НОВЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
им. академиков М.М. Ш Е М Я К И Н А и Ю.А. О В Ч И Н Н И К О В А
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах
рукописи
Оккельман Ирина Александровна
03.01.03 - Молекулярная биология
НОВЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ
АКТИВНОСТИ
ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
°05533127
1 9 C£HZU1J
Москва-2013
Работа выполнена в Группе кросс-сшивающих ферментов Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Институт биоорганической хим1Ш им. академиков М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Научный руководитель:
кандидат химических наук
Пестов Николай Борисович
Официальные оппоненты;
доктор биологических наук
Бабаков Алексей Владимирович
кандидат химических наук
Пахомов Алексей Александрович
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Защита состоится « 3 » октября 2013 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета
Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской
акадешп! наук по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
I
^
С текстом диссертати! можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждении науки Инстшут биоорганической химии им. академиков М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Автореферат разослан
сентября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор физ.-мат. наук
Олейников В. А.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Взаимодействия белков лежат в основе выполняемых ими
функций. Совокупность всех биологически значимых белковых взаимодействий в рамках
целого протеома носит название интерактом. На сегодняшний день все больше внимания
уделяется исследованиям как глобальных интерактомов различных организмов, так и
интерактомов отдельных белков. Составление карт взаимодействий между биомолекулами
(например, белками) позволяет систематизировать и расставить отдельные фрагменты
гигантской «интерактомноп мозаики» на свои места и прогнозировать возможные пути
функционирования
и регуляции
биологических
процессов. Использование
подобного
подхода имеет ценность не только для фундаментальных биологических исследований, но и
важно для разработки новых подходов в медицине. В наши дни для решения этой задачи
используют высокопоточные методы анализа взаимодействий биомолекул в клетках и
организмах. Однако, именно в силу гигантского объема информации, получаемой с
помощью высокопоточных поисковых методов, их применение порождает массу «ошибок» и
«пробелов» в составляемых интерактомных схемах. Поэтому ннтерактомные исследования,
осуществляемые небольшими коллективами, обычно посвященные отдельному объекту,
часто дают более достоверные результаты о молекулярных взаимодействиях н их роли в
функционировании организмов.
Наиболее ярким примером приложения интерактомного подхода являются исследования
этиологии
онкологических
заболеваний.
В
настоящее
время
считается,
что
канцерогенез - это сложный, многоэтапный процесс, одним из движущих факторов которого
является взаимодействие опухоли и ее окружения, а также изменение характеристик
клеточных интерактомов. Особый интерес в этом плане представляют собой белки,
непосредственно вовлеченные в процессы метастазирования и прогрессии опухоли, в
частности,
семейство
представители
лнзилоксндаз
семейства
аминокислотной
(ЬОХ,
лнзилоксндаз
последовательности
ЬОХЫ,
Ь0ХЬ2,
характеризуются
каталитического
ШХЬЗ,
высокой
домена
и
Ь0ХЬ4).
Все
консервативностью
проявляют
схожую
субстратную специфичность. Эти белки секретируются различными типами клеток во
внеклеточное
пространство, где они участвуют в посттрансляционной
модификации
коллагена и эластина, формируя тем самым структуру внеклеточного матрикса. В то же
время ряд представ1ггелей семейства лизплоксидаз (ЬОХ и Ш Х Ы ) найдены в ядрах клеток,
где они участвуют в регуляции экспрессии генов, например, гена кадгерина Е, репрессия
которого приводит к изменению клетками фенотипа с эпителиального на мезенхимальный,
характеризующийся
большей
мш-рационной
активностью.
Несмотря
на
успешность
функциональных
исследований, остаются
непонятыми
молекулярные
механизмы
этих
процессов и конкретная роль лизилоксидаз в них. Поэтому составление ннтерактомной
карты белковых взаимодействии с участием лизилоксидаз позволшо бы проанализировать
возможные механизмы работы этих белков, а также установить роль внеклеточной и
внутриклеточной функциональной активности лизилоксидаз в прогрессии опухолей.
Так как лизилоксидазы
непосредственно участвуют в метастатической
прогрессии
опухолей н являются потенциальной мишенью для терапии онкологических заболевании,
остро встает вопрос о возможности специфического воздействия на
ферментативную
активность этих ферментов in vivo. Необходимо отметить, что до сих пор не созданы
лекарственные препараты, ингнбирующие активность этих ферментов, пригодные для
применения
в медицинской
лизилоксидаз
обладают
практике.
высокой
Известные
токсичностью
на сегодняшний
и
день
неспецифичностью
ингабиторы
действия
по
отношению к лизмоксидазам и не пригодны для медицинских целен. В то же время полное
ннгабирование лизилоксидазной активности нежелательно, так как эти белки крайне
необходимы для нормального функщюнирования тканей. Поэтому наиболее перспективным
направлением
исследований
является
поиск
возможных
альтернативных
путей
регулирования / моделирования активности лизилоксидаз.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием
различных
поисковых
методов
(например,
«молекулярный
фишинг»,
двугибридный
дрожжевой скрининг) определен ряд новых, до этого момента неизвестных белков-партнеров
лизилоксидазы человека. Хотя подобные работы уже проводились рядом авторов [Fogelgren
et al, 2005; Polgar et al, 2007], до сих пор круг известных белков-партнеров лиз1Шоксидаз
очень узок и ограничен, в основном, данными о внеклеточных интеракторах этого белка.
Данное
исследование
не только выявило ряд новых потенциальных
внутриядерных
интеракторов лизилоксидазы человека, но и позволило выдвинуть гипотезу, объясняющую
механизм регуляции лизилоксидаза-зависимой репрессии гена кадгерина Е. По результатам
работы также была составлена карта фрагмента глобального интерактома с участием
лизилоксидаз.
В данной работе был осуществлен не только поиск новых интеракторов лизилоксидазы,
позволяющий предположить новые пути регуляции ее функциональной активности в
организме, но также предложен уникальньп"! метод модуляции каталитической активности
лизилоксидазы, основанный на применении изотопного эффекта. Этот метод может быть
использован
лизилоксидаз.
как
новый
инструмент
для
исследований
функциональной
активности
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлся поиск новых путей
регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека с помощью различных
подходов и методов. В связи с этим предполагалось решить следующие задачи:
1.
Получить продуценты рекомбинантной лизилоксидазы на основе различных систем
экспрессии белков и, по возможности, выделить каталитически активную лизилоксидазу.
2.
Охарактеризовать локализацию каталитического домена лизилоксидазы в различных
тканях, а также в культурах различных клеточных линий, в том числе в первичной культуре.
3.
С помощью дрожжевой двугибриднои системы произвести поиск белок-белковых
взаимодействий каталитического домена лизилоксидазы в организме человека.
4.
Подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой
двугибриднои
системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, колокализацнн в клетке и
других.
5.
