Получение и характеристика культур клеток из злокачественных

Получение и характеристика культур клеток
из злокачественных глиом человека
Выполнила: Макушева Ю.С., студентка гр. 8408
Научный руководитель: с.н.с., к.б.н. Рубцова Н.В.
Лаборатория молекулярных механизмов
патологических процессов,
Институт цитологии и генетики СО РАН
Определение и классификация глиом
• Глиомы – глиальные опухоли –
опухоли
головного
мозга,
происходящие из клеток глии:
астроцитов, олигодендроцитов
и их предшественников
• 4 типа по происхождению:
астроцитомы
олигодендроглиомы
олигоастроцитомы
глиобластомы
2
Классификация глиом по степени злокачественности
4 градации:
IV глиобластомы
• первичные
• вторичные
III анапластические
астроцитомы, олигодендроглиомы,
олигоастроцитомы
II фибрилярно-протоплазматические
астроцитомы и
олигодендроглиомы
I пилоцетарные
астроцитомы и
олигодендроглиомы
3
Культуры клеток из различных опухолей достаточно
широко применяются в современной биологии и
медицине:
• при исследовании механизмов канцерогенеза
• для отработки и усовершенствования методов
диагностики
• для первичной апробации новых подходов в лечении
4
Культивирование клеток глиальных опухолей,
современные тенденции
Среда с эмбриональной
сывороткой (10%) +
добавка инсулина в
некоторых случаях
Монослойные:
постоянные
перевиваемые
Среда без сыворотки +
специальные добавки,
поддерживающие рост
нейральных стволовых
клеток
Плавающие
нейросферы:
первичные
перевиваемые
5
Сравнение разных способов культивирования
постоянные монослойные
плавающие нейросферы
• можно поддерживать в
• трудно поддерживаются в культуре
культуре неограниченное время из-за проблемы спонтанной
дифференцировки
• значительно отличаются от
исходной опухоли по многим
характеристикам
• сохраняют многие характеристики
исходной опухоли
• возникают редко
• можно получить не из всех
глиобластом (градация IV), тем более
из опухолей более низких градаций
6
На данном этапе исследований сохраняет актуальность
отработка условий получения и поддержания первичных
перевиваемых культур клеток из злокачественных глиом
(градации III и IV).
7
Цель работы: выявление особенностей влияния условий
культивирования и типа исходной опухоли на проявление
специфических признаков клеток злокачественных глиом
человека in vitro.
Задачи:
• Получение первичных культур клеток из злокачественных
глиом человека III и IV градаций в бессывороточной среде и
среде с низким содержанием эмбриональной сыворотки.
• Сравнение ростовых характеристик первичных монослойных
культур при культивировании в ростовых средах с разными
стимулирующими рост добавками.
• Сравнение уровня экспрессии генов TFAP2A, DNMT3A, EGFR,
PTEN, MGMT и CEBPB в образцах клеток полученных культур с
уровнем их экспрессии в образцах исходных глиальных
опухолей.
8
Ростовые среды (РС), используемые при получении
первичных культур глиом
• РС0 – бессывороточная среда, стандартно используемая
для культивирования опухолевых стволовых клеток в
виде нейросфер;
• РС5 – среда с низким содержанием сыворотки (5%) и
стимулирующими рост добавками, используемая нами
для поддержания первичных монослойных культур из
глиальных опухолей.
9
Варианты роста клеток из трех глиальных опухолей в
разных ростовых средах
Среда
анапластическая
астроцитома,
градация III
вторичная
глиобластома,
градация IV
первичная
глиобластома,
градация IV
РС0
нет
не появились в
течение 3-х недель
культивирования
есть
оформились на первой
неделе культивирования
есть
оформились на
второй неделе
культивирования
есть
островки клеток
разной морфологии
нет
многочисленные скопления
прикрепившихся, но плохо
распластанных клеток
есть
много островков
клеток разной
морфологии
РС5
10
Варианты роста клеток из трех глиальных опухолей в
разных ростовых средах
Среда
РС0
анапластическая
астроцитома,
градация III
вторичная
глиобластома,
градация IV
первичная
глиобластома,
градация IV
нет
РС5
11
• Получение культуры в виде нейросфер или в монослое
зависит не только от условий культивирования, но и от
свойств исходной глиомы.
