Генетическая трансформации растений: молекулярные

Генетическая трансформации
растений: молекулярные
механизмы, методы и
практика.
Профессор, д.б.н., А.К.Гапоненко,
Главный научный сотрудник Института
Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН.
В одной лекции невозможно даже коротко изложить
современное положение и перспективы генетической
инженерии растений. Мы рассмотрим следующие, на наш
взгляд, наиболее интересные вопросы.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Каковы теоретические основы генетической инженерии?
Начало эры генетической инженерии растений, ее основатели.
Что такое рестрикционные ферменты
Понятие о плазмидах и векторах
Основные этапы генных манипуляций
Клонирование генов
Маркерные и селективные гены
Как это делается? Агобактериальная и биобаллистическая
генетическая трансформация
9. Некоторые научные результаты.
10. Наиболее впечатляющие практические свершения.
ЭРА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ НАЧАЛАСЬ
18 ЯНВАРЯ 1983 ГОДА НА СИМПОЗИУМЕ В МАЙАМИ, США
(MIAMI WINTER SYMPOSIUM)
Мари-Делл Хилтон, Университет штата Вашингтон, Сиэтл, США, доложила о получении
растений табака, устойчивых к антибиотику канамицину.
Джеф Шелл и Марк ван Монтегю, университет Гент, Бельгия, сообщили о создании
растений табака, устойчивых к канамицину и метатриоксату,
Роберт Фралей и Роберт Хорч, компании Монсанто, Сант-Льюса, штат Миссури, США,
получили растения петунии устойчивые к канамицину.
Во время одной сессии, Джефф Шелл, Роб Horsch от Monsanto, и я доложили об
исследованиях Agrobacterium и ее адапт ации как вект ора для т рансформации раст ений.
Все т рое сообщили, об успехе химерного гена уст ойчивост и к канамицину в качест ве
селект ивного маркера для раст ит ельных клет ок.
БЫЛО ЯСНО, ЧТО ПРОГРЕСС, ПОЛУЧЕННЫЙ ВО ВСЕХ ТРЕХ ГРУППАХ,
ДЕЛАЕТ РЕАЛЬНОСТЬЮ УЛУЧШЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.
Mary-Dell Chilton
Plant Physiology, January 2001, Vol. 125, pp. 9–14, www.plantphysiol.org © 2001 American Society of Plant Physiologists
Проф. А.К.Гапоненко
3
3
Основатели генетической инженерии растений:
Джеф
Шелл,
Мари ДелХильтон,
Первая его статья,
написанная в
соавторстве с
Марком Ван
Монтегю, о ДНК
Agrobacterium
опубликована в 1972
и посвящена фагам
Agrobacterium.
2005: «В конце-концов
трансформирующая
бактерия, какое бы ни
имя ей не было, всего
лишь маленький
кусочек технологии
необхо-димой для
создания трансгенного
растений».
Марк Ван
Монтегю
Решение Шелла изучать
как Agrobacterium
tumefaciens, почвенная
бактерия вызывает
опухоли у растений,
явилась ключом к тому
прогрессу, который мы
достигли за последние 30
лет
Тимоти Холл
Dr. Timothy C. Hall
Distinguished Professor
of Biology
Director, Institute of
Developmental and
Molecular Biology
Texas A&M University
Dr. Robert T. Fraley
Executive Vice President and
Chief Technology Officer
Robert Horsch
Апрель 1983 года, ген запасного белка фасоли
успешно экспрессировались в клетках
подсолнечника, после переноса его посредством
плазмиды агробактерии.
Проф. А.К.Гапоненко
4
Agrobacterium tumefaciens - бактерия и «корончатые
галлы» - болезнь которую она вызывает
Цитируется по Проф.Vitaly Citovsky
Проф. А.К.Гапоненко
5 5
Генная инженерия в природе.
Заболевание «корончатых галл» растений известно с времен Аристотеля. В 1907 году Е.Смит и
К.Таудсен показали, что это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium
tumefaciens
Общая схема «генетической колонизации» (Shell et al.,1983) Agrobacterium
tumefaciens растения и образование опухоли.
Проф. А.К.Гапоненко
6 6
Что такое генная инженерия?