Произвести поиск новых интеракторов лизилоксидазы методом
фишинга» с последующей идентификацией белков при помощи
«молекулярного
масс-спектрометрии.
Подтвердить детектированные взаимодействия независимыми методами.
6.
Измерть
изотопный
эффекг
сайт-специфичного
дейтерирования
субстратов лпз1шоксидазы и протестировать возможность регуляции
натпвных
лизилоксидазной
активности при помощи данного подхода.
7.
Исследовать
особенности
внутриклеточной
локализации
предполагаемого
онкосупрессора ТТС4.
Аппобация работы. Основные результаты работы были представлены на международных
конференциях
"Cancer Proteomics, 2009" (Дублин, Ирландия), "The 25"'
Anniversary
Symposium of the Protein Society" (Бостон, США, 2011) и "15"' Amine Oxidase Congress, AOC
2012" (Тулуза, Франция), a также на "Х-ых чтениях, посвященных памяти академика Юрия
Анатольевича Овчинникова", (Москва-Пущино, Россия, 2011), «Белки и пептиды» (Казань,
2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ -
2 статьи в
реферируемых научных журналах и 7 в сборниках тезисов.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 144 страницах
машинописного текста и состоит из введения, трех глав основной части (литературный
обзор, результаты и обсуждение, экспериментальная часть), выводов, приложения и списка
литературы, включающего 265 источников. Работа содержит 43 рисунка и 5 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1.
Изотопный эффект сайт-специфического дейтерирования лизина
на каталитическую активность лизилоксидазы
Разработка новых методов ннгнбнрования и регуляции активности лизилоксидазы от vivo
является очень важной для выяснения роли лизилоксидазы в различных физиологических
процессах и, возможно, средством для коррекции таких патологических процессов как
фиброз и метастатическая прогрессия опухолей. На сегодняшний день для интбирования
ферментативной активности LOX применяют агенты, способные связывать медь, антитела и
низкомолекулярные
ингабиторы,
такие
как
BAPN
и
его
производные.
Все
из
вышеперечисленных нншбиторов имеют серьезные недостатки. В то же время полное
ингибирование лизилоксидазной актганости может быть нежелательным, так как помимо
участия лизилоксидазы в образовании преметастатической ниши - «среды обитания» для
вновь
формирующихся
метастазов,
LOX
необходима
для
поддержания
правильной
структуры сосудов, кожи, костей, хрящевой ткани, а в молодом организме необходима для
правильного роста и закладки тканей. Поэтому наилучшим способом
корректировки
нежелательной активности лизилоксидазы является не ингибирование, а модуляция работы.
Такую возможность может дать применение кинетического изотопного эффекта (КИЭ).
Известно, что в некоторых случаях дейтерирование лекарственных препаратов может
улучшить их фармакодинамические свойства. Исходя из этих соображений, было решено
измерить кинетический изотопный эффект на активность лизилоксидазы с использованием
дейтерированных субстратов LOX.
В качестве дейтерированного субстрата LOX мы использовали 6,6-02-лизин и его
пептидные
производные, любезно синтезированные Шманаем В.В. и А.Л. Хурским
(Институт Физической Органической Химии Нащюнальной академии наук Республики
Беларусь). Использование производных лизина с заменой атомов водорода на дейтерий
только при шестом атоме углерода было неслучайным, так как замена атомов водорода в
других положениях может привести к нежелательным последствиям. Например, водородные
атомы при пятом атоме углерода вовлечены в процесс образования гидроксилизина в составе
коллагена в реакции, катализируемой лизилгидроксилазой. В то же время, отщепление
одного из атомов водорода в шестом положении является неотъемлемой стадией в реакции
окислительного дезаминирования.
Лизилоксидаза, использованная для этих исследований, была получена из аорты барана
путем экстракшш растворами мочевины, с последующей ионообменной хроматографией,
высаливанием сульфатом аммония и гель-фильтрацией. Так как для определения активности
лизилоксидаз необходимо проводить измерения с контрольными образцами в присутствии
4
специфического
ингибитора Ш Х
ВАРК, крайне важным
было получить
препарат
лизилоксидазы без загрязнения другими аминоксидазами (особенно 85АО, для которой
ВАРЫ является одновременно слабым субстратом и конкурентным ингибитором). Поэтому
полученный препарат лизилоксидазы перед использованием в эксперименте тестировали на
присутствие
активности
58АО
в
беренил-чувствнтельной
реакции
окисления
специфического субстрата 88АО - метиламина. Так как ЬОХ не чувствительна к действию
беренила, специфического ингибитора ЗЗАО, такой метод мониторинга на присутствие
55АО в препарате можно использовать на каждой из стадий выделения лизилоксидазы.
Таким образом, нам удалось получить препарат, обладающий лизилоксидазной активностью
и свободный от примесей 58АО. Присутствие в препарате лизилоксидазы было проверено
методом нммуноблотинга (рис. 1) с использованием моноклональных мышиных антител к
каталитическому домену лизилоксидазы (любезно предоставлены А.1. 01асс1а).
Рис. I. Иммуиоблотти рекомбинантной мышиной mLOX, полученной в E.coU (А) и LOX, выделенной ui
аорты барана (В). Рекомбинашпная mLOX выделена т клеток Е. coli (штачм SGI3009) и подвергнута
рефалдиигу для получения растворимого белка. Бечки препарата« LOX были разделены злектрофорезом в
11ЛА1'. перенесены на PVDF мембрану с последующим инкубированием с мышиными монокюначьными
антителами к LOX и визуапизацит'! при помощи хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена.
Электрофоретическая подвижность ниже теоретической в ачучае реко.мбинантной мышиной лизилоксидазы
объясняется присутствием N-кончевого пептида MRGSHHHHHHGS.
Для
мониторинга
окислительной
реакции,
катализируемой
лизилоксидазой,
мы
использовали флуорометрический анализ, основанный на измерении стехиометрического
образования Н2О2 в реакции окислительного дезаминирования субстратов LOX. Для
характеристики КИЭ необходимо и достаточно измерить эффект дентерирования на
максимальную скорость (V^ax) - "V, а также на отношение К„„дЖп, - °VK (последнее
соответствует
отношению
скоростей
окисления
нормального
и
дейтерированного
субстратов при бесконечно малой концентрации субстрата). Оказалось, что "VK для 6D2лизина равен 4.35±0.22 (п=4) при 37°С. Интересно, что гораздо меньшее влияние оказывается
на
для лизина это значение близко к I (1.34±0.3) (рис. 2А). Это означает, что при очень
больших концентрациях субстрата действие изотопного эффекта нивелируется. Такие
результаты
можно
объяснить
следующими
соображениями
относительно
механизма
ферментативной реакции: реакционный цикл LOX и других медь-зависимых аминоксидаз
подчиняется механизму типа «пинг-понг» и включает в себя стадию удаления атома
5
водорода, как одну из скорость-лимитирующих стадий. Вместе с этим существует другая
скорость-лимитирующая
стадия - окисление
хинонимина
молекулярным
кислородом.
