БЕЛКОВАЯ И КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ
УТВЕРЖДАЮ
декан______________
Паршин В. Г.
"21 "января 2011 г.
Рабочая программа модуля
БЕЛКОВАЯ И КЛЕТОЧНАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
МОДУЛЬ 2
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Направление подготовки
020400-БИОЛОГИЯ
Магистерская программа
Молекулярная и клеточная биотехнология
Квалификация (степень) выпускника
Магистр
Форма обучения
очная
Ростов-на-Дону
2011
1
1. Цели освоения дисциплины (модуля)
Целями освоения модуля КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ являются:
Формирование системных знаний о клеточной инженерии животных и растений,
гибридомных биотехнологиях.
Изучение современных методов культивирования клеточных культур,
создания
гибридом, методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), методов работы со
стволовыми клетками.
Формировать у студентов целостного научного представления о возможностях и
путях развития клеточных биотехнологий.
2. Место дисциплины (модуля) в структуре ООП
магистратуры
Клеточная инженерия представляет собой профессиональную дисциплину, входящую
в учебном плане в блок М3 - профессиональных дисциплин вариативной части. Студенты
обучаются по данной дисциплине в семестре А. Для освоения дисциплины необходим
теоретический базис по цитологии, гистологии, биоорганической химии, биологической
химии, биологии размножения и индивидуального развития, генетике, физиологии
растений, молекулярной биологии.
Требования к входным знаниям:
1.
Строение клетки
2.
Гистологическое особенности строения различных тканей
3.
Механизмы функционирования живых клеток на разных уровнях организации.
4.
Особенности организации и жизнедеятельности растительных и животных клеток.
Клеточная инженерия представляет собой дисциплину, состоящую из теоретических
знаний биологии клетки и совокупности технологий, используемых для работы с
клеточными культурами и конструировании новых клеток. Включает культивирование и
клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток,
технологий работы со стволовыми клетками, экстракорпоральному оплодотворению, а
также пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и
«сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.
3 Компетенции обучающегося, формируемые в результате
освоения дисциплины (модуля).
2
Дисциплина «Клеточная инженерия», наряду с другими предметами, указанными в
«Матрице соответствия компетенций, составных частей ООП и оценочных средств»,
участвует
в формировании у студента следующих компетенций (см. таблица
формируемых компетенций):
Таблица формируемых компетенций
Общекультурные компетенции
(общенаучные,
инструментальные, социальноличностные)
Профессиональные компетенции
(общепрофессиональные,
пофессиональноспециализированные)
ОК-1
ПК-1
ОК-2
ПК-2
ОК-3
ПК-3
ОК-4
ПК-4
ОК-5
ПК-6
ПК-8
ПК-9
ПК-10
ПК-12
ПК-13
ПК-15
В результате освоения дисциплины студент должен:
Знать:
1.
Биологию культивируемых клеток.
2.
Структуру и планирование лабораторных помещений.
3.
Оборудование, применяемое в клеточной инженерии.
4.
Методы асептики.
5.
Биоэтику работы с культурами клеток.
6.
Понятия первичной культуры, субкультуры, клеточных линий, клонирования,
селекции,
разделения
трансформации,
клеток,
характеристики
иммортализации,
клеток,
контаминации,
дифференцировки,
цитотоксичности
и
криоконсервации
Уметь:
3
1.
Выбрать среду и добавки определѐнного химического состава для культивирования
определѐнных клеточных линий.
2.
Проводить количественный анализ клеточной культуры
Владеть:
1.
Методами асептики, подготовительными методами работы и стерилизации.
2.
Техникой безопасной работы в лаборатории клеточных культур.
4. Структура и содержание дисциплины (модуля)
Общая трудоемкость дисциплины составляет 3 зачетные единицы, на часть 2
приходится: аудиторных 27 часов, лекционных 9 часов, практических занятий 18 часов,
СРС 27 часов, форма отчѐтности – комплексный зачѐт.
Применяемые
образовательные
технологии
Неделя семестра
№
Раздел
дисциплины
Семестр
Структура дисциплины
Виды учебной работы,
включая самостоятельную
работу студентов и
трудоемкость (в часах)
Аудиторная
Всего
часов
(трудоемкость)
Лекц
Лаб.
раб/
Пр
СРС
Формы
текущего
контроля
успеваемости
(по неделям
семестра)
Форма
промежуточной
аттестации (по
семестрам)
КУЛЬТУРЫ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
1.1
Введение в клеточную
инженерию. Цели, задачи,
объекты клеточной
инженерии. Оборудование,
питательные среды, основные
методы культивирования.
Лекциявизуализация
А 1
2
1
-
1
---
А 1
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
2
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
Лекциявизуализация
А 3
2
1
-
1
---
Метод
развивающей
кооперации
А 3
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
4
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
Коллоквиумконсультация
1.2
Биология клеток
1.3
Коллоквиум: Общие
положения клеточной
инженерии. Применяемое
оборудование. Цели, задачи,
объекты клеточной
инженерии. Оборудование,
питательные среды.
2.1
2.2
2.3
Культивирование животных
клеток. История
культивирования животных
клеток. Введение клеток в
культуру, их происхождение.
Характеристика клеток,
культивируемых in vitro.
Питательные среды и условия
культивирования
Коллоквиум: Системы
культивирования клеток.
Культура клеток человека.
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
Коллоквиумконсультация
Коллоквиумконсультация
Индивидуальн
ые
4
3.1
Культивирование клеток и
тканей беспозвоночных.
Системы культивирования
клеток. Культура клеток
человека. Культивирование
клеток и тканей
беспозвоночных.
Культивирование органов.
3.2
Культивирование органов.
Гибридизация животных
клеток. История метода.
Метод создания химер.
Механизм слияния клеток.
3.3
Коллоквиум:
Моноклональные антитела.
Получение моноклональных
антител. Применение
моноклональных антител.
4.1
4.2
4.3
5.1
5.2
5.3
Гибридизация животных
клеток. История метода.
Метод создания химер.
Механизм слияния клеток.
Моноклональные антитела.
Получение моноклональных
антител. Применение
моноклональных антител.
Коллоквиум: Трансплантация
эмбрионов.
Экстракорпоральное
оплодотворение. Клеточная
инженерия в животноводстве.
Трансплантация эмбрионов.
Экстракорпоральное
оплодотворение. Клеточная
инженерия в животноводстве.
Клонирование животных.
История клонирования.
Методы клонирования.
Перспективы клонирования.
Коллоквиум: Клонирование
животных. История
клонирования. Методы
клонирования. Перспективы
клонирования.
проблемные
задания
Лекциявизуализация
А 5
2
1
-
1
---
А 5
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
6
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
Лекция с
разбором
конкретной
ситуации
А 7
2
1
-
1
---
Метод
развивающей
кооперации
А 7
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
А 8
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
Лекция с
разбором
конкретной
ситуации
А 9
2
1
-
1
---
Метод
развивающей
кооперации
А 9
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
Метод
развивающей
кооперации
А 10
2
-
1
1
ПР-1 –
письменный тест
Коллоквиумконсультация
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
Метод
развивающей
кооперации
Коллоквиумконсультация
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
6.1
6.2
Культуры растительных
клеток. История
культивирования
растительных клеток.
Использование растительных
культур.
Каллусные ткани.
Суспензионные культуры.
Культуры отдельных клеток.
Культуры гаплоидных клеток.
Иммобилизованные
Лекция с
разбором
конкретной
ситуации
А 11
2
1
-
1
---
Метод
развивающей
кооперации
А 11
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
5
6.3
растительные клеточные
культуры.
Коллоквиум: Культуры
растительных клеток. История
культивирования
растительных клеток.
Использование растительных
культур. Каллусные ткани.
Суспензионные культуры.
Культуры отдельных клеток.
Культуры гаплоидных клеток.
Иммобилизованные
растительные клеточные
культуры.
Коллоквиумконсультация
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
А 12
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
Протопласты растительных
клеток. Способы получения,
культивирования,
применения. Слияние
протопластов.
Конструирование
растительных клеток.
Клеточная селекция.
Клональное
микроразмножение растений.
Этапы и методы клонального
размножения. Преимущества
и недостатки метода.
Ассоциации клеточных
культур.