• Параллельное
использование
двух
вариантов
культивирования в значительной степени расширяет
возможности получения первичных перевиваемых культур
от каждой индивидуальной опухоли.
12
Стимулирующие рост добавки, используемые для
поддержания пролиферации клеток в культурах
o N2 – бессывороточная добавка, рекомендованная для
выращивания нейронов в первичной культуре и опухолевых
клеток нейронального фенотипа;
o G5 – бессывороточная добавка, рекомендованная для
выращивания глиальных клеток астроцитарного фенотипа
(нормальных и опухолевых);
o AmnioMAX – полная ростовая среда, разработанная для
культивирования амниотических клеток.
13
Индексы пролиферации клеток в первичных культурах
олигоастроцитомы (GA20f-2) и глиобластомы (GB17f-1) при
культивировании с разными добавками
1
пассаж
2
пассаж
3
пассаж
Среднее
NG
1,89
1,86
1,18
1,64
A20
2,17
2,20
2,64
2,52
NG
1,33
1,23
1,30
1,20
A20
1,12
1,32
1,15
1,29
Культура Интервал Добавка
GA20f-2
GB17f-1
48ч
96ч
NG – N2 (1x) + G5 (1x); A20 – 20% AmnioMAX.
14
Морфология клеток и плотность монослоя при
культивировании с разными ростовыми добавками
Культура
NG
А20
GA20f-2
5 пассаж
GA20f-3
5 пассаж
15
Два варианта роста клеток в культуре GB17f-2
при замене в ростовой среде добавки NG на А20
медленно растущие крупные
клетки, доминирующие при
культивировании в среде с
добавкой NG
активно растущие мелкие
клетки, появившиеся при
культивировании в среде с
добавкой А20
16
Для сравнения характеристик полученных культур
клеток с образцами исходной опухоли были
использованы показатели уровня экспрессии 6 генов:
• EGFR – рецептор эпителиального фактора роста
• MGMT – метилгуанинметилтрансфераза
• CEBPB – CCAAT/энхансер связывающий белок
• PTEN – фосфотаза и гомолог тензина
• DNMT3A – ДНК-метилтрансфераза 3А
• TFAP2A – транскрипционный фактор AP2α
17
Образцы исследованных опухолей
первичная
анапластическая
анапластическая
глиобластома 17 олигоастроцитома 20 астроцитома 42
18
Образцы исследованных опухолей и культур клеток,
полученных из этих опухолей
первичная
анапластическая
анапластическая
глиобластома 17 олигоастроцитома 20 астроцитома 42
GB17f-1
GA20f-1
GA42m-1
GB17f-2
GA20f-2
GA42m-2
GA20f-3
GA42m-3
19
Образцы исследованных опухолей и культур клеток,
полученных из этих опухолей
первичная
анапластическая
анапластическая
глиобластома 17 олигоастроцитома 20 астроцитома 42
GB17f-1 (A20)
GB17f-1 (NG)
GA20f-1
GA42m-1
GB17f-2
GA20f-2 (A20)
GA20f-2 (NG)
GA42m-2
GA20f-3 (A20)
GA20f-3 (NG)
GA42m-3
Культуры клеток исследованы на 5-6 пассаже от начала культивирования
20
• Уровень относительной экспрессии генов в образцах
опухолей и в культурах клеток, полученных из этих
опухолей, был измерен методом количественной ПЦР в
реальном времени и нормализован к уровню экспрессии
гена HPRT1.
• Уровень модуляции экспрессии мРНК в культурах клеток
и в исходных опухолях был подсчитан относительно
уровня экспрессии выбранных генов в образце
нормального мозга.
