Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего
реклама
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" На правах рукописи Сохоневич Наталия Александровна РОЛЬ ЦИТОКИНОВ, ИМЕЮЩИХ ОБЩУЮ Y-ЦЕПЬ РЕЦЕПТОРОВ (IL-2, IL-7, IL-15), В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТЛИМФОЦИТОВ 03.03.01 - физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Л.С. Литвинова Калининград - 2015 1 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Феномен иммунной памяти 1.2.Фенотипическая характеристика и функциональные особенности Т-клеток иммунной памяти 1.2.1.Стволовые Т-клетки памяти (ТSCM) 1.2.2.Ткане-резидентные Т-клетки памяти (ТRM) 1.3. Фенотипическая характеристика и функциональные особенности В- клеток иммунной памяти 1.4. Краткая характеристика отдельных представителей семейства цитокинов I типа, имеющих общую гамма цепь (γc) 1.5. Влияние цитокинов семейства I типа, имеющих общую гамма цепь рецепторов (γc) на гомеостаз Т-клеток 1.6. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Тлимфоцитов 1.6.1. Молекулы активации Т-клеток 13 13 14 20 22 23 27 30 35 1.6.2. Маркеры пролиферативной активности 1.6.3. Молекулы апоптоза 1.6.4. Молекулы межклеточной кооперации 1.6.5. Молекулы клеточной адгезии 35 39 41 42 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47 2.1. Объект и материал исследования 2.2. Методы исследования 2.2.1.Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови 2.2.2. Выделение CD45RА+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов из фракции мононуклеарных лейкоцитов методом иммуномагнитной сепарации 47 47 49 2.2.3. Культивирование CD45RA + и CD45RO + Т-клеточных культур 2.2.4. Определение общего числа клеток (в мл) и количества жизнеспособных лимфоцитов в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток методом проточной цитометрии 2.2.5.Определение поверхностных маркеров CD4, CD8, CD69, CD25, CD71, CD95, HLA-DR, CD62L, CD27 на CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетках методом проточной цитометрии 49 52 54 55 2.2.5.1. Оценка экспрессии Т-клетками маркеров, определяющих степень их дифференцировки 56 2.2.5.2. Оценка экспрессии Т-клетками молекул активации и пролиферации 2.2.5.3. Оценка экспрессии Т-клетками молекул поздней активации и апоптоза 59 61 2 2.2.6. Методы статистического анализа данных ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на жизнеспособность и общее количество клеток (106/мл) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro 3.2. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), на соотношение основных субпопуляций Т-клеток: CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro 3.3. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL7, IL-15) на мембранную экспрессию молекул CD62L и CD27, определяющих соотношение разных фенотипов Т-клеток по степени дифференцировки: наивный (CD45RA+CD45R0-CD62L+CD27+), центральный (CD45RО+ CD62L+CD27+) и гетерогенные популяции эффекторных T-клеток: CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L-, в CD45RA+ - и CD45RО+ - Ткультурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro 3.4. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на мембранную экспрессию молекул ранней активации (CD69; CD25), пролиферации (CD71), поздней активации (HLA-DR и CD56) и апоптоза (CD95) в разных субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD4; CD8) в CD45RA+ - и CD45RО+ - Т-культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro 3.4.1. Мембранная экспрессия молекулы ранней активации (CD69) 3.4.2. Мембранная экспрессия молекулы активации - CD25 (IL2-Ra) 3.4.3. Мембранная экспрессия молекулы пролиферации – CD71 3.4.4. Мембранная экспрессия молекулы апоптоза – CD95 3.4.5. Мембранная экспрессия молекулы поздней активации – HLA-DR 68 68 71 71 83 83 85 87 95 100 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 105 ВЫВОДЫ 161 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 162 3 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ CD45 - общелейкоцитарный рецептор CD45RA - Т-лимфоциты, несущие высокомолекулярную изоформу рецептора CD45 CD45RO – Т-клетки памяти CD4 – популяция хелперных Т-клеток CD8 – популяция цитотоксических Т-клеток CD62L - молекула, отвечающая за поступление Т-клеток из кровяного русла во вторичные лимфоидные органы. CCR7 (CD197) - молекула, определяющая миграцию клеток в Т-зависимые зоны лимфоидных органов. CD27, CD28 - молекулы костимуляции.. TCR – Т-клеточный рецептор (T-cell receptor) BCR – В -клеточный рецептор (В-cell receptor) Th – Т-хелперы TN – наивные Т-клетки TSCM – стволовые Т-клетки памяти TCM – центральные Т-клетки памяти ТТE (ТТEMRA) – терминально дифференцированные Т-клетки TEM – эффекторные Т-клетки TTM – транзиторные Т-клетки памяти ИО – иммунный ответ Bcl – антиапоптотический фактор CD – кластер дифференцировки (cluster of differentiation) Fas – апоптотический антиген IL - интерлейкин Jak - тирозинкиназа MHC – главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex) NK – натуральные киллеры DC – дендритные клетки АПК – антиген-презентирующая клетка PTPRC – белок тирозиновая фосфатаза, рецепторный тип (Protein Tyrosine-Phosphatase, Receptor Type). STAT – фактор транскрипции эукариот 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность посвященные темы ключевым исследования. вопросам Современные физиологических исследования, механизмов иммунного контроля, сосредоточены, в основном, на изучении молекулярных и клеточных аспектов регуляции иммунной памяти (Radbruch А., Thiel А., 2004; Селедцов В.И. и др., 2010; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014). Клеточной основой иммунологической памяти являются селективная экспансия и дифференцировка клонов антиген-специфических В- и Т-лимфоцитов. Исследование структурно-функциональных свойств Т-клеток и анализ экспрессии их поверхностных маркеров позволяют выделять «наивные» лимфоциты, Т-клетки иммунной памяти и эффекторы (Sprent J., Surh C.D., 2001; Селедцов В.И. и др., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2013). Наивные Т-лимфоциты проходят антигеннезависимую дифференцировку (позитивная и негативная селекция) в тимусе, после которой появляются в периферическом кровотоке как зрелые наивные клетки. После антигенной стимуляции наивные Т-лимфоциты дифференцируются в периферических лимфоидных органах в эффекторные Т-клетки, а затем некоторые из них становятся Т-клетками памяти. Т-лимфоциты памяти долговечны и способны к дальнейшей дифференциации и пролиферации, чтобы стать эффекторными клетками при повторном контакте с антигеном (Sprent J., Surh C.D., 2001; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014). Степень проработанности темы. В настоящее время признано существование четырех основных событий во время иммунного ответа: инициация, клональная экспансия, контракция/сжатие и образование пула Т-клеток памяти с дальнейшим поддержанием их численности за счет гомеостатических механизмов (Boyman O. et al. 2007; Rochman Y. et al., 2009; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014). Иммунная система, на основе гомеостатических механизмов, адаптируется к изменяющимся требованиям, возникающим в ходе стационарного существования и, особенно, при активации агентами инфекционной и неинфекционной природы (Ярилин А.А., 2010). Важными характерологическими особенностями лимфоцитов, ответственных за иммунную память, являются: 1) сохранение численного постоянства пула Т-клеток иммунной памяти in vivo (путем регуляции баланса процессов генерации, поддержания 5 жизнеспособности и их гибели в организме в отсутствие антигенного стимула); 2) обеспечение ускоренной иммунной реакции на повторное антигенное воздействие (Geginat J. et al., 2002; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003; Luckey C.J. et al., 2006; Boyman O. et al. 2007; Rochman Y. et al., 2009; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014). Сущность ответной иммунной реакции организма на различные агенты инфекционной и неинфекционной пролиферации, дифференцировки и природы определяется программированной процессами гибели, которым подвергаются лимфоциты, как основные участники иммунного ответа. В ходе активационного (дифференцировочного) процесса на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются молекулы активации (ранней и поздней), пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Кудрявцев И.В., 2014; Литвинова Л.С. и др., 2014; Chang J.T. et al., 2014; Farber D.L. et al., 2014). Одним из перспективных направлений в изучении физиологических основ иммунного ответа является поиск, оценка и последующее определение роли наиболее значимых поверхностных антигенов, экспрессирующихся на имунокомпетентных клетках, в реализации нормального иммунного ответа и при патологии. Цитокины семейства I типа (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21), имеющие общую γ-цепь, способны оказывать комплексное воздействие на клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки (Литвинова Л.С. и др., 2013; Yamane H., Paul W.E., 2013; Farber D.L. et al., 2014; Lee B., Hong C., 2015; Schmitt N., Ueno H., 2015). Весьма вероятно, что действие некоторых цитокинов на Т-клетки носит дозозависимый характер, определяется типом клеток-мишеней и их функциональным активностью, статусом состоянием (степенью рецепторного дифференцировки, аппарата клетки). функциональной Учитывая это обстоятельство, одни и те же цитокины могут проявлять разнонаправленные эффекты на «наивные» клетки-предшественницы и Т-клетки иммунной памяти (Литвинова Л.С. и др., 2013; Tkach K.E. et al., 2014; Schmitt N., Ueno H., 2015). В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования явилась комплексная оценка эффектов цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL2, IL-7 и IL-15), на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих процессы 6 активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза, в разных условиях культивирования in vitro Задачи исследования: 1. Изучить влияние цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL- 2, IL-7 и IL-15), на процессы дифференцировки CD4+ и CD8+ популяций CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro. 2. Оценить эффекты ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации и пролиферации CD4+ и CD8+ популяций CD45RA+ и CD45RO+ Тклеток, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro. 3. Исследовать действие цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на позднюю активацию и апоптоз CD4+ и CD8+ Т-клеток в CD45RA- и CD45RO- культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro. 4. Установить общие закономерности и особенности влияния цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на функциональную активность Т-клеток, в зависимости от степени их дифференцировки и условий культивирования in vitro. Научная новизна Впервые показано, что влияние in vitro цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на гомеостаз Т-клеток определяется степенью их дифференцировки (наивные лимфоциты, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и функциональным состоянием, фенотипически выражающимся изменением спектра поверхностных молекул апоптоза. активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и Приоритетными являются данные, свидетельствующие, что в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro ɣс-цитокины (IL2, IL-7 и IL-15), в разной степени, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ 7 наивных клеток (TN) и CD4+ и CD8+ Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM) в эффекторные клетки разной степени зрелости. Впервые установлено, что эффекты ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD45RA+CD4+ и CD45RA+CD8+ Т-клеток (ассоциированные с экспрессией молекул - CD69 и CD25), в гомеостатической модели культивирования и на фоне TCR-стимуляции in vitro, имеют однонаправленный характер, но разную степень выраженности. Выявлено, что CD45RA+CD4+ T-лимфоциты, в сравнении с CD45RA+CD8+ Т-клетками, менее чувствительны к пролиферативному действию ɣсцитокинов. Приоритетными являются данные, что в гомеостатической модели культивирования in vitro СD45RO+CD4+ Т-лимфоциты обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию цитокинов, в сравнении с СD45RO+CD8+ Т-клетками. В активационной модели in vitro, напротив, CD45RO+CD8+ Т-клетки демонстрируют меньшую чувствительность к активирующим и пролиферативным эффектам ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15). Впервые выявлено, что эффекты ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на экспрессию молекулы CD95 (Fas/APO-1) CD4+ и CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток имеют разную направленность и разную степень выраженности. В гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, ɣс-цитокины способствуют росту числа CD3+CD8+CD95+ Т-клеток в популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM), тогда как экспрессия молекулы CD95 эффекторными CD8+ Тклетками (CD62L-) а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется. Показано, что в CD4+ и CD8+ популяциях эффекторных (CD62L-) CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, более 99% лимфоцитов с фенотипом - CD3+HLADR+, экспрессируют маркер CD95. Однако не все CD95-позитивные Т-лимфоциты несут на своей Опосредованное поверхности влиянием маркер цитокинов «поздней активации» HLA-DR+. повышение содержания СD3+HLA- DR+CD95+ клеток в CD4+ и CD8+ популяциях эффекторных (CD62L-негативных) CD45RА- и CD45RО- Т-лимфоцитов, может свидетельствовать о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток под действием ɣс-цитокинов. 