Принципы молекулярно-генетической оценки гемопоэтического

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Принципы молекулярно-генетической оценки
гемопоэтического химеризма
и области его применения в гематологии
Ä.Å.óÛıÎÓ‚ËÌ, Å.îÂÁÂ, å.à.á‡‡ÈÒÍËÈ, é.Ç.å‡Ë̈, Å.Ç.Äه̇Ҹ‚, Ä.ñ‡Ì‰Â
ñÂÌÚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË, ë‡ÌÍÚ-èÂÚÂ·Û„ÒÍËÈ „ÓÒÛ‰‡ÒÚ‚ÂÌÌ˚È Ï‰ˈËÌÒÍËÈ ÛÌË‚ÂÒËÚÂÚ ËÏ. à.è.臂ÎÓ‚‡;
ñÂÌÚ Ú‡ÌÒÔ·ÌÚ‡ˆËË ÍÓÒÚÌÓ„Ó ÏÓÁ„‡, ìÌË‚ÂÒËÚÂÚÒ͇fl ÍÎËÌË͇ ùÔÔẨÓÙ‡, ɇϷÛ„
Широкое применение трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) делает необходимым
диагностику донорского химеризма (ДХ) и смешанного химеризма (СХ) в популяциях клеток крови. Оценка уровней
ДХ и СХ позволяет реально оценивать приживление трансплантата, риск РТПХ и вероятность рецидива
злокачественного заболевания. Этот показатель имеет особое значение в случаях немиелоаблативной ТГСК, тем
самым обеспечивая возможность оптимизации цитостатической, иммуносупрессивной и иммуноадаптивной терапии.
Существует множество методик оценки уровней химеризма в популяциях лейкоцитов, включая цитогенетические, а в
последнее время и молекулярно-биологические подходы. Для этих целей пригодны различные ДНК-маркеры (в
основном повторы ДНК, а также ряд вариантов уникальных генов). Наиболее важной задачей сейчас является
разработка простых и недорогих методик количественной оценки ДХ. Их применение перспективно также при
органной трансплантации и некоторых аутоиммунных заболеваниях, сопровождающихся микрохимеризмом.
Ключевые слова: аллогенная трансплантация, гемопоэтические стволовые клетки, химеризм, методы, применение
Principles of molecular genetic evaluation of hematopoietic
chimerism and the areas of it’s application in hematology
A.B.Chukhlovin, B.Fehse, M.I.Zaraisky, O.V.Marinets, B.V.Afanasiev, A.R.Zander
Hematological Center of I.P.Pavlov St.-Petersburg State Medical University;
Center of Bone Marrow Transplantation, Eppendorf University Clinic, Hamburg
Wide application of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) necessitates the diagnostics of donor chimerism
(DC) and mixed chimerism (MC) in blood cell populations. Assessment of DC and MC levels enables realistic evaluation of
engraftment, risk of GvHD and relapse of malignancy. This index is of special importance in cases of nonmyeloablative HSCT,
thus providing an opportunity of optimizing cytostatic/immunosuppressive and immunoadoptive therapy. There is a variety of
techniques to assess chimerism levels in leukocyte populations, including cytogenetic and, more recently, molecular biology
approaches. A number of different DNA markers is plausible for these purposes (both DNA repeats and some variants of unique
genes). Development of simple and cost-efficient techniques for quantitative DC assay now represent the most important challenge. Likewise, their application is promising in organ transplantation and some autoimmune disorders associated with
microchimerism.
Key words: allogeneic transplantation, hematopoietic stem cells, chimerism, methods, application
В
течение последних 20 лет трансплантация гемопоэтических клеток (ТГСК) стала одним из наиболее эффективных методов лечения заболеваний системы гемопоэза, лимфом, тяжелых заболеваний системы иммунитета. Число выполненных ТГСК возрастает с каждым годом, причем все большее место среди них занимают аллогенные трансплантации
костного мозга и/или периферических стволовых клеток крови.
Несмотря на все более широкое внедрение высокодозной терапии с последующими ТГСК, ее эффективность ограничена, в
частности, рядом посттрансплантационных осложнений, в т.ч.
единичные случаи отторжения трансплантата, острая и хроническая реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), а так-
Для корреспонденции:
Афанасьев Б.В. Санкт-Петербургский государственный медицинский
университет, Центр гематологии
Телефон: (812) 238-48-55
70
же возможностью развития ранних и поздних рецидивов основного заболевания. В связи с этим своевременная и точная
оценка динамики приживления трансплантата играет важную
роль для адекватной оценки состояния больного после ТГСК и
планирования дальнейшего цитостатического и/или иммуносупрессивного лечения [1–4].
