Биотехнология приплода

ПЛЕМЕННОЕ ДЕЛО
АКТУАЛЬНО
Биотехнология приплода
(Продолжение. Начало в № 4)
Виктор МАДИСОН,
кандидат биологических наук
Головной селекционный центр Украины
Любовь МАДИСОН,
кандидат биологических наук
Национальный университет биоресурсов
и природопользования Украины
Непорочным методом — только девочки
Партеногенез. Намного привлекательнее кажутся попыт
ки ученых заставить яйцеклетку коровы делиться без опло
дотворения. Этот способ однополого размножения встреча
ется в природе позвоночных (0,1%) и недавно опробован на
макаках. То, что в результате партеногенеза рождаются ис
ключительно «девочки», — немаловажное преимущество для
фермеров, заинтересованных в увеличении маточного по
головья в своих стадах.
Медицинский источник в Интернете сообщает, что в ми
ре известно 16 случаев непорочного зачатия у людей. Но это
вряд ли проявление партеногенеза. Всепроникающее действие
сперматозоидов и их удивительная живучесть (даже после за
морозки при минус 196 °С и бомбардировке лазером) хоро
шо известна.
Ученые допускают возможность самопроизвольного деле
ния зрелой неоплодотворенной яйцеклетки человека под
влиянием тряски, неустанных молитв и медитации — то есть
стрессовых ситуаций и «сверхчеловеческого» напряжения
душевных сил. Но в обычных условиях яйцеклетка в состоя
нии партеногенетического деления погибает на ранних ста
диях. К тому же поменять свой пол на мужской она может
только под воздействием Yхромосомы, занесенной извне.
Всем нам известно из Библии о непорочном зачатии Де
вы Марии, хотя неверующие люди считают эту историю кра
сивой легендой. Основная нестыковка библейского изложе
ния, изза которой ее нельзя отнести к партеногенезу, состо
ит в том, что младенец Марии оказался мужского пола.
И всетаки… Теоретически Yхромосому «непорочным» пу
тем могли «доставить» к яйцеклетке и внедрить в нее виру
сы, микроорганизмы и паразиты. Удивительную версию,
объясняющую «мужской» партеногенез яйцеклетки, можно
прочитать в Интернете. Существуют мужчины, у которых
набор половых хромосом, вопреки канонической догме, не
X–Y, а Х–Х. Но при этом на кончике одной такой Xхромо
сомы (той, что пришла от отца) есть участок SRY. Удалось вы
яснить, откуда он там взялся. Оказывается, в ходе образова
ния сперматозоида этот кусочек случайно отломился от сво
ей Yхромосомы и «уселся» на отцовскую же Ххромосому,
вместе с которой вошел при оплодотворении в яйцеклетку как
ХХконструкция. А еще позже, уже в эмбрионе, он включил
ся в работу, сделав эмбрион мужским — типа ХХ–SRY. Мо
жет быть, сын Марии и был таким удивительным мальчиком?
В пользу этой версии говорит и то обстоятельство, что
Yхромосома — очень небольшая в сравнении с Ххромосо
мой (около 90 против 1100 генов), она может «создаваться и
деградировать, возрождаться и перерабатываться, умирать
и воскресать в новом обличии».
Семь дней для сотворения жизни и мира на Земле
Клонирование эмбриональных клеток. В отличие от кло
нирования соматических клеток исследования по раннему
эмбриогенезу тотипотентных зародышевых клеток, каждая
из которых способна дать жизнь новому организму, сулят
большие возможности для воспроизводства рекордисток.
Эти исследования быстро подхватили медики, надеясь полу
чать из тотипотентных клеток эмбриона стволовые для вы
ращивания нужных органов.
Эмбрион коровы (а также человека и других млекопитаю
щих) на ранних стадиях состоит из таких тотипотентных кле
токбластомеров (фото 1), которые находятся в состоянии по
стоянного деления. Эмбриональный зародыш млекопитаю
щих до седьмого дня после оплодотворения — как коробка
с пластилином, из плитокклеток которого можно вылепить
десятки и сотни новых организмовкопий или вырастить
любой орган будущего животного и человека. Это недельное
свойство зародыша — тотипотентность — кладезь для сотво
рения жизни.