8 Положения, выносимые на защиту: 1. Разнонаправленное влияние цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на гомеостаз CD4+ и CD8+ популяций Т-клеток определяется степенью их зрелости (наивные, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями культивирования in vitro (гомеостатическая и активационная модели), что фенотипически выражается изменением спектра поверхностных молекул активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза. 2. Цитокины, имеющие общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), в гомеостатической и активационной моделях in vitro культивирования, способствуют дифференцировке наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток (TN) и CD4+ и CD8+ Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM) в незрелые и/или зрелые эффекторные Тклетки (TEM, TEMRA). 3. Эффекты ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации и пролиферации CD4+ и CD8+ популяций Т-клеток носят разнонаправленный характер, который определяется стадией их дифференцировки (наивные, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями in vitro культивирования. 4. Экспрессия молекул HLA-DR и CD95 эффекторными популяциями (CD3+CD4+/CD8 +CD62L-) CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток является фенотипическим признаком терминальной фазы дифференцировки и созревания Т-лимфоцитов. CD4+ и CD8+ эффекторные клетки (CD62L-), а также CD8+ Т-клетки центральной памяти (TCM), конститутивно экспрессируют молекулу CD95 на своей мембране. Теоретическая и практическая значимость Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые аспекты влияния цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL15), на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих процессы активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоз, лежащие в основе формирования первичных и вторичных иммунных реакций. Практическая 9 значимость полученных функциональной активности данных о Т-клеток, цитокинопосредованном в условиях контроле гомеостатической и антигеннезависимой (TCR) - стимуляции, может представлять интерес для расшифровки фундаментальных иммунных механизмов генерации иммунной памяти, с одной стороны - как основного звена формирования и поддержания протективной противоинфекционной и противоопухолевой защиты, с другой – реализации аутоиммунной патологии. Результаты настоящего исследования могут быть положены в основу разработки технологии управления процессами клеточного гомеостаза и функциональным состоянием Т-клеточного звена с применением биомолекул (цитокинов). Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедрах фундаментальной медицины медицинского института БФУ им. И. Канта и кафедре молекулярной физиологии и биофизики химикобиологического института БФУ им. И. Канта г. Калининграда. Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны высокоинформативные методы исследования, которые выполнялись на базе современной научно-исследовательской лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Инновационного парка БФУ им. И. Канта. В качестве материала исследования использовали первичные культуры CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов, полученные из взвеси мононуклеарных клеток периферической венозной крови здоровых доноров. Основные методы исследования: 1. Иммуномагнитная сепарация (получение монокультур CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов из взвеси мононуклеарных клеток здоровых доноров); 2. Культуральные методы исследования in vitro; 3. Оценка жизнеспособности CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-клеточных культур и определение поверхностных маркеров (СD45RA; CD45RO; CD3; CD4; CD8; CD69; CD25; CD71; CD95; HLA-DR; CD62L и CD27) на Т-клетках, методом проточной цитофлюориметрии; 10 Статистический анализ результатов. 4. Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов (иммуномагнитная сепарация, культуральные методы исследования, проточная цитофлуориметрия) и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (г. Санкт-Петербург, 2011, 2012, 2013 гг.); международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» (г. Москва, 2013, 2015 гг.); III-ей Международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Fundamental and applied research in biology 3rd international scientific conference) (Украина, г. Донецк, 2014 г.); Международной научно-практической конференции «Перспективы развития науки и образования» (г. Москва, 2013, 2015 гг.); объединенном иммунологическом форуме (г. Нижний Новгород, 2013 г.); международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (г. Москва, 2015 г.); XII конференции иммунологов Урала (г. Пермь, 2015); XV всероссийском научном форуме с международным участием им. Акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2015), а также на научно-образовательных семинарах на базе Лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Балтийского Федерального Университета им. И. Канта (г. Калининград, 2012-2015). В работе «Исследование приводятся результаты научно-исследовательских молекулярно-биологических механизмов работ модуляции иммунологической памяти в норме и при аутоиммунной патологии» (ГК №П1252 от 27 августа 2009 г.); «Исследование гуморальных и клеточных механизмов регуляции иммунологической памяти» (∑ЗН ТемПлан № 1.1.09, 2009-2010 гг.); "Стероидная регуляция иммунной памяти» (Грант Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - докторов 11 наук (МД-4999.2012.7); «Разработка технологии дозозависимого управления процессами клеточного гомеостаза и функциональным состоянием Т-клеток памяти с применением биомолекул (цитокинов)» (Соглашение 14.132.21.1778 от 01.10.12 г.); «Исследование влияния иммунорегуляторных цитокинов на регуляцию процессов активации, дифференцировки и самоподдержания Т-клеток иммунной памяти» (СП СП-454.2013.4 2013-2015гг. от 28.02.2013). Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 8 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ и 12 статей и тезисов в материалах конференций и симпозиумов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 432 источникa (44 - отечественных и 388 иностранных). Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования. Результаты получены, проанализированы и обобщены в выводах и положениях автором лично. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Феномен иммунной памяти Иммунная система обладает уникальным свойством защиты макроорганизма от всех видов потенциально опасных и инфекционных агентов, а так же от аутоклонов путем их специфического распознавания и элиминации. Она обеспечивает стабильность гомеостаза и поддерживает многочисленные анатомо- функциональные связи с другими системами организма (Хаитов Р.М. и др., 2000; Crotty S., Ahmed R., 2004; Мейл Д. и др., 2007; Ярилин А.А., 2010). Как правило, иммунный ответ заключается в распознавании возбудителя или иного чужеродного материала и развертывании цепи реакций, направленных на их устранение (Галактионов В.Г., 1998; Мейл Д. и др., 2007; Хаитов Р.М., 2009; Селедцов В.И. и др., 2010; Ярилин А.А., 2010). В контексте изучаемой тематики заслуживает внимания динамическая модель коэволюции между быстро изменяющимися патогенами и адаптивным иммунным ответом. Мутация возбудителя и механизмы гомеостатического ограничения лимфоцитов способствуют развитию хронической инфекции, а не быстрому клиренсу патогена. Структура хронических инфекций на стадии становления, патогенному включающая ветвящиеся видообразованию, модели, соответствует обусловленному бесполому коэволюционными взаимодействиями. В течение долгого времени этот переход создает все более хрупкую иммунную систему и приводит к катастрофической потере иммунного контроля (Schlesinger K.J. et al., 2014). В настоящее время исследования, посвященные ключевым вопросам иммунного контроля, сосредоточены на изучении молекулярных и клеточных механизмов регуляции иммунной памяти. Иммунная память – это способность иммунной системы после первичного иммунного ответа быстро и эффективно отвечать повторно на тот же стимул (Воробьёва А. А., Быкова А. С., 2003; Radbruch A, Thiel A., 2004; Elyaman W. et al., 2008; Селедцов В.И. и др., 2010). Продолжительность иммунной памяти при ответе на разные антигены различна. Она может быть краткосрочной (дни, недели), долговременной (месяцы, 13 годы) и пожизненной (Radbruch A., Thiel A., 2004; Crotty S., Ahmed R., 2004; Cope A.P., Gorman C.L., 2008; Elyaman W. et. al., 2008) и зависит как от антигенного состава и дозы антигена, так и от состояния иммунной системы на момент проникновения антигена в организм. Предполагают, что значительную роль в поддержании иммунологической памяти играют повторные проникновения антигенов в организм, иммунотропные цитокины, присутствующие в тканевых жидкостях, а также антиген-индуцированные идиотип-антиидиотипические взаимодействия (Farber D.L., 2009; van der Windt G.J. et al., 2013; Mockler M.B. et al., 2014). Механистической основой иммунологической памяти являются селективная экспансия и дифференцировка клонов антиген-специфических В- и Т-лимфоцитов. Клетки иммунной памяти быстро пролиферируют под влиянием специфического антигена: появляется большая популяция эффекторных клеток, увеличивается синтез антител и цитокинов. За счёт клеток памяти более быстро и эффективно удаляются повторно введённые антигены (при вторичном иммунном ответе). Иммунологическая память, таким образом, может рассматриваться как адаптивный иммунный ответ на антиген, который уже знаком иммунной системе. В обычных условиях вторичный иммунный ответ подразумевает продукцию сывороточных антител в более высокой концентрации и через более короткий промежуток времени по сравнению с первичным, кроме того, синтезируемые антитела обладают более высокой связывающей способностью (Banatvala J. et al., 2000; Воробьёва А.А., Быкова А.С., 2003; Janeway Ch. et al., 2004). Феномен генерации и длительного существования клеток памяти в организме, лежит в основе всех известных на сегодняшний день методов эффективной вакцинации (Janeway Ch. et al., 2004; Селедцов В.И. и др., 2010). 1.2. Фенотипическая характеристика и функциональные особенности Тклеток иммунной памяти Оценка экспрессии поверхностных маркеров и анализ структурно- функциональных свойств Т-клеток позволяют выделять «наивные» лимфоциты и «примированные» клетки памяти; последние появляются в результате дифференцировки активированных антигеном «наивных» предшественников в ходе 14 нормального развития первичного иммунного ответа in vivo (Селедцов В.И. и др., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2013) (рисунок 1). Еще в 1980-х годах прошлого столетия было установлено, что наивные лимфоциты и Т-клетки памяти клетки человека могут быть разделены на основе дифференциальной экспрессии поверхностных молекул, в том числе CD45R (теперь CD45RA), LFA-3 (CD58), и LFA-1 (теперь CD29, CD11a) или связывания с моноклональными антителами UCHL-1 (сейчас CD45RО) (Sanders M.E. et al., 1988). CD45RО клетки нечасто встречаются у новорожденных (Yamada A. et al., 1992); их число постепенно увеличивается с возрастом (Cossarizza A. et al., 1996; Селедцов В.