В широком смысле понятие генетического химеризма включает в себя сосуществование внутри одного организма как минимум двух клеточных популяций от разных организмов. В более узком – после успешной трансплантации гемопоэтических
стволовых клеток в организме развиваются популяции клеток
крови донорского происхождения, которые функционируют в
тканях и органах реципиента. Развитие химеризма в системе
крови больных после алло-ТГСК непосредственно обусловлено
процессом обновления системы гемопоэза за счет донорских
клеток и обычно происходит в течение 30 суток после трансплантации (рисунок).
èË̈ËÔ˚ ÏÓÎÂÍÛÎflÌÓ-„ÂÌÂÚ˘ÂÒÍÓÈ ÓˆÂÌÍË „ÂÏÓÔÓ˝Ú˘ÂÒÍÓ„Ó ıËÏÂËÁχ Ë Ó·Î‡ÒÚË Â„Ó ÔËÏÂÌÂÌËfl ‚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË
Тестирование генотипа
больного и донора
Алло-ТГСК, сут.
(Ремиссия)
Парциальный
химеризм
–10
–5
–1
Циторедуктивная терапия
0
Полный химеризм
+10
Запустевание
костного мозга
+30
+100
Период
восстановления
Аллогенная ТГСК
Острая РТПХ
Хроническая РТПХ
Рисунок. Оценка генетического химеризма на различных этапах трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
В настоящее время выделяют несколько состояний приживления ГСК: полный донорский химеризм (ДХ), смешанный химеризм (СХ) и отсутствие химеризма (отторжение трансплантата). Так, постепенное нарастание доли клеток донора в периферической крови или костного мозга больного после трансплантации дает основания говорить об эффективности этой заместительной процедуры. Развитие полного донорского химеризма популяций периферических лейкоцитов у больного при
миелоаблативной ТГСК наступает, в среднем, через 3–4 недели после трансплантации, что соответствует реконституции донорского гемопоэза. Напротив, снижение относительного содержания клеток донора говорит о высокой вероятности отторжения трансплантата.
В более поздние сроки после ТГСК наличие смешанного химеризма является важным показателем, свидетельствующим
о возможном развитии рецидива заболевания и (косвенно) об
уровнях минимальной остаточной болезни, наряду с общепринятой цитогенетической и молекулярно-генетической диагностикой специфических мутаций [1, 5–7] (табл. 1).
Развитие методов оценки химеризма
Существует множество методов, с помощью которых можно
различить генотип клеток донора и реципиента. Наиболее ранним подходом было определение эритроцитарных антигенов
донора в крови больного. В дальнейшем, по мере развития энзимологии, некоторые авторы внедрили оценку химеризма по
сравнительной активности изозимных вариантов донора и реципиента.
Последние 15–20 лет диагностики генетического химеризма
связаны с цитогенетическими исследованиями, в частности, с
выявлением Y-хромосомы в лейкоцитах больных женского пола при трансплантации мужского костного мозга. В 80–90-х годах XX века диагностика генного химеризма и мозаицизма –
это отрасль молекулярной биологии. Отправным пунктом исследования здесь является специфичность (комплементарность) ДНК-зондов в отношении участков геномной ДНК. Наиболее популярным методом ДНК-диагностики химеризма в 80х годах был так называемый Саузерн-блоттинг (гибридизация
ДНК с радиоактивномеченными ДНК-зондами на твердом носителе). Однако его трудоемкость и, в особенности, невысокая
чувствительность (5–10%) ограничивали его применение в
массовых исследованиях.
С начала 90-х годов, по мере быстрого развития ДНК-ПЦР,
были разработаны и стандартизированы панели ДНК-марке-
ров на базе повторов (STR и VNTR). В одном из таких исследований показана эффективность набора из четырех маркеров
VNTR (ApoB, D1S80, DXS52, D17S5) при диагностике полного и
смешанного химеризма после аллогенных ТГСК [8]. Стала возможной как качественная, так и количественная оценка смешанного гемопоэтического химеризма по информативным
VNTR и альфоидным повторам Y-хромосомы [4].