 Непосредственное изменение структуры и характеристик генов так,
чтобы управлять биологическими процессами организмов на благо
людей – т.е. ИЗМЕНЯТЬ ГЕНЕТИЧЕСКУЮ ПРОГРАММУ ОРГАНИЗМОВ.
 Генная инженерия также известна, как технологии рекомбинантных
ДНК или манипуляции с генами (клонирование генов) для получения
Генетически Модифицированных Организмов (ГМО) с новыми
агрономическими и потребительскими свойствами.
 Возможны различные виды генетической модификации:
 Перенос чужеродного гена из одного вида в другой;
 Изменение существующих генов так, чтобы их продукты изменялись;
 ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ТАК ЧТОБЫ ОНИ БОЛЕЕ ЧАСТО
ТРАНСЛИРОВАЛИСЬ ИЛИ ВООБЩЕ ЗАМОЛКАЛИ (НОКДАУН ГЕНОВ)
Проф. А.К.Гапоненко
7
СРЕДСТВА ГЕННОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
Проф. А.К.Гапоненко
8
1. Рестрикционные ферменты
В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками опубликовали
первую работу о получении in vitro (в пробирке, вне
организма) рекомбинантной (гибридной) молекулы
ДНК, состоящей из фрагментов фаговой,
бактериальной и вирусной ДНК. Так родилась новая
ОТРАСЛЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, ПОЛУЧИВШАЯ
НАЗВАНИЕ "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ (ГЕННАЯ) ИНЖЕНЕРИЯ".
Своей целью она имеет создание новых генетических
структур и, в конечном счете, создание организмов с
новыми наследственными свойствами.
1. Рестрикционные ферменты
•
Разрезающие ДНК ферменты (МОЛЕКУЛЯРНЫЕ НОЖНИЦЫ)
•
Рестрикционные эндонуклеазы разрезают ДНК в специфичных сайтах (местах),
определяемых последовательностью оснований в ДНК (сайты узнавания) образуя
“липкие концы”
in vitro притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие
комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул. Такие
комплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так как две молекулы
ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами. ТАКИМ ОБРАЗОМ, ЕСЛИ В ПРОБИРКУ ПОМЕСТИТЬ САМЫЕ
РАЗНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК С ОДИНАКОВЫМИ ЛИПКИМИ КОНЦАМИ, ТО БУДЕТ ПРОИСХОДИТЬ РЕКОМБИНАЦИЯ,
ДАЖЕ ЕСЛИ ВСЯ ИХ СТРУКТУРА ОЧЕНЬ РАЗЛИЧАЕТСЯ.
Проф. А.К.Гапоненко
10
1. Рестрикционные ферменты
1. В практической молекулярной биологии чаще всего используются
рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев
представляет собой палиндром.
2. Палиндром Фета «А роза упала на лапу Азора».
3. Уникальные последовательности нуклеотидов, являющиеся субстратом
для рестриктаз, характеризуются большим разнообразием первичной
структуры.
4. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и
восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями
нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК).
5. Рестриктаза BamHI разрезает 5' GGATCC 3‘ 3' CCTAGG5’
Рестриктаза HaeIII разрезает
5'GGCC3‘ 3'CCGG5'
6. Несколько сотен эндонуклеаз выделены из бактерий и многие используются в
исследовании ДНК и генной инженерии, такие как: EcoR1, Hind III, HaeIII, TaqA1,
Sau3A
Открытие, предопределившее возникновение генной
инженерии, — обнаружение в бактериальных клетках
внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК.
Эти минихромосомы впервые были обнаружены в
начале 50-х годов и получили название плазмид.
Плазмиды обладают способностью к автономной от
хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся
в клетке в виде нескольких копий. Различаются
плазмиды по генетическим детерминантам. Очень
важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут
быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном
состоянии.
2. Плазмиды
• Молекулы ДНК, найденные в бактериях
• Действуют как системы для переноса генетического
материала другим бактериям, позволяя им эксрессировать
перенесенные гены
• Маленькие - несколько тысяч пар оснований, кольцевые (но
могут быть и линейные)
• Обычно несут один или несколько генов
• Имеют один район инициации репликации (участок ДНК
определенной последовательности в геноме, в котором
репликация инициируется
• Может выживать при определенной концентрации
селективного антибиотика
• Примеры: pBR322, Ti plasmid, pUC19, BAC, etc.
