генетическая дифференциация линий регенерантов мягкой

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЛИНИЙ
РЕГЕНЕРАНТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ПОМОЩЬЮ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
Хапилина О.Н., к.б.н.
Новаковская А.П., соискатель
Райзер О.Б., соискатель
Созинова Л.Ф., к.б..н.
РГП «Национальный центр биотехнологии РК» КН МОН РК
Развитие молекулярной биологии способствует появлению новых
подходов к генетическим исследованиям организмов, переходу к новым
технологиям анализа генома. Этот процесс обуславливается наличием
информативных генетических маркеров, что позволяет создать новые тестсистемы для анализа генетического полиморфизма как на уровне продуктов гена
(белки, ферменты), так и на уровне генетического материала клетки
(полиморфизм ДНК) [1, 2].
Молекулярные маркеры, основанные на полиморфизме фрагментов ДНК и
белков, позволяют успешно решать целый ряд задач фундаментального и
прикладного характера, в том числе, внедрение ДНК-технологий позволяет
расширять возможности направленной селекции растений [2, 3].
В последние годы ДНК-технологии применяются для изучения
сомаклональных
вариантов
растений,
полученных
с
использованием
биотехнологических методов. Изучение сомаклональной изменчивости вызывает
интерес не только в плане фундаментальных исследований, но и в направлении
практической селекции, как доступный источник получения генетического
разнообразия. Для расширения генофонда растений, для получения новых форм
с желательными признаками используют клеточную селекцию с отбором
клеточных структур на селективных фонах. Чтобы повысить эффективность
селекции in vitro, решить проблемы управления сомаклональной
вариабельностью, важно понять причины ее возникновения и размах. Для этого
все шире используются молекулярно-генетические маркеры, позволяющие
выявить генетические модификации растений.
Основные задачи, стоящие перед исследованием генетического
полиморфизма,
связаны
с
необходимостью
оптимального
подбора
молекулярных маркеров. Одним из наиболее доступных и быстрых способов
обнаружить вариабельность, а затем выяснить природу сомаклональной
изменчивости является применение молекулярных методов, основанных на
полимеразной цепной реакции (ПЦР) и создание с их помощью маркеров ДНК,
отличающих сомаклоны от исходного генотипа [4]. Используемые маркеры
должны обладать определенными свойствами и иметь определенные
характеристики, в т.ч. - доступность фенотипических проявлений аллельных
вариантов для идентификации, равномерность распределения в геноме, легкая
выявляемость и воспроизводимость результатов, возможность автоматизации
выявления [4, 5].
Так как геном растений в высокой степени содержит повторяющиеся
последовательности, не являющиеся кодирующей частью генома, в то же время
обладающие высокой степенью полиморфизма, изучить их вариабельность довольно
сложно. Изучение
полиморфизма ДНК с использованием нового типа
молекулярно-генетических маркеров, основанных на изучении фрагментов ДНК,
фланкированных участком фланга ретротранспозона и его инвертированным
повтором, либо участком микросателлитного локуса (IRAP и REMAP),
представляет интерес в плане генотипирования растений [4, 5, 6, 7].
Ретротранспозоны используют как промежуточный этап жизненного цикла
копирование своей РНК с помощью обратной транскрипции в ДНК-копию,
которая встраивается в ДНК хозяина с помощью интегразы. Последовательности
ретротранспозонов несут регуляторные сайты (промоторы), опознаваемые
ядерными факторами инициализации транскрипции для синтеза РНК –
полимеразами II и III. Большая часть последовательностей ретротранспозонов
инактивирована мутациями и транскрибируется только частично. В некоторых
случаях число копий ретротранспозонов может составлять до 90% ядерного
генома. Последовательности LTR-ретротранспозонов используются для
выявления полиморфизма между исследуемыми формами одного вида с
помощью ПЦР-фингерпринта – IRAP и REMAP методами [8, 9, 10, 11].
IRAP – анализ (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) – метод
амплификации
геномной
ДНК
между
близкорасположенными
последовательностями
ретротранспозонов.
Для
генотипирования
этих
последовательностей используют специально сконструированные праймеры PawS.
Первоначально с помощью данных праймеров выявляли умеренные повторы ДНК
ржи – семейство R173. Позднее было установлено, что данное семейство умеренно
повторяющихся последовательностей имеется и в других видах растений – у
картофеля, риса, пшеницы, а продукт ПЦР-амплификации геномной ДНК
является стабильным генетическим IRAP-маркером. Полиморфизм в данном
случае обусловлен либо мутацией в участке связывания праймера, либо
уникальным биологическим процессом – ретроранспозицией, в результате
встраивания ретротранспозона в новый участок геномной ДНК без потери
первоначального участка [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17].
