теоретические основы фармацевтических и пищевых

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е. АЛЕКСЕЕВА»
Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ И
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
ЧАСТЬ 3
Методические указания к практическим занятиям
по дисциплине «Теоретические основы фармацевтических и пищевых
производств» для студентов, обучающихся по направлению
19.04.01 «Биотехнология» дневной формы обучения
Нижний Новгород 2015
1
Составители: Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, А.А. Калинина, В.Р. Карташов
УДК 541.1
Теоретические основы фармацевтических и пищевых производств
Ч.3: метод. указания к практ. занятиям по дисциплине «Теоретические основы фармацевтических и пищевых производств» для студентов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» дневной формы обучения/
НГТУ; сост.: Т.Н. Соколова и др., Н. Новгород, 2015. –16 с.
Методические указания предназначены для подготовки к практическим и семинарским занятиям по дисциплине «Теоретические основы фармацевтических и пищевых производств».
Методические указания предназначены для самостоятельной и аудиторной работы студентов.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать 10.03.2013. Формат 60 841/16. Бумага газетная.
Печать офсетная. Усл. п. л. 0,5. Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2015
2
Практическое занятие № 1 − 3
Количество часов: 9
Культивирование животных клеток
I. Вопросы к семинару:
1. История культивирования животных клеток.
2. Введение клеток в культуру, их происхождение.
3. Характеристика клеток, культивируемых in vitro.
4. Питательные среды и условия культивирования.
5. Системы культивирования клеток.
6. Культура клеток человека.
7. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных.
8. Культивирование органов.
II. Контрольные вопросы по материалу практических занятий № 1 − 3:
1. Исторические этапы клеточной инженерии по культивированию животных
клеток.
2. Догма применимости диплоидных клеток для получения продуктов для
человека.
3. Два направления культивирования животных клеток: культура клеток и
культура органов и тканей (органные культуры).
4. Особенности культуры животных клеток: отсутствие структурной организации и гистиотипической структуры, наличие специальных требований к условиям культивирования
5. Гетерогенность клеточной популяции, наличие стволовых клеток и клетокпредшественниц.
6. Корреляция между специализацией клеток и выживаемостью клеток.
7. Характеристика первичных культур.
8. Пассивирование – как процесс продления жизни культуры клеток.
9. Трансформация в постоянную клеточную линию.
10. Морфологические изменения в клетках при возникновении постоянной
клеточной культуры.
11. Скорость деления клеток.
12. Поверхностные рецепторы мембраны клеток и их участие в адгезивных
контактах.
13. Электронноплотные бляшки гликопротеиновых комплексов.
14. Механизм перемещения клеток.
15. Феномен контактного ингибирования.
3
16. Торможение пролиферации клеток, зависимое от плотности клеток.
17. Факторы роста клеток.
18. Трансформация клеток. Необратимость трансформации. Изменение
транспорта питательных веществ через клеточную мембрану при трансформации.
19. Условия существования трансформированных клеток.
20. Условия обеспечения клеток in vitro внешними условиями, которые клетки имели in vivo.
21. Требования к жидкой и твердой питательной среде, и газовой фазе.
22. Стандартные среды для ведения культур животных клеток.
23. Преимущества и недостатки использования сыворотки. Цитотоксичность
сыворотки, полиамиоксидаза сыворотки.
24. Субстрат для клеточных культур. Различные материалы для подложки:
пирекс, полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон.
25. Системы культивирования клеток. Непроточная культура. Проточная
культура.
26. Монослойные культуры. Суспезионные культуры.
27. Культуры фибробластов человека.
28. Среды для культивирования клеток и тканей насекомых.
29. Причины интереса к клеточным культурам беспозвоносных.
30. Источники получения культур клеток беспозвоночных.
31. Особенности органной культуры.
32. Работы Лѐба о культивировании органной культуры.
33. Особенности субстратов для культивирования органной культуры.
34. Метод часовых стекол по Феллу и Робинсону.
35. Метод часовых стекол с агаровым сгустком по Вольффу и Хафену.
36. Выращивание органной культуры на плотиках по Чену.
37. Модифицированный метод Троувелла.
38. Метод поочередного культивирования в жидкой и газовой среде.
4
Практическое занятие № 4
Количество часов: 3
Гибридизация животных клеток
I. Вопросы к семинару:
1. История метода и методы создания химер.
2. Механизм слияния клеток.
II. Контрольные вопросы по материалу практического занятия № 4:
1. Представления Шлейдена и Вирхова о зарождении новых клеток.
2. Открытие гетерокаионов.
3. Аллофеные (химерные) организмы.
4. Методы получения аллофенных (химерных) организмов: агрегационный
метод Тарковского и Минца, инъекционный метод Гарднера.