Коллоквиум: Протопласты
растительных клеток.
Способы получения,
культивирования,
применения. Слияние
протопластов.
Конструирование
растительных клеток.
Лекция с
разбором
конкретной
ситуации
А 13
2
1
-
1
---
Игровой
имитационный
метод:
мозговой
штурм
А 13
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
Индивидуальн
ые
проблемные
задания
А 14
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
8.1
Клеточная селекция.
Клональное
микроразмножение растений.
Этапы и методы клонального
размножения. Преимущества
и недостатки метода.
Ассоциации клеточных
культур.
Лекциявизуализация
А 15
2
1
-
1
---
8.2
Растительные клеточные
технологии в фармакологии
Игровой
имитационный
метод:
мозговой
штурм
А 15
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
8.3
Коллоквиум: Клеточная
селекция. Клональное
микроразмножение растений.
Этапы и методы клонального
размножения. Преимущества
и недостатки метода.
Ассоциации клеточных
культур.
Игровой
имитационный
метод:
мозговой
штурм
А 16
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
9.1
Криоконсервация животных и
растительных клеточных
культур. Криопротекторы.
Принципы размораживания
Проблемная
лекция
А 17
2
1
-
1
---
7.1
7.2
7.3
Коллоквиумконсультация
6
клеточных культур. Основные
принципы криобиологии.
9.2
Коллоквиум:
Криоконсервация животных и
растительных клеточных
культур. Криопротекторы.
Принципы размораживания
клеточных культур. Основные
принципы криобиологии.
Проблемная
лекция
9.3
Зачѐтное итоговое занятие
Проблемная
лекция
А 17
А 18
Итого
2
-
1
УО-2 –
коллоквиум
1
2
-
1
1
27
9
18
27
ПР-1 –
письменный тест
УО-3 – устный
зачѐт
В соответствии с Типовым положением о вузе к видам учебной работы отнесены:
Лекции, консультации, семинары, практические занятия, лабораторные работы, контрольные работы,
коллоквиумы,
самостоятельные
работы,
научно-исследовательская
работа,
практики,
курсовое
проектирование (курсовая работа). Высшее учебное заведение может устанавливать другие виды учебных
занятий. Формы текущего контроля: УО-1 – собеседование, УО-2 – коллоквиум, ПР-1 – письменный тест,
ПР-2 – контрольная работа, ТС-1 – обучающий тест. Промежуточная по дисциплине: УО-2- коллоквиум,
ПР-2– контрольная работа, ПР-3 – эссе, ПР-4 – реферат. Рубежная по модулю: УО-3 – устный зачѐт, УО-4 –
устный экзамен, ПР-5 – курсовая работа, ПР-4 – реферат, ПР-6 – научно-учебный отчѐт по практике, ПР-7
– отчѐт по научно-исследовательской работе студента (НИРС).
Содержание дисциплины
Введение.
Введение в клеточную инженерию. Цели и задачи клеточной инженерии. Объекты
клеточной инженерии. История возникновения и развития клеточной инженерии. Связь
клеточной инженерии, как раздела биотехнологии с различными направлениями в
биологии.
Основные положения и методы клеточной инженерии. Оборудование,
применяемое в клеточной инженерии. Принципы организации лаборатории клеточных
культур. Основные питательные среды, используемые при культивировании клеток.
Современные задачи и проблемы клеточной инженерии. Востребованность специалистов
в области клеточной инженерии на «биотехнологическом рынке профессий».
1. Культуры животных клеток
1.1. Культивирование клеток.
1.1.1 История культивирования животных клеток.
Исторические этапы клеточной инженерии по культивированию животных клеток.
Первый этап – признание идеи о возможности культивирования животных клеток. Второй
этап – демонстрация возможности выращивания и репродукции фильтрующихся вирусов.
Третий этап – вставка в геном клетки
и экспрессия экзогенных генов, получение
7
моноклональных антител.
Научное представление о клетке как основном структурном элементе живых
организмов животного и растительного происхождения. Концепция Клода Бернара о
постоянстве внутренних условий клетки вне организма. Концепция питательных сред.
Работы
У.
Ру
по
культивированию
оболочки
куриного
эмбриона
в
теплом
физиологическом растворе. Работы Лѐба по культивированию клеток крови в сыворотке и
плазме крови. Опыты Льюнгрена в культивировании эксплантатов кожи, с сохранением
способности к реимплантации. Дополнительные эксперименты Джолли, наблюдавшим
деление
клетки
в
висячей
капле,
содержащей
лейкоциты
саламандры.
Усовершенствование методики «висячей капли» Росс Харрисоном. Культивирование
клеток Алексисом Каррелем.
Первое получение клонов клеток в культуре из одиночной клетки Эрлом с
сотрудниками в 1948 году. Исследования Игла в пищевых потребностях клетки.
Классические опыты Хейфлика и Мурхеда по выделению линии диплоидных клеток
человека (НДС) WI-38. «Предел Хейфлика» и «феномен старения» на линии WI-38.
«Бессмертность» раковых клеток и их гетероплодность. Клетки HeLa - перевиваемая
линия карциномы шейки матки, выделенная в 1952 году Джем. Диплоидность – как факт
стабильности генетического материала клетки. Догма применимости диплоидных клеток
для получения продуктов для человека.
1.1.2 Введение клеток в культуру, их происхождение.
Два направления культивирования животных клеток: культура клеток и культура
органов и тканей (органные культуры). Особенности культуры животных клеток:
отсутствие
структурной
организации
и
гистиотипической
структуры,
наличие
специальных требований к условиям культивирования. Гетерогенность клеточной
популяции, наличие стволовых клеток и клеток-предшественниц. Корреляция между
специализацией клеток и выживаемостью. Дифференцировка и пролиферация клеток.
Характеристика первичных культур. Пассивирование – как метод продления жизни
культуры клеток. Трансформация в постоянную клеточную линию. Морфологические
изменения в клетках при возникновении постоянной клеточной культуры.
1.1.3 Характеристика клеток, культивируемых in vitro.
Взаимодействие клеток друг с другом. Скорость деления клеток. «Социальный
контроль» плотности популяции. Поверхностные рецепторы мембраны клетки и их
участие в адгезивных контактах. Электронноплотные бляшки гликопротеиновых
комплексов. Механизм перемещения клеток. Феномен контактного ингибирования.
Торможение пролиферации клеток, зависимое от плотности клеток. Факторы роста
8
клеток. Рецепторы факторов роста, их представленность на мембране клеток.
Конкуренция клеток за факторы роста. Форма клеток, распластывание по субстрату.
Влияние распластывания клеток на их пролиферацию. Степень распластывания и частота
деления клеток. Контроль клеточного деления и организация цитоскелета.
Трансформация клеток. Необратимость трансформации. Изменение транспорта
питательных веществ через клеточную мембрану при трансформации.
Условия
существования трансформированных клеток. Отношение площади поверхности к объѐму
у трансформированных клеток. Рост трансформированных клеток в суспензионных
культурах. Причины трансформации: вирусная и спонтанная. Трансформирующие
вирусы: SV40 и полиомы. Трансформация как результат «включения» онкогенов.
Неограниченная продолжительность жизни трансформированных клеток.
1.1.4 Питательные среды и условия культивирования.
Условия обеспечения клеток in vitro внешними условиями, которые клетки имели in
vivo. Требования к жидкой питательной среде, к твѐрдой и газовой фазе. Солевые
растворы - основа питательной среды. Основная функция раствора – буферные свойства.
Осмотическое давление - важное условие культивирования. Солевые растворы Эрла и
Хенкса, фосфатносолевой буфер Дульбекко и Фогта, среда HEPES.
Стандартные среды для ведения культур животных клеток. Среды Игла MEM
(minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Среда Дульбекко DME или
DMEM (двойная модификация среды Игла). Среда Искова IMDM. Среда МакКоя 5А и
серия сред RPMI. Среда 199. Сыворотка. Преимущества и недостатки использования
сыворотки. Цитотоксичность сыворотки, полиаминооксидаза сыворотки. Значительная
вариабельность состава сывороток разных партий.
Субстрат для клеточных культур. Различные материалы для подложки: пирекс,
полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон. Смачиваемость и отрицательный
заряд – необходимое условие прикрепления клеток к подложке.
