роль генов распознавания и репарации повреждений днк в

РОЛЬ ГЕНОВ РАСПОЗНАВАНИЯ И РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В
РЕГУЛЯЦИИ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER В
УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ОБЛУЧЕНИЯ
Е.Н. Плюснина
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Россия
В течение жизни организмы сталкиваются, в первую очередь, с действием хронических
низкоинтенсивных стрессовых факторов, в частности, ионизирующей радиации. Эффекты,
вызванные влиянием таких факторов среды, как правило, имеют нелинейный характер,
поскольку являются результатом взаимодействия процессов возникновения и накопления
повреждений
и
противостоящих
им
механизмов
стресс-ответа.
Для
установления
механизмов комплексного влияния факторов среды на живые организмы необходимо
исследовать изменение такого интегрального показателя как продолжительность жизни. Он
зависит от многих факторов, включая особенности протекания молекулярно-клеточных и
физиологических процессов. Большое значение, в частности, имеет система распознавания и
репарации повреждений ДНК. Продуктивным экспериментальным подходом в изучении
молекулярно-клеточных механизмов по признаку продолжительности жизни может служить
ее сравнение у объектов с заданными генотипическими различиями.
Целью данной работы является изучение изменения продолжительности жизни у особей
Drosophila melanogaster с дефектами, либо сверхактивацией генов распознавания и
репарации повреждений ДНК.
Материалы и методы
Линии Drosophila melanogaster
Для
проведения
экспериментов
использовали
лабораторные
линии
Drosophila
melanogaster: линию дикого типа Canton-S; mei-9amei-41D5/+ (генотип: y1 mei-9a l(1)ESHS261
mei-41D5/FM7c)
с
мутацией
гомолога
гена
белка
эксцизионной
репарации
XPF
млекопитающих [1]; mei-41D5/mei-41D5 (генотип: w, mei-41D5/w, mei-41D5) и mei-41D5/+
(генотип: w-, mei-41D5/Basc; cn1, bw1) с мутацией гомолога гена протеинкиназы ATR,
ответственной за распознавание повреждений ДНК [2]; tefu/+ (генотип: w*; P{neoFRT}82B
tefuatm-3 e1/TM6B, Tb1), несущую мутацию гомолога АТМ, который запускается в ответ на
повреждение ДНК и участвует в регуляции длины теломер [3]; p53/p53 (генотип: y1 w1118;
p535A-1-4/y1 w1118; p535A-1-4) с дефектом гена транскрипционного фактора p53, который
регулирует клеточный цикл и запускает апоптоз в ответ на повреждение ДНК [4] (любезно
предоставлены Bloomington Stock Center, США). Для исследования влияния сверхэкспрессии
генов репарации повреждений ДНК на устойчивость дрозофилы к действию малых доз
ионизирующей радиации использовали линии: UAS-D-GADD45 содержит дополнительную
копию гена D-GADD45 под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Uri Abdu,
Ben-Gurion University, Израиль); GAL4[1407] (генотип: w*; P{GawB}1407) несет драйвер
GAL4 в нервной системе дрозофилы (любезно предоставлена Bloomington Stock Center,
США). Для сверхактивации гена D-GADD45 в нервной системе дрозофилы производили
скрещивание самок UAS-D-GADD45 с самцами GAL4[1407]. В качестве контроля
использовали особей родительских линий.
Условия эксперимента
Исследование для всех вариантов экспериментов проводили в одинаковых условиях (12часовой режим освещения, температура 25 ° С, агарно-дрожжевая среда), раз в неделю мух
переносили на свежую среду. Мухи каждого из генотипов были разделены на две группы –
контрольную и опытную. Опытных особей подвергали хроническому воздействию радиации
от гамма-источника с Ra226 в дозе 60 сГр за поколение на предимагинальных стадиях
развития (в течение 12 суток).
Анализ продолжительности жизни
Для каждого варианта эксперимента отбирали по 150-250 мух. Самцов и самок
исследовали отдельно. Ежедневно проводили подсчет числа умерших мух. Оценивали
среднюю, медианную, минимальную, максимальную продолжительность жизни и другие
показатели.
Поскольку
распределение
продолжительности
жизни
не
подчиняется
нормальному закону, использовали непараметрические критерии Гехана-Беслоу-Вилкоксона
и Колмогорова-Смирнова для оценки достоверности различий между выборками.
Результаты и обсуждение
Влияние хронического низкоинтенсивного гамма-облучения на продолжительность
жизни мутантов Drosophila melanogaster по генам распознавания и репарации
повреждений ДНК
У линии дикого типа Canton-S происходит увеличение медианной продолжительности
жизни после хронического воздействия малыми дозами ионизирующей радиации как у
самцов (на 27 %) (p<0.001), так и у самок (на 10 %) (p<0.001).
У мутантов Drosophila melanogaster по генам mei-9, mei-41 и p53 во всех вариантах
эксперимента после облучения снижалась продолжительность жизни (на 4-38 %) (p<0.001).
Данные гены детерминируют процессы сенсирования и репарации повреждений ДНК,
вызванных воздействием эндогенных и экзогенных факторов, в том числе, гамма-облучения.