FISH-метод как усовершенствование
цитогенетической диагностики
В 90-е годы в цитогенетическую диагностику химеризма был
внедрен метод FISH (fluorescent in situ hybridization) с помощью
синтетических ДНК-зондов, гибридизуемых с искомыми участками хромосом или ДНК (в интерфазных клетках). Эту методику можно считать важным вкладом молекулярной биологии в
классическую цитогенетику. С помощью FISH появилась возможность диагностики как минимальной остаточной болезни
при лейкозах и лимфомах по специфическим хромосомным
аномалиям, так и оценки уровней химеризма после «разнополых» ТКМ [9]. В последнем случае применяется, например, методика FISH с двуцветными ДНК-зондами (чаще всего специфичными для X- и/или Y-хромосом). Анализ проводится путем
Таблица 1. Диагностика минимальной остаточной болезни у
больных лейкозами [10, 11]
Диагноз
Методы
Частота Чувствительность,
применения,
клеточное
%
разведение
В-ОЛЛ
FISH
25–35
10–2
ПЦР (транслокации)
10–40
10–4–10–6
ПЦР (гены IgH/TCR)
90–95
10–4–10–5
Иммунофенотипирование
35
10–3–10–4
ПЦР (VNTRs)
100
10–2–10–4
Т-ОЛЛ
FISH
10–20
10–2
ПЦР (транслокации)
25–35
10–4–10–6
ПЦР (гены IgH/TCR)
>95
10–4–10–5
Иммунофенотипирование
90–95
10–3–10–4
ПЦР (VNTRs)
100
10–2–10–4
ОМЛ
FISH
40–60
10–2
ПЦР (транслокации)
20–30
10–4–10–6
Иммунофенотипирование
35
10–3–10–4
ПЦР (VNTRs)
100
10–2–10–4
ХМЛ
Цитогенетика
90–95
10–2
FISH
–
10–2
RT-ПЦР (Ph-транслокации)
90–95
10–5–10–6
ПЦР (VNTRs)
100
10–2–10–4
ХЛЛ
RFLP
–
10–2
ПЦР (гены IgH)
90
10–4–10–5
ПЦР (VNTRs)
100
10–2–10–4
71
Ä.Å.óÛıÎÓ‚ËÌ Ë ‰. // ÇÓÔÓÒ˚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË/ÓÌÍÓÎÓ„ËË Ë ËÏÏÛÌÓÔ‡ÚÓÎÓ„ËË ‚ Ô‰ˇÚËË, 2002, Ú. 1, ‹1, Ò. 70–74
флюоресцентной микроскопии интерфазных ядер или метафаз
по наличию раздельных и слитных сигналов [10]. Подсчет остаточных клеток реципиента (2000–3000 ядер в образце) позволяет оценивать химеризм в небольших сериях наблюдений. Достоинство методики заключается в возможности прямого подсчета доли клеток донора и реципиента. Однако при малом содержании искомых клеток в образце точность метода снижается, что ограничивает ее применение в случаях микрохимеризма (<5% от общей популяции). Однако несомненна ценность
метода FISH для ранней диагностики рецидива заболевания,
когда отмечается рост доли клеток реципиента в костном мозге на фоне появления специфических генных и/или хромосомных маркеров лейкозных клеток [11].
Этот метод внедрен и в отечественной практике при трансплантациях больным с хроническим миелолейкозом [1]. Авторы
использовали флюоресцентные ДНК-зонды к центромерным
участкам половых хромосом, что обеспечивало уверенное отслеживание химеризма в посттрансплантационном периоде.
Отмечалась связь между развитием смешанного химеризма и
возникновением рецидивов у больных.
лекс-ПЦР). Затем смесь ПЦР-продуктов гибридизуется с панелью энзим-меченых ДНК-зондов, иммобилизированных на нейлоновых мембранах-полосках (дот-блот-гибридизация), и окрашивается реактивом на пероксидазу. Оценка результатов анализа проводится по сравнению наличия и интенсивности окраски окрашенных пятен (дотов) для донора и больного.
В целом, основная задача диагностики химеризма заключается во внедрении простых и сравнительно недорогих методов
количественного определения ДХ. В числе подобных разработок для идентификации личности и диагностики химеризма
можно упомянуть полуавтоматическую тест-систему с панелью
из девяти ДНК-маркеров (STR) с принципиальной возможностью количественного сравнения интенсивности сигналов для
донора и реципиента [12]. Кроме того, за последние годы появился ряд коммерческих установок для проведения количественной ПЦР, в том числе TaqMan (фирма ABI). По нашему опыту, использование генного маркера Y-хромосомы (ген DFFRY)
позволяет успешно диагностировать наличие и относительное
содержание ДНК больного при трансплантации ему женских
кроветворных клеток [7].