Метод REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplification Polymorphism)
аналогичен IRAP, однако наряду с праймерами к ретротранспозонам используются
микросателлитные праймеры – двух-, трех- или четырехбазовые, например, (NN)n,
(NNN)n или (NNNN)n, ввиду того, что микросателлиты могут выявить высокие
показатели мутации, имеющие индивидуальное местоположение у различных
генотипов [7, 8, 18].
Использование праймеров PawS совместно с микросателлитными
праймерами для генетической дифференциации позволяет выявить
потенциальную генетическую стабильность сорта, поскольку они тесно
ассоциированы с актами инсерций/делеций элементов семейства R173, кроме
того, в результате амплификации с праймерами PawS в комбинации с
микросателлитными праймерами
можно получать относительно простые,
хорошо воспроизводимые спектры продуктов амплификации, удобные для их
применения при сортовой идентификации, при выявлении различий между
генотипами [6, 18].
Целью проводимых исследований была генетическая дифференциация
растений-регенерантов мягкой пшеницы, полученных методами селекции in
vitro, с использованием REMAP- анализа.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использованы сорта и растениярегенеранты яровой мягкой пшеницы, полученные с использованием метода
селекции in vitro. В качестве селективных агентов при индукции изменчивости in
vitro использовались: культуральный фильтрат гриба Fusarium graminearum
(в количестве 20% к объему среды), культуральный фильтрат гриба Septoria
nodorum (в количестве 10% к объему среды); ПЭГ-6000 (2% к объему
среды), хлорид натрия (0,3% к объему среды). Для анализа использовали
линии растений-регенерантов R3 -R6 поколения.
Выделение ДНК из стерильных 7-дневных проростков пшеницы
проводилось с использованием СТАВ-метода. Гомогенизация проростков
проводилась в СТАВ-буфере (2M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 5% СТАВ) с
последующей инкубацией при 65°С в течение 1 часа. Экстракция ДНК
проводилась в
смеси хлороформ-изопропанол (24:1) при комнатной
температуре в течение 1 часа с последующим центрифугированием при 3000
об/мин в течение 5 минут.
Осаждение ДНК осуществлялось
изопропанолом при комнатной
температуре, с последующим центрифугированием при 12000 об/мин в течение
10 минут. Осадок высушивался при комнатной температуре, затем растворялся в
деионизированной воде. Визуализация экстрагированной ДНК проводилась в
1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия с использованием
гель-документирующей системы Bio Rad. Определение количества выделенной
ДНК, а также соотношение А260/А280 проводилось с использованием
биофотометра Nano-Drop.
В качестве молекулярно-генетических маркеров применялись праймеры
PawS 5 и PawS 6, использующиеся для выявления умеренно повторяющихся
последовательностей ДНК семейства R173, в комбинации с микросателлитным
праймером MS17 (нуклеотидная последовательность которого - 5’(CT)10G).
Для проведения амплификации использовалась ПЦР-смесь следующего
состава: ДНК 25 нг; Tris HCl – 20 mM (pH 8,8); 2 mM MgSO4; 10 mM KCl; 10 mM
(NH4)2SO4; 0,5 μM праймеров; 200 μМ dNTP, 1 е.а. полимеразы. Режим амплификации
следующий: 94°С – 2 мин; 2) 94°С – 40 с; 3) 55°С – 40 с; 4) 72°С – 5 мин. Общее
количество циклов - 35. Продукты ПЦР разделялись путем электрофореза в 1,7%м агарозном геле с трис-боратным буфером, окрашивались бромистым этидием,
визуализировались в ультрафиолетовом свете с помощью гельдокументирующей
системы Bio Rad.
По результатам амплификации с праймерами была составлена бинарная
матрица, в которой наличие фрагмента обозначалось как 1, отсутствие как 0. На
основе данной матрицы в компьютерной программе Treecon for Windows были
рассчитаны генетические расстояния по Нею [19].
Между сравниваемыми
генотипами был проведен бутстреп-тест. Для построения суммарной дендрограммы
использовался
метод
кластеризации
UPGMA
[19].
Результаты и обсуждение
По результатам амплификации с праймером PawS 5 были выявлены
характерные фрагменты, позволяющие идентифицировать отличия линий
регенерантов друг от друга и от исходных форм (рисунок 1).