1.1.5 Системы культивирования клеток.
Две основных системы культивирования клеток. Непроточная культура. Истощение
среды.
Способы
увеличения
продолжительности
жизни
непроточных
культур:
прерывистый, постоянный, перфузионный. Проточная культура. Монослойные культуры.
Суспензионные
культуры.
Преимущества
и
недостатки
монослойных
культур.
Разновидности метода монослойных культур: чашка Колле, плоский флакон с клетками на
дне, вращающаяся бутыль с клетками на дне и на стенках, колонка с клетками на
микроносителях.
1.1.6 Культура клеток человека.
9
Культуры
фибробластов
человека.
Экстраполяция
данных,
полученных
на
культивируемых фибробластах, на условия in vivo (Гринберг). Особенности культуры
фибробластов человека.
1.1.7 Культивирование клеток и тканей беспозвоночных.
Причины
интереса
к
клеточным
культурам
беспозвоночных.
Среды
для
культивирования клеток и тканей насекомых. Особенности состава. Источники получения
культур клеток.
1.1.8 Культивирование органов.
Органная культура. Особенности органной культуры. Особенности культивирования.
Работы Лѐба о культивировании органной культуры. Особенности субстратов для
культивирования органной культуры. Метод часовых стекол по Феллу и Робинсону.
Метод часовых стекол с агаровым сгустком по Вольффу и Хафену. Выращивание
органной культуры на плотиках по Чену. Модифицированный метод Троувелла. Метод
поочередного культивирования в жидкой среде и газовой фазе.
1.2 Гибридизация животных клеток.
1.2.1 История метода и методы создания химер.
Представления Шлейдена и Рудольфа Вирхова о зарождении новых клеток. Открытие
гетерокарионов. Аллофеные (химерные) организмы. Методы получения аллофенных
(химерных) организмов: агрегационный метод Тарковского и Минца, инъекционный
метод Гарднера.
Первые межвидовые химеры.
Сельскохозяйственные химерные
животные.
1.2.2 Механизм слияния клеток.
Механизм
слияния
клеток.
Вещества-индукторы
слияния
клеток:
Ca2+,
полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай. Характеристики
веществ-индукторов. Цитотоксичность лизолецитина. Преимущества и недостатки вируса
Сендай, как сливающего агента. Слияние клеток и его этапы. Агглютинация клеток.
Полиэтиленгликоль как агглютинирующий агент. Гипотезы механизма действия
полиэтиленгликоля. Гипотеза образования мостиков между ПЭГ и отрицательно
заряженными
углеводами,
агглютинирующей
находящимися
активности
в
на
присутствии
клеточной
ионов
поверхности.
Усиление
двухвалентных
металлов.
Дегидратационная гипотеза слияния протопластов. Агглютинирующая активность
лектинов и антител. Роль гликопротеинов в агрегации клеток. Этапы слияния клеток по Н.
Рингертцу, Р. Сэвиджу: - 1-й этап, сближение цитоплазматических мембран; 2-й этап,
выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны; 3-й этап, образование
мицелл; 4-й этап, слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков.
10
1.3. Моноклональные антитела.
Функциональная
структура
антител.
Лимфоциты
–
источники
антител.
Иммуноглобулины. Понятие антигена. Антигенная детерминанта. Структура молекул
антител.
Образование
иммунных
комплексов
и
преципитация.
Агглютинация.
Образование антител. Иммунный ответ. Этапы получения антител. Иммунизация
животных. Стимуляторы иммунного ответа. Выделение антител в виде G-глобулиновой
фракции. Трудности очищения полученных фракций. Понятие специфичности. Опыты
Георга Кѐлера и Цезаря Мильштейна. Методика получения гибридом. Слияние иммунной
клетки с опухолевой. Отбор гибридом. Рост гибридом в культуральной жидкости. Метод
инъекции гибридом в брюшную полость мыши. Асцитные опухоли. Методы анализа на
основе моноклональных антител. Иммунофлюоресцентный метод Кунса. Усиление
иммунного ответа за счѐт применения антител нескольких порядков. Биотинстрептавидин система усиления сигнала. Иммуноферментный анализ. Применение
моноклональных антител.
1.4. Клонирование животных.
1.4.1 Общие сведения о клонировании животных.
Дифференцировка клеток и репрессия генома. Закономерность связи специализации
клетки и еѐ тотипотентности. Первая трансплантация ядер соматических клеток
зародышей в энуклеированные клетки лягушки Р. Бриггса и Т. Кинга. Тотипотентность
ядра в стадии поздней бластулы и ранней гаструлы. Исследования Дж. Гордона на рыбах
и дрозофилах. Ядра клеток тканей, обеспечивающих развитие X. laevis до стадии
головастика. Опыты Ди Берардино и Хофнер при трансплантации ядра неделящихся и
полностью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens.
Факторы, восстанавливающие тотипотентность ядер дифференцированных соматических
клеток. Технология клонирования костных рыб, разработанная учеными Л.А. Слепцовой,
Н.В. Дабагян и К.Г.Газарян. Пересадки ядер млекопитающих. Основные трудности при
работе с ядрами млекопитающих.
Эксперименты
Дж. Мак Грата и Д. Солтера по
клонированию эмбрионов мышей. Время активации первых групп генов у эмбрионов
разных видов животных.
1.4.2 Методы трансплантации ядер
Микропипеточный метод трансплантации ядер Б.В. Конюхова и Е.С. Платонова.
Трансплантация ядер с участием цитохалазинов. Цитохалазин В. Цитопласты и
кариопласты. Отделение цитопластов от интактных клеток в градиенте плотности.
Методы выделения кариопластов с участием частиц тантала. Реконструкция клеток из
суспензии кариопластов и монослоя культуры цитопластов.
11
1.4.3 Клонирование млекопитающих
Первое удачное клонирование эмбрионов кролика в 1988 году С. Стиком и Дж.
Роблом. Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных
животных С. Уилладсина. Пересадка ядер крупного рогатого скота Дж. Роблом. Методика
пересадки. Опыты Бондиоли с соавторами. Использование в качестве доноров ядер 16-64клеточные зародыши коров. Длительная тотипотентность клеток эмбрионов крупного
рогатого скота. Сложность экспериментов по клонированию свиней. Исследования под
руководством Я. Уилмута из Рослинского института по получению клона овец. Метод
клонирования. Результаты, полученные исследовательской группой.
1.5. Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных.
Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных. Основные методы
регулирования воспроизводства: стимуляция и синхронизация охоты, суперовуляция,
искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов, хранение гамет и эмбрионов,
целенаправленное
получение
двоен,
регулирование
пола,
раннюю
диагностику
беременности, управление процессом родов, создание химер.
2. Культуры растительных клеток.
2.1. Культуры клеток высших растений.
2.1.1 История культивирования растительных клеток.
Изолированные культуры Блоцишевского (1876), Брауна, Морриса (1892), Боннэ,
Сакса (1893). Опыты Карла Рехингера. Культивация клеток растений Габерландом.
Исследования Уайта и Готре. Получение изолированных протопластов по Коккингу.
2.1.2 Использование культуры растительных клеток
Сферы применения культур растительных клеток. Изучение биологии растительной
клетки на примере растительной клеточной культуры. Специфические особенности
популяции
клеток
экспериментально
растительной
созданная
культуры.
Культура
растительных
биологическая
система.
Технологии
клеток
на
–
основе
культивируемых тканей и клеток растений. Получение биологически активных веществ
растительного происхождения, с использованием культуры растительных клеток:
продукты вторичного метаболизма, синтез новых необычных соединений. Культура
растительных клеток как мультиферментная система, биотрансформация химических
веществ. Культура растительных клеток – источник получения безвирусных растений.
Ускоренное клональное микроразмножение растений с использованием культуры
растительных клеток. Преодоления постгамной несовместимости на основе растительной
клеточной культуры. Антерные культуры. Клеточный мутагенез и селекция при
12
использовании культуры растительных клеток. Криоконсервация и сохранение генофонда.
Иммобилизация растительных клеток. Соматическая гибридизация на основе слияния
растительных протопластов. Конструирование клеток путем введения различных
клеточных органелл. Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.
Изучение системы «хозяин (растительная клеточная культура)
– паразит (вирусы,
бактерии, грибы и насекомые)».