Поэтому низкие показатели '^V свидетельствуют о сильном влиянии стадии окислительной
полуреакции на суммарную скорость реакции. Это также подтверждает тот факт, что при
постановке LOX-катализируемой реакции в условиях гипоксии (данные не приведены)
показатели °VK тоже приближаются к единице. При этом даже при низких концентрациях
субстрата фактором, определяющим скорость реакции, будет концентрация кислорода, и
изотопный эффект будет мал.
КИЭ может быть использован для уменьшения активности лизилоксидазы без полного ее
блокирования. Однако, чтобы действительно оценить практическое значение изотопного
эффекта, оказываемого на отношение величин V„„JK„ необходимо проводить эксперименты,
приближенные к условиям in vivo. Это может быть достигнуто использованием сайтспецифически
субстратов
дейтерированных
образование
и
белков
и
диссоциация
пептидов.
В случае
фермент-субстратного
высокомолекулярных
комплекса
может
в
значительной степени лимитировать реакцию и маскировать изотопный эффект. По этой
причине,
очень
важно
измерить
КИЭ
на
полипептидных
субстратах.
Уровень
аутокаталитического окисления у лизилоксидазы невысок, так как этот фермент содержит
низкий уровень аминокислотных остатков лизина в своей последовательности proLOX (так
всего 6 остатков Lys приходится на 417 аминокислотных остатков последовательности
proLOX человека). Учитывая эти факторы, мы получили типичный пептидный фрагмент
последовательности
коллагена,
содержащий
один
дейтерированный
остаток
лизина.
Скорость его окисления была измерена в диапазоне концентраций от 0.1 до 0,8 мМ и
показано, что "VK для этого 6,6-02-Ьуз-содержащего пептида равен 3.1 при 37°С (рис. 2В).
• .-IH'JHII
А 6D2-.-tHiHii
ООО 0 25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50
(S, 1иМ)-1
А
0.2S'
X 0.20.
ï
"л 0.1S3
s 0.10Б
0.050.00<>•"
5.0
7.5
10.0 12.5
(S, мМ)-!
В
Рис. 2. А. Иютопный эффект дейтерирования субстрата на окисление свободного лизина .чишлоксидаюй.
В. Изотопный эффект дейтерирования субстрата на окиачеиие Lys-содержащего пептида АсRGGGGEKGGGGG-NH2 лтилоксидаюй
из аорты барана. Квадратами обозначен немеченый литн,
треугольниками деИтерированный лизин (6,6-ü2-Lys) (значения трех повторных imiepemiíi). "УК определяли
по соотношению накчатв пряных завиашости, а "V ~ по соотношению пересечений с осью у. В случае
эксиериштпов с использование.^ лизинового субстрата четыре независимых препарата WX из аорты барана
дат следующие значения °VK=4.35±0.22 и °V~I.34í0.3
(среднее ± стандартное отклонение). Для Lysсодержащего пептида '^VK^S.l.
Таким образом, разработан новый способ регуляции лизилоксидазной
активности,
который может оказаться полезным для исследований роли окисления белковых субстратов
лизилокспдазой в экспериментах на животных и клеточных моделях. В то же время
перспективы применения его для медицинских целен сомнительны в виду чрезвычайно
высокой стоимости дейтер1фованного лизина.
2.
Исследование локализации эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных
линиях, тканях и первичной культуре фнбробластов
Аминокислотная
последовательность
полноразмерной
лизилоксидазы
(ppLOX)
представляет собой совокупность трех структурно-функциональных регнонов: сигнального
пептида, пропептидного домена (LOPP), и каталитического домена (mLOX), отделенного от
последовательности LOP? последовательностью сайта протеолитической деградации (DDR).
Обычно новосинтезированный
локализуется
на
белок секретируется во внеклеточное пространство
соединительнотканных
волокнах,
однако
некоторые
и
псследования
свидетельствуют о ядерной локализации этого белка в некоторых типах клеток, например, в
гладкомышечных клетках и фибробластах. Мы решили изучить, насколько
широко
распространена ядерная локализация LOX. Для этого мы проанализировали локализацию
лизилоксидазы в имеющихся в нашем распоряжении клеточных линиях и сравнили ее с
локализацией LOX в некоторых доступных для нас тканевых образцах. Мы наблюдали
преимущественно ядерную локализацию
и в меньшей
степени
цитоплазматическую
локализацию эндогенной лизилоксидазы во всех исследованных нами препаратах различных
клеточных линий (рис. 3). При этом эндогенный белок был локализован в ядрах в виде
точечных структур, вне области расположения ядрышек.
Так как современные клеточные культуры являются имморталнзованными клеточными
линиями,
претерпевшими
многократное
культивирование,
и
по
многим
характеристикам часто отличаются от нормальных (неишюрталнзованньк)
первичных
клеточных
культур,
мы
решили
также
проанализировать
своим
клеток и
локализацию
эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры и в некоторых доступных
тканевых препаратах человека. Для исследования поведения LOX в первичной культуре мы
использовали
фибробласты,
полученные
из
эмбриона
курицы
культивировали в течение нескольких недель и подвергали
(рис.
4).
Клетки
иммунощггохимическому
анализу с использованием антител к лизилоксндазе. Для первичной клеточной культуры
фнбробластов также была характерна ядерная локализация LOX в клетке в точечных
структурах. В то же время в этих клетках мы наблюдали более интенсивное, чем в случае
нмморталтпованной культуры фнбробластов мыши, окрашивание 1Н1тозоля, напоминающее
структуры секреторных везикул и, вероятно, связанное с повышенной продукцией и
секрецией
LOX.
Однако,
в
целом
локализация
лизилоксидазы
в
первичной
и
иммортализованных клеточных линиях была аналогичной, что позволяет использовать
иммортализованные клеточные культуры для исследования ядерной LOX.
Рис. 3. Анали! клеточной локаличации лизилоксида'Ш в ратичных линиях клеток: мышиных фибробластов
NIHST3, HeLa (adenoKapifiuioMa человека, эштелиапьиая
морфология), Л549 (к^точиоя
линия
немелкоклеточног'! кар11шюмы легкого человека), MCF-7 (кпеточная линия рака молочной железы человека,
эпителиальная морфология). Зеленая и красная флyopec^ieнгiuя соответствует лилиюксидазе, .меченной
антителами к эпшпону кататтшческого домена LOX, синяя флуоресцет{ия соответствует окраске ядер
клеток DAPI. Масштаб 10 мк.\1.
Рис. 4. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры эмбриона курицы.
Зеченая флуоресценция соответствует лизилоксидазе, меченной anniumeiaun к этшюпу каталитического
домена LOX, синяя флуоресценция соответствует окраске клеточных ядер DAPI. Масштаб Юмкм.