И. и др., 2010). Как уже упоминалось, быстрый и усиленный ответ клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от их «наивных» потомков (Sanders M.E. et al., 1988; García-Berrocal J.R. et al., 1997; Carter L.L. et al., 1998; Kimmig S. et al., 2002; Altemus M. et al., 2006; Хайдуков C.В., 2008; Ярилин А.А., 2010). Недавние исследования показывают, что наивные Т-клетки, несущие идентичные Т-клеточные рецепторы (TCR), подвергаются гетерогенной дифференциации и экспансии. Для изучения механизмов регуляции динамического равновесия клеток иммунной системы, предложена вычислительная модель описывающая процессы, происходящие между лимфатическими узлами и кровью. Полиорганная модель объединяет события на клеточном и тканевом уровнях, позволяя изучать гетерогенную дифференцировку отдельного предшественника, родственного наивным Т-клеткам, способного генерировать эффекторные и Тлимфоциты памяти (Gong C. et al., 2014). Наивные клетки проходят только антиген-независимую дифференцировку в тимусе, после которой появляются в кровяном русле. Т-клетки памяти проходят антиген-зависимую дифференцировку в периферических лимфоидных органах в ходе вторичного иммунного ответа. В соответствии с экспериментальными системами и используемыми маркерами, наивные и Т-клетки памяти были описаны различными способами и с использованием разной номенклатуры. Например, в мышиных моделях инфекций, термин "эффектор" относится к Т-клетке, недавно активированной антигеном. У человека "эффектор" обычно обозначает популяцию терминально 15 дифференцированных Т-клеток памяти, способных к продукции провоспалительных цитокинов и немедленной цитотоксичности с низкой пролиферативной активностью (Mahnke Y.D. et al., 2012; 2013). Согласно современным представлениям, степень дифференцировки T-клеток памяти определяется четырьмя каноническими маркерами, т.е. CD45RО (или CD45RA), CCR7, CD28, и CD95, что позволяет идентифицировать шесть популяций в периферической крови здоровых людей: наивные Т-клетки (TN), стволовые клетки памяти (TSCM), Т-клетки центральной памяти (TCM), Т-клетки терминально дифференцированные эффекторы (ТТE), эффекторные клетки памяти (TEM) и транзиторные Т-клетки памяти (TTM). TRM Периферические ткани Лимфоидная ткань TN TSM TCM TEM TTE Апоптоз M Экспозиция антигена Рисунок 1. Дифференцировка основных циркулирующих субпопуляций Т-клеток памяти из активированных наивных Т-клеток в зависимости от степени экспозиции антигена (адаптировано из Farber D.L. et al., 2014) Анализ рецепторов хоуминга показал, что Т-клетки памяти являются гетерогенными по способности к локализации в периферических тканях, что определяется экспрессией молекулы – CD62L, отвечающей за поступление этих клеток из кровяного русла во вторичные лимфоидные органы, и CCR7 (CD197), определяющей миграцию клеток в Т-зависимые зоны лимфоидных органов. В частности, наивные Т- клетки экспрессируют высокие уровни CD62L (L-селектина), в то время как клетки памяти разделены на CD62L+ и CD62L- субпопуляции (Picker L.J. et al., 1993; Кудрявцев И.В., Савицкий В.П., 2012; Mahnke Y.D. et al., 2013). 16 Взаимоисключающая экспрессия CD103 и CLA предполагает эксклюзивный потенциал Т-клеток к хоумингу в кишечнике и коже, соответственно (Picker L.J. et al., 1993). Это привело к гипотезе, что Т-клетки иммунной памяти организованы в популяции, которые селективно распределяются в организме в соответствии с их эффекторными функциями (Mahnke Y.D. et al., 2012; 2013). В настоящее время для выявления популяций Т-клеток при помощи проточной цитофлюориметрии применяется три основных комбинации антител. Во-первых, классификация клеток может основываться на оценке уровня экспрессии CD45RA (и/или CD45R0) и CD62L (Segundo D.S. et al., 2010; Кудрявцев И.В., Савицкий В.П., 2012). В этом случае фенотип ТN-клеток можно описать как CD45RA+CD45R0– CD62L+, TCM - клеток – CD45RA–CD45R0+CD62L+, TEM клеток – CD45RA– CD45R0+CD62L–, а TEMRA-клеток (иногда их называют еще CD45RA-позитивные эффекторные клетки памяти или терминально дифференцированные эффекторные клетки памяти) – CD45RA+CD45R0–CD62L–. Второй подход основан на использовании вместо CD62L, хемокинового рецептора CCR7 (CD197) (Yoon J.W. et al., 2006). CCR7+ - Т-клетки центральной памяти (TCM), обладают способностью к миграции во вторичные лимфоидные ткани (Sallusto F. et al., 1999). CCR7-негативные Т-клетки-эффекторы памяти (ТЕМ), проявляют быстрые эффекторные функции ex vivo, их хоуминг ориентирован в периферические лимфоидные и нелимфоидные органы и ткани (Sallusto F. et al., 1999). И, наконец, третий подход базируется на оценке уровня экспрессии CD27 и CD28 (вместо CD62L или CD197) в комбинации с CD45RA и/или CD45RО (Takata H. et al., 2012). В этом случае наивные Т-клетки будут иметь фенотип CD27+CD28+CD45RA+, ТСМ Т-клетки – CD27+CD28+CD45RA–, ТEM -клетки – CD27– CD28–CD45RA+, а ТEMRA T-клетки, негативные по всем перечисленным выше маркерам. В случае использования подобного набора антител некоторые исследователи выделяют в отдельную популяцию «поздние» клетки памяти, имеющие фенотип CD27–CD28–CD45RA+ (de Graaf M.T. et al., 2011). Следует отметить, что в настоящее время предпринимаются попытки унифицировать классификацию этих клеток и выработать общие стандарты и нормативные показатели по их основным популяциям (Maecker H.T. et al., 2012). 17 Экспрессия CD4+- и CD8+-Т-клетками поверхностных молекул CCR7, CD62L, CD27 и CD28 определяет функциональные свойства Т-клеток (Sallusto F. et al., 1999; Farber D.L. et al., 2014). В частности, Т-клетки CCR7−/CD62L−CD28+ находятся в периферической крови здоровых лиц (Okada R. et al., 2008) или макак-резус (Picker L.J. et al., 2006) и представляют собой популяцию "переходных" клеток памяти. Эти клетки более дифференцированы, чем TCM, и аналогичны ТЕМ с точки зрения фенотипа (Okada R. et al., 2008) и величины экспансии в ответ на цитокин IL-15 in vivo (Picker L.J. et al., 2006; Lugli E. et al., 2010). IL-15 также увеличивает популяцию ТЕМ-клеток, которые повторно экспрессируют CD45RA (клетки TTE или TEMRA) (Lugli E. et al., 2010). TTE-клетки с маркерами CD45RA+CCR7− чаще обнаруживаются в популяции CD8+-клеток (Sallusto F. et al., 1999). Клетки с фенотипом CCR7−/CD62L−, как правило, негативны по CD27 и CD28 и имеют самые короткие теломеры среди Т-лимфоцитов (Romero P. et al., 2007). TTE экспрессируют маркеры старения, в том числе KLRG-1 (Henson S.M., Akbar A.N., 2009), CD57 (Brenchley J.M. et al., 2003) и фосфорилированные гистоны H2AX (Di Mitri D. et al., 2011), имеют низкий пролиферативный и функциональный потенциал (Brenchley J.M. et al., 2003), что указывает на их терминальную дифференцировку. Циркулирующие Т-клетки здоровых доноров находятся, в основном, в состоянии покоя, лишь небольшая их доля в периферической крови (как правило, менее 1 %) активно обновляется (пролиферирует). Вывод сделан на основании экспрессии этими клетками ядерного антигена Ki-67 (Hazenberg M.D. et al., 2000), который экспрессируется пролиферирующими клетками, независимо от фазы клеточного цикла (Li X. et al., 2012; Литвинова Л.С. и др., 2014). In vivo клетки Ki67+ – это лимфоциты с фенотипом ТЕМ (Hazenberg M.D. et al., 2000; Gattinoni L.et al., 2011). Экспрессия Ki-67, как правило, ассоциирована с экспрессией маркеров активации HLA-DR и CD38. ТN-клетки не экспрессируют Ki-67 (Gattinoni L. et al., 2011). Т-клетки памяти CD45RA−CD8+, экспрессирующие CD27, продуцируют IL-2 и IFNγ, но не имеют киллерной активности (поэтому называются клетками памяти). Тклетки CD45RA−CD27−CD8+ продуцируют в основном цитокины IFNγ и TNFa, но не IL-2, и обладают способностью к непосредственной цитотоксической активности ex vivo (являются эффекторами) (Hamann D. et al., 1997) (таблицы 1, 2). 18 CD4+ и CD8+ Т-клетки памяти, позитивные по CCR7, вырабатывают большое количество IL-2 и низкие уровни других эффекторных цитокинов (т.к. IL4, IL-5, и IFN-γ), в то время как CCR7- Т-клетки памяти экспрессируют высокие уровни IL-4 и IL-5 (только CD4+ Т-клетки), и / или IFN-γ (CD4+ и CD8+ Т-клетки), и содержат гранулы перфорина для реализации механизмов цитотоксичности (Sallusto F. et al., 1999; Fritsch R.D. et al., 2005) (таблицы 1, 2). Таблица 1. Фенотипические и функциональные особенности наивных Тлимфоцитов и разных субпопуляций Т-клеток памяти Т-клетки Фенотип Локализация CD45RA+CD45R0−CCR7+ CD62L+CD27+CD28+ CD95+ Тимус, селезенка, периферическая кровь, лимфатические узлы Периферическая кровь, селезенка TCM (центральной памяти) СD45RO+CD62L+CCR7+ CD27+CD28+ Лимфатические узлы, селезенка, кровь TEM (эффекторные) СD45RO+CD62L-CCR7CD27-CD28- Селезенка, кровь, печень TN (наивные) TSM (стволовые) CD45RA+ CD62L+CCR7+ CD27+CD28+ Функциональные особенности ↑ПП, ↑продукция IL-2, ↑миграция, ЭФ нет ↑ПП, ↑продукция IL-2, ↑ миграция, ЭФ нет ↑ПП, ↑продукция IL-2, ↑миграция, ↓ЭФ и ↓ЦТ ↓ПП, ↓продукция IL-2, ↑миграция, ↑ЭФ и ↑ЦТ ↓ПП, ↓продукция IL-2, ↓миграция, ↑ЭФ и ↑ЦТ Кожа, легкие, кишечник, мозг CD103+CD69+CD62L(тканерезидентные) CD27 Характерна экспрессия тканспецифических хемокиновых рецепторов и интегринов CD45RA+CD62L-CCR7TEMRA – – (TEM- CD45RA+) CD27 CD28 TRM Кровь ↓ПП, ↓продукция IL-2, ↓миграция, ↑ЭФ и ↑ЦТ Примечание. ПП – пролиферативный потенциал, ЭФ – эффекторные функции, ЦТ – цитотоксичность. Стрелками обозначена степень выраженности признака: стрелка, направленная вверх – высокие значения показателя, стрелка - вниз – низкие значения показателя. В исследованиях in vitro и in vivo установлено, что менее дифференцированные Т-клетки памяти обладают большей способностью к длительному существованию, по сравнению с терминально 19 дифференцированными. Так, ТСМ клетки имеют повышенный пролиферативный потенциал, способность к самообновлению и мультипотентность в сравнении с ТЕМ клетками (Mahnke Y.D. et al., 2013). Также TCM клетки сохраняют профиль экспрессии генов, связанный с защитой от апоптоза, т.е., повышенные уровни IL7R (Holmes S. et al., 2005) или STAT5a и более низкие уровни проапоптотического белка Bim (Riou C. et al., 2007). CD4+ TCM лимфоциты имеют низкую способность как к спонтанному, так и к CD95-индуцированному апоптозу in vitro по сравнению с CD4+ ТЕМ Т-клетками (Riou C. et al., 2007). TCM клетки имеют более длинные теломеры, чем ТЕM и способны генерировать ТЕА in vitro, но не наоборот (Sallusto F. et al., 1999). TCM в большей степени, чем ТЕM, способны поддерживать и реконструировать иммунную память (Tanel A. et al., 2009). Фенотипические и функциональные особенности Таблица 2. Фенотипические особенности и цитокинпродуцирующая активность основных субпопуляций Т-клеток памяти CD45RA CCR7 CD69 CD103 IL-2 IFNy TNFa Циркулирующие Т-клетки памяти Резидентные Т-клетки памяти TSM TCM TEM TRM + + +++ - + +++ ++ ++ ++ +++ +++ + +/+++ +++ TRM CD103+ + + +/+++ +++ 1.2.1. Стволовые T-клетки памяти (TSCM) Множество исследований, проведенных на мышах, не человекообразных приматах и позже, у людей, подтвердило понятие, что TCM - ранние дифференцированные прогениторы, способные к самообновлению и одновременно, к производству более дифференцированного потомства (Sallusto F. et al., 2004; Stemberger C. et al., 2009; Buchholz V.R. et al., 2013; Mahnke Y.D. et al., 2013; Mueller S.N. et al., 2013). Предполагали, что TCM Т-клетки способны поддерживать популяцию долгоживущих Т-клеток памяти, наподобие стволовых клеток (Lanzavecchia A., Sallusto F., 2002; Stemberger C. et al., 2009). Тем не менее, было высказано 20 предположение о существовании небольшой популяции клеток, обладающей большими регенерационными свойствами. У человека и макак-резусов были идентифицированы Т-клетки с некоторыми свойствами стволовых клеток, так называемые стволовые T-клетки памяти (TSCM) (Gattinoni L. et al., 2011; Lugli E. et al., 2013). Эти антиген-специфические клетки включают относительно редкую популяцию клеток памяти, имеющих в основном, фенотип наивных клеток: CD45RA+CD45R0−CCR7+CD62L+CD27+CD28+ и сверхэкспрессию CD95, характерную для популяции клеток памяти (Fagnoni F.F. et al., 2000; Lugli E. еt al., 2007). Клетки TSCM обладают способностью к самоподдержанию in vitro: при стимуляции anti-CD3/CD28, они демонстрируют более высокую активность в отношении сохранения оригинального фенотипа по сравнению с TCM-клетками (Gattinoni L. et al., 2011). Согласно данным, полученным Lugli E. и др. (2013), у зараженных обезьяноподобным вирусом иммунодефицита (SIV) макак, активированные TSCM клетки, экспрессировали более высокие уровни Bcl2, MCL1, и LEF1 (способность к самообновлению) по сравнению с TCM и TEM – клетками (Lugli E. et al., 2013). Также TSCM клетки демонстрировали большую мультипотентность, поскольку они способны к генерации всех популяций клеток памяти, включая TCM (Gattinoni L. et al., 2011; Lugli E. et al., 2013). Найдены четкие доказательства, что TSCM предшествуют клеткам TCM (Mahnke Y.D. et al., 2013). Несмотря на то, что TSCM-клеткам присуща функциональная активность клеток памяти, они сохраняют профиль экспрессии генов, характерных для наивных Тклеток, а также их закономерности и распределение в естественных условиях рециркуляции. В тоже время популяция, способная восстановить TSCM-клетки, не найдена (Gattinoni L. et al., 2011; Lugli E. et al., 2013; Mahnke Y.D. et al., 2013). Cieri N. и др. (2013) показали, что TSCM накапливаются в ранние сроки после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и имеют промежуточный фенотип между наивными и TCM Т-клетками. Трансплантация иммунодефицитным мышам генетически модифицированных TSCM превосходит другие Т-лимфоциты памяти по способности к экспансии и дифференцировке в эффекторные клетки, способные опосредовать мощную ксеногенную РТПХ (Cieri N. et al., 2013). 