2.1.3 Культуры соматических клеток.
Тотипотентность – основное свойство, лежащее в основе культивирования
растительных клеток. Требования растительных клеток к условиям культивирования.
Каллус - основной тип культивируемой растительной клетки.
Основные функции, выполняемые каллусной тканью. Ауксины. Основные ауксины.
Ауксины и образование каллусной ткани. Этапы образования каллусной ткани,
дедифференцировка тканей экспланта. Фитогормоны - активаторы матричной активности
ДНК хроматина и активности РНК–полимеразы. Индолилуксусная кислота (ИУК) –
основной ауксин. Механизм действия ИУК, первичное и вторичное действие на клетку.
2.1.4 Морфофизиологическая характеристика каллусных тканей.
Два типа культивируемых растительных клеток. Нормальные и опухолевые
растительные клетки. Морфологические особенности опухолевых растительных клеток.
Гормононезависимость
опухолевых
клеток.
Тератома.
Два
вида
существования
растительных клеток в культуре: суспензия в жидкой питательной среде и каллус на
поверхности твердой питательной среды. Особенности поверхностного культивирования.
Виды каллусных тканей. Особенности культивирования каллусных тканей. Пассирование
и субкультивирование каллусной ткани. Типы клеток каллусной ткани. Индукторы
органогенеза. Геммогенез и ризогенез при делении клеток меристематического очага.
Дифференциация клеток растения. Различная экспрессия генов - основа клеточной
дифференциации. Детерминация клетки. Обратимость дифференциации растительных
клеток в клеточных культурах. Пути развития дочерних клеток. Компетенция.
Индуцирующие воздействия и компетенция. Индуцирующие факторы. Концепция
органогенеза Скуга и Мурасиге. Полиплоидизация клетки как основа морфологической
гетерогенности. Ассоциация клеток каллусной ткани. Физико-химические контакты
клеток. Донорно-акцепторные молекулы цитоплазматической мембраны. Эффекторы и
апорепрессоры. Адгезия клеток. Аллостерические белки. Генетическая обусловленность
процессов морфогенеза.
2.1.5 Суспензионные культуры.
13
Суспензионная культура. Суспензионная культура как модельная система. Признаки
"хорошей" линии. Морфологические характеристики "хорошей"
линии. Степень
дезагрегации. Морфологическая выравненность клеток. Отсутствие трахеидоподобных
элементов. Технология получения клеточной суспензии. Параметры оценки роста
суспензионной культуры. Объем осажденных клеток (ООК). Число клеток. Сырая и сухая
масса. Содержание белка. Проводимость среды. Жизнеспособность клеток. Ростовая
кривая. Открытая и закрытая система культивирования клеток растительных культур.
Характеристики закрытой системы. Открытые, проточные культуры. Закрытое глубинное
культивирование. Особенности роста суспензионных культур. Перемешивание и аэрация
растительных культур. Влияние газовой среды на рост суспензионной культуры. Высокая
плотность
роста
физиологическая
– отличительная особенность суспензионных культур.
метаболическая
активность.
Периодическое
Низкая
культивирование.
Получение вторичных метаболитов.
2.1.6 Культивирование отдельных клеток
Культивирование отдельных клеток для получения клонов, изучения их генетической
и физиологической изменчивости, стабильности,
гибридных и
трансформированных линий.
клоновой селекции мутантных,
Отдельные клетки
как модель
для
сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке.
Этапы
выращивания
отдельных
клеток:
изолирование
неповрежденной
клетки
растительной или каллусной ткани и создание условий, благоприятных для роста и
развития изолированной клетки. Характеристика первого этапа выращивания. Обработка
тканей пектиназами. Выделение отдельных клеток: микроманипуляции и метод
разведений. Метод культивирования отдельных клеток – метод «ткани – няньки по
Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Метод «кормящего слоя».
2.1.7 Культуры гаплоидных клеток.
Способы получения гаплоидов. Отдалѐнная гибридизация как классический метод
получения гаплоидных клеток. Культивирование in vitro из неоплодотворенных половых
клеток с редуцированным набором хромосом. Дигаплоиды, их получение. Преимущества
гаплоидов. Демаскировка рецессивных генных мутаций. Абсолютная гомозиготность
дигаплоидов. Использование гомозиготных растений: количественный генетический
анализ,
изучение
определение
групп
взаимодействия
сцепления,
генов,
изучение
установление
числа
генетической
генов,
изменчивости,
действующих
на
количественные признаки, определение локализации полигенов. Методы индуцирования
гаплоидов. Индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы. Селективная
элиминация хромосом в гибридном зародыше.
Псевдогамия - развитие гаплоидного
14
зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или
же развитие изолированной семяпочки (гиногенез).
Получение первых гаплоидных растений в 1964 году индийскими исследователями
С. Гуха и С. Махешвари при культивировании пыльников дурмана. Два направления
получения гаплоидных растений из изолированных пыльников: прямая регенерация
соматических зародышей и каллусогенез. Культура пыльцы. Эмбриоид. Способы
освобождения микроспор от соматических тканей пыльника: спонтанное высвобождение,
гомогенизация и фильтрация, разрезание стенки пыльника. Партеногенез и апогамия.
2.2 Культура тканей растения как источник вторичных метаболитов.
2.2.1 Иммобилизованные клеточные культуры растений.
Культура растительных тканей – источник вторичных метаболитов. Первая удачная
попытка иммобилизации клеток растений Мосбаха. Методы иммобилизации клеток:
иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате, адсорбция
клеток на инертном субстрате, адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью
биологических макромолекул, ковалентное связывание с другим инертным носителем
типа КМЦ. Преимущества иммобилизованных клеток. Медленный рост биомассы при
использовании
иммобилизованных
клеток.
Механизмы
связи
между
ростом
и
метаболизмом. Химические контакты при тесном физическом контакте. Генетический и
эпигенетический уровни контроля вторичного метаболизма. Внешние факторы, влияющие
на метаболизм: концентрация кислорода, углекислого газа, уровень освещения.
Химический состав окружающей среды. Выделение идиолитов из окружающей среды
культур клеток.
2.2.2 Системы культивирования иммобилизованных клеток.
Два типа систем культивирования иммобилизованных клеток: система культуры с
плоской основой, клетки выращиваются в горизонтально расположенном сосуде; система
колоночной культуры, где клетки выращиваются в вертикальном сосуде. Колоночные
культуры.
2.3 Протопласты растительных клеток.
2.3.1 Применение протопластов.
Протопласты
как
уникальная
физиологических проблем
модель
у растений.
для
Основные
изучения
фундаментальных
направления физиологических
исследований с использованием культуры изолированных протопластов. Изучение химии
и структуры клеточной стенки. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных
перемещений. «Мягкое» выделение органелл. Наблюдение за закономерностями
дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра
15
и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.
Введение чужих органелл. Введение чужеродных генов в растительную клетку
(трансгенез).
2.3.2 Способы получения и культивирования протопластов.
История выделения протопластов Дж. Клеркером. Механический способ получения
протопластов. Ограничения метода: невысокая производительность, можно использовать
ткани
только
с
экстенсивным
плазмолизом,
трудоемкость
и
длительность.
Энзиматический способ выделения протопластов методом Коккинга. Преимущества
энзиматического метода: одновременно выделяется большое количество протопластов,
клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу, клетки не повреждаются, метод
сравнительно
быстрый.
Ферменты,
удаляющие
клеточную
стенку:
целлюлазы,
гемицеллюлазы и пектиназы. Этапы выделения протопластов: обработка ферментами,
выделение протопластов из клеточных стенок, отделение интактных протопластов от
клеточных осколков. Метод флотации Гамборга. Способы культивирования протопластов:
метод жидких капель и метод платирования.
2.3.3 Способы слияния протопластов.
Парасексуальная гибридизация.
Преимущества парасексуальной гибридизации:
скрещивание филогенетически отдаленных видов растений; получение асимметричных
гибридов; слияние трех и более клеток; получение гибридов, представляющих сумму
генотипов родителей; перевод мутаций в гетерозиготное состояние; получение растений,
гетерозиготных по
внеядерным
генам.