Пока не образовалась полость и морула не превратилась
в бластоцисту (восьмидневный эмбрион с полостью), каж
дый бластомервиноградинка теоретически способен дать
жизнь новому зародышу или новому органу (в качестве ство
ловой клетки). Остается только разделить бластомеры на то
типотентные заро
дышевые бутоны и
научиться выращи
вать их до взросло
го состояния.
К восьмому дню
развития в эмбрио
не коровы образу
ется полость (бла
стула), происходит
визуально заметная
дифференциация Фото 1. Восьмиклеточная морула
клеток на трофо (100кратное увеличение)
бласт (питание пло
да) и эмбриобласт (сам зародыш теленка). После этого эм
бриональные клетки утрачивают свою тотипотентность и
растут по заданной природой программе. Клеточный «пла
стилин» спустя неделю после оплодотворения к лепке орга
низмов и органов становится не пригодным.
Разве не удивительно, что эта биотехнологическая исти
на сотворения жизни в течение первой тотипотентной неде
ли стала известна науке сравнительно недавно, а в Библии се
мидневный лимит на сотворение мира описан еще задолго
до изобретения микроскопа?!
В отчете Американской ассоциации трансплантации
эмбрионов (АЕТА) за 2008 г. есть ссылка на 2 фирмы (из 123
ЖИВОТНОВОДСТВО РОССИИ МАЙ 2010
5
АКТУАЛЬНО
ПЛЕМЕННОЕ ДЕЛО
зарегистрирован
ных), занимающи
еся клонированием
эмбрионов (одна из
них предпочла ос
таться анонимной).
Кратко и без ком
ментариев сообща
ется о 70 трансплан
тациях клонирован
ных эмбрионов.
Фото 2. Ю. Березовский с расщеплен
Получение хи
ными по полу и масти телятами
мер — генетических
мозаиков — хорошо
отработанная технология, имеющая один недостаток: теле
нокхимера, несущая в себе генотип четырех и более роди
телей (две мамы + два папы), не способна передавать эту
комбинированную наследственность потомкам. Такие гене
тические мозаики легко «лепятся» под микроскопом из на
следственного материала (бластомеров) разных по генотипу
животных, но породные признаки у потомства не «переме
шиваются» и не наследуются. При попытках дальнейшего вос
производства химеры (> или +) ее приплоду передается толь
ко один парный набор хромосом родителей. Например, те
ленок от родителяхимеры краснопестрой + чернопестрой
породы (красночернобелой расцветки) унаследует гено
тип лишь одной пары родителей и будет красной или черно
пестрой масти. Такой опыт был четверть века назад осуществ
лен в ВИЖ с участием немецких ученых.
Невозможность наследуемости искусственно созданного
химеризма обусловливает его чисто познавательный и кон
структорский (как в «лего») интерес. Иногда селекционерам
важно проследить фенотипическое проявление разных гено
типов (например, комплекса признаков высокобелковости
и жирномолочности коровдоноров), объединенных в од
ном временном организме.
Разделение спермы и эмбрионов по полу. Больше всего жи
вотноводовпрактиков за последние два десятилетия заинте
ресовали открывшиеся перспективы разделения спермы, а
значит, планирование зародышей по полу. До недавнего вре
мени кариотипирование (обследование под электронным ми
кроскопом) зародыша на наличие мужской Yхромосомы бы
ло возможно только после биопсии (отщепления) клеточной
массы, которая нарушала его целостность и снижала выжива
емость эмбриона. Теперь, используя для осеменения коров и
доноров сексированную сперму, можно планировать получе
ние однополых телят и эмбрионов с вероятностью 80–90%.
Об этом мы писали в «Животноводстве России» пять лет на
зад (2005, № 10): «Метод поточной лазерной цитометрии для
разделения спермопродукции по полу, который предлагает ан
глийская компания Cogent, сложен и пока остается дорогим удо
вольствием. Решить эту проблему на родине великого откры
тия — криоконсервации спермопродукции — дело чести рос
сийской биотехнологической науки. Нужно только желание
правительства и немного патриотизма, чтобы профинансиро
вать исследования. В век конструирования генов можно, навер
ное, изыскать и более простой способ разделения X и Y гамет,
чтобы получать приплод и эмбрионы нужного пола».