Однако мы не наблюдали ядерной локализации лизилоксидазы при анализе тканевых
образцов, даже в случае клеток с выраженной фибробластоподобной морфологией (как в
образцах соскоба эндометрия матки, взятого у пациентки с дисплазией эндометрия (рис. 5), в
сравнении с эндометрием здорового пациента (рис. 6). В тканях с хорошо выраженным
внеклеточным матриксом, как, например, в случае трахеи эмбриона курицы, мы наблюдали
исключительно внеклеточную локализацию лизилоксидазы вдоль соединительнотканных
волокон (рис. 7). Таким образом, в клеточной культуре in vitro мы наблюдали нехарактерную
для тканевых препаратов ядерную локализацию лизилоксидазы. Возможно, что ту или иную
локализацию LOX определяет не только природа клеток, но и структура внеклеточного
матрикса. Однако не исключено, что существуют и другие объяснения этого явления.
8
Рис. 5. Анализ локалтации эндогенной лтияоксидты в KJtemKox шдометрия матки при дисплаши
эндометрия.
окрашивания парафинового среза ткани использовали антитела к ката:штическо.му до.мену
LOX. На препарате видны клетки с характерной для фибробластов морфю.югиеи, в которых локализация
эпитопов лизилоксидазы соответствует ц11тот1аз.матическо.му ко.шарптенту тетки, а не ядерно.т.
Рис. 6. Анализ .локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках эндометрия .матки (норма). Два
увеличения. В препарате видны отдельные клетки округло!'! фор.мы с сег.ментированны.м ядро.м, в которых
локатзачия эндогенной лизилоксидазы соответствует читоплазматическому ко.мпарптенту. Масштаб 10
л/ки.
Рис. 7. Им.чунофлуоресцентный гистохи.»ический анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в
образцах трахеи э.чбриона курицы. Красная флуоресчеття соответствует распредечению лизичоксидазы
вдоль волокон внекчеточного матрикса. Синяя флуоресцеш1ия окраска DAPI ядер кчеток.
Мы
также
человека.
исследовали
Мазки
стандартной
локализацию
крови, ф и к с и р о в а н н ы е
методике
антителами
к
клеточной
в холодном
лизилоксидазы
в
препарате
крови
м е т а н о л е (-20''С), о к р а ш и в а л и
каталитическому
домену
лизилоксидазы
по
(чтобы
у б е д и т ь с я в с п е ц и ф и ч н о с т и антител, этот э к с п е р и м е н т б ы л в о с п р о и з в е д е н с н е с к о л ь к и м и
р а з л и ч н ы м и а н т и т е л а м и : к а к с к о м м е р ч е с к и м и , так и с п о л у ч е н н ы м и в н а ш е й л а б о р а т о р и и ) .
Результат представлен на рис. 8. П о л о ж и т е л ь н о е о к р а ш и в а н и е а н т и т е л а м и к L O X н а б л ю д а л и
т о л ь к о у т р о м б о ц и т о в (В) и с е г м е н т о я д е р н ы х л е й к о ц и т о в (А).
Рис. 8. Локализация лизилоксидазы в клетках крови человека. А - сегментоядерные лейкоциты, В тромбоциты, '.ieiencm флуореа/еиция соответствует локализации LOX, синяя флуоресценция -- окраска DAPI
ядер клеток. Масштаб Ю.мкм.
Отметим, что присутствие LOX в тромбоцитах нами показано впервые, в то же время
функция лизилоксидазы в тромбоцитах остается неясной.
3. Исследование интерактома лизилоксидазы
Для
интерактомных
методологических
исследований
подходов,
лизилоксидазы
позволивший
человека бьш
представить
наиболее
применен
полную
спектр
картину
взаимодействий лизилоксидазы. Мы не ограничились применением только одного способа
поиска белковых взаимодействий и подтвердили у некоторых интеракторов способность
взаимодействовать с каталитическим доменом лизилоксидазы с помощью альтернативных
методов.
3.1. Поиск белков интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга».
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа - новая субстратная мишень лизилоксидазы
В качестве материала для получения белковых экстрактов использовали следующие
ткани: печень, головной мозг, почки и семенники крыс породы WISTAR в возрасте от 0,5 до
1 года. Органы гомогенизировали с добавлением ингибиторов протеаз, гомогенат подвергали
процедуре
центрифугирования
и
нерастворимой
фракции.
последовательно
дополнительной
мочевины.
Полученные
фильтрации
для
Водонерастворимую
тканевые
экстракции
экстракты
разделения
фракцию
растворами
водорастворимой
препарата
неионных
последовательно
подвергали
детергентов
пропускали
и
через
и
три
тандемные колонки с иммобилизованными рекомбинантными белками: ßm-субъединицей
Х,К-АТФазы (контрольный бедок), пропептидным доменом лизилоксидазы (LOPP) и ее
каталитическим доменом (mLOX). После инкубации с тканевыми экстрактами систему
последовательно промывали
от неспецифически связанных белков, чередуя растворы на
10
основе PBS, содержащие 1 М мочевину, с растворами, содержащими неионный детергент
Triton XI00. После промывания проводили элюцию прочно связанных белков. Элюцию
осуществляли с каждой отдельной колонки последовательно буферными
содержащими
как
мочевину,
так
и мочевину
с
имидазолом.
растворами,
Полученные
элюаты
концентрировали ультрафильтрацией и анализировали методом электрофореза в 13.5%
ПААГ. Специфические связанные белки анализировали при помощи масс-спектрометрии. В
препарате,
элюированном
4М
мочевиной,
нам
удалось
детектировать
глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH) (полоса, соответствующая 36-37 кДа на рис.
9) в качестве возможного интерактора каталитического домена LOX.
Получение белковых экстрактов
4М urea PBS cluate
инкубация их с рекомбииаитиыми
hm
SiNU
наживками,
I.OPP l.(l.\
NiNTANiNTAl
¡шмобилизованиыми
из ткаиеП и
белкамина смоле.
:SOkl)a
МПкШ —
Идентификация o6pa3tfa методом
.масс-спектрометрии как GAPDH
5.41)a —
/ 1
Дополтте.пьные
взаимодействия
исследования
LOX/GAPDH
Рис. 9. Схема чксперимеита по «.ио.'1екулярпо.ну фишипгу» белков-партиеров лтилоксидаш т тканей
крысы. На рисунке также представлен резулыпат электрофоретического раздаения бечков одной из фратрш
полученных элючиеО растворо.м состава 4 М мочевина/РВЯ рН 7.4. LOPP - пропептид лизтоксидазы, Рт контрольный белок.
Так как нам не удалось подтвердить взаимодействие GAPDH/mLOX in vitro методом
пулл-даун, мы предположили, что это взаимодействие слабое или требует особых условий.
Такое взаимодействие может подразумевать и то, что GAPDH служит субстратом в реакции,
катализируемой
лизилоксидазой.