Исследуемые генотипы отличались друг от друга в основном по
низкомолекулярным бэндам, в то время как имели 3 общих, характерных для
всех генотипов пшеницы бэнда длиной 300, 550 и 1000 п.о.
1 – Л 503 (исходная форма); 2 – R6 Л 503 с 20% F.g. № 1; 3 - R6 Л 503 с 20% F.g.
№ 5-2; 4 - R6 Л 503 с 20% F.g.; 5 - R6 Л 503 с 20% F.g. № 5; 6 – Акмола 3
(исходная форма); 7 – R4 Акмола 3 с 10% Sn № 6; 8 – R4 Акмола 3 с МС № 2-1; 9
– 118/95-1 (исходная форма); 10 – R6118/95-1 с 2% ПЭГ № 2; 11 – R6 118/95-1 с
30% F.g. № 1; 12 – R6 118/95-1 с 0,3% NaCl №6-2-2
Рисунок 1 - Результаты амплификации ДНК линий растений-регенерантов и
исходных форм с праймерами PawS5+MS17
По результатам REMAP-анализа с комбинацией праймеров PawS5+MS17
были выявлены молекулярно-генетические отличия исследуемых генотипов.
Идентифицируемые ампликоны имели размеры от 450п.о. до 1300 п.о. Бэнды
размером 450, 550 и 1000 п.о. были мономорфными, т.е. присутствовали в спектрах
амплификации всех исследуемых генотипов. Суммарное количество бэндов у 12
изученных линий составило 76, из которых 41 – были полиморфными. Общий
процент полиморфизма, детектируемого с использованием данной комбинации
праймеров, составил 53,95%. Наиболее насыщенными были спектры амплификации
у сорта Акмола 3 (исходная форма), у исходной формы линии 118/95-1, а также у
линии R6118/95-1 с 2% ПЭГ № 2, у данных генотипов было идентифицировано от 6
до 8 фрагментов. Линия R6Л 503 с 20% F.g. № 5-2 отличалась от исходной формы
и остальных линий регенерантов наличием фрагмента длиной 800 п.о. Линия № 6
сорта Акмола 3, полученная на среде МС+10% КФ S. nodorum была идентична по
спектру амплификации с линией R4 Акмола 3 с МС № 2-1, однако, эти линии
регенерантов отличались от исходной формы отсутствием фрагмента размером 500
п.о., который присутствовал в спектре исходной формы. Исходная форма Л 503 и
линии регенерантов поколения R6 отличались от других генотипов наличием
высокомолекулярных бэндов размером 1200 и 1300 п.о.
При использовании комбинации праймеров PawS6 +MS17 наблюдали
иной характер распределения продуктов амплификации (рисунок 2). В данном
случае спектры амплификации были менее насыщенными, было
идентифицировано от 1 до 5 6 фрагментов амлификации, которые были
высокомолекулярными – размер превышал 1000 п.о. Спектр амплификации
наиболее насыщенным был у таких генотипов, как Л 503 (исходная форма) и
линий-регенерантов 6-го поколения, полученных с использованием
культурального фильтрата F. graminearum, а также у линии R4 Акмола 3 с 10%
Sn № 6. Возможно, что появление дополнительных бендов связано с
культивированием на средах с культуральными фильтратами грибов, в
результате воздействия токсичных метаболитов которых в растительных клетках
активируются защитные механизмы, происходит синтез белков, ферментов. По
результатам амплификации с комбинацией праймеров PawS6 +MS17 было
идентифицировано у 12 генотипов 38 фрагментов размером от 1000 до 1500 п.о.,
из которых 26 были полиморфными, т.о. процент выявляемого полиморфизма
при использовании данной комбинации праймеров увеличился до 71,05%.
1 – Л 503 (исходная форма); 2 – R6 Л 503 с 20% F.g. № 1; 3 - R6 Л 503 с 20% F.g.
№ 5-2; 4 - R6 Л 503 с 20% F.g.; 5 - R6 Л 503 с 20% F.g. № 5; 6 – Акмола 3
(исходная форма); 7 – R4 Акмола 3 с МС № 2-1; 8 - R4 Акмола 3 с 10% Sn № 6;
9 – 118/95-1 (исходная форма); 10 – R6118/95-1 с 2% ПЭГ № 2; 11 – R6 118/95-1 с
30% F.g. № 1; 12 – R6 118/95-1 с 0,3% NaCl №6-2-2
Рисунок 1 - Результаты амплификации ДНК линий растений-регенерантов и
исходных форм с праймерами PawS6+MS17
Линия регенерантов константной формы Л503 № 1, полученная на среде
МС+20% КФ гриба F. graminearum, отличалась от исходной формы и других
линий отсутствием фрагментов размером 1250 п.о., 1300 п.о. и 1400 п.о. Также и
линия R4 Акмола 3 с 10% Sn № 6 отличалась от исходной формы
присутствием фрагментов размером 1250, 1300 п.о. и 1400 п.о.