5. Первые межвидовые химеры.
6. Сельскохозяйственные химерные животные.
7. Механизм слияния клеток.
8. Вещества-индукторы слияния клеток: Ca2+, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай.
9. Характеристики веществ-индукторов.
10. Цитотоксичность лизолецитина.
11. Преимущества и недостатки вируса Сендай, как сливающего агента.
12. Слияние клеток и его этапы.
13. Агглютинация клеток. Полиэтиленгликоль как агглютинирующий агент.
14. Гипотезы механизма действия полиэтиленгликоля.
15. Гипотеза образования мостиков между ПЭГ и отрицательно заряженными
углеводами, находящимися на клеточной поверхности.
16. Усиление агглютинирующей активности в присутствии ионов двухвалентных металлов.
17. Дегидратационная гипотеза слияния протопластов.
18. Агглютинирующая активность лектинов и антител. Роль гликопротеинов
в агрегации клеток.
19. Этапы слияния клеток по Н. Рингертцу, Р. Сэвиджу: - 1-й этап, сближение цитоплазматических мембран; 2-й этап, выход гликопротеидов и обнажение
липидных слоев мембраны; 3-й этап, образование мицелл; 4-й этап, слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков.
5
Практическое занятие № 5 – 6
Количество часов: 6
Моноклональные антитела
I. Вопросы к семинару:
1. Функциональная структура антител.
2. Лимфоциты – источники антител.
3. Иммуноглобулины.
4. Понятие антигена. Антигенная детерминанта.
5. Образование иммунных комплексов и преципитация.
6. Агглютинация.
7. Образование антител. Иммунный ответ.
8. Этапы получения антител.
9. Трудности очищения полученных фракций антител.
10. Опыты Георга Кѐлера и Цезаря Мильштейна.
11. Методика получения гибридом.
12. Отбор гибридом.
13. Методы анализа на основе моноклональных антител.
14. Иммунофлуоресцентный метод Кунса.
15. Иммуноферментный анализ.
16. Применение моноклональных антител.
II. Найти и дать объяснение следующим терминам: антитела, антигены,
лимфоциты, иммуноглобулины, антигенная детерминанта, преципитация, агглютинация, иммунный ответ, иммунизация, специфичность антител, гибридом, асцидные опухоли, моноклональные антитела, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноферментный анализ.
6
Практическое занятие № 7 – 8
Количество часов: 6
Клонирование животных
I. Вопросы к семинару:
1. Клонирование животных.
2. Методы трансплантации ядер.
3. Клонирование млекопитающих.
4. Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных.
II. Контрольные вопросы по материалу практических занятий № 6 - 7:
1. Дифференцировка клеток и репрессия генома.
2. Закономерность связи специализации клетки и еѐ тотипотентности.
3. Первая трансплантация ядер соматических клеток зародышей в энуклеированные клетки лягушки Р. Бриггса и Т. Кинга.
4. Тотипотентность ядра в стадии поздней бластулы и ранней гаструлы.
5. Исследования Дж. Гордона на рыбах и дрозофилах.
6. Ядра клеток тканей, обеспечивающих развитие X. laevis до стадии головастика.
7. Опыты Ди Берардино и Хофнер при трансплантации ядра неделящихся
и полностью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana
pipiens.
8. Факторы, восстанавливающие тотипотентность ядер дифференцированных
соматических клеток.
9. Технология клонирования костных рыб, разработанная учеными Л.А.
Слепцовой, Н.В. Дабагян и К.Г.Газарян.
10. Пересадки ядер млекопитающих.
11. Основные трудности при работе с ядрами млекопитающих.
12. Эксперименты Дж. Мак Грата и Д. Солтера по клонированию эмбрионов мышей.
13. Время активации первых групп генов у эмбрионов разных видов животных.
14. Микропипеточный метод трансплантации ядер Б.В. Конюхова и Е.С.
Платонова.
15. Трансплантация ядер с участием цитохалазинов. Цитохалазин В.
16. Цитопласты и кариопласты. Отделение цитопластов от интактных клеток
в градиенте плотности.
7
18. Первое удачное клонирование эмбрионов кролика в 1988 году С. Стиком
и Дж. Роблом.
19. Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных животных С. Уилладсина.
20. Пересадка ядер крупного рогатого скота Дж. Роблом.
21. Методика пересадки. Опыты Бондиоли с соавторами. Использование в
качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров.
22. Длительная тотипотентность клеток эмбрионов крупного рогатого скота.
23. Регулирование воспроизводства сельскохозяйственных животных.
24. Основные методы регулирования воспроизводства: стимуляция и синхронизация охоты, суперовуляция, искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов, хранение гамет и эмбрионов, целенаправленное получение двоен, регулирование пола, раннюю диагностику беременности, управление процессом родов, создание химер.