Спонтанное
и
индуцированное
слияние
протопластов. Методы слияния протопластов: физический способ Циммермана, методика
"ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+". Судьба ядерного и
цитоплазматического
геномов
слившихся
протопластов.
Гибриды,
цибриды,
ассимметричные гибриды. Растения регенеранты.
2.4 Конструирование растительных клеток.
Протопласты как реципиенты клеточных органелл. Введение ядра и клеточных
органелл в протопласт. Метод сэндвича. Липосомный и микроинъекционный методы.
2.5 Клеточная селекция.
Методы клеточной селекции. Оплодотворение in vitro. Способы оплодотворения in
vitro. Плацентарное оплодотворение. Эмбриокультура. Сомаклональная вариабельность.
Полиморфизм культивируемых клеток. Физиологическая гетерогенность клеточных
культур.
Асинхронность
растительной
клеточной
культуры.
Генетическая,
эпигенетическая и модификационная изменчивость – как факторы культуральной
16
гетерогенности клеток. Причины генетической изменчивости. Химические и физические
мутагены – как факторы селекционного процесса. Спонтанный и индуцированный
мутагенез. Селективные агенты. Приѐмы клеточной селекции: позитивная селекция,
негативная селекция, тотальная селекция, визуальная селекция и неселективный отбор.
Виды культур используемых в клеточной селекции. Недостатки и преимущества
клеточной селекции. Схема получения мутантных форм путем клеточной селекции по В.
И. Артамонову.
2.6 Клональное микроразмножение растений.
Способы размножения растений. Недостатки семенного размножения. Сущность
микроклонального размножения. Преимущества микроклонального способа размножения:
получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от
вирусов
за
счет
использования
меристемной
культуры;
высокий
коэффициент
размножения; сокращение продолжительности селекционного процесса; ускорение
перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; размножение
растений, трудно размножаемых традиционными способами; возможность проведения
работ в течение всего года; возможность автоматизации процесса выращивания.
Основоположник
клонального
размножения
–
Жан
Морель.
Исследования
по
микроклональному размножению Бутенко. Первые работы по культуре тканей древесных
растений – Готре. Трудности микроклонального размножения хвойных растений.
Факторы влияющие на клональное размножение. Влияние длительности культивирования
на эффективность клонального размножения. Эффективность стерилизации культуры.
Этапы микроклонального размножения. Выбор растения-донора. Изолирование
эксплантов.
Получение
стерильной
культуры.
Собственно
микроразмножение.
Ускоренное размножение побегов. Выращивание растений в условиях теплицы.
Особенности питательных сред, применяемых на каждом из этапов клонирования.
Методы клонального размножения по Мурасиге, по Бутенко. Снятие апикального
доминирования. Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями
экспланта. Соматический эмбриогенез. Дифференциация адвентивных почек в первичной
и пересадочной каллусной ткани. Исключение вирусов из посадочного материала. Термои химиотерапия, как методы освобождения клеток растения от вирусов.
2.7 Ассоциация клеточной культуры высшего растения с микроорганизмом.
Понятие
искусственной
ассоциации
клеточной
культуры
растения
с
микроорганизмом. Эндо и экзосимбиотические ассоциации. Цели создания ассоциаций:
реконструкция
симбиотических
эволюционного
отношений,
процесса
изменение
симбиогенеза,
продуктивности
природные
модели
растительных
клеток17
продуцентов, растения-регенеранты. Азотфиксирующие симбионты. Методы получения
симбионтов. Метод инокуляции азотфиксирующими микроорганизмами. Методы генной
инженерии. Введение целых азотфиксирующих организмов в растения. Ассоциации с
клубеньковыми бактериями. Ассоциации со свободноживущими азотфиксаторами.
Ассоциации
с
зелеными
водорослями.
Ассоциации
с
грибами.
Ассоциации
с
цианобактериями.
3. Криоконсервация клеточных культур.
Необходимость в криоконсервации клеточных культур. Способы сохранения
клеточных культур: криоконсервация, лиофильное высушивание, замедление роста.
Факторы
определяющие
успех
низкотемпературной
криоконсервации.
Предкультивирование растительных культур в различных условиях. Добавки к средам
культивирования. Криопротекторы. Программы охлаждения. Быстрое и медленное
охлаждение клеток. Этапы охлаждения клеток. Принципы размораживания клеток.
Методы замедления роста растительных клеточных культур.
5. Образовательные технологии
В ходе освоения студентами дисциплины биоорганическая химия используются
традиционные и инновационные виды образовательных технологий:
1. Лекция-визуализация. В ходе лекции студент преобразовывает устную и
письменную информацию в визуальную форму, выделяя при этом наиболее
значимые и существенные элементы. На лекции используются схемы, рисунки,
чертежи, слайды-презентации, к подготовке которых привлекаются обучающиеся.
Проведение лекции проводится в виде связного развернутого комментирования
подготовленных наглядных пособий.
2. Проблемная
лекция. В ходе проблемной
лекции
знания вводятся как
«неизвестное», которое необходимо «открыть». Проблемная лекция начинается с
вопросов, с постановки проблемы, которую в ходе изложения материала
необходимо решить. При этом выдвигаемая проблема не имеет однотипного
решения, готовой схемы нет. Данный тип лекции строится таким образом, что
деятельность
студента
по
ее
усвоению
приближается
к
поисковой,
исследовательской. В ходе лекции происходит диалог преподавателя и студентов.
3. Лекция с разбором конкретной ситуации. В ходе лекции конкретная ситуация
излагается устно или в виде краткого диафильма, видеозаписи и т. п. Студенты
совместно анализируют и обсуждают представленный материал.
18
4. Коллоквиум-консультация, при котором до 50% времени отводится для ответов
на вопросы студентов.
5. Интерактивная форма проведения лабораторного занятия, на котором студенту
предлагается
решить
конкретную
задачу,
с
привлечением
лабораторно-
технических средств, справочно-методических пособий и ресурсов Интернет.
6. Индивидуальные проблемные задания, связанные с поиском и анализом
полученной информации и формулированием выводов и готового решения,
которое формулируется в виде готового эссе.
7. Игровой имитационный метод: мозговой штурм. Применяется свободная форма
дискуссии, позволяющая быстро включить в работу всех членов учебной группы.
Используется там, где требуется генерация разнообразных идей, их отбор и
критическая оценка. Этапы продуцирования идей и их анализа намеренно
разделены: во время выдвижения идей запрещается их критика. Внешне
одобряются и принимаются все высказанные идеи. Больше ценится количество
выдвинутых идей, чем их качество. Идеи могут высказываться без обоснования.
8. Метод развивающей кооперации. При этом методе ставится задача, которую
трудно выполнить в индивидуальном порядке и для которой нужна кооперация,
объединение учащихся с распределением внутренних ролей в группе. Для решения
проблемы, создаются группы учащихся из 3-4 человек. «Группа формируется так,
чтобы в ней был «лидер - генератор идей», «оппонент» и «исследователь». После
того, как каждая группа предложит свой вариант решения, начинается дискуссия, в
ходе которой группы через своих представителей должны доказать истинность
своего варианта решения.
Удельный вес занятий, проводимых в активных и интерактивных
формах,
составляет 50% от общего числа аудиторных занятий.
6. Оценочные средства для текущего контроля успеваемости,
промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины и учебнометодическое обеспечение самостоятельной работы студентов
Общие положения
В ходе освоения учащимся дисциплины клеточная инженерия
используются
следующие оценочные средства (таблица применяемых оценочных средств):
Таблица применяемых оценочных средств
19
№
Оценочные средства
1
УО-1
2
УО-2
3
ПР-1
4
ПР-2
5
ПР-3
6
ПР-4
1. Проверка выполнения домашнего задания в виде устного собеседования (УО-1).
2. Собеседование при приеме результатов экспериментальной лабораторной работы
(УО-1).
3. Проведение коллоквиума по освоенной теме (УО-2)
4. Письменный отчѐт о домашней контрольной работе, в которой имеются
контрольные вопросы и контрольные задания (составление и заполнение таблиц и
графиков) (ПР-2).
5. Проверка результата самостоятельной работы по индивидуальному проблемному
заданию (составление эссе) (ПР-3)
6. Письменный тест в начале лабораторного или практического занятия по
предыдущей теме (ПР-1)
7. Написание реферата по предложенной теме (ПР-4)
Контрольные самостоятельные задания
1. Культивирование животных клеток Алексисом Каррелем.