ДНК-маркеры, пригодные для оценки
химеризма, и проблема его количественной
оценки
Полиморфизм уникальных генов
и диагностика химеризма
Необходимое условие для диагностики химеризма – различия в нуклеотидных цепях гомологичных участков генов у донора и реципиента. Кроме того, при «разнополых» трансплантациях возможна оценка химеризма по наличию Х- или Y-специфической ДНК в образцах изучаемых клеток.
Общеизвестно, что большую часть генома человека составляют повторяющиеся участки ДНК. Чаще всего они являются
«балластом», накопленным в процессе эволюции, но иногда обладают регуляторными эффектами на функционирующие (уникальные) гены. Поскольку анализ ДНК-повторов продвигался
существенно быстрее, то генная диагностика химеризма сейчас
основана, главным образом, на анализе повторяющихся последовательностей ДНК – коротких повторов (STR) или так называемых тандемных повторов различной длины (VNTR).
Основной областью применения ДНК-диагностики у человека, как известно, является судебная медицина, т.е. задачи
идентификации личности по генотипу. Главное требование к
подобным генным маркерам это нормальное (близкое к менделевскому) распределение гомо- и гетерозигот обоих аллелей в
популяции доноров и больных, а именно 1 : 2 : 1. Такое соотношение обеспечивает максимальное число информативных пар
донор – реципиент. Для того, чтобы обеспечить оценку химеризма в 95% трансплантаций хотя бы по одному гену, необходима панель из 6–7 пар аллелей с нормальным распределением в популяции. На основании этих подходов были разработаны соответствующие коммерческие тест-системы, предназначенные, главным образом, для судебно-медицинских целей.
Эти методики позволяют выявлять ДНК больного и донора в
качественном и полуколичественном вариантах. Подобные диагностические системы были успешно применены в диагностике химеризма в ряде онкогематологических клиник [7, 12]. В частности, в Гамбургском университете был использован диагностический набор AmpliType (Perkin–Elmer), там проводится амплификация сразу по нескольким маркерным генам (мультип-
72
Значительный интерес в последние годы вызывает полиморфизм уникальных генов, имеющих конкретные функции в
клетках (выработка энзимов, цитокинов, рецепторов физиологически активных молекул), в особенности тех генов, которые
связаны с гистосовместимостью (при аллогенных пересадках –
редко) и с патогенезом посттрансплантационных осложнений
(гены TNF-альфа; ИЛ-1; ИЛ-6; ИЛ-10), которые имеют аллельные варианты, как правило, не в кодирующих участках, а в промоторных (регуляторных) зонах. В отличие от «обычных» генных мутаций, когда изменяется активность соответствующих
белков, здесь различаются уровни транскрипции генов при
различных аллельных вариантах (табл. 2). Это ведет к различной продукции специфических мРНК и белка, например, в ответ на воспаление или при иных иммунных реакциях, например, РТПХ. Так, продукция коллагеназы-1 (ген ММР-1) при индукции этого гена в несколько раз выше при варианте промотера 2G (вставка основания) по сравнению с вариантом 1G
(умеренный уровень транскрипции). Поскольку эти генные варианты имеют большое физиологическое значение и, если их
Таблица 2. Регуляторный полиморфизм некоторых генов, регулирующих миграцию клеток и воспалительные реакции
Белковый фактор
Функции
Аллельные Более активный
варианты
вариант
МатриксДеградация
1G/2G
2G
–1607
металлопротеиназа-1
коллагена,
(коллагеназа-1)
факторов
свертывания
МатриксДеградация
5A/6A
5A
–600
металлопротеиназа-3
коллагена
(стромелизин)
Плазминоген
Активация
4G/5G
4G
–675
активатор-ингибитор-1 плазминогена
ФНО-альфа
Провоспалительный Длина (GA)n
d3/d3
цитокин
(интрон 3)
Интерлейкин-6
Провоспалительный
G/C
G
–174
цитокин
Интерлейкин-10 Противовоспалительный G/A
A
–1082
цитокин
èË̈ËÔ˚ ÏÓÎÂÍÛÎflÌÓ-„ÂÌÂÚ˘ÂÒÍÓÈ ÓˆÂÌÍË „ÂÏÓÔÓ˝Ú˘ÂÒÍÓ„Ó ıËÏÂËÁχ Ë Ó·Î‡ÒÚË Â„Ó ÔËÏÂÌÂÌËfl ‚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË
распределение в популяции близко к менделевскому, то их
можно использовать для оценки химеризма посредством тех
же методик, которыми исследуют ДНК-повторы, т.е. ДНК-ПЦР
с последующей идентификацией специфических продуктов.