Проф. А.К.Гапоненко
13
3. Вектора
• Носители ДНК (могут переносить рДНК в клетку-хозяина)
• Внутри клеток хозяина, вектора могут реплицироваться
продуцируя множество идентичных копий сегмента ДНК
(клоны)
• Клетки хозяина передают рекомбинантную молекулу ДНК
своему потомству
• Клонированные сегменты ДНК выделяют из клеток хозяина
для очистки и анализа
• Размер вектора должен быть не большим ( <10kb), иметь
инициатор репликации и способны реплицироваться в клетке
хозяина
• Вектором может быть плазмида, вирусный геном или
хромосома дрожжей
Проф. А.К.Гапоненко
14
3. Вектора
• p ОБОЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИД, B и R по имени создателей Bolivar и Rodriguez
• Плазмида имеет двуспиральную (ds) ДНК - ds-DNA 4361 BP (пар оснований
• Содержит район репликации и селективные гены: ampR и tetR , устойчивости
к антибиотикам
• Имеет уникальные сайты рестрикции Pst I, EcoR I, Hind III, Sal I и Cla I
• Число копия на клетку высоко (20 – 30)
• Может нести вставку ДНК величиной 1-5kb
Проф. А.К.Гапоненко
15
Основные этапы генных манипуляций
Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде.
1. Вектор переносит ген в клетку-хозяина (как правило,
бактерия Escherichia coli).
2. В клетке-хозяина вектора размножаются, производя
многочисленные идентичные копии не только себя, но гена,
который несет вектор.
3. Когда клетка-хозяин делится, копии рДНК передается по
наследству.
4. После нескольких клеточных делений, образуются колонии
идентичные клеткам-хозяина (клоны). Каждая ячейка в
клоне содержит один или более копий рДНК
Проф. А.К.Гапоненко
16
Основные этапы генных манипуляций
Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде.
Фрагмент ДНК, содержащий ген,
который необходимо клонировать,
вставляется в кольцевую молекулу
ДНК, которая называется вектором,
для получения рекомбинантных
ДНК или (рДНК)
Гибридизация in vitro молекул ДНК возможно, если они
будут иметь небольшие комплементарные
односпиральные участки из четырех и более
нуклеотидов на концах молекул (до12 нуклеотидов).
Такие комплементарные односпиральные
последовательности получили название липких
концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться
(слипнуться) этими концами.
Таким образом, если в пробирку поместить самые
разные молекулы ДНК с одинаковыми липкими
концами, то будет происходить рекомбинация, даже
если вся их структура очень различается.
Рисунок Лещинской И.Б., Генетическая инженерия,
1996, Соровский образовательный журнал, №1,
Проф. А.К.Гапоненко
17
Основные этапы генных манипуляций
клонирование гена интереса
Проф. А.К.Гапоненко
18
Схема строения Agrobacterium tumefaciens и
генетическая карта Ti плазмиды
(Tumor inducing) – вызывающая опухоли.
•
•
•
•
T-DNA (transferred DNA) – ДНК, переносимая в ядро клетки растения
Л и П – левая и правая границы Т-области (right и left borders, RB и LB) с прямыми
повторами длиной 25 пн
Область, содержащая vir-гены, контролирует синтез и перенос Т-ДНК в растения
Область оri – точка начала репликации
Проф. А.К.Гапоненко
19
Список «Разоруженных» линий агробактерии»,
лишенных генов аналогов фитогормонов – ауксинов и
цитокининов, вызывающих образование опухолей в растениях
Проф. А.К.Гапоненко
20
Общая схема генетической карты Ti плазмиды
(Tumor inducing) – вызывающей опухоли.
T- DNA, – transferred
– переносимая ДНК
Размеры Т-ДНК Ti и Ri плазмид
варьируют от 10 до 30 kbp
ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА
Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным
вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев
агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных
растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков.
Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой
доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные
промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под
контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены
Проф. А.К.Гапоненко
21
Как встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды.
1. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и
встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в
клетках бактерий - Escherichia coli.
2. E. сoli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть
размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в
плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура
может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа
копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием.
3. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего
эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов
работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген.
4. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее
геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. Tumefaciens. Таким
образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в
Т-сегмент нужным геном.
Схема трансформационной кассеты
СОДЕРЖИТ:
1.Ген интереса
• Кодирующая последовательность
и ее контролирующие элементы
2. Селективный ген - маркер
• для отличия трансформированное/
нетрансформированное растение
3. Инсерционные последовательности агробактерии (25 пар
нуклеотидов с каждого конца)
•Agrobacterium insertion
Проф. А.К.Гапоненко
23
В процессе генетической трансформации растительной клетки
можно выделить десять главных событий:
1. Процесс начинается с распознания
агробактерией специфических
рецепторов клетки хозяина и
прикрепления бактерии к клетке
хозяина (растения-реципиента),
посредством белков, кодируемых
хромосомой агробактерии;
2. Опознавание специфических сигналов
растительной клетки двух
компонентной системой агробактерии
(VirA–VirG) сигнально – трансдукцион
ного механизма;
3. Далее следует VirG-mediated сигнальная
трансдукция и активация вирулентных
(vir) генов в vir области агробактерии;
4. Образование мобильной копии T-DNA, the
T-strand;
5. Доставка VirD2–DNA комплекса (незрелый
T-комплекс), вместе с несколькими
другими Vir белками, в цитоплазму
клетки растения реципиента;
6. После ассоциации VirE2 с T-strand, и
образования зрелого T-комплекса,
последний импортируется через
цитоплазму хозяина;
7. T-комплекс активно импортируется
вовнутрь ядра клетки растенияхозяина;
8.Оказавшись внутри ядра, the T-DNA
доставляется в место интеграции
Источник: Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky,
геномной ДНК;
Agrobacterium-mediated genetic
9. T-DNA освобождается от эскортирующих
transformation of plants: biology and
ее белков.
biotechnology, CURRENT OPINION IN
10. Наступает момент интеграция T-DNA в
геном клетки хозяина посредством VirD2
BIOTECHNOLOGY 2006, 17:147–154.
и/или VirE2 и факторов хозяина.
Проф. А.К.Гапоненко
24
Типы агробактериальных векторов для генетической
трансформации растений
Коинтегративный вектор
Бинарный вектор
Бинарные векторные системы, создание которых
Отсутствуют
заключается в том, что агробактериальная клетка должна
содержать по крайней мере две разные модифицированные
Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только virобласть, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК.
Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами.
Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с
нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны Гены vir
вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на
соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от
их местоположения. Таким образом, если клетки
агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую
плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии
могут трансформировать клетки растений.
25
Бинарные векторы CAMBIA
Маркерный ген
Селективный ген
Селективный ген
Обязательными элементами бинарного вектора являются:
• Сайт инициации репликации широкого круга хозяев, либо два репликатора, функционирующих в E. Coli
и A.tumafaciens;
• Правую и левую фланкирующую последовательность Т-ДНК;
• Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания/инсерции гена (генов) между
границами Т-ДНК;
• Ген, обеспечивающий селекцию трансформантов бактерий, содержащих данный вектор;
• Целевую кодирующую последовательность, для переноса в растения.
Проф. А.К.Гапоненко
26
Маркерные гены, для отслеживания процессов
трансформации и экспрессии в трансгенных клетках,
тканях и растениях
Проф. А.К.Гапоненко
27
Маркерные гены: ген люцефиразы luc
Проф. А.К.Гапоненко
28
Маркерные гены
β-глюкоронидаза - uidA
A
B
Мониторинг транзиентной экспрессии гена
β-глюкоронидазы uidA, при биобаллистической трансформации
подсолнечника: A – незрелых зародышах, B – семядолях подсолнечника.
(Гапоненко, 1993 )
Проф. А.К.Гапоненко
29
Маркерные гены
β-глюкоронидаза - uidA
Мониторинг стабильной экспрессии гена
β-глюкоронидазы uidA при агробактериальной трансформации
подсолнечника (Гапоненко, 1993 )
Проф. А.К.Гапоненко
30
Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в
трансгенном подсолнечнике:
A – разрез незрелого соцветия; B – цветках и развивающихся семенах;
C – прорастающих семенах T1 (2ой генерации) и D – различных тканях растения.