Аминокислотная
последовательность
GAPDH
богата
аминокислотными остатками лизина, например, входящими в состав сигнала ядерной
локализации GAPDH. Модификации этих лизинов важны для регуляции транспорта белка
между цитоплазмой и ядром клетки, что влияет на процессы транскрипции, репликации,
транспорта РНК и апоптоза, осуществляемые при участии GAPDH. Для тестирования этой
гипотезы мы разработали новый метод определения лизилоксидазной активности, который
можно успешно применять для исследования субстратных характеристик крупных белковых
молекул, основанный на поляризации флуоресценции зонда с активной карбонильной
группой (рис. 10).
11
- n o BAPN
-BAPN
- n o GAPDH
Рис. 10. Зависимость по.чяризации флуоресценции от количества препарата LOX, используемого в
реакции. Перед измерет1ем поляризации флуорес11ен11ии препарат LOX гшкубироеачи в течение 30 мин с
GAPDH. Для определения вкчада лизилоксидазной активности во вкчючение флуоресцентной метки в молекулы
GAPDH ту же процедуру проводшш в присутствии ингибитора BAPN. В качестве контроля использовали
препарат LOX, гткубированньт без GAPDH.
3.2. Поиск новых белковых партнеров зрелой формы лизилоксидазы человека в
системе дрожжевого двугибридного срининга.
Другим подходом, использованным для поиска новых интеракторов mLOX, был метод
двугибридного дрожжевого скрининга. В качестве «наживки» использовали каталитический
домен
LOX
изоферментов
человека,
семейства
нормализованной
как
наиболее
консервативный
лизилоксидаз.
универсальной
Скрининг
библиотеки
структурный
проводили
кДНК
человека
с
элемент
всех
использованием
(Clontech).
Было
идентифицировано около 300 клонов, у которых наблюдался положительный рост на
селективной
среде, дефицитной
по аденину
и гистидину.
Наиболее
перспективные
интеракторы были подвергнуты дополнительной проверке на способность активировать
промотор а-галактозидазы в штамме АН 109. После отсева всех ложноположительных клонов
был составлен список наиболее интересных интеракторов лизилоксидазы (Таб.1). Анализ
литературы и известных интерактомных баз данных (PIPs, BioGrid, String) позволил
составить фрагмент карты взаимодействий лизилоксидазы
(рис. И). Некоторые из новых
интеракторов являются ядерными резидентами (например MDC1, рббр, 2G4). Исследование
функционального значения этих взаимодействий может прояснить роль внутриядерной
лизилоксидазы. В то же время не меньший интерес представляет собой взаимодействие LOX
с
белком
S0S2,
являющимся
одним
из
важных
компонентов
Ras-опосредованных
сигнальных путей. Как известно, LOX является онкосупрессором Ras-трансформированных
опухолей, т.е. роль LOX в канцерогенезе становится противоречивой и поэтому особенно
интересной. Наши дальнейшие исследования мы сосредоточили на изучении взаимодействия
mLOX/рббр и его функций в клетке.
12
ïs 5
I 3
i « S
s g i¿
3 I
1=
'V*
na
s 3
I is жi
i
III
Ё.
is
=1
III
ia
j|Ë
I-
ÜÍ
isg
^ S
3 g
Ii
il.
•ilia
^ I 3
y
a
Эi iЫ
fi
J i
<
=S &!
f
a u
S
5 3"
II
S I
gs
l5 ie
й s
•s
s
gi
li
S
s.
ss
s
li-l
Si-s
я .s ä Ч 3 ь -
•i ^ " ï I g
litilL
t l i P i
3.3. Картирование доменов репрессора транскрипции рббр, вовлеченных во
взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы
Для подтверждения возможности белка рббр взаимодействовать с mLOX in vitro мы
использовали пулл-даун. В качестве «белка-наживки» использовали рекомбинантную mLOX,
иммобилизованную на Ni-NTA. На первом этапе эксперимента мы подобрали оптимальные
условия получения клеточных
экстрактов с использованием
различных
буферных систем, таких как RIPA, основанную на использовании
детергентов додецилсульфата
и дезоксихолата
с неионным
лизирующих
смеси
анионных
нонидетом-40;
и CATZ,
основанную на использовании цвитерионного детергента CHAPS и катионного детергента
бромида
гексадецилтриметиламмония.
В обоих
случаях
мы наблюдали
одинаковую
эффективность экстракции GFPp66p (соответствует полосе с подвижностью 92 кДа, в
отличие от GFP - 27 кДа), оверэкспрессированного в клетках НЕК293Т (рис. 12А). Однако
при постановке пулл-дауна с экстрактами, полученными с использованием CATZ и RIPA, мы
наблюдали
значительную
разницу
в
эффективности
формирования
комплекса
GFPp66p/mL0X in vitro (рис. 12В). Поэтому при постановке пул-дауна с различными
фрагментами
последовательности
рббр
мы
целенаправленно
использовали
систему
лизирующего раствора CATZ для получения клеточных экстрактов.
Выравнивание
аминокислотных
последовательностей
рббр
различных
организмов
выявляет в первичной структуре белка два высококонсервативных участка (домены CR1 и
CR2), обладающих различной функциональной активностью. При этом в составе CR2 домена
присутствует аминокислотный мотив цинковых пальцев GATA-типа, вероятно, вовлеченных
в белок-белковые взаимодействия [Brackertz et al, 2006]. Чтобы определить роль структурнофункциональных доменов рббр в формировании белкового комплекса рббр/mLOX, мы
воспроизвели
эксперимент
по
пулл-дауну
с использованием
клеточных
экстрактов,
содержащих GFP-меченные домены рббр: GFPCR1 (1-338 а.о.) и GFPCR2 (339-593 а.о), продуцированные в клетках НЕК293Т (рис. 12С). В результате проведенного эксперимента
оказалось, что С112-домен рббр, также как и полноразмерный рббр способен формировать
комплекс с рекомбинантной mLOX, иммобилизованной на Ni-NTA. В то же время CR1домен рббр такой активностью не обладает (рис. 12D). Таким образом, мы впервые
продемонстрировали
новую
способность
CR2
функционального
домена
рббр
-
взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы. Предположительно, способность
рббр формировать комплекс с LOX важна для инкорпорации лизилоксидазы в состав
нуклеосом-ремоделирующего комплекса Mi2/NuRD и в регуляции взаимодействия LOX с
гистонами.
15
глт/.
RIPA
2Skl>3
(;fp
I;FP(RI c f p c k i
«Sklb
(;kpi>*a(«i« (iFPf Ki
<;м>рмьп«
(imm
t;Fp
Рас, 12, Подтверждение взаимодействия LOX и p66ß. А. Оценка эффективности -jKcmpaKifuu экзогенных
GFP и GFPp66ß из клеток линии НЕК293Т с использованием лизисных растворов С ATZ и RIPA. В.
Полноразмерный p66ß способен связываться с каталитическим доменом лизилоксидазы in vitro. Наибольшая
Э(/к/)ективность взаимодействия
наблюдается
в присутствии
буф/ерного раствора
CATZ. С.