Достоинством анализа промотерных вариантов уникальных генов является то, что их можно достаточно легко определять и в
режимах количественной оценки.
Клинические ситуации
с длительным смешанным химеризмом
Немиелоаблативная трансплантация
гемопоэтических клеток
В настоящее время все большее внимание уделяется так называемым немиелоаблативным режимам аллогенных ТГСК
(НМТ, или мини-трансплантация). Применение этого подхода основано на давно отмеченном эффекте «трансплантат против
лейкоза» (graft versus leukemia), коррелирующим с реакцией
«трансплантат против хозяина». С клинических позиций, НМТ
выгоднее миелоаблативной ТГСК, т.к. при этом меньше повреждаются антиген-презентирующие популяции, ответственные за
выработку первичного иммунного ответа; острая РТПХ наблюдается реже и менее выражена; существенно снижается ранняя
смертность больных, связанная с интенсивной кондиционирующей терапией [5]. В связи с этим, НМТ – это метод выбора при
лечении ослабленных больных и лиц старших возрастных групп.
С точки зрения онкоиммунологии, НМТ является весьма действенной процедурой, при которой во многих случаях происходит
редукция злокачественных клеточных клонов под влиянием цитотоксического эффекта со стороны аллогенных донорских клеток (особенно при наличии большого количества донорских лимфоцитов в трансплантате). Смешанный гемопоэтический химеризм – своего рода постоянная находка при НМТ, и его динамика требует постоянного контроля, поскольку снижение его уровней может говорить о недостаточном приживлениии трансплантата и необходимости изменений режима иммуносупрессии.
Перманентное состояние смешанного химеризма коррелирует с лучшей переносимостью трансплантированных тканей и
органов, причем в данных ситуациях достаточно сравнительно
невысоких уровней донорского химеризма [13].
Инфузии донорских лимфоцитов
В рамках иммунотерапии злокачественных заболеваний используется метод инфузии лимфоцитов донора (ИДЛ) для создания антилейкемического цитотоксического эффекта in vivo.
Этот терапевтический подход часто является дополнительным
к немиелоаблативной ТГСК, и также требует мониторинга донорских клеток в кровотоке больного. Так, в работе Diez-Martin
и соавт. (1998) [6] изучали химеризм у больных после «разнополой» трансплантации и ИДЛ с применением ДНК-зондов,
специфичных для центромерных областей X- и Y-хромосом.
Показатели смешанного химеризма вполне коррелировали с
данными цитогенетики и морфологическими параметрами в
аспекте диагностики рецидивов и клинического ответа на ИДЛ.
Состояния после органной трансплантации
Из целого ряда наблюдений известно, что трансплантация
крупных органов (почек и печени) сопровождается появлением
донорских лейкоцитов в крови больных. Этот феномен «микро-
химеризма» связывают со значительным содержанием примесных лейкоцитов донора в трансплантате (passenger leukocytes) и их дальнейшим выходом в кровоток больного. Для детекции донорской ДНК в крови реципиентов органов применяются весьма чувствительные методики (например, real-timeПЦР на базе флюоресцентных ДНК-зондов) при анализе Y-специфических генных последовательностей. При этом относительное содержание донорских клеток может варьировать в
широких пределах – от 0,0001 до 3% [14]. До сих пор, однако,
не решен вопрос о судьбе этих клеточных популяций и их возможной роли в отторжении или, наоборот, развитии толерантности в отношении трансплантированного органа, хотя вполне
вероятна их связь с развитием реакции «трансплантат против
хозяина» в подобных ситуациях [3].
Персистенция клеток плода
при аутоиммунных заболеваниях у женщин
Феномен миграции клеток плода в кровоток матери известен уже в течение десятилетий. Так, ПЦР генов, специфичных
для Y-хромосомы показала, что у женщин, беременных плодом
мужского пола, Y-специфическая ДНК часто обнаруживается в
клеточной фракции и плазме крови [15]. Предполагается, что
основной источник фетальной ДНК в кровотоке матери – это
эритробласты и, в меньшей мере лимфоциты плода. В частности, клеточно-опосредованный механизм «крапивницы беременных» подкрепляется находками фетальной ДНК в зонах
специфических высыпаний [2].