8
Практическое занятие № 9 – 11
Количество часов: 9
Культуры клеток высших растений
I. Вопросы к семинару:
1. История культивирования растительных клеток.
2. Использование культур растительных клеток.
3. Культуры соматических клеток.
4. Морфофизиологическая характеристика каллусных клеток.
5. Суспензионные культуры.
6. Культивирование отдельных клеток.
7. Культуры гаплоидных клеток.
II. Найти и дать объяснение следующим терминам: клональное микроразмножение растений, постгамная несовместимость, антерные культуры, криоконсервация, соматическая гибридизация, иммобилизация растительных клеток, тотипотентность, каллус, ауксины, дедифференцировка тканей экспланта, фитогормоны, индолилуксусная кислота, тератома, геммогенез, ризогенез, детерминация
клетки, суспензионная культура, морфологическая выровненность клеток, псевдогамия, эмбриоид, партеногенез, апогамия, каллусогенез.
9
Практическое занятие № 12 – 13
Количество часов: 6
Культура тканей растения как источник вторичных метаболитов
I. Вопросы к семинару:
1. Иммобилизованные клеточные культуры растений.
2. Системы культивирования иммобилизованных клеток.
II. Контрольные вопросы по материалу практических занятий № 12 - 13:
1. Культура растительных тканей – источник вторичных метаболитов.
2. Первая удачная попытка иммобилизации клеток растений Мосбаха.
3. Методы иммобилизации клеток: иммобилизация клеток или субклеточных
органелл в инертном субстрате, адсорбция клеток на инертном субстрате, адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул, ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ.
4. Преимущества иммобилизованных клеток.
5. Медленный рост биомассы при использовании иммобилизованных клеток.
6. Механизмы связи между ростом и метаболизмом.
7. Химические контакты при тесном физическом контакте.
8. Генетический и эпигенетический уровни контроля вторичного метаболизма.
9. Внешние факторы, влияющие на метаболизм: концентрация кислорода, углекислого газа, уровень освещения.
10. Химический состав окружающей среды.
11. Выделение идиолитов из окружающей среды культур клеток.
12. Два типа систем культивирования иммобилизованных клеток: система
культуры с плоской основой, клетки выращиваются в горизонтально расположенном сосуде; система колоночной культуры, где клетки выращиваются в вертикальном сосуде.
13. Колоночные культуры.
10
Практическое занятие № 14 – 15
Количество часов: 6
Протопласты растительных клеток
I. Вопросы к семинару:
1. Применение протопластов.
2. Способы получения протопластов.
3. Способы слияния протопластов.
II. Контрольные вопросы по материалу практических занятий № 14 - 15:
1. Протопласты как уникальная модель для изучения фундаментальных физиологических проблем у растений.
2. Основные направления физиологических исследований с использованием
культуры изолированных протопластов.
3. Изучение химии и структуры клеточной стенки.
4. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.
5. «Мягкое» выделение органелл.
6. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии
протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной
гибридной клетке, изучение соматических гибридов.
7. Введение чужих органелл.
8. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).
9. История выделения протопластов Дж. Клеркером.
10. Механический способ получения протопластов.
11. Ограничения метода: невысокая производительность, можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, трудоемкость и длительность.
12. Энзиматический способ выделения протопластов методом Коккинга.
13. Преимущества энзиматического метода: одновременно выделяется большое количество протопластов, клетки не подвергаются сильному осмотическому
стрессу, клетки не повреждаются, метод сравнительно быстрый.
14. Ферменты, удаляющие клеточную стенку: целлюлазы, гемицеллюлазы и
пектиназы.
15. Этапы выделения протопластов: обработка ферментами, выделение протопластов из клеточных стенок, отделение интактных протопластов от клеточных
осколков.
16. Метод флотации Гамборга.
17. Способы культивирования протопластов: метод жидких капель и метод
платирования.
11
18. Парасексуальная гибридизация. Преимущества парасексуальной гибридизации: скрещивание филогенетически отдаленных видов растений; получение
асимметричных гибридов; слияние трех и более клеток; получение гибридов,
представляющих сумму генотипов родителей; перевод мутаций в гетерозиготное
состояние; получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам.
19. Спонтанное и индуцированное слияние протопластов.
20. Методы слияния протопластов: физический способ Циммермана, методика "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+".
21. Судьба ядерного и цитоплазматического геномов слившихся протопластов.
22. Гибриды, цибриды, ассимметричные гибриды. Растения регенеранты.
12
Практическое занятие № 16 - 18
Количество часов: 9
Конструирование растительных клеток
I. Вопросы к семинару:
1. Конструирование растительных клеток.