21 1.2.2. Ткане-резидентные Т-клетки памяти (TRM) Помимо центральных и эффекторных Т-клеток иммунной памяти, выделяют популяцию нециркулирующих, ткане-резидентных Т-клеток памяти (TRM) (Mahnke Y.D. et al., 2013; Shin H., Iwasaki A., 2013). TRM являются ключевым звеном при защите слизистых поверхностей, эпительных барьеров, а также других лимфоидных и нелимфоидных органов от внедрения патогенов (Mueller S.N. et al., 2013; Turner D.L., Farber D.L., 2014). Для TRM клеток мышей и человека характерна экспрессия CD69 (таблица 3). Предполагают, что резидентные Т-клетки слизистых оболочек происходят от рекрутированных эффекторных Т-клеток, происходящих из лимфоидных органов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы, определяющие их миграцию в ткани. Сохранение TRM в периферических тканях, как полагают, опосредовано ингибированием их выхода через рецепторы S1PR1 и за счет межклеточных взаимодействий, опосредованных экспрессией интегринов. Самоподдержание и гомеостаз TRM в слизистых тканях зависит от компонентов микроокружения: цитокинов, конститутивного воспаления низкого уровня и сохранения антигена на месте (Turner D.L., Farber D.L., 2014). Роль CD4+ и CD8+ популяций TRM клеток активно обсуждается (Cauley LS, Lefrançois L., 2013; Mueller S.N. et al., 2013; Turner D.L., Farber D.L., 2014). Многие исследования были сосредоточены на приоритетной роли CD8+ TRM в местных защитных реакциях. Однако накапливается все больше сведений о TRM CD4+ Тклетках. Популяции рекрутированных TRM CD4+Т-клеток дифференцируются в тканях из эффекторных Т-клеток, в ответ на местное воспаление или инфекцию (рисунок 2). Предполагают, что такая компартментализация Т-клеток памяти в определенных участках тканей может обеспечить оптимальный дизайн для будущих стратегий вакцинации (Turner D.L., Farber D.L., 2014). 1.3. Фенотипическая характеристика и функциональные особенности Вклеток иммунной памяти Как уже упоминалось ранее, отличительной чертой адаптивного иммунного ответа является генерация долговременной защиты после первичного воздействия патогена. При гуморальном ответе эта защита состоит из устойчивых титров антител, 22 долгоживущих В-клеток памяти (memory B cells, MBCS) и плазматических клеток (plasma cells, PCs) (Shlomchik M.J., Weisel F., 2012). Процесс дифференцировки В-клеток чрезвычайно зависим от микроокружения и условий антигенной стимуляции. В связи с этим, В-клетки памяти представляют собой гетерогенную клеточную популяцию. B-клеточную память подразделяют на естественную и адаптивную; на Т-зависимую и Т-независимую; на изотиппереключенную и непереключенную; на мутированную и немутированную (Sanz I. et al., 2008). Естественные В-клетки памяти (natural memory B cells) дифференцируются из наивных B-клеток, в основном, в маргинальных зонах (marginal zones) лимфоидных органов и экспрессируют немутированные IgM. Их функциональная активность не зависит от Т-лимфоцитов (Dörner T. et al., 2009; Fournier E.M. et al., 2012). В отличие от естественных B-клеток памяти, дифференцировка адаптивных Влимфоцитов памяти (adaptive memory B-cells) является Т- и антигензависимой и происходит в герминативных центрах (germinal centers, GC) лимфоидной ткани (Hamel K.M. et al., 2012; Shlomchik M.J., Weisel F., 2012). GC - уникальная структура, которая формируется в течение иммунного ответа (ИО) на многие антигенные стимулы и заселяется активированными антигенспецифическими В- и Т-клетками (на ранних стадиях ИО). По своей сути, GC - пункт интенсивной пролиферации B-клеток и их гибели (Schmidlin H. et al., 2009; Chan T.D., Brink R., 2012; Shlomchik M.J., Weisel F., 2012). В-клетки в GC подвергаются соматической гипермутации и переключению изотипов; дарвиновский процесс эффективно выбирает В-клетки с более высокой способностью к выживанию и экспансии. В-клетки герминативного центра активируются и приобретают уникальный транскрипционный профиль, после чего они готовы к дифференциации либо в В-лимфоциты памяти или плазматические клетки (Sanz I. et al., 2008; Dörner T. et al., 2009; Shlomchik M.J., Weisel F., 2012). 23 TCM TRM TEM TSM Костный мозг TRM Легкие Лимфатические узлы Селезенка TCM TRM CCR7 Периферическая кровь Integrin α2 TCM TEM CCR4 CLA CCR10 CCR6 TCM TRM TEM TRM CD103+ CCR9 Integrin a4β7 TEM TSM CCR7 Лимфатические узлы Кожа TRM TRM CD103+ CCR4 CLA CCR10 TCM TRM Кишечник TRM TRM CD103+ + Рисунок 2. Основные и дополнительные пути миграции субпопуляций Т-клеток памяти: стволовых Т-клеток памяти (TSCM), центральных Тклеток памяти (TCM), эффекторных Т-клеток памяти (TEM) и ткане-резистентных Т-клеток (TRM) и их распределение в разных тканях (адаптировано из Farber D.L. et al., 2014) 24 Механизмы, определяющие направление дифференцировки В-клеток GC в сторону В-клеток памяти или плазматических клеток, а также потенциальные источники обоих типов клеток – активно обсуждаются. Предполагают, что GC подвергается временному переключению, которое изменяет направление дифференцировки с MBCs на PCs, в то время как иммунный ответ прогрессирует. При этом ключевая роль отводится В-клеточному рецептору (BCR) (Shlomchik M.J., Weisel F., 2012). Современные исследования свидетельствуют, что зародышевый центр (GC) может участвовать в патогенезе аутоиммунных заболеваний. События, происходящие в GC, т.к.селекция В-клеток с высоким аффинитетом, пролиферация В-клеток, и дифференцировка В-клеток в плазматические клетки, зависят от Т-клеток, в частности, от Тфолликулярных хелперов (Tfh). Последние характеризуются экспрессией транскрипционного фактора (В-клеточная лимфома 6), поверхностными молекулами (CD40-лиганд, СХСR 5, ICOS и др.), и продукцией цитокинов - IL-21, IL-6, IL-10, и т.д. Неконтролируемая генерация Tfh клеток в GC или на периферии может привести к формированию аутоиммунной реакции. Недавние исследования продемонстрировали, что повышение числа Tfh в периферической крови больных и в лимфоидных тканях мышей с красной волчанкой или ревматоидным артритом играет важную роль в гиперпродукции патологических аутоантител (Zhang X. et al., 2013). Moutai T. и др. (2014) показали, что мышиные В-клетки из зародышевых центров (IGB клетки), индуцированные in vitro из наивных В-клеток, становятся плазматическими клетками и продуцируют IgG- антитела в течение более чем месяца в костном мозге необлученных реципиентов. При адоптивном трансфере IGB клетки эффективно подавляют метастазы меланомы в легких в экспериментальных моделях, продлевая выживаемость реципиентов. Этими авторами разработана новая система культивирования - FAIS, позволяющая выборочно увеличивать число антигенспецифических клеток, в основе которой лежит высокая чувствительность IGB клеток к Fas-индуцированной гибели клеток, опосредованная отсутствием контакта между рецепторами к антигену и мембраносвязанными антигенами (Moutai T. et al., 2014). 25 Фенотипические и функциональные отличия В-клеток памяти от наивных предшественников малоизученны. Наивные B-клетки и B-клетки памяти имеют разный профиль цитокиновой продукции. Наивные B-клетки, в большей степени продуцируют TNF и лимфотоксин, а В-клетки памяти - IL-10. Различия между этими клетками затрагивают и их антигенпрезентирующие свойства (Sanz I. et al., 2008). Как и в случае с Т-клеточным ответом, высокий уровень первичного антительного ответа не гарантирует исходный уровень вторичного ответа. Zhang Q. и др. (2010) опубликовали данные, согласно которым пневмококковые липопротеины (лиганды для Toll-подобных рецепторов (TLR)-2) способны усиливать первичный антительный ответ у интактных детей, оказывая, в то же время, негативный эффект на вторичный иммунный ответ, развивающийся у ранее вакцинированных подростков (Zhang Q. et al., 2010). Ранее, поверхностная молекула CD27 cчиталась универсальным маркером B-клеток памяти человека. Относительно недавно была выявлена субпопуляция В-лимфоцитов памяти, негативная по CD27. CD27— В-клеткам отводят значимую роль в патогенезе красной волчанки и при некоторых вирусных инфекциях. Популяция В-клеток памяти является гетерогенной по экспрессии маркеров: CD38, СD21, СD24, СD19, B220, FCRН4 и CD25. Отличия экспрессии поверхностных маркеров B-клетками памяти находят отражение в их функциональной активности: CD27+СD25+ В-клетки секретируют больше IL-10 и меньше IL-2 в сравнении с СD27+СD25- В-клетками (Sanz I. et al., 2008). Одним из маркеров, связанных с функциональной активностью В-клеток памяти, является молекула CD73, катализирующая преобразование внеклеточных нуклеозидов в аденозин (Peng Z. et al., 2008). Высокая экспрессия молекулы CD73 регистрируется на Вклетках иммунной памяти крыс и усиливается после иммунизации на В-лимфоцитах зародышевых центров и фолликулярных T-хелперах, однако отсутствует на плазматических клетках и плазмобластах. Предполагают, что CD73-зависимый аденозиновый сигналинг играет ключевую роль в зрелом GC и необходим для создания долгоживущего компартмента плазматических клеток, подтверждая, тем самым, роль CD73 в гуморальном иммунитете (Conter L.J. et al., 2014). 26 Найден ключевой фактор - IL-21, способный модулировать процессы в зародышевом центре (GCs), определяя направление дифференцировки B-клеток (Reynaud C.A. et. al., 2012; Zotos D., Tarlinton D.M., 2012; Yang X. еt al., 2013). Как уже упоминалось, IL-21, необходимый для формирования GC, синтезируют Tfh CD4+ Тклетки. Однако центральная роль IL-21 в формировании GC больше направлена на генерацию Tfh-клеток, а не В-лимфоцитов. Для оптимальной продукции IL-21 необходима экспрессия индуцибельной костимуляторной молекулы (ICOS) на Tfhклетках, имеющей 19% гомологии с CD28. Показано, что костимуляторная активность IL-21 для дифференцировки Tfh-клеток работает на уровне Т-клеточного рецептора через сигналосому - сигнальную молекулу – Vav1 (Vogelzang A. et al., 2008). Ding Y. c коллегами (2014) установили, что высокие уровни IL-21 селективно увеличивают дифференцировку Tfh-клеток, с одновременным угнетением способности фолликулярных регуляторных T- клеток (Tfr) подавлять активность Tfh и Bлимфоцитов. Авторы предполагают, что IL-21 нарушает баланс Tfr/Tfh, способствуя развитию аутоиммунных реакций в GC у мышей BXD2 (Ding Y. et al., 2014). В то же время IL-21 рассматривают в качестве перспективной терапевтической мишени при системной красной волчанке, из-за способности IL-21 регулировать дифференцировку плазматических клеток (Deng X.M. et al., 2015). Очевидно, что функциональная гетерогенность В-клеток памяти заслуживает дальнейшего тщательного изучения. 