Oпределение химеризма
в отдельных клеточных популяциях
В целом принято считать, что по мере развития донорского
химеризма происходит постепенное замещение в системе крови клеток реципиента на донорские популяции. Этот процесс
происходит быстрее всего в популяциях миелокариоцитов, периферических гранулоцитов, Т- и В-лимфоцитов, моноцитов.
Однако популяции макрофагов костного мозга, как более резистентные к цитостатической терапии, могут длительное время
находиться в состоянии СХ [16]. Возможно также, что смешанный химеризм стромальных клеток костного мозга является
важным фактором успешного приживления донорских СКК,
особенно при частичной МНС-несовместимости [17]. Выявление СХ в популяциях Т-лимфоцитов, по ряду данных может препятствовать развитию острой РТПХ III–IV степени, что снижает
риск жизнеопасных осложнений [18, 19].
Особое значение имеет выявление остаточных злокачественных клеток в крови и костном мозге с применением маркеров реципиента. Поскольку примесь этих клеток может быть
весьма малой, рекомендуется их предварительное обогащение
из суммарной популяции, например, незрелых CD33+ клеток
при ОМЛ [18]. Обсуждение этих вопросов не входит в задачи
данного обзора, хотя подобный подход является одновременно
и методом определения минимальной остаточной болезни, и
дополнительным способом оценки клеточного химеризма, что
исключительно важно для клиники.
Заключение
Таким образом, динамика развития СХ или ДХ является важным диагностическим и прогностическим показате-
73
Ä.Å.óÛıÎÓ‚ËÌ Ë ‰. // ÇÓÔÓÒ˚ „ÂχÚÓÎÓ„ËË/ÓÌÍÓÎÓ„ËË Ë ËÏÏÛÌÓÔ‡ÚÓÎÓ„ËË ‚ Ô‰ˇÚËË, 2002, Ú. 1, ‹1, Ò. 70–74
лем, позволяющим оценивать ход приживления донорских гемопоэтических клеток, восстановления гемопоэза,
а также, в ряде ситуаций, вероятность возникновения рецидива злокачественного заболевания. В связи с этим,
необходимо совершенствовать способы оценки гемопоэтического химеризма – с одной стороны повышая чувствительность и специфичность методики, а с другой – внедряя количественные подходы к диагностике данных показателей.
Литература
1. Виноградова О.А., Савченко В.Г., Неверова А.Л. и др. Изучение временной динамики смешанного химеризма с помощью гибридизации in situ у больных хроническим миелолейкозом после аллогенной трансплантации костного мозга. Тер. арх.
2001; 73(7): 26–34.
2. Aractingi S., Berkane N., Bertheau P. et al. Fetal DNA in skin of polymorphic eruptions
of pregnancy. Lancet 1998; 352 (9144): 1898–1901.
3. Au W.Y., Wa S.K., Kwong Y.L. et al. Graft-versus-host disease after liver transplantation:
documentation by fluorescent in situ hybridization and human leukocyte antigen typing.
Clin.Transplant. 2000; 14(2): 174–177.
4. Bader P., Beck J., Frey A. et al. Serial and quantitative analysis of mixed hematopoietic
chimerism by PCR in patients with acute leukemias allows the prediction of relapse after
allogeneic BMT. Bone Marrow Transplant. 1998; 21(5): 487–495.
5. Brouha P.C.R., Ildstad S.T. Mixed allogeneic chimerism. Transplantation 2001;
72(suppl. 8): 36–42.
6. Diez-Martin J.L., Llamas P., Gosalvez J. et al. Conventional cytogenetics and FISH evaluation of chimerism after sex-mismatched bone-marrow transplantation.
Haematologica 1998; 83(5): 408–415.
7. Fehse B., Chukhlovin A., Kuehlcke K. et al. Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation. J. Hematother. Stem Cell Res. 2001; 10(3): 419–425.
8. Stuppia L., Calabrese G., Di Bartolomeo P. et al. Retrospective investigation of
hematopoietic chimerism after BMT by PCR amplification of hypervariable DNA regions.
Cancer Genet Cytogenet. 1995; 85(2): 124–128.