2. Классические опыты Хейфлика и Мурхеда. «Предел Хейфлика» и «феномен
старения».
3. Культура клеток человека.
4. Органная культура.
5. Химеры. Методы создания химер.
6. Гибридомная технология.
7. Методы получения моноклональных антител.
8. Клонирование животных. Клонирование млекопитающих.
9. Биоэтические проблемы, связанные с клонированием.
10. Каллусная культура.
11. Культура отдельных клеток.
12. Суспензионная культура.
20
13. Культуры гаплоидных клеток.
14. Использование культуры
растительных клеток, как источника вторичных
метаболитов.
15. Протопласты. Получение. Слияние. Использование.
16. Конструирование растительных клеток.
17. Ассоциаты клеточных культур растений с различными микроорганизмами.
18. Криоконсервация клеточных культур.
Проблемы
и
задачи
криобиологии.
Спорность крионики.
Тестовое задание
Пример тестового задания к главе 1 – Культура животных клеток
Тест рубежного контроля
Тест содержит задания, на выполнение которых отводится 20 минут. Выберите один или несколько
правильных, по вашему мнению, вариантов ответа и отметьте их любым значком в бланке ответов.
1. Основным объектом клеточной инженерии является:
1
Органная культура
3
Клеточная культура
2
Микробная культура
4
Растительная культура
2. Клеточная инженерия основана на:
1
скрещивании растений
3
культивировании клеток вне
организма
2
отборе растений и животных
4
синтезе генов и внедрении их в
клеточные культуры.
3. Первые эксперименты, показавшие, что животные ткани возможно некоторое время
культивировать в физиологическом растворе in vitro провел:
1
У. Ру (Роукс)
3
К. Бернард
2
Р. Харрисон
4
Г. Келер
4. Для клеточной культуры характерно:
1
Контроль жинамических свойств.
3
Характерная гистиотипическая
структура.
2
Состояние биохимических процессов в
клеточной культуре максимально
приближено к условиям in vivo.
4
Отсутствие структурной организации.
5. Концепция "Предела Хейфлика" и разработка теории феномена старения была осуществлена
в:
1
1955 год
3
1937 год
2
1961 год
4
1968 год
6. Образованию постоянной клеточной культуры соответствуют следующие
морфофизиологические особенности клеток:
1
Увеличение гетероплоидности и
анеуплоидности
3
Уменьшение эффективности
клонирования.
2
Увеличение времени удвоения клеток.
4
Увеличение зависимости от субстрата.
7. Переход клеточной культуры в стационарную фазу связан с:
21
1
нарушением цитокинеза.
3
истощением питательных веществ.
2
вирусной инфекцией.
4
укорочением теломер.
8. Одной из причин контактного торможения роста клеток в клеточной культуре является:
1
накопление в питательной среде продуктов
метаболизма клеток.
3
образование фибронектина на
клеточной поверхности.
2
увеличение доли клеточной поверхности
обращѐнной к среде
4
уменьшение продукции SP- белка
(клеточного поверхностного белка)
9. Трансформация клеток это:
1
Слияние соседних клеток, находящихся в
клеточной культуре.
3
Обратимое изменение ростовых и
морфологических свойств клеток.
2
Необратимое изменение ростовых и
морфологических свойств клеток.
4
Адаптация клеток находящихся в
культуре к факторам окружающей
среды.
10. Для суспензионной культуры клеток характерно:
1
Прекращение пролиферации клеток,
вследствие истощения среды.
3
высокая плотность клеток на единице
площади пространства.
2
расположение клеток в виде взвеси в
ростовой среде.
4
скачкообразное изменение кдеточного
метаболизма, вследствие
периодической замены среды.
Список рефератов
19. Культивирование животных клеток Алексисом Каррелем.
20. Классические опыты Хейфлика и Мурхеда. «Предел Хейфлика» и «феномен
старения».
21. Культура клеток человека.
22. Органная культура.
23. Химеры. Методы создания химер.
24. Гибридомная технология.
25. Методы получения моноклональных антител.
26. Клонирование животных. Клонирование млекопитающих.
27. Биоэтические проблемы, связанные с клонированием.
28. Каллусная культура.
29. Культура отдельных клеток.
30. Суспензионная культура.
31. Культуры гаплоидных клеток.
32. Использование культуры
растительных клеток, как источника вторичных
метаболитов.
33. Протопласты. Получение. Слияние. Использование.
34. Конструирование растительных клеток.
35. Ассоциаты клеточных культур растений с различными микроорганизмами.
22
36. Криоконсервация клеточных культур.
Проблемы
и
задачи
криобиологии.
Спорность крионики.
Перечень вопросов при подготовке к зачѐту по специальному курсу.
1. Исторические этапы клеточной инженерии по культивированию животных клеток.
2. Классические опыты Хейфлика и Мурхеда по выделению линии диплоидных
клеток человека WI-38. «Предел Хейфлика» и «феномен старения» на линии WI38.
3. Особенности культуры животных клеток. Гетерогенность клеточной популяции.
4. Характеристика
первичных
культур
животных
клеток.
Пассивирование.
Трансформация в постоянную клеточную линию.
5. Взаимодействие клеток друг с другом в культуре животных клеток. Скорость
деления клеток. «Социальный контроль» плотности популяции.
6. Трансформация клеток животной культуры. Причины трансформации.
7. Питательные среды и условия культивирования животных клеток.
8. Непроточная культура животных клеток. Способы увеличения продолжительности
жизни непроточных культур.
9. Монослойные культуры. Преимущества и недостатки монослойных культур.
10. Культура клеток человека. Особенности культуры клеток человека.
11. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных.
12. Органная культура. Особенности органной культуры. Методы органной культуры.
13. Гибридизация животных клеток.
14. Химеры. Методы создания химер.
15. Моноклональные антитела. Функциональная структура, получение, использование.
16. Дифференцировка
клеток
и
репрессия
генома.
Закономерность
связи
специализации клетки и еѐ тотипотентности.
17. Клонирование
животных.
Технология
клонирования.
Пересадки
ядер
млекопитающих.
18. Методы трансплантации ядер млекопитающих. Цитопласты и кариопласты.
19. Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных.
20. Исторические этапы клеточной инженерии по культивированию растительных
клеток.
21. Сферы применения культур растительных клеток. Специфические особенности
популяции клеток растительной культуры.
22. Культуры соматических клеток растений. Требования растительных клеток к
условиям культивирования.
23
23. Каллус. Основные функции выполняемые каллусной тканью. Ауксины и
образование
каллусной
ткани.
Этапы
образования
каллусной
ткани,
дедифференцировка тканей экспланта.
24. Фитогормоны. Нормальные и опухолевые растительные клетки. Морфологические
особенности опухолевых растительных клеток. Тератома.
25. Суспензионная и каллусная растительная клеточная культура. Виды каллусных
тканей. Особенности культивирования каллусных тканей.
26. Дифференциация клеток растения. Различная экспрессия генов - основа клеточной
дифференциации.
Детерминация
клетки.
Обратимость
дифференциации
растительных клеток в клеточных культурах.
27. Суспензионная культура растительной ткани. Суспензионная культура как
модельная система. Степень дезагрегации. Морфологическая выравненность
клеток.
28. Открытые, проточные культуры растительных клеток. Закрытое глубинное
культивирование. Особенности роста суспензионных культур. Периодическое
культивирование.
29. Культивирование отдельных растительных клеток. Этапы выращивания отдельных
клеток. метод «ткани – няньки по Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Метод
«кормящего слоя».
30. Культуры гаплоидных клеток. Способы получения гаплоидов. Дигаплоиды, их
получение. Преимущества гаплоидов.
31. Методы индуцирования гаплоидов. Индуцированный андрогенез в культуре
пыльников и пыльцы. Селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше.
Псевдогамия. Эмбриоид.
32. Культура растительных тканей как источник вторичных метаболитов. Методы
иммобилизации растительных клеток. Генетический и эпигенетический уровни
контроля вторичного метаболизма.
33. Системы культивирования иммобилизованных клеток.
34. Протопласты
как
уникальная
модель
для
изучения
фундаментальных
физиологических проблем у растений. Способы получения и культивирования
протопластов.
