Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial

CURRICULUM VITAE
Кристина Петровна Афанасьева
Дата рождения: 26 июля, 1984
Место рождения: г. Минск, Республика Беларусь
Образование:
2002 – 2007
Международный государственный университет им. А.Д. Сахарова, факультет
Радиобиологии и экологической медицины, Минск, Беларусь, диплом с
отличием
2009-2012
Аспирантура: Учебно-научный центр Объединенного института ядерных
исследований, Дубна, Россия
Опыт работы:
2007-2008
2008 -
Лаборант с в/о, Лаборатория протеомики, Институт биофизики и клеточной
инженерии Национальной академии наук Беларуси. Академическая, 27, Минск
220072, Беларусь
Младший научный сотрудник, Объединенный институт ядерных исследований,
Лаборатория ядерных проблем им. Джелепова. Жолио-Кюри, 6, 141980 Дубна,
Московская обл., Россия
Навыки:
Выделение ДНК, метод полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод
конформационно-чувствительного гель-электрофореза, цитологический метод,
хроматографический
метод
разделения
ДНК/белков
(тонкостенная
хроматография, электрофорез)
Языки:
Английский
Конференции/публикации
2015, в печати, Доклады Биохимия и Биофизика, том. 460, с. 1–3.
«Межхромосомная генная конверсия как регулярный механизм потери
гетерозиготности (LOH) в ранней зиготе у Drosophila melanogaster.» И. Д.
Александров, М. В. Александрова, К. П. Афанасьева.
2014, Москва, Россия / VII Съезд по Радиационным исследованиям, с.70 –
«Генная конверсия в ядре зиготы регулярно замещает радиационноповрежденный отцовский дикий аллель мутантным материнским у
Drosophila melanogaster»
2014, Москва, Россия / VII Съезд по Радиационным исследованиям, с.69 –
«Молекулярные закономерности радиационного локус-специфического
мутагенеза и новые подходы к оценке генетического риска ионизирующих
излучений»
2012 Радиационная биология. Радиоэкология, том 52, № 3, с. 234–246.
«Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster.
Сообщение 1. ген vestigial: молекулярная характеристика «точковых»
мутаций» Александров И.Д., Афанасьева К.П., Александрова М.В., И.Л.
Лапидус
2012 Радиационная биология. Радиоэкология, том 52, № 4, с. 349–362.
«Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster.
Сообщение 2. ген vestigial: молекулярная характеристика аберрационных
мутантов» К. П. Афанасьева, М. В. Александрова, И. Д. Александров, С. В.
Кораблинова.
2012, Дубна, Россия / XV Международная научная конференция молодых
ученых и специалистов. – «Молекулярный анализ гамма- и нейтрониндуцированых мутаций vestigial, ассоциированных с хромосомными
аберрациями».
2011, Москва, Россия / X Конференция молодых ученых, специалистов и
студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в Космос»
с.13. – «Сравнительная эффективность γ-квантов, нейтронов и ионов 12С в
индукции наследуемых мутаций генов разной величины и экзонинтронной организации у D. melanogaster».
2011, Дубна, Россия / XV Международная научная конференция молодых
ученых и специалистов. – «Фено-генетический и молекулярный анализ γ- и
нейтрон-индуцированных мутаций гена vestigial D. melanogaster».
2011, Санкт-Петербург, Россия / Российская научная конференция с
международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и
радиобиологии» с. 123-124. – «Характеристика молекулярного спектра
наследуемых мутаций сложного гена vestigial Drosophila melanogaster
вызываемых реакторными нейтронами и фотонами 60Со.».
2010, Москва, Россия / VI съезд по радиационным исследованиям
(радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), том. 2, с.53. –
«Изменения ДНК, выявляемые методом ПЦР, у спонтанных и γиндуцированных мутантов по гену vestigial у Drosophila melanogaster».
2010, Alushta. Ukraine / Third International Conference, Dedicated to N. W.
Timofeeff-Ressovsky «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and
evolution», p.182-184. - «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology
and evolution».