21
Показатели относительной экспрессии генов, по которым были
выявлены значимые различия исследованных образцов исходных
опухолей и образцов нормального головного мозга
Образец
TFAP2A*
EGFR*
PTEN*
N1
1,7±1,3
0,3±0,2
1,6±0,2
N2
1,0±0,2
1,0±0,2
1,0±0,1
N3
1,8±0,8
1,1±0,1
1,1±0,1
17
158,6±40,6
5,7±1,5
8,3±1,8
20
362,0±76,1
124,6±21,2
7,7±1,7
42
12,7±4,1
8,8±1,1
4,2±1,2
* статистически значимые различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, p<0,05.
22
• Показатели уровня экспрессии генов DNMT3A, CEBPB и
MGMT в образцах исходных опухолей и полученных из
них культурах клеток значимо не отличались от
аналогичных показателей в образцах нормального мозга.
• При сравнении образцов культур клеток, выращенных с
разными ростовыми добавками (A20 или NG), не было
выявлено достоверных различий по уровню экспрессии
исследованных генов.
23
Экспрессия гена EGFR в культурах клеток по сравнению с исходными
образцами опухолей (17, 20, 42) и образцами нормального мозга
17
20
42
- уровень экспрессии в образцах
нормального мозга
- уровень экспрессии в образцах
исходных опухолей
- уровень экспрессии в образцах
культур клеток, полученных из
соответствующей опухоли
* статистически значимые различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, p<0,05.
24
Экспрессия гена TFAP2A в культурах клеток по сравнению с исходными
образцами опухолей (17, 20, 42) и образцами нормального мозга
17
42
20
- уровень экспрессии в образцах
нормального мозга
- уровень экспрессии в образцах
исходных опухолей
- уровень экспрессии в образцах
культур клеток, полученных из
соответствующей опухоли
* статистически значимые различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, p<0,05.
25
Исследованные нами культуры клеток могут быть
основой для создания панели культур при изучении
влияния экспрессии TFAP2A на молекулярно-генетический
статус опухолевых глиальных клеток.
26
Выводы
1.
При культивировании in vitro клеток глиальных опухолей разных типов –
первичной глиобластомы, вторичной глиобластомы и анапластической
астроцитомы – в одних и тех же ростовых средах было показано, что
формирование культуры в виде нейросфер или монослоя зависит от исходных
свойств опухоли.
2.
Добавление в ростовую среду 20% среды AmnioMAX способствует активной
пролиферации первичных культур клеток глиобластомы и анапластической
олигоастроцитомы, как минимум, в течение 5-6 пассажей от начала
культивирования. В случае анапластической олигоастроцитомы добавление
среды AmnioMAX позволяет поддерживать рост первичных монослойных
культур клеток более длительное время по сравнению с добавками N2 и G5.
3.
Для двух из шести исследованных генов – TFAP2A и EGFR – показатели
уровня относительной экспрессии в клетках независимо полученных
монослойных культур из анапластической астроцитомы и анапластической
олигоастроцитомы достоверно отличаются от аналогичных показателей в
образцах опухолей, из которых они были получены. В культурах клеток из
глиобластомы показатели экспрессии этих генов не отличаются от аналогичных
показателей в исходной опухоли.
4.
Исследованные первичные монослойные культуры клеток глиальных
опухолей могут служить основой для создания панели культур клеток,
отличающихся по уровню относительной экспрессии гена TFAP2A.