1.4. Краткая характеристика отдельных представителей семейства цитокинов I типа, имеющих общую гамма цепь (γc) Цитокины семейства I типа (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21), имеющие общую γ-цепь (γc или CD132), способны оказывать комплексное воздействие на клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки (Schluns K.S., Lefrancois L., 2003; Benczik M., Gaffen S.L., 2004; Литвинова Л.С. и др., 2013). IL-2 представляет собой гликопротеин с массой - 14-17 кДа. IL-2 связывается с высокоафинным рецептором, который состоит из трех субъединиц: IL-2Rα (CD25), IL2Rβ (CD122) и γс(CD132) и не является стабильной гетеротримерной структурой (Wang 27 X. et al., 2005; Stauber D.J. et al., 2006; Goudy K. et al., 2013; Joly M., Odloak D., 2013). Связывание IL-2/IL-2Rα играет важную роль для функционирования IL2R in vivo. Для IL2-зависимых ответов продукция IL-2 и экспрессия IL-2R должны временно происходить в той же микросреде (Huse M. et al., 2006; Sabatos C.A. et al., 2008). IL-2-зависимая активность регуляторных клеток (Treg) и Т-клеток-эффекторов in vivo находятся под жестким физиологическим и антиген-зависимым контролем (Malek T.R., Castro I., 2010). Многими авторами было описано, что дефицит IL-2 приводит к формированию аутоиммунной патологии, вследствие нарушения функциональной активности Treg (Bayer A.L. et al., 2008; O'Gorman W.E. et al., 2009; Russell S.E. et al., 2012; Garg G. et al., 2012). Дефицит IL-2, CD25 или IL-2Rβ приводит к полиорганному воспалению и системному аутоиммунитету у мышей и человека (Yamanouchi J. et al., 2007; Cénit M.C., et al., 2013). Уникальная роль IL-2 в регуляции иммунитета связана скорее не с выполнением функции ростового фактора лимфоцитов, где его действие дублируется другими цитокинами, а больше с контролем за гиперактивацией иммунной системы или индукцией толерантности за счет стимуляции дифференцировки Тreg лимфоцитов in vivo (Malek T.R., Bayer A.L., 2004; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). IL-7 - гликопротеин с молекулярной массой 25 кДа. Первоначально, IL-7 был охарактеризован как гемопоэтический фактор роста, способный стимулировать пролиферацию лимфоидных клеток-предшественниц (Schluns K.S. et al., 2000; Surh C.D. et al., 2006; Venet F. et al., 2012). В настоящее время IL-7 рассматривается в качестве фактора роста и выживания для популяций наивных клеток-предшественниц и Т-клеток памяти (Schluns K.S. et al., 2000; Surh C.D. et al., 2006; Tan J.T. et al., 2001; Mengus C. et al., 2011). IL-7 продуцируют, преимущественно, стромальные клетки лимфоидной ткани (Barata J.T. et al., 2005; Mazzucchelli R. et al., 2007; De Bock M. et al., 2013). Рецептор IL-7 представлен на поверхности клетки в виде белков внеклеточного матрикса. Циркулирующая форма IL-7, необходимая для поддержания популяции Т-клеток при гомеостатической пролиферации, продуцируется и высвобождается стромальными клетками в костном мозге, лимфатических узлах, коже, кишечнике и печени (Janot-Sardet C. et al., 2010; Ponchel F. et al., 2011; Sammicheli S. et al., 2011; Silva de Azevedo R.I., 2011). Рецептор IL-7 (IL-7R) состоит из двух компонентов: уникальной цепи IL-7Rα 28 (CD127) и γc-цепи (Kovanen P.E. et al., 2004; Grenningloh R. et al., 2011; Haas J. et al., 2011; Lévy Y. et al., 2012). После связывания рецептора, Jak1 и Jak3, ассоциированные с IL7Rα и γc, соответственно, гетеродимеризуются и становятся фосфорилированными, создавая сайты стыковки для STAT5a/5b (Leonard W.J., 2001; Chehtane M. et al., 2010; Catalfamo M. et al., 2011). IL-15 – гликопротеин с молекулярной массой 14 кДа. IL-15 - медиатор, важный для развития, гомеостаза и функционирования CD8+ Т-клеток, NK-клеток, NKT-клеток и CD8α интраэпителиальных лимфоцитов (Nishimura H. et al., 2000; Fehniger T.A., Caligiuri M.A., 2001; Chen J. et al., 2013; Lee N. et al., 2014; Marçais A. et al., 2014). У человека IL-15 синтезируется моноцитами/макрофагами, дендритными и эпителиальными клетками стромы костного мозга, другими эпителиальными клетками, однако мРНК IL-15 не обнаружена в активированных Т- и В-лимфоцитах (Waldmann T.A., 2006). За счет общности строения рецепторов, IL-15 во многом обладает биологическими активностями, свойственными IL-2. Как уже упоминалось, оба рецептора имеют по три субъединицы, две из которых общие для IL-2 и IL-15. Специфичность действия связана с разными α-субъединицами рецепторных комплексов и различиями в экспрессии всех компонентов рецепторов на разных типах клеток. Опыты с knockout мышами позволили более точно определить роль IL-15 в регуляции иммунитета (Cooper M.A. et al., 2002). Как уже упоминалось ранее, сигналы IL-15 передаются через IL-2/15Rβ и общую γс-цепь. Доставка IL-15 к этим сигнальным компонентам осуществляется за счет уникального механизма – транспрезентации. Так, внутриклеточный IL-15 с высокой афинностью связывается с IL-15-связывающим белком - IL15Rα, затем курсирует к клеточной поверхности, где он стимулирует IL-15 сигнальные компоненты на соседних клетках через межклеточные взаимодействия. Транспрезентация разделяет субъединицы рецепторов цитокинов - IL-15 и IL-2, позволяя осуществлять более точную доставку в IL15 в чувствительные к нему клетки (Nishimura H. et al., 2000; Fehniger T.A., Caligiuri M.A., 2001). Обнаружение на клеточной поверхности комплекса IL-15-IL-15Rα является наиболее значимым для идентификации активно транспрезентирующих клеток (Stoniera S.W. et al., 2010). IL-15Rα отличается от IL-2Rα, и имеет высокое сродство к IL-15, независимое от компонентов β/γC. При отсутствии IL-15Rα, комплекс β/γC связывается с IL-15 со 29 средней аффинностью (Lorenzen I. et al., 2006; Hanick N.A. et al., 2007). Важность IL-15Rα в формировании IL-15-сигналинга была подтверждена изучением моделей дефицитных мышей IL-15 -/-, IL-15Rα -/-, которые имели нарушения функционирования CD8+ Тклеток, NK-клеток, NKT-клеток и CD8α-интраэпителиальных лимфоцитов (Becker T.C. et al., 2002; Ranson T. et al., 2003). Изучение эффектов IL-15 показало, что он может индуцировать многие из тех реакций, которые опосредуются IL-2 in vitro, например, пролиферацию Т-клеток (Waldmann T.A., 2006). Однако механизм действия IL-15 существенно отличается от такового у IL-2. In vivo характер экспрессии IL-15Rα гораздо шире, чем у IL-2Rα и перекрывается с экспрессией IL-15, по крайней мере, на уровне транскриптов. В то время как экспрессия IL-2Rα, в основном, ограничивается Т-клетками, IL-15Rα экспрессируется практически каждой ядросодержащей клеткой разных типов тканей. Однако исследования с нокаутом IL-15 показали, что главной мишенью IL-15 являются лимфоциты. Кроме того, для ответа на IL-15 in vitro, присутствие IL-15Rα необязательно. Это может свидетельствовать о том, что IL-15Rα лишь усиливает сигнализацию, но не приводит к увеличению афинности IL-15 для комплекса β/γC (Kennedy M.K. et al., 2000; Stonier S.W. et al., 2008). 1.5. Влияние цитокинов семейства I типа, имеющих общую гамма цепь рецепторов (γc) на гомеостаз Т-клеток IL-2 считается самым ранним цитокином, индуцированным после активации Тклеточного рецептора (TCR), в частности, у CD4+ Т-клеток. Как правило, это происходит в менее дифференцированных клетках, таких как - TSCM и TCM, особенно в отсутствии TNFα и IFN-γ, и играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и выживании антиген-специфических Т-клеток (Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004). Интенсивное и постоянное воздействие IL-2 способствует образованию/генерации короткоживущих CD8+ клеток-эффекторов за счет индукции клеток иммунной памяти (Kalia V. et al., 2010; Pipkin M.E. et al., 2010). Данные, представленные Waysbort N. и др. (2013), позволяют выделять различные временные фазы активации Т-клеток, связанные с продукцией IL-2. Во-первых, антиген30 зависимые сигналы активируют низкую экспрессию IL-2R α и высокую - IL-2, независимо от IL-2 сигналинга. Впоследствии, секреция IL-2 способствует высокой экспрессии IL-2R α, уменьшая синтез IL-2 и пролиферацию клеток. Этот переход не зависит от TCR-сигнализации (Waysbort N. et al., 2013). Кроме того, обнаружен весьма интересный факт, свидетельствующий, что Т-клетки могут масштабировать свою, так называемую коллективную продукцию IL-2, к общему количеству антигена в широком динамическом диапазоне, независимо от численности клеточной популяции. Посредством экспериментального количественного анализа и вычислительного моделирования выявлено, что масштабирование обеспечивается путем ингибирования перекрестных связей между антигеном и IL-2- сигнализацией и нелинейного ускорения IL-2 секреции на клетку (Tkach K.E. et al., 2014). Взаимодействие IL-2 с высокоаффинным рецептором на Т-лимфоцитах является ключевым моментом, который обеспечивает запуск сигнальных событий, непосредственно регулирующих вступление покоящихся Т-лимфоцитов в клеточный цикл (Ярилин А.А., 1999; Leonard W.J., Lin J.X., 2000; Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004). Поскольку Т-клетки памяти находятся в G1 фазе клеточного цикла, это способствует их более быстрому входу в IL-2-зависимую фазу иммунного ответа (Ярилин А.А., 1999). IL-2 в условиях in vitro является необходимым фактором роста для CD4+ Т-клеток памяти. В то же время, сведения, касающиеся роли IL-2 в клональной экспансии примированных CD4+-Т-лимфоцитов в условиях in vivo носят весьма разнородный характер (Kneitz B. et al., 1995; Khoruts A. et al., 1998; Lantz O. et al., 2000; Leung D.T. et al., 2000; Schluns K.S., Lefrancois L., 2003). Некоторые авторы отрицают роль IL-2 в клональной экспансии CD4-клеток памяти (Lantz O. et al., 2000), тогда как другие, напротив, указывают на участие IL-2 в этом процессе, за счет индукции их апоптотической гибели (Khoruts A. et al., 1998; Schluns K.S., Lefrancois L., 2003). Неоднозначные данные и в отношении действия ростового фактора - IL-2 на процессы активации и генерации цитотоксических СD8+ Т-клеток памяти. В эксперименте на трансгенных мышах было показано, что IL-2 значительно усиливает их апоптоз (Ku C.C. et al., 2000) и подавляет пролиферацию CD8+-Т-клеток памяти in vivo, 31 преимущественно за счет его опосредованного влияния на другие субпопуляции клеток, преимущественно - регуляторные Т-лимфоциты (CD25+CD4+) (Kamimura D. et al., 2004). Противоположным IL-2 действием обладает IL-15 (Ku C.C. et al., 2000; Kamimura D. et al., 2004). Однако оба этих цитокина - IL-2 и IL-15 in vivo стимулируют пролиферацию CD8+-Т-клеток памяти (Schluns K.S., Lefrancois L., 2003). Интересно, что для CD8+ Тклеток памяти характерен высокий уровень экспрессии IL-2R β-цепи, который имеет положительную корреляцию с чувствительностью лимфоцитов к действию IL-15 (Zhang X. et al., 1988). Следует отметить, что после активации Т-клеток, экспрессия IL-2Rα происходит быстро, но кратковременно, тогда как повышение экспрессии IL-15Rα поддерживается на должном уровне достаточно долгое время (Brincks E.L., Woodland D.L., 2010). В экспериментах на IL-15- и IL-15Rα-дефицитных мышах было установлено, что IL-15 необходим как для генерации нормального числа антиген-специфических CD8+ Т-клеток, так и для поддержания их функциональной активности (продукция эффекторых цитокинов) (Chow K.P. et al., 2012). IL-15 является мощным ингибитором Fas/FasL-индуцированного апоптоза эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти (Mueller Y.M. et al., 2003; Fas S.C. et al., 2006; Strasser A. et al., 2009). Во время инициации Т-клеточного ответа, IL-15 вовлечен в активацию дендритных клеток (DC) (Chijioke O., Münz C., 2013; Sehgal K. et al., 2014). Показано, что IL-7 играет важную роль в выживании CD4+ и CD8+ Т-клеток. Эффекты IL-7, наряду с IL-15, обусловлены регуляцией Bcl-2 семейства: IL-7 индуцирует экспрессию антиапоптотических факторов Bcl-2 и Мсl-1 и, напротив, инактивацию факторов апоптоза - Bax и Bad, что обеспечивает устойчивость Т-клеток к Fas/FasL апоптозу (Marsden V.S., Strasser A., 2003; Jiang Q. et al., 2004; Cai K. et al., 2013). В сочетании с TCR-сигналингом, IL-7 является ключевым цитокином, необходимым для выживания наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток и для поддержания Тклеток памяти (Kondrack R.M. et al., 2003; Li J. et al., 2003; Alves N.L. 2007; Wallace D.L. et al., 2006; Dooms H.et al., 2007; Shou C. et al., 2011; Osborne L.C. et al., 2011). IL-7 также является важным фактором в генерации и поддержании функционального эффекторного ответа. IL-7R-дефицитные мыши испытывают тяжелые лимфопении и утрачивают Т-клеточные функции, что может быть скорректировано избыточной экспрессией Bcl-2 (Kondrack R.M. et al., 2003, Li J. et al., 2003). 