Не откажемся от этих слов и сегодня. Надо искать более
«человечный» способ «растаскивания» гамет разной половой
6
ЖИВОТНОВОДСТВО РОССИИ МАЙ 2010
ориентации: химический (включая половые феромоны), ме
ханический (например, тряску и центрифугирование), элек
трический, магнитный и т.д.
А пока практикам не стоит особенно обольщаться первыми
успехами половой дифференциации генетической продукции.
В США только 2,4% суперовуляций и сборов эмбрионов молоч
ного скота осуществлено с использованием сексированной
спермы. Похожая картина (1,8%) и в мясном скотоводстве. Да
и цена такой спермопродукции и эмбрионов пока кусается.
Как известно, сексированные сперматозоиды после лазер
ного сканирования и сортировки на X и Yносители имеют
пониженную оплодотворяющую способность и маленькую
концентрацию: результативность оплодотворения близка к
30%. Можно ее повысить до 50–60% за счет использования
только на виргинных (девственных) телочках и только один
(первый) раз.
В подтверждение этому приведем новогоднее сообщение из
ПСП «Плешкані» Черкасской области. Главный зоотехник
Ю. Березовский (фото 2) приводит статистику результативно
сти осеменения стада интактных (девственных) телок в воз
расте 15–17 месяцев сексированной спермой голштинского бы
ка Парадокса (линия Чифа из США). После искусственного
однократного осеменения 197 телочек стельными стали 102
(51,8%), от них полученно 40 голов (37 телочек и 3 бычка).
Можно поздравить директора хозяйства Д. Лысуна и тех
никаосеменатора И. Гразион с таким успехом! Новогодний
сюрприз от быка Парадокса состоял в том, что из 40 телят,
отцом которых стал сексированный по полу голштин крас
ной масти, почти половина оказалась черной окраски. До это
го времени (2007–2008 гг.) в хозяйстве осеменяли животных
спермой того же быка, но не разделенной по полу, и все оте
лившиеся телята были красной масти.
Все это лишний раз свидетельствует о том, что биотехно
логия приплода далеко не изучена и таит еще много подобных
сюрпризов. Можно только предположить, что в результате ла
зерной атаки у части сексированных Xспермиев была утра
чена доминантность гена, отвечающего за красную масть по
томства. Она стала рецессивной и, видимо, сможет проявить
себя вновь лишь в последующих поколениях. К тому же крас
ная окраска оказалась «сцепленной» с полом приплода.
Эти предположения можно подтвердить или опроверг
нуть только при тщательном генетическом или иммуногене
тическом анализе отца и его потомства.
Все сюрпризы и парадоксы, возможно, происходят изза
облучения спермы при поточной лазерной цитометрии. Затем
спермопродукция подвергается стрессу при криоконсерва
ции. Вполне вероятно, что этот «упадок сил» после шоково
го воздействия на сперму лазерного луча и холода будет пере
дан и сексированному по полу эмбриону. Но это лишь пред
положение. Поэтому было бы интересно узнать от читателей
журнала, какие еще сюрпризы преподносит подобная спер
мопродукция и сексированные по полу эмбрионы на фермах.
С коллегами из полтавского ООО «Племсервис» мы пла
нируем в этом году получить разделенные по полу эмбрио
ны после осеменения коровдоноров сексированной спер
мопродукцией и проанализировать их «поведение» после
трансплантации.
Отчет коллег из США за 2008 г. о трансплантации эмбрио
нов (ТЭ) свидетельствует о том, что выход жизнеспособных
эмбрионов при осеменении сексированной спермой был при
ПЛЕМЕННОЕ ДЕЛО
мерно на 1,5 зародыша ниже по сравнению с вымыванием по
сле традиционного искусственного осеменения доноров.
В этой стране в 2008 г. получено от коровдоноров молоч
ных пород 123 056 жизнеспособных эмбрионов (+15 тыс. к
2007 г.), в том числе после осеменения сексированной спермо
продукцией — 2098 эмбрионов. От доноров мясных пород —
соответственно 120 057 и 2994 эмбриона.