2010, Дубна, Россия / XIV Международная научная конференция молодых
ученых и специалистов. – «Генетическая эффективность ускоренных ионов
12с при облучении зародышевых клеток Drosophila melanogaster».
2009, Москва, Россия / V съезд Вавиловского общества генетиков и
селекционеров – «Природа и распределение на карте гена vestigial
Drosophila
melanogaster
радиационно-индуцированных
изменений,
выявляемых методом ПЦР».
2009, Москва, Россия / V съезд вавиловского общества генетиков и
селекционеров – Два разных гена. Две разные мишени и два разных спектра
молекулярных изменений при радиационном мутагенезе у Drosophila».
2009. Дубна, Россия / XIII Международная научная конференция молодых
ученых и специалистов.. – «Анализ молекулярной структуры гена vestigial у
γ- и нейтрон-индуцированных мутантов Drosophila melanogaster».
Диплом о высшем образовании:
ПЦР-анализ структуры гена vestigial у гамма- и нейтрон-индуцированных
мутантов Drosophila melanogaster
Диссертация кандидата наук:
Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial Drosophila melanogaster.
Диссертация, защита
2013, Москва, МГУ, Кандидат биологических наук, Радиобиология.
Научный руководитель:
Д.б.н. Игорь Донатович Александров, Главный научный сотрудник,
Лаборатория ядерных проблем, Объединенный институт ядерных исследований
ТЕЗИСЫ ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ
Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster. Сообщение 1.
Ген vestigial: молекулярная характеристика «точковых» мутаций
И. Д. Александров, К. П. Афанасьева, М. В. Александрова, И. Л. Лапидус,
Радиационная биология. Радиоэкология. 2012 г., т.52, №3, с. 1-14.
Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведен скрининг молекулярных
изменений ДНК у 9 спонтанных и 59 индуцированных (воздействие γ-излучения, нейтронов и
нейтроны+γизлучения) “точковых” мутантов по гену vestigial (vg) Drosophila melanogaster. В
зависимости от картины наличия или отсутствия того или иного фрагмента (ов) среди 16, на
которые был разделен ген vg (15.1 т.п.н., 8 экзонов, 7 интронов) все изученные мутанты были
отнесены к одному из четырех классов: 1) ПЦР+-мутанты (40.7%) – без выявленных
изменений; 2) “односайтовые” мутанты (33.9%) – без какого-либо одного фрагмента; 3)
делеционные мутанты (15.2%) без 2–9 смежных фрагментов и 4) “кластерные” мутанты
(10.2%) с 2–3 независимыми изменениями 2-го и/или 3-го классов. Если все особи, имеющие
спонтанные мутационные изменения (кроме одного ПЦР+ мутанта) относятся к классу (2), то
для радиационно-индуцированных повреждений соотношение названных четырех классов
существенно зависит от дозы и качества радиации. В частности, нейтроны почти в 9 раз
эффективнее γ-излучения в индукции “кластерных” мутантов. Установлен неслучайный
характер распределения “односайтовых” изменений и концов делеций на карте гена. Методом
CSGE установлено наличие гетеродуплексов ДНК в экзоне 3 у 5 ПЦР+ мутантов из 17
изученных, в основе которых, как показало секвенирование, лежат микроделеции 5 и 11 п.н.
(2 мутанта), а у трех – транзиции A-G. Уже эти первые результаты показывают, что риск от
излучений с низкой и высокой ЛПЭ в отношении индукции однонуклеотидного
полиморфизма (SNP) может быть гораздо выше по сравнению с таковым по цитогенетическим
критериям.
Радиационная биология структуроно разных генов Drosophila melanogaster. Сообщение 2.
Ген vestigial: молекулярная характеристика аберрационных мутаций
К. П. Афанасьева, М. В. Александрова, И. Д. Александров, С. В. Кораблинова,
Радиационная биология. Радиоэкология. 2012 г., т.52, №4, с. 349–362.
Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) изучена структура всего гена vestigial(vg)
D. melanogaster, подразделенного на 16 перекрывающихся фрагментов, у 52 γ-, нейтрон- и
нейтроны+ γ-индуцированных мутантов vg с инверсионным (In) или транслокационным (T)
разрывом в микрорайоне локализации изучаемого гена. Согласно результатам “ПЦРпрогулки” по гену, четыре мутанта (2 In и 2 T) имеют крупные делеции всего микрорайона
протяженностью около 200 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), включая ген vg и смежные sca и
l(2)C маркеры. У 23 мутантов из 48 ПЦР-анализ не выявил доступных этому методу
изменений, указывая на локализацию аберрационного разрыва, по-видимому, вне гена.
Остальные 25 мутантов содержат внутригенные изменения, регистрируемые как отсутствие
одного, двух и более (до шести) смежных фрагментов или одновременно нескольких
фрагментов (как кластер), разделенных нормальными участками гена. При этом у 5 из 25
мутантов аберрационный разрыв находится вне гена, у 6 – внутри гена, а для 14 его точная
локализация пока не установлена. Существенно, что разрывы внутри гена сопровождаются
делециями в 1–6 фрагментов (от 0.8 до 6 т.п.н.). Следовательно, формирование радиационноиндуцированных хромосомных обменов часто сопровождается потерями генетического
материала разной величины в микрорайоне локализации аберрационного разрыва-соединения.
Разработана и представлена молекулярная модель образования подобного рода комплексных
обменно-делеционных аберраций. Наряду с этим на основе полученных данных о наличии у
изученных мутантов целого ряда независимых и одновременно возникающих мутационных
изменений на иерархически разных уровнях организации генетического материала (ДНК–ген–
микрорайоны хромосом) выдвигается концепция о преимущественно кластерном характере
генетического действия излучений с низкой и высокой ЛПЭ на геном клеток высших
организмов.
ТЕЗИСЫ КАНДИДАТСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ
«Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial Drosophila melanogaster»
Наиболее актуальным в настоящее время остается изучение радиомутабильности
генов в генеративных клетках. Поскольку, радиационный мутагенез на молекулярном
уровне в этих клетках является менее изученными, но при этом высоко значимым для
оценки рисков действия радиации для последующих поколений. Проведение такого рода
масштабных исследований в относительно короткий период времени возможно лишь на
немногих объектах, генетика которых хорошо изучена. Среди них в первую очередь
следует рассматривать Drosophila melanogaster.
Целью работы было сравнительное изучение природы молекулярных изменений
крупного гена vestigial (vg) Drosophila melanogaster у мутантов точковой и аберрационной
природы, индуцированных разными дозами γ-квантов 60Со, моноэнергетических
нейтронов (Еср = 0,85 МэВ) и их комбинированного воздействия. Так же оценивали спектр
этих изменений и их распределения по карте гена.
Материалы и методы.
Объект исследования - рецессивный ген vg (15107 п.н., 8 экзонов, 7 интронов),
локализованный в секции 49Е1 плеча политенной аутосомы 2R Drosophila melanogaster.
В работе были проанализированы случайные выборки из 8 мутантов vg спонтанного
происхождения, и 114 мутантов радиационно-индуцированной природы (среди них 60 γ-,
27 нейтрон- и 27 нейтроны + γ-индуцированных, среди которых 5 получены от источника
252
Cf). Физические параметры источников: γ-излучение 60Со (установка «Gamma-cell-220»,
N=5,7 Гр/мин, дозы 5–60 Гр), моноэнергетические нейтроны деления (реактор БР-10,
Еср=0.85 МэВ, N=2,6 Гр/мин, дозы 2.5–20 Гр), комбинированное действие нейтронов и γизлучения (те же источники, с их равном вкладе в общую дозу 15–30 Гр) смешанное γнейтронное излучение (источник 252Cf, N=0,35 Гр/мин, дозы 7-28 Гр).
Полимеразная цепная реакция. Учитывая значительный размер гена, для ПЦРанализа вся его последовательность была подразделена на 16 перекрывающихся
фрагментов варьирующей величины (381–1901 п.н.).