9. Fox J.L., Hsu P.H., Legator M.S. et al. Fluorescence in situ hybridization: powerful molecular tool for cancer prognosis. Clin. Chem. 1995; 41(11): 1554–1559.
10. Najfeld V., Burnett W., Vlachos A. et al. Interphase FISH analysis of sex-mismatched
BMT utilizing dual-color XY probes. Bone Marrow Transplant. 1997; 19(8): 829–834.
11. Tamura S., Saheki K., Takatsuka H. et al. Early detection of relapse and evaluation of
treatment for mixed chimerism using fluorescence in situ hybridization following allogeneic hematopoietic cell transplant for hematological malignancies. Ann. Hematol.
2000; 79(11): 622–626.
12. Thiede C., Florek M. Bornhauser M. et al. Rapid quantification of mixed chimerism
using multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection. Bone Marrow Transplant. 1999; 23(10): 1055–1060.
13. Wood K., Sachs D.H. Chimerism and transplantation tolerance: cause and effect.
Immunol. Today 1996; 17(12): 584–587.
14. McDaniel H.B., Yang M., Sidner R.A. et al. Prospective study of microchimerism in
transplant recipients. Clin. Transplant. 1999; 13: 187–192.
15. Lo Y.M.D. Fetal DNA in maternal plasma: biology and diagnostic applications. Clin.
Chem. 2000; 46(12): 1903–1906.
16. Wickenhauser C., Thiele J., Perez F. et al. Mixed chimerism of the resident macrophage
population after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia.
Transplantation 2002; 73(11): 104–111.
17. Ikehara S. Successful allogeneic bone marrow transplantation. Crucial roles of stromal
cells in prevention of graft rejection. Acta Haematol. 2001; 105(3): 172–178.
18. Matsson J., Uzunel M., Tammik L. et al. Leukemia lineage-specific chimerism analysis
is a sensitive predictor of relapse in patients with acute myeloid leukemia and
myelodysplastic syndrome after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia 2001;
15 (12): 1976–1985.
19. Matsson J., Uzunel M., Remberger M., Ringden O. T cell mixed chimerism is significantly correlated to a decreased risk of acute graft-versus-host disease after allogeneic stem cell transplantation. Transplantation 2001; 71(3): 4333–4339.
МЕЖДУНАРОДНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПЕЧАТЬ
Выявление химеризма после аллогенной трансплантации
стволовых клеток периферической крови с помощью микросателлитов
Ren Y., Zhu P., Xiao M., et al.
Department of HematÓlogy First Hospital, Peking University Beijing 100034 China
Zhonghua Nei Ke Za Zhi 2002 Jul; 41(7): 462–4
Цель. Изучить возможность использования пяти избранных последовательностей тетрануклетидных повторов для выявления
химеризма у больных, перенесших аллогенную трансплантацию стволовых клеток периферической крови, а также корреляцию
между характером химеризма и прогнозом для больных.
Методы. Геномная ДНК была собрана из пуповинной крови 140 нормальных новорожденных. 5 локусов, включая CSF1PO,
D3S1359, D5S818, D17S1293 и D20S161 в каждой пробе были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР). Продукты ПЦР были подвергнуты электрофорезу в PAGE геле. Были собраны фрагменты разного размера каждого локуса для определения химеризма. Для разнополых трансплантаций был анализирован локус амелогенина для различия между
каппа и Y хромосомой. Изучали корреляцию между химеризмом и прогнозом.
Результаты. Было выбрано четыре полиморфных локуса, в которых учитывались число аллелей, генотипов и процент гетерогенности для каждого: для CSF1PO – 7 аллелей, 16 генотипов, гетерозиготность 69,03%; для D3S1359 – 12, 26, 76,79%; для
D5S818 – 8, 21, 81,67%; для D20S161 – 7, 17, 79,67% и 0,7250. Было 12 полных химер, из которых один больной умер от РТПХ.
Один больной со смешанным химеризмом умер после второй трансплантации. Пациент, у которого не было клеток донорского
происхождения, тоже умер. Один больной, у которого химеризм трансформировался от смешанного к полному после второй
трансплантации, живет без признаков рецидива. У оставшихся двух вид химеризма определить не удалось.
Заключение. Химеризм после трансплантации может быть успешно определен с помощью повторов пяти тетрануклеотидных
последовательностей. Каждый вид химеризма имеет свой прогноз. Уменьшение числа донорских клеток ухудшает прогноз.
74