В Канаде в 2008 г. получено от доноров молочных и мяс
ных пород соответственно 70 571 и 18 498 качественных эм
брионов; пересажено сексированных зародышей свежими и
после оттаивания 1227 и 1321. О проценте приживляемости
разделенных по полу эмбрионов не сообщается.
Кто будет заниматься биотехнологией приплода на Укра
ине и в России при отсутствии единого биотехнологического
центра репродуктивных технологий? Энтузиастов, подобных
директору агрофирмы «Петродолинская» или руководству
«Племсервиса», в эпоху рыночных отношений почти не оста
лось. Но именно загадки зарождения жизни лежат в основе бу
дущих открытий, которые мы упускаем, заигравшись в рыноч
ную экономику и забросив биотехнологические исследования.
Послевоенные 1940е годы были для СССР куда более тя
желыми, чем нынешнее время, но именно тогда (всего 60
лет назад) были заложены открытия, перевернувшие миро
вые представления об искусственном осеменении и транс
плантации эмбрионов.
Почему сегодня нашим президентам не приходит в голову
идея собрать под одной межгосударственной крышей биотех
нологовэнтузиастов из стран бывшего Союза, а других вернуть
изза рубежа? Талантливых «биоколдунов» (в хорошем смысле
слова) на самом деле не так уж много, и вести подобные иссле
дования в каждой отдельно взятой стране нерационально.
Производство трансгенных животных. Над получением
трансгенных коз сегодня трудятся на российскобелорусском
предприятии по совместной программе «БелРосТрансген».
Ученые и специалистыбиотехнологи в городе Жодино Мин
ской области почти 10 лет пытаются вживить в ДНК козы че
ловеческий ген. После пересадки такого генномодифициро
ванного зародыша ожидают появления коз, которые будут
способны вырабатывать вместе с молоком полезные для че
ловека биологически активные вещества, например лактофер
рин, так необходимый для искусственного вскармливания
младенцев. И к этому есть реальные предпосылки.
На ферме в Чарлтоне (штат Массачусетс, США) 30 генети
чески модифицированных коз с 2006 г. дают молоко с челове
ческим белком — антитромбином, который способен разжи
жать кровь. На его основе получено первое лекарство ATryn. За
рубежом уже десять лет успешно доят коз и коров для произ
водства из молока человеческого лизоцима и лактоферрина.
Вообще лактоферрин грудного молока продолжает удив
лять фармакологов: недавно в нем обнаружена выраженная
противоопухолевая активность. Так что молоко матери, не
смотря на успехи трансгенеза, пока остается незаменимым
лекарством от множества болезней, в том числе и онкологи
ческих. Вопрос лишь в том, будет ли добавка отечественно
го порошка лактоферрина (если его всетаки удастся полу
чить) в смеси для грудного вскармливания полноценной за
меной материнского молока?
В Жодино появления трансгенных коз ожидают уже 10 лет
(первые были обещаны еще в 2006 г.). Срок немалый даже для
такой сложной генетической конструкции.
АКТУАЛЬНО
Игорь Гольдман, автор совместного проекта, еще четверть
века назад в ВИЖ занимался принудительным клонирова
нием эмбрионов кролика. К самопроизвольному делению
зародыш должна была подтолкнуть накинутая на него пет
ля из сверхпрочной микронити.
Сама идея в то время вызвала большой интерес, и этот
способ клонирования эмбрионов млекопитающих даже по
лучил название «петля Гольдмана». Правда, дальше лабора
торных кроликов «петля» не пошла, и идея была забыта.
Спустя 20 лет биотехнолог приходит на прием к секретарю
Союзного государства Павлу Бородину. Павел Павлович,
судя по всему, попал в «петлю Гольдмана» и выделил 50 млн руб.
из общесоюзного фонда на начало разработок по генетическим
модификациям зародышей коз.