Линии регенерантов гибрида 118/95-1, полученные на средах с
различными селективными агентами (КФ гриба F. graminearum, хлорид
натрия и ПЭГ-6000) не отличались от исходной формы, спектр
амплификации был представлен только 1 бэндом – 1000 п.о.
По результатам амплификации был проведен анализ спектров амплификации с использованием REMAP-анализа (таблица 1). Выявлено, что данный
метод является достаточно информативным для выявления индивидуальных
отличий
генотипов
пшеницы.
Таблица 1 – Анализ спектров амплификации ДНК пшеницы различных
генотипов с использованием REMAP-ПЦР
Комбинация
праймеров
Праймер
PawS5+ MS17
Праймер
PawS6+ MS17
Сумма по
всем
праймерам
Общее кол-во
ампликонов,
шт.
Кол-во
вариабельных
ампликонов, шт.
Полиморфизм
,%
41
Кол-во
стабильных
ампликонов,
шт.
35
76
38
26
12
71,05
98
68
30
69,39
53,95
По результатам амплификации с праймерами ((PawS 5+MS17)+(PawS
6+MS17)) была составлена бинарная матрица, в которой наличие фрагмента
обозначалось как 1, отсутствие как 0. Затем, по результатам данной матрицы в с
использованием программы Treeconw между сравниваемыми генотипами был
проведен бутстреп-тест. Для построения суммарной дендрограммы использовался
метод
кластерного
анализа
UPGMА
(рисунок
3).
Рисунок 3 – Суммарная дендрограмма результатов амплификации ДНК линий
регенерантов пшеницы с REMAP-маркерами
По результатам амплификации очевидно разделение генотипов на кластеры и
подкластеры. В один (верхний) подкластер поместились исходная форма и линии
регенеранты, полученные на селективных средах с культуральным фильтратом F.
graminearum, причем все генотипы отличаются друг от друга, а также от исходной
формы. Ближе всех по генотипической характеристике к исходной форме стоит
линия R6 Л 503 с 20% F.g. № 1, при этом процент сходства-различий составил
63%. Линии 118/94-1, полученные в процессе различных схем селекции in vitro,
также разместились в различных подкластерах, при этом линия R6118/95-1 с 2%
ПЭГ № 2 показала всего 29% сходства-различий от исходной формы.
Линия R4 Акмола 3 с МС № 2-1, находящаяся в одном подкластере с
исходной формой, тем не менее отличается от нее, проявляя 34% сходства.
Значительно отличается от них линия R4 Акмола 3 с 10% Sn № 6, которая
находится от них на значительном генетическом расстоянии.
В целом, распределение генотипов на ветвях дендрологического древа
довольно логичное, так, практически все линии, полученные в результате
селекции на устойчивость к фитопатогенам находятся в одном большом
кластере, а линии, устойчивые к абиотическим стрессорам – в малом нижнем
кластере, за исключением линии R6 118/95-1 с 0,3% NaCl №6-2-2.
В результате проведенного анализа установлено, что использование в
качестве
праймеров
к
длинным
концевым
последовательностям
ретротранспозонов PawS 5 и PawS 6 в комбинации с микросателлитным
праймером MS 17 (5'(CT)10G), позволяет получать относительно простые,
хорошо воспроизводимые спектры продуктов амплификации, удобные для
идентификации генотипов пшеницы, полученных с использованием различных
схем селекции in vitro. Кроме того, показано, что использование данного типа
молекулярных маркеров позволяет идентифицировать индивидуальность линий
регенерантов мягкой пшеницы, полученных биотехнологическими методами, на
уровне
умеренно
повторяющихся
последовательностей.
Литература
1. Schulman A.H. Molecular markers to assess genetic diversity//Euphytica. –
2007, vol. 158. – Р. 313-321.
2. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК технологии
создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная
биология. - 2003. - № 3. – С. 26-41.
3. Чекалин, Н.М. Генетические основы селекции зернобобовых культур на
устойчивость к патогенам. — Полтава: Изд-во «Iнтерграфiка», 2003. — 186 с.
4. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров
и их применение. // Физиология и биохимия культурных растений. – 2002. – Т.