A
D
B
C
(Гапоненко, 1997 )
Проф. А.К.Гапоненко
31
Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в трансгенном
подсолнечнике: A – разрез незрелого соцветия;
B – специфическая экспрессия гена uidA в пыльцевых нитях.
A
B
(Гапоненко, 1997)
Проф. А.К.Гапоненко
32
Маркерные гены: Green Fluorescent Protein - GFP
Мониторинг транзиентной экспрессии гена gfp в незрелых зародышах и каллусных
тканях пшеницы после биобаллистики
а
б
в
г
(а) Транзиентная экспрессия гена gfp в незрелом зародыше пшеницы
(б, в) Транзиентная экспрессия гена gfp в каллусных тканях через 24 часа после биобаллистической
трансформации; (г) контроль не трансформированный каллус (Фадеев, Гапоненко, 2006)
Проф. А.К.Гапоненко
33
Оценка стабильной экспрессии гена gfp
Стабильная экспрессия gfp гена в трансгенных тканях пшеницы
а
б
(а) Эмбриогенный каллус.
Экспрессия GFP, наблюдаемая на
21 день после трансформации.
б) Побег трансгенной
пшеницы. 35 дней
после трансформации.
в
в) Корешок трансгенной
пшеницы. 35 дней после
трансформации
Экспрессия маркерного гена gfp, обнаруживаемая на 17 день после
биобаллистической трансформации, определяется как стабильная
(Фадеев, Гапоненко, 2006)
Проф. А.К.Гапоненко
34
Типы селекции (отбора) трансформированных
клеток растений
Позитивная
Негативная
придает преимущество в росте
трансформированных клеток
ПРИ ПОЗИТИВНОЙ СЕЛЕКЦИИ,
трансформированные клетки получают
возможность расти с использованием
специального источника сахаров, азота или
регуляторов роста, как агента селекции.
селекция препятствуют росту
трансформированных клеток
ПРИ НЕГАТИВНОЙ СЕЛЕКЦИИ, более
традиционной, в среду для
культивирования клеток добавляют
токсичные или тормозящие развитие
соединения - антибиотики или гербициды,
которые используются для уничтожения
или предотвращения роста
нетрансформированных клеток.
При позитивной селекции селективные гены способствуют росту
трансформированных тканей, а при негативной селекции селективные
гены ведут к смерти или торможение роста нетрансформированных клеток
и тканей.
Проф. А.К.Гапоненко
35
Гены кодирующие токсичные антибиотики для негативной
селекции
Проф. А.К.Гапоненко
36
Вещества и ферменты для углеводород
зависимой позитивной селекции
Проф. А.К.Гапоненко
37
Токсичные гербициды, гены их кодирующие для
условно-позитивной селекции
Проф. А.К.Гапоненко
38
Генетическая
трансформация злаков via
Agrobacterium tumefaciens
ИСТОЧНИК:
Plant Biotechnology Journal
(2006), 4, pp. 575–603 Ashok Kumar
Shrawat and Horst Lцrz
Agrobacterium-mediated
transformation of cereals: a promising
approach crossing barriers
Проф. А.К.Гапоненко
39 39
Трансформация пшеницы via Agrobacterium с селекцией на глифосате
Agrobacterium-mediated large-scale
transformation of wheat (Triticum
aestivum L.) using glyphosate
selection,
Plant Cell Rep (2003) 21:1010–1019, T. Hu, S.
Metz, C. Chay, H. P. Zhou, N. Biest ·G, Chen, M.