Поэтому мутации данных генов, так или иначе, нарушают функционирование систем
распознавания и репарации повреждений ДНК и препятствуют адекватной реакции живых
систем на действие повреждающего агента. В результате мы наблюдали снижение
продолжительности жизни животных в условиях хронического низкоинтенсивного гаммаоблучения.
В то же время, у мутантов-гетерозигот по гену tefu снижения продолжительности жизни
после хронического воздействия гамма-облучения в дозе 60 сГр не наблюдали. Возможно,
это связано с тем, что функционирование данного гена не отключено полностью, а только
снижено (полное отключение гена tefu приводит к гибели особей Drosophila melanogaster
еще на предимагинальных стадиях развития).
Изменение
продолжительности
жизни
особей
Drosophila
melanogaster
со
сверхэкспрессией гена D-GADD45 после хронического низкоинтенсивного воздействия
ионизирующей радиации
Сверхактивация гена D-GADD45 приводит к продлению жизни особей Drosophila
melanogaster. Медианная продолжительность жизни у самцов со сверхэкспрессией гена DGADD45 по сравнению с медианной продолжительностью жизни самцов родительских
линий увеличилась на 73-77 % (p<0.001), у самок – на 22-46 % (p<0.001). Белки GADD45
определяет реакцию организма на экзогенные и эндогенные воздействия и вовлечены в
процессы распознавания поврежденных молекул ДНК, эксцизионной репарации нуклеотидов
и оснований, задержки клеточного цикла и апоптоза в ответ на повреждения ДНК [5, 6].
Сверхэкспрессия гена D-GADD45 в нервной системе дрозофилы, по-видимому, привела к
более эффективному обнаружению и устранению повреждений ДНК и проявилась в
продлении жизни.
У особей родительских линий хроническое облучение в дозе 60 сГр привело как к
повышению длительности жизни (до 26 %), так и к снижению (до 7 %). У самок Drosophila
melanogaster со сверхэкспрессией гена D-GADD45 наблюдали увеличение медианной
продолжительности жизни на 13 % после хронического облучения дозой 60 сГр (p<0.001).
Однако у самцов со сверхэкспрессией гена D-GADD45 наблюдали снижение медианной
продолжительности жизни на 17 % после хронического облучения (p<0.05). Следовательно,
сверхактивация гена D-GADD45 в нервной системе не оказывала дополнительного
радиопротекторного действия. Тем не менее, в условиях хронического облучения
продолжительность жизни особей Drosophila melanogaster со сверхэкспрессией гена DGADD45 оставалась выше по сравнению с продолжительностью жизни особей родительских
линий на 17-37 % (p<0.001). Таким образом, показано, что сверхактивация гена D-GADD45 в
нервной системе продлевает жизнь особей дрозофилы как в контрольных условиях, так и при
действии хронического низкоинтенсивного гамма-облучения.
Заключение
Было показано, что особи Drosophila melanogaster с дефектами генов распознавания и
репарации повреждений ДНК (в частности, mei-9, mei-41, tefu и p53) имеют меньшую
продолжительность жизни и повышенную чувствительность к хроническому воздействию
ионизирующей радиации в малых дозах по сравнению с линией дикого типа Canton-S.
Cверхактивация гена D-GADD45 приводит к продлению жизни особей Drosophila
melanogaster по сравнению с особями родительских линий, сохранившемуся в условиях
хронического облучения, что говорит об их большей приспособленности к действию
спонтанных
и
индуцированных
факторов
среды.
Таким
образом,
полученные
экспериментальные данные свидетельствуют о роли механизмов распознавания и репарации
повреждений ДНК в регуляции продолжительности жизни и детерминации ответа на
воздействие хронического низкоинтенсивного гамма-облучения.
Список литературы
1. BOYD, J. B., M.D. GOLINO, and R.B. SETLOW, 1976 The mei-9a mutant of Drosophila
melanogaster increases mutagen sensitivity and decreases excision repair. Genetics. 84(3):527–544.
2. LAURENCON, A., A. PURDY, J. SEKELSKY, R.S. HAWLEY, and T.T. SU, 2003
Phenotypic analysis of separation-of-function alleles of MEI-41, Drosophila ATM/ATR. Genetics.
164(2):589-601.
3. OIKEMUS, S.R., N. MCGINNIS, J. QUEIROZ-MACHADO, H. TUKACHINSKY, S.
TAKADA, C.E. SUNKEL, and M.H. BRODSKY, 2004 Drosophila atm/telomere fusion is required
for telomeric localization of HP1 and telomere position effect. Genes Dev. 18(15):1850-1861.
4. JIN, S., S. MARTINEK, W.S. JOO, J.R. WORTMAN, and N. MIRKOVIC et al., 2000
Identification and characterization of a p53 homologue in Drosophila melanogaster. PNAS.
97(13):7301-7306.
5. CARRIER, F., P.T. GEORGEL, P. POURQUIER, M. BLAKE, and H.U. KONTNY et al.,
1999 Gadd45, a p53-responsive stress protein, modifies DNA accessibility on damaged chromatin.
Molecular and Cellular Biology. 19(3):1673-1685.
6. LIEBERMANN, D.A., B. HOFFMAN, 2008 Gadd45 in stress signaling. Journal of Molecular
Signaling. 3:15.