32 IL-7R играет важнейшую роль в дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Тклетки иммунной памяти (Appay V. et al., 2007). IL-2 и IL-7 оказывают взаимное влияние. IL-2-/- Т-клетки экспрессируют более высокие уровни IL-7R (Hoyer K.K. et al., 2008) и блокируют IL-2Ra цепи (CD25), что индуцирует увеличение продукции IL-7, опосредующего гомеостатическую пролиферацию Т-клеток (Monti P. et al., 2009). С другой стороны, IL-2 положительно влияет на формирование IL-7Rhi клеток памяти (Dooms H., 2010; Kameyama K. et al., 2010). Кроме того, эти цитокины играют важную роль в формировании Tregs в тимусе и развитии IL-7R сигнализации, способствующей поддержанию периферического гомеостаза (Bayer A.L. et al., 2008; Katzman S.D. et al., 2011). Экспрессия цепей рецептора IL-7 может регулироваться экзо- и эндогенными факторами. В частности, у ВИЧ-инфицированных пациентов снижение экспрессии IL-7Rα-цепи (CD127) на CD8 Т-клетках, опосредованное растворимым белком Tat, восстанавливается после антиретровирусной терапии с устойчивым подавлением вируса (Faller E.M. et al., 2014). Система IL-2/IL-7 действует как переменный цикл подавления и активации Тклеточных ответов для поддержания баланса между иммунитетом и толерантностью. Нарушение равновесия способствует развитию иммунопатологических состояний. Разработка способов локального восстановления баланса цитокинов может нести терапевтический эффект (Bayer A.L. et al., 2008, Katzman S.D. et al., 2011). Установлено, что наивные CD45RA+ Т-лимфоциты и CD45RO+ Т-клетки памяти человека в естественных условиях (in vivo) могут поддерживать свое численное постоянство без антигенной стимуляции, за счет гомеостатической пролиферации, опосредованной действием цитокинов (Geginat J. et al., 2002). При этом чувствительность Т-лимфоцитов к цитокинам (rIL-2, rIL-15, rIL-7), имеющим общую γ-цепь зависит от стадии их дифференцировки и не зависит от TCR-стимуляции (Geginat J. et al., 2001; 2002; Jaleco S. et al., 2003), демонстрируя разные требования к передаче активирующего сигнала. Согласно (Geginat J. et al., 2001; 2002), для гомеостатической пролиферации наивных CD45RA+ Т-лимфоцитов, в отличие Т-клеток памяти, требуется костимуляция цитокинами (TNF-α, IL-6, IL-10, и IL-12) дендритных клеток, которые положительно регулируют экспрессию IL-2/15Rβ и γc-цепи (Nakarai T. et al., 1994), 33 индуцируя, тем самым пролиферацию наивных Т-клеток и увеличение Т-клеток памяти в ответ на действие цитокинов, имеющих общую γc цепь (IL-2, IL-4, IL-7 и IL15). При этом наивные Т-клетки избирательно реагируют на IL-4. Такая дифференциальная чувствительность СD45RA+ клеток к цитокиновым стимулам зависит от экспрессии и модуляции соответствующих рецепторов. Интересным является тот факт, что CD4+CD45RA+ Т-лимфоциты, количество которых увеличено под влиянием цитокинов, поддерживают «наивный» фенотип, тогда как CD45RO+ Тклетки дифференцируются, приобретая эффекторные функции и изменяя экспрессию хемокиновых рецепторов. Существуют данные, что IL-7 и IL-15 с высокой эффективностью увеличивают число эффекторных T-клеток, менее чувствительны к ним центральные T-клетки, а наивные Т-лимфоциты вовсе не реагируют (Geginat J. et al., 2001; 2002; 2003). Относительно недавно было выявлено, что мышиные наивные CD8+ Т-клетки подвергаются пролиферации после синергического моделирования воспалительными цитокинами. Такая цитокин-управляемая, антигеннезависимая активация делает наивные CD8+ Т-клетки «чувствительными» (праймирует), и наделяет способностью к продукции эффекторных цитокинов и мощной цитолитической активности. Авторы полагают, что синергизм цитокинов, вызывающих антиген-независимую активацию и премирование наивных CD8+ Т-клеток, может внести значительный вклад в переход от врожденного к адаптивному иммунному ответу и привести к случайной активации клонов аутореактивных CD8+ Т-клеток (Ramanathan S. et al., 2009). Гомеостатическая пролиферация более значима в поддержании численности + CD8 Т-лимфоцитов памяти in vivo, вследствие увеличения чувствительности к IL-15 (Moniuszko M. et al., 2004; Surh C.D., Sprent J., 2005; Ramanathan S. et al., 2009; Castillo E.F., Schluns K.S., 2012). CD8+-Т-клетки памяти (CD44hi или CD122hi) проявляют большую чувствительность к IL-15-индуцированной пролиферации, нежели наивные CD8+-лимфоциты, а также CD4+-клетки разной степени дифференцировки. Этот факт связывают с высокой экспрессией IL-15R на цитотоксических лимфоцитах памяти (Lodolce J.P. et al., 1998; Kennedy M.K. et al., 2000). IL-15 является более мощным агентом пролиферации для CD8+-Т-клеток памяти, чем IL-2 (Geginat J. et al., 2003; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003). CD4+ Т-клетки памяти in vivo пролиферируют только 34 в ответ на IL-7 (Geginat J. et al., 2001; Schonland S.O. et al., 2003, Shou C. et al., 2011), а IL-15 in vivo - способствует их выживанию (Mueller Y.M. et al., 2003). 1.6. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Тлимфоцитов 1.6.1. Молекулы активации Т-клеток Молекула костимуляции CD69. СD69 – интегральный трансмембранный гликопротеин II типа, относится к лектинам C-типа. CD69 вовлечен в процессы ранних функциональных преобразований лимфоцитов, моноцитов, натуральных киллеров (NKклетки), а также активацию нейтрофилов, эозинофилов и тромбоцитов. CD69 формирует димеры на клеточной мембране, которые выступают в качестве трансдуктора сигнала, усиливая клеточную активацию (De Maria R. et al., 1994; Marzio R. et al., 1999; Hasegawa A., Nakayama T., 2010). CD69 действует как молекула костимуляции для Т-клеточной активации и пролиферации, включая механизм увеличения концентрации внутриклеточного Ca++, синтез различных цитокинов и их рецепторов (Clausen J. et al., 2003; Freeman B.E. et al., 2012). CD69 не экспрессируется на покоящихся лимфоцитах периферической крови, но появляется после активации лимфоцитов в течение 1–2 часов после антигенной стимуляции, через механизм, опосредованный активацией p21ras (D’Ambrosio D. et al., 1994). Экспрессия CD69 требует синтеза матричной РНК и является очень непостоянной, так как матричная РНК быстро деградирует под действием функционального мотива AUrich. CD69 имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез IL-2. Сигналы, поступающие с CD69, вызывают увеличение как продукции этого цитокина, так и количество рецепторов к нему на иммунокомпетентных клетках (IL-2Rα), экспрессию которых принято считать одной из ключевых стадий процесса активации (Marzio R. et al., 1999). Показано, что экспрессия CD69 имеет решающее значение для формирования и поддержания специализированных T-лимфоцитов памяти, эффективно формирующих гуморальный иммунитет поздней фазы иммунного ответа (Shinoda K. et 35 al., 2012). Кроме того выявлено, что экспрессия CD69 лимитирует дифференцировку Th0лимфоцитов в провоспалительные хелперные Т-клетки (Th17). Этот процесс тесно сопряжен с протеиновым Jak3/Stat5 сигнальным путем регуляции (Martin P. et al., 2010). Особого внимания заслуживает роль СD69 при патологии. Высокая плотность этих молекул регистрируется на Т-клетках, полученных из воспалительных инфильтратов при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит, вирусные гепатиты, бронхиальная астма, аутоиммунные заболевания щитовидной железы и др. На сегодняшний день CD69 рассматривается в качестве возможной терапевтической мишени для лечения артрита и астмы у человека (Hasegawa A., Nakayama T., 2010). Повышенная экспрессия маркеров ранней активации, в частности, CD69, CD25 и HLADR, обнаружена на CD3+ Т-лимфоцитах при болезни Кавасаки. Авторами показано, что активация СD3+ Т-клеток на ранних и промежуточных стадиях этого заболевания, является одним из основных механизмов, ответственных за формирование сердечнососудистой патологии (Zhang Y.Y. et al., 2006). Выявлено, что Т-клетки с высокой экспрессией молекулы CD69 способствуют опухолевой прогрессии: при контакте с аутологичными CD69+-Т-клетками, опухоль-ассоциированные макрофаги приобретают способность продуцировать гораздо большее количество белка с ферментативной активностью, обладающего иммуносупрессивным действием - IDO (indoleamine 2,3 диоксигеназа). Последний избыточно экспрессируется в различных типах опухолей, включая рак молочной железы, гепатоцеллюлярная карцинома и др. (Soliman H. et al., 2013; Zhao Q. et al., 2012). В тоже время уменьшение содержания неактивированных Тклеток (CD69-) в пуповинной крови, секретирующих гамма-интерферон (IFNy+/CD69-), является сильным и независимым предиктором формирования атопического дерматита у детей младенческого возраста (Tereshchenko S. et al., 2012). Интересным является факт, что NK-клетки, полученные от лиц с активной формой СКВ, наряду с низкой цитотоксичностью, обладают уникальными фенотипическими характеристиками, в том числе, для них характерна высокая экспрессия молекул CD69 и NKG2A и низкая рецепторов типа Fcγ IIIa/CD16, CD8α, а также иммуноглобулин-подобного рецептора клеток-киллеров (KIR) KIR2DL1/KIR2DS1 (Hervier B. et al., 2011). 36 CD25 (α-цепь рецептора IL-2). Запуск пролиферативного ответа Т-лимфоцитов – многокаскадный процесс, в котором ключевую роль играет экспрессия Т-клеточного ростового фактора интерлейкина-2 (IL-2) и его рецептора (IL-2R) (Lin J., Weiss A., 2001). Этот рецептор несут на своей мембране различные типы клеток периферической крови: CD4+, CD8+, NK- и CD4+NKT-клетки, В-клетки, моноциты (Луговская С.А. и др., 2005). На покоящихся лимфоцитах крови человека рецептор IL-2 является димером (состоит из субъединиц β (CD122) и γс (CD132)) и способен к проведению сигнала, который индуцируется после связывания с лигандом - IL-2. Однако он обладает низким сродством к IL-2 (Leonard W.J., Lin J.X., 2000; Gaffen S.L., 2001; Eicher D.M. et al., 2002). В процессе активации антигеном, в Т-клетках формируется гетеродимерный компонент, в состав которого кроме цепей β и γс, входит α-цепь (CD25) (Waldmann T.A., 1994; Ярилин А.А., 1999; Gaffen S.L., 2001). Появление α-цепи в составе рецептора к IL-2 на нормальных лимфоцитах человека приводит к повышению сродства рецептора к IL-2 на несколько порядков. Взаимодействие IL-2 с высокоаффинным рецептором на Тлимфоцитах является тем ключевым моментом, который обеспечивает запуск сигнальных событий, непосредственно регулирующих вступление покоящихся Тлимфоцитов в клеточный цикл (Ярилин А.А., 1999; Leonard W.J., Lin J.X., 2000; Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004). Хотя CD25 может кратковременно присутствовать на различных активированных CD4+ Т-лимфоцитах, интенсивность экспрессии этого маркера на регуляторных клетках (Тreg) (CD25high) выше, чем в других субпопуляциях Т-лимфоцитов (Baecher-Allan C. et al. 2001; Jonuleit H. et al., 2001; Sanchez J. et al., 2004). Биологическая функция CD4+CD25+ T- клеток – поддержание клонального баланса среди лимфоидных клеток и предотвращение избыточной активации иммунной системы (Чередеев А.Н. и др., 1999; Graca L., Gobbold S.P., 2002; Karim M. et al., 2002). Повышение числа CD4+CD25+ Т-клеток может происходить при воспалительных процессах любой этиологии (инфекционного и неинфекционного генеза, аутоиммунных заболеваниях и др.) (Chatila T.A., 2005; Литвинова Л.С. и др., 2012). Один из механизмов, за счет которого CD4+CD25+ реализуют свой супрессорный потенциал, связан с действием внутриклеточных перфоринов и гранзимов (Grossman W.J. et al., 2004). Эти 37 медиаторы могут оказывать прямой цитотоксический эффект на эффекторные CD8 и хелперные CD4 Т-лимфоциты (Thompson C.B., Allison J.P., 1997; Dieckmann D. et al., 2002). На основании ряда экспериментов сделан вывод, что экспрессия IL-2Rα в Тлимфоцитах человека, запускаемая антигеном через Т-клеточный рецептор, происходит с участием Src-киназ. В то время как IL-2, продуцируемый антиген-активированной клеткой, усиливает и продлевает экспрессию IL-2Rα через JAК-зависимый путь внутриклеточной сигнализации (Зенин В.В. и др., 2011; Шатрова А.