Cheng, X. Feng, M. Radionenko, F. Lu,·J. Fry
a Four-day precultured immature embryo
b Agrobacterium infection, c embryogenic callus
after 1 week mM glyphosate selection medium,
d shoot differentiation C+0.1 mM glyphosate
e plantlet regeneration +0.02 mM glyphosate
f T0 transgenic plant (left) and non-transgenic control
(right) 7 days after being sprayed with Roundup Ultra;
this kind of transgenic event (left) with some
vegetative damage will not be advanced to the next
generation
Проф. А.К.Гапоненко
40
Что еще необходимо нам
рассмотреть по теме:
1.Компетентные к регенерации в растения клетки или ткани
2.Другие способы доставки генов в клетки, компетентные к
регенерации в растения
3.Векторные конструкции для доставки генов,
представляющих интерес
4. Селективные и маркерные гены
5. Способы регуляции экспрессии целевого гена в нужном
месте и в нужное время.
6.Возможность «выключать» собственные гены растения
и/или патогенного организма, насекомого вредителя.
7.Стабильность интеграции и наследования введенных генов
Проф. А.К.Гапоненко
41 41
ДЛЯ УСПЕШНОГО ПРОИЗВОДСТВА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ НЕОБХОДИМА
ТРЕХКОМПОНЕНТАЯ СИСТЕМА:
ИНТЕГРАЦИЯ СИСТЕМЫ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, СИСТЕМА ДОСТАВКИ
ДНК, И ВЕКТОРА, НЕСУЩЕГО ГЕН ИНТЕРЕСА
Проф. А.К.Гапоненко
42
42
Схематическое
представление
физических и
биологических
методов,
используемых для
переноса генов в
растения
Проф. А.К.Гапоненко
43
43
Практические методы генетической
трансформации растений
 Посредством Agrobacterium tumefaciens
 Прямой ввод генов методом биобаллистики
 Методы микроинъекций, электропорации
протопластов не имеют практического значения,
кроме как для нескольких генотипов риса.
Проф. А.К.Гапоненко
4444
Требования к системам генетической
трансформации (СГТ)
Трансформационное событие сопровождается рядом негативных для селекционера
процессов:
•
Инсерционным мутагенезом, вследствие случайности сайта интеграции ДНК
•
Феноменом «умолкания генов» (gene silencing phenomenon)
•
Трансгенные растения показывают различную степень экспрессии трансгенов
вследствие эффекта положения, количества встроенных копий и etc.
Правила биобезопастености, принятые в Евросоюзе не рекомендуют использовать гены
устойчивости к антибиотикам в качестве селективных
•
Необходима позитивная селекция на основе гена фосфоманозаизомеразы (PMI) или
гербицид устойчивости – bar или:
•
Необходимо использование « Систем удаления селективного гена посредством
индукции рекомбинации»
Для получения достаточной выборки трансгенных растений,
фенотипические не отличающихся от исходных (только по
вводимому гену) СГТ должна обладать:
•
•
•
Высокой эффективностью;
Воспроизводимостью;
Для уменьшения риска сомаклональной изменчивости уменьшением фазы культуры
in vitro
Проф. А.К.Гапоненко
45
Разработка «генной пушки» под руководством Джона
Сандфорда и Теодора Клейна в Корнельском
Университете, США (1983 – 1987)
Джон Сандфорд
Klein T.M. 2006, Wien
Права на технологию были проданы Du Pont в 1990 г.
Source: [(2000) In Vitro, Cell Dev Biol Plant 36:303–308; Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N
(1987), J Part Sci Technol 5:27–37]
Проф. А.К.Гапоненко
46
Методы
генетической
трансформации
растений
Генетическая трансформация растительных
клеток путем Биологической баллистики
(Biolistic) Принципиальная схема
Источник давления
«Макроноситель»
Металлические
частицы с ДНК
Клетки растений
Проф. А.К.Гапоненко
47
Генетическая трансформация растительных клеток путем
Биологической баллистики (Biolistic)
Баллистической способ генетической трансформации, связанный с преципитацией ДНК на
микроскопические частицы и последующим обстрелом этими частицами клеток живой ткани,
были впервые применены на растениях в 1987, в 1990 году первые фертильные растения
трансгенной кукурузы были получены с помощью этого метода.
Эта демонстрация была важным поворотным пунктом в области генной модификации
зерновых культур, как и демонстрация в 1983 году способности трансформировать растения
Agrobacterium tumefaciens
Klein T.M., Wolf E.D , Wu R. and Sanford J.C. (1987) High-velocity microprojec-tiles for
delivering nucleic-acids into living cells. Nature 327 , 70 – 73 .
