Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов сайтов рестрикции. Название этих ферментов происходит от английского restriction (ограничения); они были выявлены у определенных штаммом бактерий. Крайне редко помимо эндонуклеазной активности рестриктаза обладает еще и метилазной (Есо571), производя последовательности, модификацию (метилирование) узнаваемой рестриктазой; определенных такие нуклеотидов в модифицированные последовательности не подвержены ферментативной рестрикции. Но обычно эти ферменты структурно независимы и работают в комплексе, образуя так называемую RM-систему (систему рестрикции-модификации). Одновременное наличие в клетке обеих ферментативных активностей защищает от интеграции в геном чужеродной ДНК (например, вирусов или плазмид) и предотвращает разрушение собственной ДНК. Известно около 2500 рестриктаз. Название того или иного фермента составляется из первой буквы рода и двух первых букв вида бактерии, из которой данная рестриктаза выделена, еще одна буква может обозначать тип штамма. Если в определенном штамме клеток имеется несколько рестриктаз, то к буквенному названию фермента добавляется числовое обозначение. Например - рестриктаза HindIIII выделена из клеток Haemophilus influenzae с серотипом d и относится к III классу RM-системы. Рестриктазы могут кодироваться не только геномной ДНК бактерии, но также плазмидами и фагами, в связи с этим к названию фермента добавляется название внехромосомного элемента (ЕсоRI). Рестриктазы Рестриктазы 4 типа Рестриктазы 1 типа Рестриктазы 2 типа Рестриктазы 3 типа Рестриктазы 1 типа Рестриктазы 1 типа представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, Sаденозилметионина и ионов Mg2+. Расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от несимметричных сайтов узнавания. При этом образуется сплошной спектр рестриктов, не детерминированных по размерам и содержанию информации, поэтому данные рестриктазы в генной инженерии не используют. Примером таких рестриктаз может служить ЕсоК. Рестриктазы 2 типа Рестриктазы II типа имеют широкое применение, поскольку рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо Сайты узнавания совпадают с сайтами расщепления или находятся рядом с ними на определенном расстоянии, в результате чего получаются фрагменты ДНК воспроизводимого состава и длины. Более половины рестриктаз данного класса узнают нуклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (палиндромы). По способу расщепления данные ферменты делятся на два подкласса: Представители первого осуществляют ступенчатый разрез комплементарных нитей ДНК, в результате чего образуются фрагменты с выступающими (липкими) концами: либо 5'- концами, либо 3'-концами, как в случае действия рестриктазы PstI. Ферменты второго подкласса (например, SmaI) расщепляют совпадающие связи, в результате чего образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами. Тупой-конец Липкий 5`-конец Липкий 3`-конец Рестриктазы 3 типа Рестриктазы 4 типа Рестриктазы III класса (например, EcoRI Pl) действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов, при этом расщепление происходит на определенном расстоянии от сайта узнавания. RM-система представлена (комплекс пока рестриктазы уникальным и метилазы) ферментом Eco571 IV в класса одной полипептидной цепочке которого и эндонуклеазная, и метилазная активность. A. Связывание РНК-полимеразы и начало транскрипции в направлении 5-3. B. Включение нуклеотидов в РНК со скоростью 40 нукл\сек, одновременно к иРНК прикрепляются рибосомы. C. Группы рибосом следуют за полимеразой. С 5`-конца начинается деградация ДНК. D. По мере движения рибосом иРНК деградирует, но с меньшей скоростью, чем идёт процесс трансляции. E. После окончания транскрипции иРНК освобождается, но процессы деградации и трансляции продолжаются. Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и специфической последовательностью, называемой промотором и располагающейся в начале всех транскрипционных единиц. 1. Поиск промотора 2. Образование закрытого промоторного комплекса 3. Образование открытого комплекса 4. Отсоединение σ – фактора и присоединение фактора элонгации 5. Терминация синтеза. РНК- полимераза достигает зоны терминатора 6. Высвобождение готовойго РНУ0транскрипьа в виде копии матричной ДНК. Интрон это участок ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о последовательности аминокислот. Интроны были обнаружены в генах кодирующих белки геномов органелл и ядер низших и высших эукариот, прокариот и вирусов. Последовательность нуклеотидов соответствующая интрону, удаляется из транскрибированной с него РНК в процессе сплайсинга до того, как произойдёт считывание белка (трансляция). Интроны характерны для всех типов эукариотической РНК, но также найдены в рибосомальной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК) прокариот). ТИПЫ ИНТРОНОВ Интроны генов ядерных мРНК Твинтрон Интроны в генах тРНК Особый тип интронов: группа 3 Особый тип интронов: группа 2 Особый тип