И.м.мунох1шический аначиз лнзатов НЕК293Т. экспрессирующыхразличные конструкции белка p66ß. Детекцию
экзогенных белковых продуктов осуи(ествля.чи с по.мощью антител к GFP (в разведение 1:5000). D.
Полноразмерный p66ß, а также его СК2-до.мен содержаищ! фраг.мент способны образовывать бепковые
комплексы с реко.мбинантной лизипоксидазой in vitro. Детекцию белков опчцесташчи антнтешми к GFP
(1:5000).
3.4. А н а л и з л о к а л и з а ц и и э н д о г е н н ы х p 6 6 ß н L O X в к л е т к а х м л е к о п и т а ю щ и х .
Исследование локализации LOX и p66ß в клетках при совместной экспрессии
Д л я х а р а к т е р и с т и к и в з а и м о д е й с т в и я p 6 6 ß / L O X м ы п р о в е л и и с с л е д о в а н и е их л о к а л и з а ц и и
в к у л ь т и в и р у е м ы х к л е т к а х . Д л я этой цели б ы л п р о в е д е н и м м у н о ц и т о х и м и ч е с к и й
анализ
л о к а л и з а ц и и э т и х б е л к о в в клетках л и н и и M C F 7 (рис. 13). К а к в и д н о на р и с у н к е и p 6 6 ß , и
LOX
колокализуются
в
ядре
в
похожих
точечных
образованиях,
избегая
области
р а с п о л о ж е н и я я д р ы ш е к (на ф о т о г р а ф и и с о о т в е т с т в у ю т пустотам). В т о ж е в р е м я оба белка
одинаково локализуются и в делящихся клетках в несвязанном с хромосомами состоянии.
Подобное поведение белков также может служить дополнительным свидетельством в пользу
с у щ е с т в о в а н и я их в з а и м о д е й с т в и я в н у т р и клетки.
Рис. 13. Исс-чедование .чокализации зидогешшх LOX (В, F) и рббф (С, G) в клетках линии MCF7. Клетки
бы.»!/ фиксированы фор.мапьдегидо.м: детекцию эндогенных бачков проводит с испо.чьзованием специфических
антитеч к LOX (В, F) и к p66fi (С, О). А, Е окраска DAPI. D, И начожение изображений В и С, F и G. В
нижнег'! части рисунка (Е-Н) представчены изображения двух де.чяи{и.хся клеток. Масштаб Ю.мкм.
16
в то же время способность локализоваться в точечных структурах в ядрах клеток
сохраняется и у оверпродуцированного ОРРрббр (рис.14). Вероятно, что в ядрах клеток
существуют некие локусы, способствующие скоплению ОРРрббр и формированию им телец.
Возможно, что в них могут формироваться функционально активные белковые комплексы,
отвечающие за нуклеосомный ремоделинг и репрессию генов, например, нуклеосомремоделирующий комплекс М12/НиЯО, компонентом которого является белок рббр.
Рис. 14. Исследование локализации GFPp66ß (вверху) и GFP (внизу) при их оверпродукции в клетках
мышиных фибробластов NIH3T3. Живые клетки фотографировали через 18 часов после трансфекщш.
Масштаб 10 мк.ц.
Экзогенный
домен
mLOX
(в отличие
от эндогенной
лизилоксидазы)
не
может
транспортироваться в ядро и накапливается в цитозоле клетки, что вполне объяснимо, так
как у него отсутствует свой собственный сигнал ядерной локализации. Чтобы объяснить
способность
проверить,
каталитического
как
присутствие
домена лизилоксидазы
оверпродуцированного
проникать в ядро, мы
p66ß
влияет
на
решили
локализацию
оверпродуцированной mLOX in vivo.
Рис. 15. Исследование локализации ОРРрббр и RFPLOX при их совместной продукции в клетках линии
ИеЬа. Клетки линии HeLa котрансфег1нроват1 плазмидами, кодирующими GFPp66ß и RFPLOX (А - С) или GFP
и RFPLOX (отрш1ательныи контро.чь, D - F). Локапизацию флуоресцентных белков аншизировапи через 8
часов после трансфекции. В присутствии оверэкспрессированного p66ß, LOX переносится в ядра, где
локализуется в точечных структурах вместе с p66ß. Масштаб Юмкм.
17
Для этой цели клетки линии HeLa трансфецировали плазмидами, кодирующими RFPLOX
и GFPp66p, и анализировали локализацию обоих белков in vivo через 8 часов после
трансфекции. Как видно на рис. 15, в отсутствие GFPp66ß RFPLOX локализуется внеядерно
в цитоплазматической фракции. В то же время совместная экспрессия GFPp66ß и RFPLOX
приводит к появлению ядерной лизилоксидазы, сосредоточенной в тельцах неизвестной
природы, совпадающих по локализации с тельцами GFPp66ß. Подобная локализация
экзогенного белка напоминает поведение эндогенной лизилоксидазы, которая также имеет
точечный характер ядерной локализации.
Неспособность оверэкспрессированной лизилоксидазы накапливаться в ядре можно
объяснить как отсутствием у нее своего собственного сигнала ядерной локализации, так и
недостатком
свободных
сайтов
связывания
экзогенной
лизилоксидазы.
Вероятно,
экзогенный p66ß, как ядерный интерактор лизилоксидазы, создает дополнительные сайты
связывания LOX и способствует ее локализации в ядре. Более того, возможно, p66ß
напрямую вовлечен в транслокацию лизилоксидазы из цитозоля в ядро клетки.
Необычную картину наблюдали при коэкспрессии GFP p66ß с ppLOX (полноразмерная
молекула лизилоксидазы, содержащая сигнальный пептид для внеклеточной секреции,
пропептидный домен и каталитический домен). В этом случае происходила аномальная
локализация p66ß в цитоплазматическом
компартменте (рис.
16), причем в строгой
колокализации с лизилоксидазой. Такое поведение строго ядерного белка,
вероятно,
объясняется его заякореванием на внутриклеточных мембранах за счет взаимодействия с
оверэкспрессированной, содержащей сигнальный пептид лизилоксидазой (так как из-за
большого количества экзогенной лизилоксидазы собственные протеолитические системы
клетки не справляются с отщеплением сигнального пептида).
Рис. 16. Исследование локализации СРРрббр и ррЬОХ при их сов.нестной оверэкспрессии в клетках линии
НеЬа. СЬ'Ррббр колокализуется с препрофермешпом лизилоксидазы (ррЮХ) в цитозоле. Такая локализация
белка сильно оптичается от характерной для него ядерной локачизации. В отличие от ОРРрбб/! беюк СУР не
меняет характерного для него равно.мерного распредезення внутри клетки при его совместной продукщш с
ррЮХ. Масштаб 10 мкм.
18
Таким образом, нам удалось продемонстрировать взаимодействие p66p/LOX in vivo и
показать, каким образом лизилоксидаза способна проникать в клеточное ядро.