Gordonkamm W.J., Spencer T.M., Mangano M.L., Adams T.R., Daines R.J., Start W.G. Obrien
J.V., Chambers S.A., Adams W. R., Willetts N.G., Rice T.B., Mackey
C.J., Krueger R W., Kausch A.P. And Lemaux , P. G. (1990) Transformation of
maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2, 603 – 618 .
Проф. А.К.Гапоненко
48
Общая схема установки PDS 1000 SYSTEM Bio Rad
Проф. А.К.Гапоненко
49
PDS 1000 He SYSTEM Bio Rad
Проф. А.К.Гапоненко
50
Прибор компании Bio Rad для генетической
трансформации клеток растений in vivo методом
биологической баллистики
Проф. А.К.Гапоненко
51
Установка для биобаллистики
др. Кристофера Сауттера,
Цюрих, Федеральный Институт
Технологии, 1991 год.
Проф. А.К.Гапоненко
52
История баллистической трансформации
растений
Доктор Кристофера Сауттер,
Цюрих, Федеральный Институт Технологии, 1991 год.
Проф. А.К.Гапоненко
53
Генная пушка PIG (Particle
Inflow Gun), конструкции
Д.Файнера и др.
Проф. А.К.Гапоненко
54
Сотрудники лаборатории проф. Д.Файнера (1993 г.)
Вустер, Огайо, США
L-R Back: John Finer, Tai-Sheng Cheng, Masood Hadi, Hong-Chang Ma
Front: Cheri Nemes, Alex Gaponenko, Philippe Vain, Barb Norris
Проф. А.К.Гапоненко
55
Методы
генетической
трансформации
растений
Д.б.н., А.К.Гапоненко
56
56
PIG в секторе клеточной инженерии
растений института биологии
развития им.Н.К.Кольцова РАН
Проф. А.К.Гапоненко
57
Основные этапы генетической трансформации и получения
генетически модифицированного (генно-инженерного или
биотехнологического) растения
1. Индукция морфогенного каллуса или прямой регенерации клеточной структуры,
компетентной к прямой регенерации растения in vitro.
2. Создание векторных конструкций для доставки и регуляции экспрессии генов
«интереса» в клетку-мишень, компетентную к регенерации в растение.
3. Встраивание чужеродных генов в геном реципиента – посредством
агробактериальной трансформации или прямого ввода генов via
биобаллистики.
4. Селективный отбор трансформированных клеток. Введение наряду с геном
«интереса» селективного гена для негативной - (устойчивость к антибиотикам
– гены hyg, nptII) или позитивной селекции – (способность усваивать продукт –
ген PMI фосфоманозаизомераза).
5. Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro.
6. Укоренение или прививка побегов.
7. Адаптация пробирочных растений к условиям теплицы.
8. Молекулярный – ПСР и саузерн анализы на предмет интеграции в геном и
определение числа копий введенного гена.
9. Отбор трансформантов с высокой экспрессией трансгена и с наименьшими
отклонениями от исходного фенотипа.
10. UPOF – полевые испытания и испытания на биобезопасность.
Проф. А.К.Гапоненко
58
Agrobacterium
Mediated transformation
Microprojectile
Bombardment (Biolistic)
Индукция морфогенного каллуса, выбор экспланта
или клеточной структуры, компетентной к прямой
регенерации растения in vitro.
Bombardment
Селективный отбор
трансформированных клеток, на
среде с селективным агентом
Индукция регенерации побегов или
эмбриогенеза in vitro.
Укоренение или прививка побегов
Молекулярный – ПСР, RT-PCR и Cаузерн, Вестерн анализы
на предмет интеграции в геном и определение числа
копий введенного гена.
Control
plants
Transgenic lines
Transgenic lines
Control
plants
Адаптация пробирочных растений к
условиям теплицы.
Отбор трансформантов с высокой экспрессией
трансгена и с наименьшими отклонениями от
Prof. Alex Gaponenko
исходного фенотипа.
Полевые испытания и
испытания на биобезопасность UPOF.