Мы пишем об этом с той лишь целью, чтобы читатель не
принимал на веру любые обещания биотехнологических фан
тазеров. Конечно, биотехнология — дело тонкое, но бескон
трольность таких исследований со стороны ученыхколлег бу
дет порождать новых «биофокусников». Несложный подсчет
показывает, что на те 50 млн руб. можно было заказать у за
рубежных специалистов стадо из 18 генетически модифи
цированных коз или 3 ГМкоровы и через 10 лет иметь фер
му трансгенных животных и ГМэмбрионы от них. А самое
главное — если бы эти средства выделялись в рамках науч
ных программ, вместе с генномодифицированными живот
ными стали бы появляться и научные школы наподобие шко
лы академика Милованова, прославившей отечественную
биотехнологию в середине прошлого века.
А пока… «Сергей Миронов оплодотворил мышь», — со
общается о посещении председателем Совета Федерации ла
боратории трансгенеза Института биологии гена.
Остается надеяться, что на этот раз шумиха, поднятая во
круг конструирования генномодифицированных козбио
реакторов по проекту «БелРосТрансген», тоже не окажется
горой, родившей биотехнологическую мышь.
Вот почему сегодня мы не желаем скорейшего возвраще
ния наших талантливых согражданбиотехнологов изза ру
бежа. Там они смогут реализовать себя без постыдных фаль
сификаций. Всетаки хочется честной (пусть пока и бедной)
отечественной биотехнологии.
Приплод из пробирок
Оплодотворение ооцитов in vitro. Большие и не оправдавшие
ся в полной мере надежды возлагались на культивирование
и оплодотворение яйцеклеток вне организма. Казалось заман
чивым отбирать зачаточные ооциты из яичников высокопро
дуктивных коров на мясокомбинате или у живых особей ме
тодом аспирации фолликулов и доводить их «до ума» вне ор
ганизма — в искусственных средах и инкубаторах. Число
таких «неиспользуемых» в репродукции самки ооцитов за
жизнь достигает 100–200 тыс., так почему бы не пустить их
«в дело»? Но природа пока не хочет полностью открыть тай
ну зарождения жизни «вне организма».
После экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) «в
пробирке» зародыш утрачивает жизненную силу гораздо бы
стрее эмбриона, полученного после оплодотворения в мат
ке. Яйцеклетки, прошедшие стадию зарождения жизни «на
стекле», не имеют всего комплекса «ощущения матки», ко
торый они могли бы иметь при оплодотворении в половых
путях in vivo. Чегото им не хватает.
ЖИВОТНОВОДСТВО РОССИИ МАЙ 2010
7
АКТУАЛЬНО
ПЛЕМЕННОЕ ДЕЛО
Рис. 1. «Нечестное» оплодо Рис. 2. Искусственное оплодо
творение ооцита in vitro од творение яйцеклетки извне
ним сперматозоидом
То же самое относится и к сперме. Сперматозоиды, не про
шедшие по половым путям матки (некапацитированные) перед
слиянием с яйцеклеткой, не приобретают требуемых свойств для
полноценного зарождения новой жизни (рис. 1, 2). После опло
дотворения и выращивания «на стекле» эмбрион остается ос
лабленным, плохо криоконсервируется и приживляется после
ТЭ, несмотря на тепличные условия и «хитромудрые» среды.
Причины такого комплекса «неполноценности» науке по
ка не совсем ясны. Выход качественных эмбрионов у коров
доноров после ЭКО составляет лишь 5,4% общего числа яй
цеклеток, а приживляемость падает до 20–30%. Это касает
ся и людской ТЭ: результат приживляемости эмбрионов,
зачатых in vitro, составляет 25–30% и достигается за счет од
новременной пересадки трех зародышей («правило трех»).
В традиционной ТЭ коров действует магическое число 60.
То есть 60% животных реагируют на введение гонадотропи
нов суперовуляцией, выход качественных зародышей в эм
бриосборе составля
ет примерно 60%,
приживляемость за
родышей лимити
руется 60%.
Надо сказать, что
проблемы с ЭКОза
родышами никак не
влияют на здоровье и
генетический аппа
рат животных и че
ловека, полученных
таким необычным
методом. Приплод и
дети «из пробирки»
(а их более миллио
Фото 3. Первая в СССР девочка «из
на) рождаются впол
пробирки» родилась в Москве, сейчас
не здоровыми и уже
живет в Севастополе
имеют собственное
потомство.
