматозоида в яйцеклетку. Фиксирующие пипетки, несколько вариантов диаметра, угла наклона и длины K991700 Фиксирующие пипетки предназначены для удержания яйцеклетки или эмбриона в определенном положении с использованием вакуума во время внутрицитоплазматической инъекции единичного сперматозоида в яйцеклетку и других микроманипуляций. Пипетка для биопсии бластомера, несколько вариантов диаметра и угла наклона K022643 Пипетки для биопсии бластомера предназначены для биопсии бластомера, которая может выполняться с целью проведения предимплантационной генетической диагностики генного материала клетки(-ок), полученной(-ых) при биопсии. Пипетки для частичного иссечения блестящей оболочки K991700 Пипетки для частичного иссечения блестящей оболочки предназначены для получения отверстия в блестящей оболочке с целью вспомогательного хэтчинга. Инструменты Swemed от Vitrolife Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Продукт 510(k) Предназначение Пипетки для вспомогательного хэтчинга, два варианта диаметра и длины K991700 Пипетки для вспомогательного хэтчинга предназначены для получения отверстия в блестящей оболочке. Режущий инструмент Только для исследля стволовых клеток, довательских два варианта диамет- целей ра Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Режущий инструмент для стволовых клеток предназначен для рассечения колоний эмбриональных стволовых клеток на части, которые можно заново посеять на среду и вырастить новые колонии. Инструменты Swemed от Vitrolife - Переписка 63 Предостережения и меры предосторожности Не использовать продукт при помутнении. С целью сохранения стерильности компания Vitrolife рекомендует вскрывать и использовать среды только в асептических условиях. Не следует хранить флакон со средой после вскрытия. Утилизируйте избыток среды после завершения процедуры. Только для наружного применения. Не использовать в качестве вещества для инъекций. Внимание: Федеральным законом США распространение данного устройства ограничивается заказом или продажей для врачей. ВНИМАНИЕ: Все продукты полученные из крови следует рассматривать как потенциально инфицированные. Исходный материал, из которого был получен данный продукт, показал негативные результаты при тестировании согласно современным требованиям FDA на ВИЧ типов 1 и 2; вирус гепатита В (ВГВ), гепатита С (ВГС). Ни один из известных методов не может дать гарантии, что продукт, полученный из крови человека, не является переносчиком инфекционных агентов. Риск неблагоприятного воздействия на репродуктивную сферу и внутриутробное развитие сред для ЭКО, в том числе G5 Series™, не определен и остается неясным. Дополнительная информация Изложенный материал содержит ограниченные сведения о продуктах компании Vitrolife. Содержащиеся в настоящем руководстве сведения о разнообразных тестах и клинических исследованиях являются обобщенными, предназначенными для ознакомления с данными продуктами. Эти сведения не следует считать полными или заменяющими рекомендации врача. Таким образом, важно обсудить изложенные сведения с врачом. Если вы являетесь врачом, мы рекомендуем обратиться в компанию Vitrolife или к ее уполномоченным агентам и распространителям за полной информацией о продуктах и процедурах, описанных в настоящем руководстве. Кроме того, изложенный материал имеет непосредственное отношение к здоровью, возможности применения, области медицины и разнообразным видам медицинской помощи, предназначенным для применения только у человека. 64 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Некоторые упомянутые в материале продукты доступны не во всех странах. За дополнительной информацией обращайтесь в компанию Vitrolife или к распространителю ее продукции. Рекомендации по использованию могут быть изменены после того, как данный материал был напечатан. Свежую информацию можно получить на веб-сайте компании Vitrolife (www.vitrolife.com). Помните, что все закупки сред и инструментов, произведенных компанией Vitrolife, регулируются общими условиями продажи, с которыми можно ознакомиться на веб-сайте Vitrolife (www.vitrolife.com); в случае возникновения спорных моментов, первоочередное значение имеют общие условия продажи. Все среды для ЭКО и инструменты Swemed IVF отмечены знаком соответствия Директивам ЕС (СЕ). Все продукты, за исключением двух (CCM™ и режущий инструмент для стволовых клеток) разрешены для продажи на территории США. Сведения, изложенные в настоящем руководстве, верны на момент его выхода из печати. Последние обновления размещены на веб-сайте www.vitrolife.com Переписка Компания Vitrolife приветствует любые комментарии к тексту настоящего руководства. В случае возникновения вопросов или необходимости в дополнительных разъяснениях обращайтесь: Европа, Средний Восток, АзиатскоТихоокеанский регион Тел.: +46-31-721 80 20, линия поддержки Факс: +46-31-721 80 99 E-mail: [email protected] Адрес: Vitrolife Sweden AB Box 9080 SE-400 92 Göteborg Sweden (Швеция) Северная и Южная Америка Тел.: 866-VITRO US (866-848-7687) Факс: 866-VITROFAX (866-848-7632) E-mail: [email protected] Адрес: Vitrolife Inc. 3601 South Inca Street Englewood Colorado 80110 USA (США) Интернет http://www.vitrolife.com Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife 65 66 Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife Руководство 3.0™ среды G5 Series Vitrolife 67 Северная и Южная Америка Vitrolife Inc., 3601 South Inca Street Englewood, Colorado 80110, USA (США) Тел.: 866-848-7687 (866-VITRO US) Факс 866-848-7632 (866-VITROFAX) Европа, Средний Восток, АзиатскоТихоокеанский регион Vitrolife Sweden AB, Box 9080 SE-400 92 Kungsbacka, Sweden (Швеция) Тел. +46-31-721 80 20, Факс +46-31-721 80 99 Поддержка по электронной почте для Северной и Южной Америки [email protected] Поддержка по электронной почте для Европы, Среднего Востока, АзиатскоТихоокеанского региона [email protected] E-mail [email protected] Интернет http://www.vitrolife.com