59
Нами исследованы параметры баллистической
трансформации, влияющие на эффективность
трансформации
Физические параметры
 Физические и химические свойства металлических частиц
используемых для переноса ДНК (размер, хим. инертность)
 Природа ДНК (концентрация, размер молекул),
преципитация ДНК на частицы
 Давление и обьем Не при выстреле
 Величина отрицательного давления вакуума в камере
 Расстояние от источника частиц до ткани-мишени
 Количество выстрелов на один образец ткани
Биологические параметры
 Выбор типа и возраста экспланта
 Обработка ткани-мишени осмотическим шоком до и после
бомбардмента
 Стратегия селекции трансгенных тканей
 Отложенная
 Градационная
 Регенерационная
Проф. А.К.Гапоненко
60
Вектор для биобаллистической трансформации злаков с
GFP (маркерный) и BAR (селективный) генами под контролем злаковых
промоторов ( P.Quail and B.V.Conger 2001)
Селективный
ген
Маркерный ген
Плазмида любезно предоставлена нам
Prof. P.Conger & Prof. B.Quial
Проф. А.К.Гапоненко
61
Векторные конструкции, созданные на основе вектора psGFPBAR, с Gly I
and GST генами, которые любезно предоставлены проф. S. K.Sopory
(ICGEB, New-Delhi).
Целевой ген
Проф. А.К.Гапоненко
GST
Целевой
ген
62
Общая схема ведения культуры клеток
пшеницы и регенерации растений in vitro
Незрелый зародыш, 1 -1,5 мм
Морфогенный каллус (МК)
Неморфогенный каллус (НМК)
Морфогенный каллус (МК)
Регенерация побегов
Регенерация растений
63
(А.К. Гапоненко, и др., 1984)
63
Оптимизация параметров баллистической
трансформации мягкой пшеницы
Описание эксперимента:
Оцениваемые сорта:
Лада, Эстер, Мис
Баллистическая пушка PIG
Сравниваемые параметры:
•давление гелия 5, 6, 7 и 8 атм
•расстояние 10, 12, 14 см
•Срок с момента индукции культуры
4, 7, 10, 14 сутки
Морфогенетические
Транзиентная экспрессия гена
В эксперименте оценено ~20000
каллусы, подготовленные к
uidA через 2 дня после
эксплантов
трансформации
трансформации
Оценка эффективности параметров:
Способом оценки эффективности доставки вектора экспрессии, содержащего
гены интереса с регуляторными элементами, является сравнение количества
участков экспрессии маркерного гена uidA на единицу поверхности тканимишени, при различных вариантах опыта
(Фадеев, Гапоненко, 2006)
Проф. А.К.Гапоненко
64
64
Анализ трансгенных растений с помощью
Полимеразной Цепной Реакции на наличие гена bar
Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы
(праймер для гена bar)
1, 20 MWMarker1 kb
2
негативный контроль ДНК пшеницы
3–17 ДНК первичных трансформантов
18 позитивной контроль ДНК
трансгенного картофеля
19 плазмида pGFPBAR
Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы
(праймер для nos’3 терминатора)
(Фадеев, Гапоненко, 2006)
1, 20 MWMarker1 kb
2
негативный контроль ДНК пшеницы
3–17 ДНК первичных трансформантов
18 позитивной контроль ДНК
трансгенного картофеля
19 плазмида pGFPBAR
Проф. А.К.Гапоненко
65
Сравнение свойств агробактериальной и
биобаллистическая трансформации
Агробактериальная трансформация
Плюсы
• Относительная
дешевизна и
изученность метода
• Более предсказуемые
результаты внедрения
трансгена в геном
реципиента
Биобаллистическая трансформация
Минусы
Вид и генотип
зависимость трудность
применения для
многих видов и
генотипов
• Ограничения по
количеству
вводимых генов
Плюсы
•Пригодна для любых объектов
in vitro (хвойные, злаки,
бобовые).
•Универсальная доставка ДНК в
любую ткань и орган.
•Возможно использовать при
прямой регенерации растений,
минуя каллус.
•Позволяет вводить
одновременно несколько генов.
•Не нуждается в сложных
векторах.
Используется для
трансформации пластид
Минусы
•Относительная
дороговизна метода
•Непредсказуемость
интеграции и
копийности вводимых
генов
•
Проф. А.К.Гапоненко
66
Благодарю за внимание