Н. и др., 2011). Вышесказанное позволяет считать молекулу CD25 - «ранним» маркером активации лимфоцитов, экспрессия которой отражает их способность к пролиферации и дифференцировке (Graca L., Gobbold S.P., 2002). Особого внимания заслуживает субпопуляция CD8+ Т-клеток памяти с фенотипическим профилем - CD8+CD25+. Последние имеют поликлональный репертуар TCR и обладают способностью пролиферировать в ответ на стимуляцию IL-2. Выявлено, что накопление этих клеток происходит, в основном, в пожилом возрасте и является необходимым условием для развития иммунной реакции при отсутствии наивных Тклеток (Herndler-Brandstetter D. et al., 2005). Молекула гистосовместимости HLA-DR. HLA-DR поверхностный маркер лимфоцитов, принадлежащий к молекулам гистосовместимости MHC II. Его экспрессия характерна для В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, клеток-предшественниц, а также зрелых, активированных Т-лимфоцитов. HLA-DR является маркером не только поздней, но и длительной активации клеток, т.е. HLA-DR позитивные лимфоциты продолжительно циркулируют в крови, а экспрессия этого маркера наиболее полно отражает активационное состояние клеток (Stites D. et al.,1986; Tomkinson B.E. et al., 1987; Levacher M. et al.,1990; Чередеев А.Н. и др., 1999). Согласно современным представлениям, система HLA, обеспечивая регуляцию иммунного ответа, осуществляет такие важнейшие функции как взаимодействие иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных, в том числе измененных собственных клеток, запуск и реализацию иммунного ответа, 38 обеспечивая выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии (Хаитов Р.М., 2009). Показано, что количество HLA-DR+ Т-клеток, преимущественно CD8+, увеличивается при медленных вирусных инфекциях (ВИЧ), и некоторых аутоиммунных заболеваниях, а также при старении (Imamichi H. et al., 2012; Kobayashi H. et al., 2012). Высокий процент активированных Т-клеток с фенотипом CD4+HLA-DR+CD38 + и CD8+HLA-DR+CD38+ Т-клеток (по сравнению со здоровыми донорами) регистрируется при болезни Шагаса, ассоциированной с хронической кардиопатией (Giraldo N.A. et al., 2013). 1.6.2. Маркеры пролиферативной активности CD71 (рецептор трансферрина). Рецептор трансферрина представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 180-190 кДа. Этот антиген присутствует в больших количествах на плазматической мембране эритропоэтических клеток. Кроме того, наличие рецептора показано на поверхности клеток плаценты, печени, лимфоцитах и некоторых опухолевых клеток (Beguin Y., 1992; Marsee D.K. et al., 2010). Было клонировано два трансферриновых рецептора – TfR1 и TfR2. Однако именно TfR1 считается основным белком, ответственным за поступление железа в клетку, из-за его высокой аффинности (Marsee D.K. et al., 2010). На мембранах нормальных покоящихся Т-клеток, экспрессия TfR1 очень низкая, однако после 48-60 часов неспецифической стимуляции митогеном ФГА, уровень TfR1 значительно увеличивается (Li L. et al., 2010). Недостаточность экспрессии CD71 ведет к нарушению пролиферативных процессов (Newman R. et al., 1982; Baynes R. D. et al., 1994; Хаитов Р.М., 2009). С другой стороны, нарушения, приводящие к усилению экспрессии данного маркера, лежат в основе развития опухолевых заболеваний (Тупицын Н.Н. и др., 2001; Олейник Е.К. и др., 2006). Так, экспрессия рецепторов трансферрина (CD71) регистрируется в опухолевых клетках гематогенного (НХЛ из клеток фолликулярных 39 центров, анапластическая крупноклеточная НХЛ и др.) и негематогенного (клеточные линии эзофагиального рака (OE21), опухолевые клетки молочной железы и др.) происхождения (Самойлова Р.С., Булычева Т.Н., 2005; Urbani S. et al., 2006; Артамонова Е.В., Тупицын Н.Н., 2007). В последнее время активно разрабатываются технологии селективного истощения аллореактивных донорских Т-клеток с удалением лимфоцитов, активно экспрессирующих молекулы CD25 и CD71, что на выходе дает пул клеток с выраженными противовирусными свойствами при минимальной способности вызывать РТПХ (Albon S.J. et al., 2013). Важно отметить, что CD71, наряду с CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166 и HLA-AB, является маркером МСК (Ranera B. et al., 2011). CD127 (IL-7Rα). Важную роль в пролиферации и дифференцировке наивных и зрелых Т-клеток играет рецептор IL-7Rα (CD127) (Zaunders J.J. et al., 2006). Экспрессия IL-7R связана с поддержанием Т-клеточного гомеостаза, что определяется взаимодействием сигнальных систем: Т-клеточного рецептора (TCR) и IL-7R (Carrette F., Surh C.D., 2012). CD127 - α-цепь гетеродимерного рецептора IL-7R, который состоит из CD127 и общей γ-цепи, которая представлена и у других цитокиновых рецепторов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, и IL-21R). CD127 экспрессируется на тимоцитах, T- и B-клетках предшественницах, зрелых T-лимфоцитах, моноцитах, и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках. Установлено, что активация Т- клеток приводит к резкому снижению экспрессии CD127 (Simonetta F., Chiali A. et al., 2010; Crawley A.M., Angel J.B., 2012). Исследования показали низкую экспрессию CD127 на Treg клетках (Liu W. et al., 2006). При этом инкубация Treg клеток с IL-7 in vitro приводит к повышению экспрессии CD127, что значительно повышает их выживаемость. Высокий уровень экспрессии CD127 выявляется у наивных клеток-предшественниц и у Т-лимфоцитов памяти. Цитотоксические клетки с фенотипом CD8+CD127+CCR7+ появляются при спонтанном клиренсе вирусной инфекции, с восстановлением их функций (Boettler T. et 40 al., 2006; Urbani S. et al., 2006). В противоположность этому, хронизирующиеся вирусные инфекции (гепатиты В и С, ВИЧ и др.) сопровождаются стойким снижением количества антигенспецифических CD8+ клеток, экспрессирующих CD127+ (Lv G. et al., 2010). В частности, вирусспецифические CD8+CD127+(hi) Т-клетки сохраняются как долгоживущие клетки памяти только у ВИЧ-инфицированных лиц, получавших антиретровирусную терапию на ранних стадиях развития инфекции (Sabbaj S., Heath S.L. et al., 2007). Кроме того, ВИЧ инфекция сопровождается не только снижением субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток (в том числе и с фенотипом CD127+132-), но и увеличением пропорции активированных/терминально дифференцированных Т-клеток с фенотипом CD127-132+ Ki-67+Bcl-2 (low), содержащих повышенные уровни ВИЧ-ДНК (Sasson S.C. et al., 2012). Показано, что отсутствие таких промоторов апоптоза как Bim (Bcl-2 interacting mediator of death), способствует переходу значительного числа CD4+ и CD8+ Т-клеток-эффекторов после острого Т-клеточного ответа в Т-клетки памяти с экспрессией характерного антигена - CD127 (Wojciechowski S. et al., 2006). 1.6.3. Молекулы апоптоза Естественным завершением дифференцировочного процесса является активационный апоптоз. Факторы, оказывающие влияние на запуск программированной гибели клетки, весьма многочисленны и разнообразны. Один из возможных путей реализации апоптоза может быть осуществлен в результате влияния экзогенных факторов, действующих через специализированные “рецепторы смерти” Fas, TNFR1, DR-3, DR-4, DR-5, DR-6 и другие (Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006; Krampe B., AlRubeai M., 2010; Кайгородова Е.В. и др., 2012). Fas/APO-1 (CD95), способен запускать в клетке апоптоз после взаимодействия с его лигандом (FasL) (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Fas конститутивно экспрессируется на кортикальных тимоцитах, фибробластах, кератиноцитах, гепатоцитах и циркулирующих Т-лимфоцитах памяти. При активации клеток экспрессия CD95 в наибольшей степени повышается на нейтрофилах, гепатоцитах, CD4+-лимфоцитах, что 41 характеризует их высокую чувствительность к FasL-индуцированному апоптозу (Peter M.E., Krammer P.H., 2003). FasL экспрессируется клетками передней камеры глаза, клетками Сертоли и, в значительной степени, - активированными Т-лимфоцитами (Степанов Ю.М. и др., 2000; Strasser A. et al., 2009). Взаимодействуя с Fas-рецептором в виде мембраноассоциированного или растворимого белка, FasL становится основным индуцирующим фактором апоптотической гибели клеток-мишеней при инфекционных (вирусные гепатиты, СПИД и др.) и аутоиммунных (аутоиммунный гепатит, аутоиммунная гемолитическая анемия, артрит) заболеваниях (Петухов В.И., 2000; Жукова О.Б. и др., 2006). Экспрессия молекулы CD95 слабо выражена на мембранах покоящихся Т-клеток, увеличиваясь в 10 раз после активации. При этом FasL экспрессируется только активированными Т-лимфоцитами (Drappa J. et al., 1993; Yoshino T. et al., 1994). Антиапоптотическая молекула Bcl-2. Семейство Bcl-2 представляет собой комплекс митохондриальных белков, которые регулируют программированную гибель клеток. Формируя различные гомодимеры и гетеродимеры они могут либо способствовать, либо препятствовать развитию апоптозу (Eskes R. et al., 1998). Известно, что Bcl-2 ингибирует р53-зависимый и независимый апоптоз. При этом Bcl-2 способствует образованию в митохондриях ионных каналов, стабилизируя этим митохондриальную цитохром-оксидазу С и связывает белки, участвующие в апоптозе. Цитохром-оксидаза С способна инициировать активацию каскада каспаз и, как следствие, деградацию ДНК и апоптоз (Антонеева И.И., Петров С.Б., 2008). Как показывает ряд исследований, излишняя экспрессия антиапоптозных белков способствует устойчивости некоторых опухолей к апоптотическим стимулам (Hellemans P. et al., 1995). Аналогичная картина характерна для хронических воспалительных процессов. Так, при ревматоидном артрите иммунное воспаление суставов вызвано тем, что зрелые иммунные T–лимфоциты в синовиальных полостях своевременно не погибают путем апоптоза, а продолжают продуцировать провоспалительные цитокины (IL-17, IL-21, TNFa и др.). Кроме того, в синовиальных T–лимфоцитах аномально повышена экспрессия антиапоптозных белков Bcl–2 и Bcl–xL (Хаитов Р.М., 2009). 42 1.6.4. Молекулы межклеточной кооперации Рецептор-фермент CD38. Молекула CD38 — это бифункциональный рецепторфермент с молекулярной массой 46 кД, участвующий в передаче внутриклеточной сигнальной информации, а так же в межклеточной коммуникации клеток различной природы (Хаитов Р.М. и др., 1995; Lee H.C., 2000). CD38 экспрессируется на разных клетках, включая клетки крови, центральной нервной системы, поджелудочной железы, кардиомиоциты (Ferrero E., 2000; Okamoto H., Takasawa S., 2002; Flora A. et al., 2004). Этот мембранный нуклеотид-метаболизирующий фермент служит также активационным поверхностным маркером зрелых клеток, отражающим степень активности клеточного звена иммунитета (Janeway C.A., Travers P., 1994). CD38 обеспечивает проводимость сигнала активации в Т-клетки и является регулятором в гуморальном ответе, так как участвует и в В-клеточной активации. Клетки с высоким уровнем экспрессии CD38 проявляют низкую пролиферативную активность, но обладают высоким потенциалом в отношении продукции IL-2 и IFNγ (SandovalMontes C., Santos-Argumedo L., 2005). Кроме того, определена его роль в процессе адгезии лимфоцитов к эндотелию сосудов (Lund F.E. et al., 1998). Экспрессия CD38 регистрируется на самых ранних стадиях дифференциации лимфоцитов. На промежуточных этапах созревания клетки экспрессия CD38 прекращается и возобновляется на зрелых лимфоцитах, находящихся на поздних стадиях активации (Ярилин А.А., 1999). Недавние эксперименты продемонстрировали, что IL-15 усиливает супрессорную активность CD8(+)CD38(high) T-клеток и контролирует их выживание и экспансию. Показана способность этих клеток угнетать пролиферацию CD4+ эффекторных лимфоцитов. Кроме того, мышиные T-клетки с фенотипом CD8+CD38(high), являются потенциальными ингибиторами чрезмерной иммунной (в том числе аутоиммунной) реакции (Kolber M.A., 2008; Bahri R. et al., 2012). 43 Молекулы позитивной (CD28, ICOS) и негативной (CD152) костимуляции. CD28 и CD152 (CTLA-4) играют важную и сложную роль в контроле иммунного гомеостаза. Эти молекулы являются первичными корецепторами на Т-клетках, которые опосредуют негативную и позитивную костимуляцию, при помощи одних и тех же лигандов на АПК - CD80 и CD86 (Brunner M.C. et al., 1999). Активация CD28 затрагивает механизмы, опосредующие повышение продукции IL-2 и, как следствие - Т-клеточную пролиферацию. После прохождения нескольких циклов пролиферации, на мембране T– лимфоцита регистрируется экспрессия CTLA–4. CTLA–4 связывает B-7 с существенно большей (примерно в 20 раз) аффинностью, чем молекула CD28. Однако CTLA–4 посылает в клетку негативный сигнал, ингибирует транскрипцию IL-2 и тем самым останавливает пролиферацию антигенспецифичного клона (Brunner M.C. et al., 1999; Хаитов Р.