27
28
Содержание активных молекул в N2, G5 и AmnioMAX
Активные
молекулы
трансферрин
селен
инсулин
трийодтиронин
глюкагон
гидрокортизон
тестостерон
эстрадиол
прогестерон
фактор роста
фибробластов
эпидермальный
фактор роста
биотин
путресцин
N2,
мкг/мл
G5,
мкг/мл
AmnioMAX,
мкг/мл
10000
5000
5
0,52
0,52
1,58
500
500
10
-
-
0,07
-
-
0,001
-
0,36
0,36
-
-
0,29
-
-
0,27
0,63
-
0,31
-
0,5
0,01
-
1
-
-
100
-
1611
-
http://products.invitrogen.com/
29
Ген
EGFR
рецептор эпителиального фактора
роста
MGMT
метилгуанинметилтрансфераза
PTEN
Роль в онкогенезе
активация рецептора → ↑ пролиферации
клеток, блокировка апоптоза
метилирование→ устойчивость к
химиотерапии
супрессор опухоли
фосфотаза и гомолог тензина
CEBPB
CCAAT/энхансер связывающий белок
TFAP2A
транскрипционный фактор AP2α
DNMT3A
ДНК-метилтрансфераза 3А
ATF3
активирующий фактор транскрипции
повышение уровня экспрессии→ ↑
пролиферации клеток
уровень экспрессии уменьшается с
увеличением градации
снижение уровня экспрессии→ развитие
глиобластом
снижение уровня экспрессии→ развитие
опухоли
30
Экспрессия четырех из шести генов в культурах клеток
олигоастроцитомы 20 по сравнению с исходной опухолью и
образцами нормального мозга
DNMT3A
MGMT
CEBPB
PTEN
31
Уровень экспрессии генов TFAP2A, DNMT3A и EGFR,
нормализованный к уровню экспрессии гена HPRT1, в
образцах опухолей и немалигнизированных тканей мозга
Тип
образца
Номер
образца
TFAP2A
DNMT3A
EGFR
Норма
N1
1
1
N2
0,74
21
GB2
AO
AA
Тип
образца
Номер
образца
TFAP2A
DNMT3A
EGFR
1
17
119,61
0,79
3,2
3,99
2,8
18
23,95
3,91
48,95
40,26
―
3,82
22
45,64
7,29
7,58
43
90,66
8,32
32,54
26
2,32 (min)
1,85
1,68 (min)
19
15,18
―
89,07
28
44,8
4,39
488,53
20
178,59
7,55
189,71
29
11,8
9,9
49,04
38
15,96
56,27 (max)
1141,19 (max)
31
189,6
6,95
35,44
44
26,9
12,26
18,47
37
5,97
1,14
1,79
25
95,55
5,39
107,01
41
5,5
0,56 (min)
6,97
33
581,05 (max)
54,87 (max)
161,55
39
68,49
―
11,39
GB1 и GB2 – первичные и вторичные глиобластомы
42
9,11
1,88
19,98
Цветом выделены максимальные (max) и
минимальные (min) значения экспрессии генов
32
GB1
АА – анапластические астроцитомы
AO – анапластические олигоастроцитомы
Культуры клеток: терминология
Способность к делению in vitro
• Неперевиваемые
• Перевиваемые
Время жизни in vitro
• Первичные (ограниченный срок)
• Постоянные = иммортолизованные
(неограниченный срок)
• Первичные
неперевиваемые культуры
• Первичные перевиваемые
• Постоянные перевиваемые
33
Проблема выбора: «за» и «против»
• Первичные неперевиваемые
+ свойства клеток наиболее близки к исходной ткани
- ограниченное число клеток, очень ограниченное время жизни,
невозможность повторения экспериментов
• Постоянные перевиваемые
- свойства клеток катострофически далеки от исходной ткани
+ неограниченное число клеток, неограниченное время жизни
нет ограничений в повторении экспериментов
• Первичные перевиваемые
+ - «золотая середина»
34
Сравнение уровня экспрессии генов в образце исходной опухоли
(20) и в клетках культур (2GA20f и 3GA20f) при культивировании с
добавками NG и А20
3.0
Уровень относительной экспрессии
NG
A20
2.5
DNMT3A
EGFR
2.0
MGMT
1.5
TFAP2A
1.0
ATF3
0.5
0.0
20
2GA20f 5п
3GA20f 5п
2GA20f 5п
3GA20f 5п
35
Гистограмма, отображающая уровни экспрессии трех
генов в исследованных образцах глиом
36
Пути формирования глиобластом
По материалам статьи Riemenschneider M. J. et al (2010). "Molecular
diagnostics of gliomas: state of the art." Acta Neuropathol 120(5).
37
Варианты роста клеток анапластической астроцитомы (GA42m) и
глиобластом (GB43m и GB17f) в разных ростовых средах
Среда РС0
Среда РС5
Среда РС10
GA42m
После краткого
хранения при
+4оC
Нейросферы
не появились
GB43m
После краткого
хранения при
+4оC
Монослойного роста
не возникло
GB17f
После
длительного
хранения
в жидком азоте
38