интронов: группа 1 У генов, кодирующих разные тРНК, внутренние и фланговые участки интронов заметно различаются. Нет никакой канонической последовательности, которая могла бы узнаваться ферментами сплайсинга для растений, амфибий и млекопитающих. Все интроны содержат последовательность, комплементарную антикодону тРНК. Это приводит к формированию альтернативной конформации антикодоновой петли, при которой её длина увеличивается за счёт спаривания оснований антикодона с интроном. В основе сплайсинга тРНК лежит узнавание вторичной структуры тРНК, а не нуклеотидной последовательности интрона. Особый тип интронов: группа 1 находятся: а) в ядерных генах рРНК некоторых низших эукариот (Netrahymena thermophile, Physarum polycephalum) б) в генах рРНК митохондрий, хлоропластов, дрожжей и грибов в) в некоторых митохондриальных генах мРНК дрожжей и грибов г) в генах тРНК хлоропластов высших растений. Размеры интронов первой группы варьируют от от 400 п. н. у интрона про-рРНК Tetrahymena до нескольких тысяч п. н у митохондриальных мРНК. Интроны 1 группы сами катализируют свой сплайсинг, причём вся информация, необходимая для сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей внутри интрона, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием пространственной структуры. Автокаталитический сплайсинг был открыт у транскриптов генов рРНК T. thermophile. характерной Аутосплайсинг 26 S рРНК у тетрахимены в процессе образования рибозима . 1. Гуанозин атакует 5`- конец интрона, в результате чего происходит разрыв межнуклеотидной связи и высвобождение 5`- конца интрона; 2. Гидроксильная группа 3`-конца экзона 1 атакует фосфодиэфирную связь на 3`- конце интрона. 3. Замыкание фосфодиэфирной связи между ОН-группой 3`-конца экзона 1 и 5`- фосфатной группой экзона 2 4. В результате двухэтапного аутокаталитического расщепления 19 нуклеотидов из состава интрона образуется рибозим, обладающий каталитическими свойствами. Многие интроны группы I кодируют эндонуклеазы, обеспечивающие им мобильность. Известно уже несколько семейств таких эндонуклеаз, но у всех у них рядом с активным центром располагается аминокислотный мотив LAGLIDADG. Примером интрона группы I, кодирующим эндонуклезу, является интрон td фага Т4, который режет последовательность – мишень, расположенную на 24 пн выше сайта внедрения интрона . Интроны группы II распространены менее широко, чем интроны группы I. Они обнаружены: А) в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидаазы и цитохром. Интроны данной группы не содержат канонических последовательностей, характерных для интронов группы 1, но они также имеют специфическую вторичную структуру, образующуюся благодаря внутримолекулярному спариванию оснований. Интроны II группы также подвергаются аутосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком, входящим в состав самого интрона. Интроны II группы, высвобожденные в результате сплайсинга, представляют собой лассоподобные структуры, в которых 5`- концевой фосфат РНК интрона соединён фосфодиэфироной связью гидроксильной группой внутреннего нуклеотида. с 2`- Самые изученные мобильные интроны группы II кодируют по одному единственному белку. Открытая рамка считывания находится за пределами каталитического ядра интрона и даёт белок с активностями обратной транскриптазы, матуразы, эндонуклеазы. Также в этом белке имеется ДНК-связывающий мотив. Обратная транскриптаза синтезирует ДНК- копию интрона на матрице РНК и эта копия ведёт себя подобно копиям ретропозонов. Внося надрезы по обеим цепям ДНК, эндонуклеаза готовит сайт-мишень к внедрению интрона. Интроны генов ядерных мРНК находятся в ядерных генах кодирующих белки. Их размер варьирует от 100 п. н. до 10 т. п. н. и более. Наиболее характерной отличительной чертой всех интронов данной группы является наличие специфических последовательностей вблизи их 5`- и 3`-концов. Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов весьма консервативны и практически одинаковы во всех генах ядерных мРНК Интроны принимают участие в увеличении разнообразия продуктов экспрессии генов за счёт альтернативного сплайсинга (MironovA.A. etall, 1999; ClarkF.,ThanaraiT. A., 2002). Некоторые интроны содержат энхансеры и способны активно регулировать экспрессию генов, которым они принадлежат (RenX.-Y. Etall., 2006; DasD. Etall., 2007; ChungB. Y.W. etall., 2006). Интроны влияют на экспрессию генов через увеличение времени, необходимого для транскрипции гена. В работе группы учёных показано, что существует обратная зависимость, между длиной интронов и временем транскрипции генов, содержащих данные интроны (SwinburneI.A., 2008). В ряде работ было показано, что прерывание кодирующей последовательности гена вставкой интрона приводит к усилению экспрессии гена. В интронах были обнаружены последовательности, кодирующие новый класс микроРНК. Данный класс микроРНК получил название Id-miRNA. С функционированием данных молекул связаны процессы генной интерференции (Lin SL., 2008).