35. Способы слияния протопластов. Конструирование растительных клеток.
36. Клеточная селекция.
37. Клональное микроразмножение растений.
38. Ассоциации клеточной культуры высшего растения с микроорганизмом.
24
39. Способы
сохранения
клеточных
культур:
криоконсервация,
лиофильное
высушивание, замедление роста. Предкультивирование растительных культур в
различных условиях.
40. Криоконсервация клеточных культур. Криопротекторы. Программы охлаждения.
Принципы размораживания клеток.
7. Учебно-методическое и информационное обеспечение дисциплины
(модуля)
Для проведения дисциплины «Клеточная инженерия» студент обеспечен всей
необходимой учебно-методической литературой и доступом к програмному обеспечению
и интернет-ресурсам. Вся необходимая учебно-методическая литература имеется в
библиотеке студенческого абонемента, зональной научной библиотеке, библиотеке
кафедры и преподавателя дисциплины. Доступ к интернет-ресурсам осуществляется через
интернет-класс факультета, зональной научной библиотеки и локальной компьютерной
сети университета.
а) основная литература:
1.
Фрешни Р. Я. Культура животных клеток: практическое руководство / пер. 5-го англ.
Изд.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010.- 691 с.: ил., [24] с. цв. вкл.
2.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир, 2002. 589 с.
3.
Бутенко Р.Г. и др. Клеточная инженерия. - М.: Высшая школа, 1987.
4.
Герасименко В.Г. Биотехнология. Киев: Выща школа, 1989. 343 с.
5.
Кефели В.И., Дмитриева Г.А. Биотехнология: курс лекций. Пущино, 1989. 96 с.
6.
Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж.Б. и др. Биотехнология клеток животных. М.:
Агропромиздат, 1989. Т. 1, 2.
7.
Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.
8.
Шевелуха В. С., Калашникова Е. А., Дегтярев С. В. и др. Сельскохозяйственная
биотехнология: Учеб. Под ред. Шевелухи В. С., М.: Высш. школа, 1998. 416 с.
9.
Кузьмина Н. А.
Основы биотехнологии / Учебное пособие для студентов
биологического факультета: Издание Омского педагогического университета, 2005.
б) дополнительная литература:
1. Артамонов В.И. Сельские профессии биотехнологии. М.: Изд-во МСХА, 1992. 127 с.
2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1. М. : Мир,
1994.
3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН, 1993.
241 с.
25
4. Блинов А.Г. Бесклеточные белоксинтезирующие системы. // Методы молекулярной
генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990. С. 80 - 86.
5. Борнман Х. Реконструкция клеток растений: Brassica в качестве объекта изучения. //
Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. С. 85 95.
6. Бутенко Р. Г. Изолированные протопласты растений - объект и модель для
физиологических исследований. // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С. 69 84.
7. Бутенко Р. Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ
растительного происхождения. // Культура клеток растений и биотехнология. М.:
Наука, 1986. С. 3 - 20.
8. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.
М.: Наука,1964. 272 с.
9. Высоцкий В. А. Клональное микроразмножение растений. // Культура клеток
растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 91 - 102.
10. Глеба Ю. Ю. Гибридизация соматических клеток растений. // Культура клеток
растений. М.: Наука, 1981. С. 85 - 91.
11. Глеба Ю. Ю., Зубко М.К. Теоретические и прикладные аспекты клеточной
инженерии растений // Биотехнология. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР.
М., 1988. Т. 9. С. 3 - 72.
12. Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Слияние протопластов и генетическое конструирование
высших растений. Киев: Наук. думка, 1982. 104с.
13. Дмитриева Н. Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре
клеток и тканей растений. // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С.113-123.
14. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры ткани в
физиологии и биохимии растений. Киев: Науковадумка, 1980. 488 с.
15. Катаева Н. В., Аветисов В. А. Клональное размножение в культуре ткани. // Культура
клеток растений. М.: Наука, 1981. С.137-149.
16. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука,
1983. 96 с.
17. Корженевская Т. Г., Бутенко Р.Г., Гусев М.В. Ассоциации цианобактерий с
культивируемыми клетками и тканями высших растений. // Культура клеток
растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 225 - 242.
26
18. Кучко А. А. Гибридизация соматических клеток растений методом слияния
изолированных протопластов. // Культура клеток растений и биотехнология. М.:
Наука, 1986. С. 144 - 159.
19. Мамаева С.
Е.
Хромосомный
анализ
культивируемых клеток.
//
Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 78 98.
20. Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата:
Наука, 1988. 168 с.
21. Новак Ф. Й. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значение в селекции
растений. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 171 - 195.
22. Носов А. М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений. //
Биология культивируемых клеток и биотехнология. М.: Наука, 1991. С. 5 - 19.
23. Попов А. С. Криоконсервация клеток растений. // Методы культивирования клеток.
Л.: Наука, 1988. С. 70 - 77.
24. Родин А. Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной
инженерии для получения посадочного материала древесных пород. Учебное
пособие. М.: МГУЛ, 1993. 90 с.
25. Смоленская И. Н., Носов А.В. Методы получения и культивирования протопластов. //
Методы культивирования клеток.Л.: Наука, 1988. С. 164 - 175.
26. Урманцева В. В. Культивирование каллусных тканей на твердых средах. // Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 232 - 241.
27. Цуцаева А. А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63 - 69.
28. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии. М.:
Агропромиздат, 1990. Т.2. 463 с.
29. Гринберг К. Н., Кухаренко В. И., Ляшко В. Н., Терехов С. М., Пичугина Е. М.,
Фрейдин М. И., Чериков В.Г. Культивирование фибробластов человека для
диагностики наследственных болезней. // Методы культивирования клеток. Л.:
Наука, 1988. С. 251 - 260.
30. Завертляев Б. П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого
скота. Л.: Агропромиздат, 1989. 255 с.
31. Какпаков В. Т. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных. // Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 241 - 250.
32. Конюхов Б. В. Долли – случайность или закономерность? // Человек. 1998. № 3
27
33. Крыжанов М. А., Залесских А. Ф., Троицкая М. В., Соловьев В. В., Тихомиров А. И.
Культивирование клеточной линии HEp-2 на микроносителях с целью получения
вируса полиомиелита. // Биотехнология и генетика. Н.Новгород, 1991. С. 87 – 92.
34. Прудовский И. А., Сухарев С.И. Гибридизация клеток животных. // Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 176 – 193
35. Рингертц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М.: Мир, 1979. 412 с.
36. Тартаковский
А.
Д.
Питательные
среды
для
культивирования
клеток
млекопитающих. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 44 - 63.
37. Фридлянская И. И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194 - 205.
38. Цуцаева А. А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63 - 69.
в) программное обеспечение и Интернет-ресурсы
1.
Иллюстративные материалы - схемы, плакаты по основным разделам программы.
2.
Презентационные материалы по курсу: Клеточная инженерия.
3.
http://www.biotechnolog.ru; http://www.molbiol.ru
5. Материально-техническое обеспечение дисциплины (модуля)
При проведении дисциплины «Клеточная инженерия» учащиеся обеспечены всей
необходимой материально-технической базой:
1. Лекционной аудиторией с мультимедийным презентационным оборудованием для
демонстрации презентаций и иллюстративного материала.
2. Аудиторией для семинарских занятий с мультимедийным презентационным
оборудованием для демонстрации презентаций и иллюстративного материала
28
Программа составлена в соответствии с требованиями ФГОС ВПО с учетом
рекомендаций и ПрООП ВПО по направлению подготовки БИОЛОГИЯ
Автор: к.б.н, ст. преп. Вечканов Евгений Михайлович
Рецензент: д.б.н., проф. Бондаренко Т. И.
Программа утверждена на заседании Учѐного совета биолого-почвенного факультета
от 21 января 2011 года, протокол № 5.