Опираясь на полученные нами результаты, а также на литературные сведения, мы
предложили следующую гипотезу о возможной функциональной активности взаимодействия
p66p/LOX в клетке. Как известно, белок репрессор транскрипции рббр является постоянным
компонентом
нуклеосом-ремоделирующего
комплекса
Mi-2/NuRD,
осуществляющего
репрессию генов, в частности, вовлеченного в репрессию гена белка клеточной адгезии
кадгерина-Е. Mi-2/NuRD связывается с хроматином благодаря способности одного из
компонентов этого комплекса - белка MBD2 распознавать и связывать метилированные
CpG-островкн. В то же время рббр за счет своего CR2 функщюнального домена участвует в
связывании гастонов НЗ и Н4. Таким образом, происходит одновременная «фиксация»
нуклеосом-ремоделирующего комплекса как на ДНК, так и на гистоновых корах. Так как
NuRD не способен связываться с метилированным НЗК4, для сборки репрессорного
комплекса необходимо деметилирование этого гистона.
В настоящее время показана
способность лизилоксидаз (по крайней мере, LOXL2) окислять тримепшированный по
остатку лизина 4 гистон НЗ [Hen-anz et al 2012]. Так как мы показали, что рббр за счет своего
CR2 функционального домена участвует в формировании комплекса с каталитическим
доменом лизилоксидазы и определяет ее ядерный транспорт и локализацию в ядерных
структурах, мы предположили, что это взаимодействие вовлечено в лиз1шоксндазаопосредованное деметилирование НЗК4, способствующее сборке Mi2/NuRD репрессорного
комплекса на нужных сайтах хроматина.
3.5. Исследование ядерного транспорта белка ТТС4 в клетке
В рамках интерактомных исследований часть работы мы посвятили изучению ядерного
транспорта белка ТТС4 (tetratricopeptide repeat domain protein 4). Этот белок является
потенциальным онкосупрессором, вовлеченным в трансформацию меланоцитов, но в целом
изучен слабо. Для нас особый интерес представляет его взаимодействие с хампином,
который может быть ассоциирован с фактором RASSF1C и ГТФазой Ras. В свою очередь,
взаимодействие Ras, этого важнейшего сигнального белка, - через S0S2 - с LOX (рис. 11)
может быть объяснением «парадоксальной» онкосупрессорной активности LOX в rasтрансформированных клетках.
Сверхпродуцироваиный белок ТТС4 локализуется исключительно в цитоплазме клетки,
вне клеточных ядер. Однако такая локализация эндогенного белка не характерна для
эндогенного ТТС4, обладающего либо строго ядерной локализацией, или локализующегося
одновременно в шгеоплазме и ядре. Поведение сверхпродуцированного белка можно
19
объяснить
либо
нехваткой
нативных
белковых
партнеров
ТТС4,
в
норме
взаимодействующих с ним и определяющих его транспорт в ядро из цотоплазмы, либо
неспособностью
системы
ядерного
транспорта
белков
«справляться»
с
обилием
сверхпродущ|рованного ТТС4 в клетке. В асинхронной культуре клеток эндогенный ТТС4,
идентифицированный специфическими антителами, имел различный характер локализации:
от строгой локализации в ядрах клеток до диффузного распределения по всей клетке. Мы
предположили, что характер локализации эндогенного белка зависит от стадии клеточного
цикла.
Для
подтверждения
этой
гапотезы
нами
бьш
поставлен
эксперимент
по
синхронизации клеток с последующим иммуцитонохимическим анализом локализации ТТС4
(данные не приведены). Клетки в той или иной стадии клеточного цикла фиксировали и
подвергали иммуношггохимии с использованием поликлональных кроличьих антител к
ТТС4, полученных ранее в нащей лаборатории. Иммуноцитохнмический анализ показал, что
в Go фазе ТТС4 обладает ядерно-щггоплазматической
локализацией.
При
индукщш
клеточного цшота ТТС4 из щггоплазмы постепенно транслоцируется в ядро и в Gi фазеимеет
наиболее выраженный ядерный характер локализации. Позднее, уже в G2 фазе, белок снова
начинает появляться в ш1топлазме. Таким образом, ТТС4 имеет динамический характер
локализации, зависящий от стадни клеточного цикла.
Существует несколько возможных объяснений появлению цитоплазматического ТТС4 в
G:
фазе:
блокада
ядерного
транспорта
этого
белка,
взаимодействие
его
с
цитоплазматическнм партнером 1шн деградащм ядерного пула ТТС4. Мы предположили, что
данный феномен может возникать преимущественно благодаря ядерному экспорту белка
ТТС4, так как его динамика в клетке сильно напоминает поведение ядерных белков,
имеющих сигнал
ядерного экспорта. Ориентируясь на данные анализа
присутствия
возможных NES в последовательности ТТС4 и учитывая структурные особенности белка, мы
создали
конструкции,
последовательности
кодирующие
четыре
белка ТТС4 мыши находящихся
перекрывающихся
фрагмента
в одной рамке считывания
с
флуоресцентными белками: два участка, содержащих последовательность TPR-мотпва (1185, 79-386), последовательность TPR-мотива (79-185) и С-концевую последовательность
ТТС4 (185-386). Клетки лишщ НЕК293Т
кодирующей
фрагмент
трансфецировали одной из конструкщ1н,
последовательности
ТТС4, и через
18 часов
анализировали
локализацию флуоресцентного продукта in vivo. Как видно на рис. 17, только фрагмент 1-185
обладал
характерной
для
полноразмерного
ТТС4
цитоплазматической
внеядерной
локализацией, не зависящей от положения флуоресцентного белка с N- (конструкция GFP1185) гаи с С-конца (конструкщм 1-185RFP) последовательности. В то же время для всех
других фрагментов, в том числе и содержащих TPR-мотив, было характерно равномерное
20
распределение между ядром и цитоплазмой. Такое поведение описано для белков GFP и
RFP, не обладающих высокой молекулярной массой и не имеющих сигналов ядерного
экспорта, способных свободно проникать через ядерные поры. Так как TPR-мотив (79-185)
никак
не влиял
на ядерное распределение
GFP79-185
и GFP79-386
в клетке,
мы
предположили, что возможный сигнал ядерного экспорта содержит последовательность 1-79
ТТС4.
Мы предположили, что белок ТТС4 способен транспортироваться в ядро в комплексе с
его ядерным белком-партнером хампином (гомолог MSL1 Drosophila melaiiogaster), ранее
идентифицированным в нащей лаборатории [Dmitriev et al., 2007]. Чтобы проверить это
предположение, мы трансфецировали клетки фибробластов мыщи конструкцией TTC4RFP
совместно с конструкцией, кодирующей хампин, содержащий на С-конце белковой
молекулы GFP, и проводили анализ локализации белков в живых клетках (рис. 18). Нами
было показано, что при совместной экспрессии ТТС4 с хампином происходит накопление
ТТС4 в ядрах клеток и его локализация в точечных структурах. В отличие от хампина,
другой ядерный белок - DNMT1 - при совместной с ТТС4 продукцией не влиял на
клеточную локализацию последнего.