34. - № 4. – С. 279-296.
5. Глазко В.И., Цветков И.А., Иванов А.И. IRAP-маркеры в оценках
диффернциации сортов риса// Доповiдi НацiональноÏ АкадемиÏ Наук Укра Ïни. –
2007.- № 7. – С. 153-159
6. Брик А.Ф., Календарь Р.Н., Стратула О.Р., Сиволап Ю.М. IRAP- и
REMAP-анализ сортов ячменя одесской селекции.// Цитология и генетика. –
2006. - № 3. – С. 24-33.
7. Kalendar R., Grob T., Regina M. et al. IRAP and REMAP: Two new
retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Theoretical and Applied
Genetics. 1999. - Vol. 98. - Р. 704–711.
8. Kalendar R., Schulman A.H. IRAP and REMAP for retrotransposon-based
genotyping and fingerprinting // Nature Protocols. - 2006. - Vol. 1. - № 5. - Р. 2478–
2484.
9. Leigh F., Kalendar R., Lea V. et al. Comparison of the utility of barley
retrotransposon families for genetic analysis by molecular marker techniques // Mol.
Gen. Genomics. - 2003. - Vol. 269. - Р. 464–474.
11. Боронникова С.В., Календарь Р.Н. Использование IRAP-метода для
анализа генетической изменчивости популяций ресурсных и редких видов
растений. // Генетика. – 2010. – Т. 46. - № 1. – С. 44-50.
12. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация популяций редких
видов растений рода Adonis c использованием ISSR- и IRAP-маркеров //
Известия ТСХА. - 2009. - № 1. - С. 83–89.
13 Rogowsky P.M., Shepherd K.W., Langridge P. Polymerase chain reaction
based mapping of rye involving repeated DNA sequences // Genome. - 1992. – Vol.
35. – P. 621-626.
14. Хавкин Э.Е. ДНК генотипирование растений Brassica и Solanum // 3
Моск. Межд. Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. –
2007. – С. 304.
15. Kumar A., Bennetzen J. Plant retrotransposons // Annual Rev. Genetics. 1999. - Vol. 33. - P. 479–532.
16. Евгеньев М.Б. Мобильные элементы и эволюция генома //
Молекулярная биология. - 2007. - Т. 41. - № 2. - С. 234–245.
17. Guidet F., Rogowsky P., Taylor C. Cloning and characterization of a new
rye-specific repeated sequence // 1991. – Genome. – Vol. 34. – P. 81-87.
18. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии.
– Москва: Воскресенье. – 2006. – 480 с.
19. Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist. –
1972. – Vol. 106. – P. 283-291.
Summary
The purpose of research is genetic differentiation of plant-regenerants of soft
wheat using REMAP-analysis. Study of polymorphism DNA using a new type of
molecular-genetic markers that are based on the study of DNA fragments, flanking of
his inverted repeat retrotranspozons, somewhere in the locus of microsatellites (IRAP
and REMAP) is of interest for genotyping of plants. Found that the use of primers
PawS 5 and 6 PawS in combination with microsatellite primer MS 17 (5 ' (CT) 10 g),
allows for simple, well reproducible spectra products amplification, convenient for
identifying genotypes of wheat. Use of this type of molecular markers to identify the
individual sheets of soft wheat lines derived by biotechnological techniques,
moderately repetitive sequences.
Түйін
Зерттеу жұмысының мақсаты in vitroда селекция әдісімен алынған
жаздық жұмсақ бидайдың өсімдік регенеранттарының генетикалық
дефференциациясын зерттеу. in vitroда селекция әдісімен алынған жаздық
жұмсақ бидайдың өсімдік регенеранттарын және сорттарын қолдандық.
Микросателитті локусы бар аймақты (IRAP- және REMAP) немесе
ретротранспазоның қайталанатын инвертерленген фланкирленген
ДНҚ
франгменттерін зерттеуге арналған жаңа молекулалық генетикалық маркерлерді
пайдаланып, ДНҚ полиморфизмін анықтау. PawS 5 және PawS 6 праймерлері
MS 17 (5'(CT)10G) микросателитті парймерлермен бірге бидай генотипін
идентификациялауға ыңғайлы
амплификация өнімінің қарапайым, жақсы
спекторын беретіні анықталды. Осындай молекулалық маркерлерді
биотехнологиялық әдіспен, қалыпты қайталанатын тізбек деңгейінде алынған
жаздық
жұмсақ
бидай
регенеранттарның
жеке
линияларының
идентификациялау үшін пайдалануға болады.