2. Клеточная селекция.
3. Клональное микроразмножение растений.
4. Ассоциация клеточной культуры высшего растения с микроорганизмами.
5. Криокгнсервация клеточных культур.
II. Контрольные вопросы по материалу практических занятий № 16 - 18:
1. Протопласты как реципиенты клеточных органелл.
2. Введение ядра и клеточных органелл в протопласт.
3. Метод сэндвича.
4. Липосомный и микроинъекционный методы.
5. Методы клеточной селекции.
6. Оплодотворение in vitro.
7. Способы оплодотворения in vitro.
8. Плацентарное оплодотворение.
9. Эмбриокультура.
10. Сомаклональная вариабельность.
11. Полиморфизм культивируемых клеток.
12. Физиологическая гетерогенность клеточных культур.
13. Асинхронность растительной клеточной культуры.
14. Генетическая, эпигенетическая и модификационная изменчивость – как
факторы культуральной гетерогенности клеток.
15. Причины генетической изменчивости.
16. Химические и физические мутагены – как факторы селекционного процесса.
17. Спонтанный и индуцированный мутагенез.
18. Селективные агенты.
19. Приемы клеточной селекции: позитивная селекция, негативная селекция,
тотальная селекция, визуальная селекция и неселективный отбор.
20. Виды культур, используемых в клеточной селекции.
21. Недостатки и преимущества клеточной селекции. Схема получения мутантных форм путем клеточной селекции по В. И. Артамонову.
13
22. Способы размножения растений. Недостатки семенного размножения.
23. Сущность микроклонального размножения. Преимущества микроклонального способа размножения: получение генетически однородного посадочного
материала; освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; высокий коэффициент размножения; сокращение продолжительности селекционного процесса; ускорение перехода растений от ювенильной к
репродуктивной фазе развития; размножение растений, трудно размножаемых
традиционными способами; возможность проведения работ в течение всего года; возможность автоматизации процесса выращивания.
24. Основоположник клонального размножения – Жан Морель.
25. Исследования по микроклональному размножению Бутенко.
26. Первые работы по культуре тканей древесных растений – Готре.
27. Трудности микроклонального размножения хвойных растений.
28. Факторы, влияющие на клональное размножение.
29. Влияние длительности культивирования на эффективность клонального
размножения.
30. Эффективность стерилизации культуры.
31. Этапы микроклонального размножения. Выбор растения-донора. Изолирование эксплантов.
32. Получение стерильной культуры. Собственно микроразмножение.
33. Ускоренное размножение побегов. Выращивание растений в условиях
теплицы.
34. Особенности питательных сред, применяемых на каждом из этапов клонирования.
35. Методы клонального размножения по Мурасиге, по Бутенко.
36. Снятие апикального доминирования.
37. Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями
экспланта.
38. Соматический эмбриогенез.
39. Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
40. Исключение вирусов из посадочного материала. Термо -и химиотерапия,
как методы освобождения клеток растения от вирусов.
41. Понятие искусственной ассоциации клеточной культуры растения с микроорганизмом.
42. Эндо и экзосимбиотические ассоциации.
14
43. Цели создания ассоциаций: реконструкция эволюционного процесса симбиогенеза, природные модели симбиотических отношений, изменение продуктивности растительных клеток - продуцентов, растения-регенеранты.
44. Азотфиксирующие симбионты.
45. Методы получения симбионтов.
46. Метод инокуляции азотфиксирующими микроорганизмами.
47. Методы генной инженерии. Введение целых азотфиксирующих организмов в растения.
48. Ассоциации с клубеньковыми бактериями. Ассоциации со свободноживущими азотфиксаторами.
49. Ассоциации с зелеными водорослями. Ассоциации с грибами. Ассоциации с цианобактериями.
50. Криоконсервация клеточных культур.
15
СПИСОК РЕКОМЕНДОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература
1. Фрешни Р. Я. Культура животных клеток: практическое руководство / пер.
5-го англ. Изд.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. - 691 с.: ил., [24] с. цв.
вкл.
2. Бутенко Р.Г. и др. Клеточная инженерия. - М.: Высшая школа, 1987.
3. Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж.Б. и др. Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989. Т. 1, 2.
4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с
англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002. - 589с.
Дополнительная литература
5. Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.
6. Родин А. Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной инженерии для получения посадочного материала древесных пород. Учебное
пособие. М.: МГУЛ, 1993. 90 с.
7. Сингер, М. Гены и геномы. (В 2-х т.): Пер. с англ.Т. 1. / М.Сингер, П.Берг.
- М.: Мир, 1998. - 373 с.
8. Кларк Д., Рассел Л. Молекулярная биология. – М.: ЗАО «Компания
КОНД», 2004. – 472 с.
16