I
gii
Wim
! ' Г-
Рис. 17. Картирование фраг.мента бе.1ка ТТС4, отвечающего за ядерный экспорт белка. Кпетки линии
НЕК293Т трансфегщровачи плазмидныш конструю/иями. Kodupvmmuvu различные участки полипептидной
Чеии ТГС4 в рачке с GFP (GFPI-185, GFP79-185, GFP79-386, GFP185-386) шш RFP (RFP1-I85).
Через 18
часов наблюдачи флуореа^енцию белков в живых клетках. Характерную для по.тораз.мерного ТТС4
локачнзацию проявляют только белки GFP1-185 и 1-185FRP.
21
Рис. 18. Исследование ядерного транспорта белка TTC4RFP в присутствии оверпродуцированных ядерных
белков GFPDNMT1 и GFPhampin. Кчетки фиброб.частов траисфегщровачи пчахмидньши конструкиияии
TTC4RFP и GFPhampin ичи GFPDNMT1. Через 18 часов поаче траисфекции аиатзировачи .чокачизацию
оверпродуцировапиого бачка ТТС4 in vivo. При совместной продукции ТТС4 и DNMT1 белок ТТС4 не
транспортируется в ядро и .покализуется строго в цито11чаз.ме кчеток. При коэкснрессии ГТС4 и хампина
белок ТТС4 транспортируется из цитопчахмы в ядро, где происходит его накоп.ченне в точечных структурах.
Масштаб 50 .мк.м.
ВЫВОДЫ
1.
Получены
бактериальные
и
дрожжевые
продуценты
рекомбинантного
каталитического домена лизилоксидазы. Использование дрожжевого продуцента позволяет
получить
препарат растворимой
лизилоксидазы.
Оптимизирован
процесс
рефолдинга
денатурированного очищенного каталитического домена лизилоксидазы, продуцированного
в Е. coli.
2.
Впервые измерен кинетический изотопный эффект с использованием нативных
субстратов лизилоксидазы; лизина и лизин-содержащего пептида.
3.
Проанализирована локализация эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных
культурах и тканях. Показано, что в культивируемых клетках лизилоксидаза
имеет
преимущественно ядерную локализацию, в то время как в тканях наблюдается либо
внеклеточная, либо цитозольная локализация. Лизилоксидаза впервые детектирована в
зрелых тромбоцитах и лимфоцитах.
4.
С использованием различных методологических подходов (дрожжевой двугибридной
системы
и «молекулярного
фищинга»)
детектированы
неизвестные
лизилоксидазы.
Показано, что глицеральдегидфосфатдегидрогеназа
лизилоксидазы.
Ядерные
резиденты
MDC1,
p66ß
и
2G4
-
ранее
партнеры
новый
субстрат
являются
возможными
внутриядерными интеракторами лизилоксидазы. С использованием полученных результатов
и литературных данных составлена интерактомная карта лизилоксидазы.
5.
Независимыми методами показано взаимодействие p66ß/LOX in vivo и in vitro. Данное
взаимодействие осуществляется СК2-доменом белка p66ß и каталитическим
доменом
лизилоксидазы. Белок p66ß определяет локализацию зрелой формы лизилоксидазы в ядре.
22
6.
Исследована зависимость локализации белка ТТС4 от стадии клеточного цикла.
Фрагмент белка с координатами 1-185 а.о. содержит предполагаемый сигнал ядерного
экспорта белка ТТС4. Совместная продукция белка ТТС4 и хампина приводит к транспорту
ТТС4 в ядро и его колокализацин с белком хампином.
Список сокращений:
LOX - лизилоксидаза
mLOX - зрелая форма лизилоксидазы
ppLOX - полноразмерная лизилоксидаза, включающая сигнальный пептпд и пропептидный
домен
LOPP - пропептидный домен лиз1шоксидазы
LOXL - лизилоксидаза-подобные белки
SSAO -семикарбазид-чувствительная аминоксидаза
GAPDH - глицеральдегидфосфатдешдрогеназа
ТТС4 - tetratricopeptide repeat domain protein 4
RFP - красный флуоресцентный белок
GFP - зеленый флуоресцентный белок
23
Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
Статьи в рецензируемьк журналах:
1.
Dmitriev R.I., Okkelman I.A., Shakhparonov M.I., Abdulin R.A., Pestov N.B. (2009)
Nuclear transport of protein TTC4 depends on the cell cycle. Cell Tissue Res. 336: 521-527.
2.
Pestov N.B., Okkelman I.A.. Shmanai V.V., Hurski A.L., Giaccia A.J., Shchepinov M.S.
(2011) Control of lysyl oxidase activity through site-specific deuteration of lysine. Bioorg. Med.
Chem. Leu., 21: 255-258.
Тезисы конференций:
1.
Pestov N., Dmitriev R., Okkelman I.. Shakhparonov M. (2008) Hampin/MSLl regulates
nuclear transport of putative tumor suppressor TTC4. Mol. Biol. Cell, 19 (suppl), abstract
#2779/B493. (The 48th Annual Meeting of The American Society for Cell Biology, Dec 13-17,
2008, San Francisco, USA).
2.
Okkelman I.A.. Pestov N.B. (2009) Identification of new proteins that interact with lysyl
oxidase. (The 1Г'' Cancer Proteomics Conference, June 8-11, 2009, Dublin, Ireland).
3.
Okkelman I.A.. Pestov N.B., Fedotova A.S. (2010) Differential intracellular localization of
lysyl oxidase in vitro and in vivo. FASEB J. 2010, 24: 816.1 (Experimental Biology Annual
Meeting, April 24 - 28, 2010, Anaheim/OC, USA).
4.
Okkelman I.A.. Pestov N.B. (2011) GAPDH is a putative intracellular lysyl oxidase
interactor. Protein Sei. 20: Suppl. 1, 166 (The 25th Anniversary Symposium of the Protein Society,
July 23-27, 2011, Boston, USA).
5.
Оккельман
двугибридного
И.А.
(2011)
скрннинт.
Поиск
(Научная
белков-партнеров
конференция
по
лизилоксидазы
биоорганической
в
системе
xmmihi
и
биотехнолопп! «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», 14-17 ноября, Москва Пущино).
6.
Okkelman I.A.. Pestov N.B. (2012) Transcription repressor p66ß is putative intranuclear
lysyl oxidase interactor. (15"" Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).
7.
Pestov N.B., Okkelman I.A. (2012) Tissue-specificity of ß-aminopropionitrile oxidase in the
rat. (15"" Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).
24
•7
Заказ №516. Подписано в печать 30.08.2013 год. Тираж 91 шт.
ИП «Тихонов», тел.: 8 (495) 777-53-28 www.jpcom.ru e-mail: [email protected]