Анализ гетеродуплексов. Для выявления возможных изменений ДНК гена, не
определяемых методом ПЦР, был проведен гетеродуплексный анализ ДНК экзонов 3 и 4
(это 8 и 10 фрагменты) у 50 радиационных мутантов vg из той же изучаемой выборки с
использованием метода конформационно-чувствительного гель-электрофореза (CSGE).
Секвенирование. Секвенирование прямой и обратной нитей ДНК было проведено
для экзонов 3 и 4 гена vg у мутантов с выявленными в процессе гетеродуплексного
анализа изменениями.
В ходе работы генетическая коллекция из 121 мутантов vestigial Drosophila
melanogaster была систематизирована по цитогенетической природе (62 «точковой», 52
аберрационной), виду и дозе радиации.
ПЦР-анализ структуры гена vg у изученных в работе мутантов выявил 4 типа
молекулярных повреждений: ПЦР+,(без изменений структуры, выявляемых методом),
«односайтовые» (отсутствие одного из 16 фрагментов), «многосайтовые» (отсутствие двух
и более смежных фрагментов), кластерные (несколько независимых повреждений
односайтовых, многосайтовых или их комбинации, разделенных между собой
нормальными последовательностями ДНК).
Все 4 типа встречаются у радиационных мутантов «точковой» и аберрационной
природы после трех испытанных видов облучения, у спонтанных мутантов – два типа
(ПЦР+ и «односайтовые»), следовательно, многосайтовые делеции и кластеры
повреждений у мутантов можно рассматривать как молекулярные маркеры действия
радиации на ген.
Качественная картина молекулярных изменений гена, выявляемая методом ПЦР,
одинакова для двух изученных видов радиации, однако в индукции частичных делеций
гена нейтроны более эффективны, чем γ-излучение.
Спектр ПЦР-детектируемых мутационных повреждений после комбинированного
нейтроны+γ-облучения качественно идентичен таковому для двух видов радиации в
отдельности, а соотношение в нем разных типов повреждений близко к наблюдаемому для
γ-излучения.
Установлена зависимость спектра повреждений от дозы только для γ-излучения у
«точковых» мутантов, для всех остальных изученных в работе выборок мутантов дозовых
зависимостей не установлено.
Распределение «односайтовых» повреждений и концов «многосайтовых» делеций на
карте гена является не случайным, с их локализацией преимущественно в 3’-конец
интрона 2 и интроне 3.
Гетеродуплексный анализ ДНК и секвенирование ПЦР+-фрагментов гена vg выявили
молекулярные изменения в виде замен оснований, небольших делеций и инсерций.
Систематические замены оснований ДНК в облученном гене ведущие к повышению
уровня однонуклиотидного полиморфизма (SNP) свидетельствуют о необходимости
нового подхода к оценке риска радиации, основанного на анализе SNP.
Комплексный молекулярный, генетический и цитологический анализ радиационных
мутантов vg позволил выявить мутантов с одновременным повреждениями различного
размера, таких, как хромосомная аберрация, небольшие делеции, и молекулярные
повреждения на уровне отдельных оснований в различной их комбинации.
Появление кластеров на молекулярном, генетическом и хромосомном уровнях
организации генома после действия радиации разного качества свидетельствует о гораздо
более высокой степени пораженности генома клетки чем это следует из анализа
традиционных радиобиологических эффектов (генные мутации, аберрации хромосом).
Установлен факт внутрихромосомной генной конверсии с переносом части
материнского аллеля vg1 в отцовский ген vg+32 у некоторых спонтанных и радиационноиндуцированных мутантов. Эта генная конверсия обусловлена механизмом репарации,
который включается на стадии первого диплоидного ядра ранней зиготы дрозофилы
Комплексный молекулярно-генетический анализ радиационно-индуцированных
мутантов vg аберрационной природы выявил потери ДНК сопутствующие
аберрационному разрыву-соединению, варьирующей величины на молекулярном и
генетическом уровнях. Это ожидаемо в рамках современной теории структуры трека и
моделей организации хроматина зрелых генеративных клеток.