29
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Календарно-тематический план
Дисциплина биоорганическая химия
Курс магистратура семестр А
Общая трудоемкость (кредиты/ часы) 3/108
Аудиторная общая работа (часы) 27, в т.ч. лекции 9, практические занятия 18
Самостоятельная работа (часы) 27
Аудиторная индивидуальная работа (контактные часы) 17
1.1
1.2
1.3
2.1
2.2
2.3
3.1
Раздел дисциплины
Неделя семестра
№
Семестр
Неделя
Аудиторная работа и самостоятельная работа
Виды учебной работы,
включая самостоятельную
работу студентов и
трудоемкость (в часах)
Аудиторная
Всего
часов
(трудоемкость)
Лекц
КУЛЬТУРЫ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Введение в клеточную инженерию.
Цели, задачи, объекты клеточной
инженерии. Оборудование,
А 1
2
1
питательные среды, основные методы
культивирования.
Биология клеток
А 1
2
Коллоквиум: Общие положения
клеточной инженерии. Применяемое
оборудование. Цели, задачи, объекты
клеточной инженерии. Оборудование,
питательные среды.
Культивирование животных клеток.
История культивирования животных
клеток. Введение клеток в культуру, их
происхождение.
Характеристика клеток,
культивируемых in vitro. Питательные
среды и условия культивирования
Коллоквиум: Системы культивирования
клеток. Культура клеток человека.
Культивирование клеток и тканей
беспозвоночных.
Системы культивирования клеток.
Культура клеток человека.
Культивирование клеток и тканей
беспозвоночных. Культивирование
органов.
Формы
текущего
контроля
успеваемости
(по неделям
семестра)
Форма
промежуточной
аттестации (по
семестрам)
Лаб.
раб/
Пр
СРС
-
1
---
1
1
УО-1 –
собеседование
2
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
А 3
2
1
-
1
---
А 3
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
4
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
А 5
2
1
-
1
---
30
3.2
Культивирование органов.
Гибридизация животных клеток.
История метода. Метод создания химер.
Механизм слияния клеток.
3.3
Коллоквиум: Моноклональные
антитела. Получение моноклональных
антител. Применение моноклональных
антител.
4.1
4.2
4.3
5.1
5.2
5.3
6.1
6.2
6.3
7.1
7.2
Гибридизация животных клеток.
История метода. Метод создания химер.
Механизм слияния клеток.
Моноклональные антитела. Получение
моноклональных антител. Применение
моноклональных антител.
Коллоквиум: Трансплантация
эмбрионов. Экстракорпоральное
оплодотворение. Клеточная инженерия
в животноводстве.
Трансплантация эмбрионов.
Экстракорпоральное оплодотворение.
Клеточная инженерия в
животноводстве.
Клонирование животных. История
клонирования. Методы клонирования.
Перспективы клонирования.
Коллоквиум: Клонирование животных.
История клонирования. Методы
клонирования. Перспективы
клонирования.
А 5
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
6
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
А 7
2
1
-
1
---
А 7
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
А 8
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
А 9
2
1
-
1
---
А 9
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
А 10
2
-
1
1
ПР-1 –
письменный тест
1
---
1
УО-1 –
собеседование
1
УО-2 –
коллоквиум
КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Культуры растительных клеток.
История культивирования
А 11
2
1
растительных клеток. Использование
растительных культур.
Каллусные ткани. Суспензионные
культуры. Культуры отдельных клеток.
Культуры гаплоидных клеток.
А 11
2
1
Иммобилизованные растительные
клеточные культуры.
Коллоквиум: Культуры растительных
клеток. История культивирования
растительных клеток. Использование
растительных культур. Каллусные
А 12
2
1
ткани. Суспензионные культуры.
Культуры отдельных клеток. Культуры
гаплоидных клеток. Иммобилизованные
растительные клеточные культуры.
Протопласты растительных клеток.
Способы получения, культивирования,
применения. Слияние протопластов.
Конструирование растительных клеток.
Клеточная селекция.
Клональное микроразмножение
А 13
2
1
-
1
---
А 13
2
-
1
1
УО-1 –
31
растений. Этапы и методы клонального
размножения. Преимущества и
недостатки метода. Ассоциации
клеточных культур.
Коллоквиум: Протопласты
растительных клеток. Способы
получения, культивирования,
применения. Слияние протопластов.
Конструирование растительных клеток.
собеседование
А 14
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
8.1
Клеточная селекция. Клональное
микроразмножение растений. Этапы и
методы клонального размножения.
Преимущества и недостатки метода.
Ассоциации клеточных культур.
А 15
2
1
-
1
---
8.2
Растительные клеточные технологии в
фармакологии
А 15
2
-
1
1
УО-1 –
собеседование
8.3
Коллоквиум: Клеточная селекция.
Клональное микроразмножение
растений. Этапы и методы клонального
размножения. Преимущества и
недостатки метода. Ассоциации
клеточных культур.
А 16
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
9.1
Криоконсервация животных и
растительных клеточных культур.
Криопротекторы. Принципы
размораживания клеточных культур.
Основные принципы криобиологии.
А 17
2
1
-
1
---
9.2
Коллоквиум: Криоконсервация
животных и растительных клеточных
культур. Криопротекторы. Принципы
размораживания клеточных культур.
Основные принципы криобиологии.
А 17
2
-
1
1
УО-2 –
коллоквиум
9.3
Зачѐтное итоговое занятие
7.3
Итого
А 18
27
Контактные часы
1.2
Биология клеток
1.3
Коллоквиум: Общие положения клеточной
инженерии. Применяемое оборудование. Цели,
задачи, объекты клеточной инженерии.
Оборудование, питательные среды.
2.2
2.3
3.2
2
Характеристика клеток, культивируемых in vitro.
Питательные среды и условия культивирования
Коллоквиум: Системы культивирования клеток.
Культура клеток человека. Культивирование
клеток и тканей беспозвоночных.
Культивирование органов. Гибридизация
животных клеток. История метода. Метод
создания химер. Механизм слияния клеток.
А
А
А
-
1
1
9
18
27
ПР-1 –
письменный тест
УО-3 – устный
зачѐт
1
1
УО-1 –
собеседование
2
1
УО-1 –
собеседование
3
1
УО-1 –
собеседование
4
1
УО-1 –
собеседование
5
1
УО-1 –
собеседование
32
3.3
4.2
4.3
Коллоквиум: Моноклональные антитела.
Получение моноклональных антител. Применение
моноклональных антител.
Моноклональные антитела. Получение
моноклональных антител. Применение
моноклональных антител.
Коллоквиум: Трансплантация эмбрионов.
Экстракорпоральное оплодотворение. Клеточная
инженерия в животноводстве.
6
1
УО-1 –
собеседование
А
7
1
УО-1 –
собеседование
А
8
1
УО-1 –
собеседование
5.2
Клонирование животных. История клонирования.
Методы клонирования. Перспективы
клонирования.
А
9
1
УО-1 –
собеседование
5.3
Коллоквиум: Клонирование животных. История
клонирования. Методы клонирования.
Перспективы клонирования.
А
10
1
УО-1 –
собеседование
А
11
1
УО-1 –
собеседование
А
12
1
УО-1 –
собеседование
А
13
1
УО-1 –
собеседование
А
14
1
УО-1 –
собеседование
6.2
6.3
7.2
7.3
Каллусные ткани. Суспензионные культуры.
Культуры отдельных клеток. Культуры
гаплоидных клеток. Иммобилизованные
растительные клеточные культуры.
Коллоквиум: Культуры растительных клеток.
История культивирования растительных клеток.
Использование растительных культур. Каллусные
ткани. Суспензионные культуры. Культуры
отдельных клеток. Культуры гаплоидных клеток.
Иммобилизованные растительные клеточные
культуры.
Клональное микроразмножение растений. Этапы
и методы клонального размножения.
Преимущества и недостатки метода. Ассоциации
клеточных культур.
Коллоквиум: Протопласты растительных клеток.
Способы получения, культивирования,
применения. Слияние протопластов.
Конструирование растительных клеток.
8.2
Растительные клеточные технологии в
фармакологии
А
15
1
УО-1 –
собеседование
8.3
Коллоквиум: Клеточная селекция. Клональное
микроразмножение растений. Этапы и методы
клонального размножения. Преимущества и
недостатки метода. Ассоциации клеточных
культур.
А
16
1
УО-1 –
собеседование
9.2
Коллоквиум: Криоконсервация животных и
растительных клеточных культур.
Криопротекторы. Принципы размораживания
клеточных культур. Основные принципы
криобиологии.
А
17
1
УО-1 –
собеседование
33