Первая в мире девочка «из пробирки» (1978 г.) Луиза Браун
благополучно обзавелась сыном, а появившаяся таким же
путем в СССР (1986 г.) еще одна девочка Лена тоже имеет ре
бенка и, судя по фотографии (фото 3), выглядит прекрасно.
В отличие от соматического клонирования природа не соби
рается «мстить» своим биотехнологическим детям «из про
бирки», полученным из половых клеток.
И всетаки прогресс в ЭКО есть. Двадцать лет назад опло
дотворение яйцеклеток скота in vitro проводилось в лаборато
риях НИИ и рождение телят от таких зародышей составляло
8
ЖИВОТНОВОДСТВО РОССИИ МАЙ 2010
не более 15–20% от попыток их трансплантации. Сегодня бла
годаря усилиям ученых метод «выходит» на фермы. На рын
ке ТЭ появились эмбрионы, оплодотворенные in vitro с 30–35%
ной стельностью реципиентов, и фирмы предлагают их по
80–100 долл. Правда, таких эмбрионов поступает на реализа
цию пока немного (≈10%) и ажиотажного спроса на них нет.
Но изза того, что ооциты для IVF (оплодотворения in vi
tro) достаются почти даром (с убойного и «попутного» мате
риала доноров), их себестоимость может быть вполовину мень
ше себестоимости зародышей, полученных способом тра
диционного оплодотворения in vivo. Статистика производства
эмбрионов по IVFтехнологиям в 2008 г. выглядит так.
В 19 странах Европы методом IVF и доращиванием «на сте
кле» произвели 7832 эмбриона, что составляет 9% эмбрио
сбора по традиционной ТЭ. С этой целью осуществили 3753
прижизненные аспирации яичников у коровдоноров. Каче
ственный сбор после IVFтехнологий — 6751 эмбрион. Еще
1081 эмбрион вырастили из яичников доноров после их убоя.
В США было 4308 попыток сбора ооцитов для IVF у ко
ровдоноров, из них 3089 — у мясного скота. Выращено по
3,2 качественного IVFэмбриона на сбор. Пересажено све
жими 12 843 IVFэмбриона, заморожено — 1054.
В Канаде в результате прижизненных аспираций и сбора
ооцитов на бойнях получено для IVF соответственно 650 и
3200 качественных эмбрионов (все у молочных доноров).
Пересажено 299, судьба остальных в отчете не отражена, но
и в экспорте не числится.
Следует знать, что, если заказчику предлагают дешевые эм
брионы, они, возможно, получены методом IVF или клони
рованием (но не в Харькове). В этом случае могут возник
нуть проблемы с результативностью их пересадки, которую
для таких зародышей лучше поручить специалистам той фир
мы, которая их производит.
При самостоятельной пересадке эмбрионов гарантий до
биться трудно. Их не дают даже медицинские фирмы, исполь
зующие вспомогательные репродуктивные технологии на
людях. При этом каждая попытка трансплантации ЭКОэм
брионов стоит пациенткам несколько тысяч долларов.
Кроме того, высокопродуктивных «элитных» доноров IVF
процедурам пока не подвергают. Задача этой биотехнологии
сегодня — получение дополнительного мясного приплода
за счет эмбрионов от попутных и забитых доноров, подсажен
ных молочным и мясным реципиентам.
Сохранение и восстановление видов. Если возникнет потреб
ность, специалисты по трансплантации эмбрионов готовы ве
сти пересадки зародышей почти всех видов млекопитающих.
К примеру, финансирование по зарубежным грантам позво
ляет новосибирским ученым работать над сохранением и
размножением отечественных видов норки в неволе. Очень
актуально в год Тигра сообщение о возможности восстанов
ления популяции вымерших каспийских тигров за счет ре
конструкции их генетического материала и его трансплан
тации амурским собратьям.
Особенно впечатляют успехи в работе с овцамидонорами ка
надских биотехнологов. Их усилиями создан банк 2 тыс. овечь
их эмбрионов (повидимому, ценных пород), из которых
около 1 тыс. криоконсервированных зародышей в прошлом го
ЖР
ду были отправлены на экспорт.
Украина
(Окончание в следующем номере)