М., 2009), даже в предварительно активированных Т-лимфоцитах (Chuang E. et al., 2000). Мыши с нокаутом по гену CTLA–4 погибают от лимфопролиферативных процессов (Хаитов Р.М., 2009). Поверхностная экспрессия CD152 в большинстве случаев индуцируется сигналом с TCR, однако может усиливаться и растворимыми факторами (Egen J.G., Allison J.P., 2002; Gimsa U. et al., 2004). Экспрессия CD152 становится максимальной через 48-72 часа после стимуляции Т-клеток, что коррелирует со снижением экспрессии Bcl-хL, и в это же время наблюдается максимальный пик функционирования CD152 (Noel P.J. et al., 1996). Функциональность CD152 напрямую зависит от регуляции её экспрессии на мембранах клеток, и только ограниченное количество активированных Т-клеток могут экспрессировать данный маркер (Maszyna F. et al., 2003; Pandiyan P. et al., 2004). Однако между CD152 и CD28 возможны синергичные взаимодействия, что, в частности, выражается в резистентности клеток к апоптозу (Kirchhoff S. et al., 2000; Pandiyan P. et al., 2004; Kolar P. et al., 2009). Таким образом, по мере развития процессов активации в T-лимфоцитах в них возрастает и экспрессия собственного ингибирующего фактора. Вероятно, именно экспрессия ингибирующих рецепторов на некоторой части иммунных лимфоцитов превращает их в пул лимфоцитов памяти (Хаитов Р.М., 2009). 44 Активация уже иммунокомпетентных лимфоцитов не зависит от CD28. Предположительно, корецептором активации иммунных T-лимфоцитов является индуцибельная принадлежащая мембранная к молекула семейству - ICOS (англ. Inducible иммуноглобулиноподобных CO-Stimulator), костимуляторных поверхностных молекул CD28. ICOS имеет 19% гомологии с молекулой CD28. Возможно, что ICOS работает как при реактивации иммунных лимфоцитов памяти, так и на эффекторном этапе работы иммунного лимфоцита в очаге деструкции повреждённой ткани (Хаитов Р.М., 2009). 1.6.5. Молекулы клеточной адгезии CC хемокин типа 7 (CCR7;CD197). CCR7 является белком, который активизирует хоуминг В- и Т-лимфоцитов в первичные, вторичные и третичные лимфоидные органы (Moschovakis G.L., Förster R., 2012). Этот хемокин играет важную роль в активации иммунного ответа, а также может непосредственно ингибировать Тклеточную пролиферацию. Было показано, что CCR7, экспрессирующийся совместно с L-селектином на центральных клетках памяти, управляет их миграцией во вторичные лимфоидные органы, а также стимулирует созревание дендритных клеток (Campbell J.J. et al., 2001; Höpken U.E. et al., 2004). Для этого рецептора были определены два лиганда CCL19 / ELC и CCL21. Адекватное функционирование системы рецептора CCR7 и его лигандов, позволяет сохранять баланс между иммунным ответом и толерантностью (Bromley S.K. et al., 2005; Ziegler E. et al., 2007; Förster R. et al., 2008). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Подводя итог вышесказанному, следует отметить, что современные представления о разных популяциях иммунокомпетентных клеток формируются на основе оценки экспрессии их поверхностных маркеров. Клетки приобретают свои 45 свойства благодаря функциональной роли, которую несет каждый рецептор. Анализ экспрессии таких молекул, как CD45RA(RО), CCR7, CD28 и CD95, позволяет выявить различные степени дифференцировки Т-клеток. Хемокиновые рецепторы CD62L, CCR7, CD103 и CLA определяют миграцию и последующую селективную локализацию клеток в организме в соответствии с их функциями (рисунок 2). Активационная модуляция иммунокомпетентных клеток, обусловленная воздействием разных агентов (инфекционной и неинфекционной природы) и биологически активных молекул (гормоны, цитокины), характеризуется, как правило, изменением репертуара поверхностных молекул, что последовательно отражает проходящие в клетке процессы: активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. В научной периодике появляются данные, что цитокины семейства I типа, имеющие общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21), способны оказывать комплексное воздействие на клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки. Вероятно, что действие некоторых цитокинов на Т-клетки носит дозозависимый функциональным характер, статусом определяется (степенью типом клеток-мишеней дифференцировки, и их функциональной активностью, состоянием рецепторного аппарата клетки). Становится очевидным, что изучение аспектов цитокинопосредованной регуляции гомеостаза Т-клеток позволит расширить представления о механизмах адаптивного иммунитета на разных этапах его реализации. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объект и материал исследования В основу работы положены результаты комплексного исследования 58 здоровых доноров (29 мужчин и 29 женщин в возрасте от 21 до 35 лет). Критериями исключения из исследования являлись: возраст моложе 18 и старше 40 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; инфекционные, онкологические, аутоиммунные, наследственные и психические болезни; алкогольная и наркотическая зависимости. Материалом для исследования служила венозная кровь (20 мл), взятая из локтевой вены с помощью стандартных вакуумных систем "BD VACUTAINER TM" («Greiner-bioone», Австрия) с гепарином (20 Ед/мл). Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете (№ 5 от 5 ноября 2013 г.). Все экспериментальные исследования проводились на базе лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Инновационного парка БФУ им. И.Канта (зав. лабораторией – д-р мед. наук, Л.С. Литвинова). 2.2. Методы исследования В соответствии с поставленными целью и задачами исследования, нами был предложен алгоритм экспериментального блока, позволяющий оценить влияние цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на функциональную активность CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток. Дизайн исследования схематично представлен на рисунке 3. В зависимости от условий культивирования, были предложены 2 модели: - I модель (гомеостатическая, стационарная), предполагает создание in vitro условий гомеостатического влияния цитокинов семейства I типа (IL-2, IL-7 и IL-15) на CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетки. - II модель (активационная), отражает процесс взаимодействия Т-лимфоцитов с антиген-презентирующими клетками (активация клеток через мембранные рецепторы CD2, CD3 и CD28), в комбинации с разными концентрациями цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15). 47 ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Мононуклеарные клетки здоровых доноров (n=58) Иммуномагнитная сепарация Экспериментальный блок in vitro CD45RA+ Т-культуры (n=58) CD45RO+ Т-культуры (n=58) Гомеостатическая модель in vitro + Контрольная проба + + rIL-7 rIL-2 rIL-15 Активационная модель in vitro Активация комплексом анти - CD2/CD3/CD28 Комплекс анти-CD2/CD3/CD28 + + rIL-2 + rIL-7 rIL-15 Используемые концентрации цитокинов в эксперименте: 0,1 - 0,5 - 1,0 нг/мл Инкубация 24 и 48 ч Аналитический блок Оценка основных субпопуляций CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов Проточная цитометрия Оценка фенотипов Т-лимфоцитов по степени дифференцировки: CD62L+CD27+;CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L- в CD45RA и CD45RО - Т-культурах Оценка числа лимфоцитов, несущих на своей мембране маркеры активации, пролиферации и апоптоза: CD69, CD25, CD71, HLA-DR и CD95 в CD45RA - и CD45RО - Т-культурах Статистический анализ результатов Программа IBM SPSS Statistics 20 Гипотеза нормальности распределения (Колмогорова-Смирнова) Критерий для зависимых выборок Вилкоксона. Корреляционный анализ (коэффициент ранговой корреляции Спирмена, r) Регрессионный анализ (коэффициент регрессии, r2) Уровень значимости р<0,05 Рисунок 3. Схема дизайна исследования 48 2.2.1. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови осуществляли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урогрофин («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см 3) (Натвиг Дж. и др., 1980). Венозную гепаринизированную кровь (20 ед/мл) смешивали с 0,9% физ. раствором (NaCl) в соотношении 1:1. Полученную разведенную кровь наслаивали на градиент фиколл-урогрофина (1,077 г/см³) в соотношении 1:3 и центрифугировали при 1500 об/мин 45 мин на мультифункциональной центрифуге с охлаждением (Thermo Fisher Scientific, США). Образовавшееся интерфазное кольцо из МНК собирали автоматической пипеткой с раздела фаз в стерильную пробирку и дважды отмывали 0,9% раствором NaCl, последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 15 мин при 1500 об/мин. Тщательно слив надосадочную жидкость, полученную взвесь мононуклеарных клеток доводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) («Miltenyi Biotec», Германия) до 1 мл и в дальнейшем использовали для выделения фракций CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов. 2.2.2. Выделение CD45RА+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов из фракции мононуклеарных лейкоцитов методом иммуномагнитной сепарации Принцип метода: Для получения монокультур СD45RA + и CD45RO+ Т-клеток из взвеси МНК, был использован метод иммуномагнитной сепарации (ИМС), в основе которого лежит технология MACS® («Miltenyi Biotec» Германия), основанная на использовании суперпарамагнитных частиц MACS MicroBeads, конъюгированных с высокоспецифичными моноклональными антителами (МАТ). Добавленные к взвеси клеток MicroBeads, в течение короткого промежутка времени связываются с их мембранами, несущими соответствующие рецепторы к антителам. Диаметр частиц значительно меньше порога разрешения светового микроскопа и составляет около 50 нм. 49 MACS MicroBeads биодеградируемы и не вызывают реакции со стороны клеток. Колонки MACS, заполненные не токсичным для клеток ферромагнитным матриксом, помещённые в сепаратор MACS, позволяют генерировать сильное магнитное поле для фиксации клеток, нагруженных MicroBeads, сохраняя их жизнеспособность. Клетки, не связавшие MicroBeads, удаляются промыванием колонки буфером, как негативная фракция. Это процедура представляет собой негативную селекцию. После изъятия колонки из магнитного поля, с помощью поршня, под давлением столба жидкости (MACS-буфер) элюируется высокообогащённая фракция клеток, связавших магнитные частицы (позитивная фракция) - позитивная селекция клеток (рисунок 4). Рисунок 4. Позитивная иммуномагнитная селекция Для избавления смеси мононуклеаров от CD14 +-клеток (моноцитов) был использован метод позитивной иммунномагнитной селекции с применением автоматического магнитного сепаратора АutoMACS ProSeparatorInstrument («Miltinyi Biotec», Германия) и моноклональных антител к СD14 + с парамагнитными частицами (MicroBeads human, “Miltenyi Biotec”, Германия) согласно протоколу фирмыизготовителя. Для этого к выделенной ранее суспензии МНК (80 мкл взвеси содержали не менее 107 кл), добавляли 20 мкл магнитных частиц к CD14+ (MicroBeads human, «Miltenyi Biotec», Германия), согласно протоколу производителя. Суспензию с магнитными частицами инкубировали 15 мин в темноте при +4 0 С. После инкубации 50 клетки отмывали 2-мя мл ФСБ (с 0,5% BSA, «Miltenyi Biotec», Германия) и центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Затем сливали надосадочную жидкость и добавляли 500 мкл буфера в клеточную суспензию, тщательно ресуспендируя. Далее переходили к автоматической иммунномагнитной сепарации, следуя протоколу производителя. После проведенной позитивной селекции, для получения CD45RA + и CD45RO + Т-клеток, в дальнейшем, использовали негативную фракцию, которую центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Далее сливали надосадочную жидкость и добавляли в пробирку 80 мкл буфера и 20 мкл магнитных частиц к CD45RО+ (MicroBeads human, «Miltenyi Biotec», Германия). Для позитивной селекции СD45RО+ Т-лимфоцитов повторяли процедуру, аналогичную для CD14+ клеток. Полученные пробы с позитивной фракцией, содержащей CD45RO+ Т-клетки и пробы с негативной фракцией, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Сливали надосадочную жидкость и добавляли в пробирку, содержащую CD45RO+ Тлимфоциты среду Искова, а в пробирку с негативной фракцией - 80 мкл ФСБ и 20 мкл магнитных частиц к CD45RА+ (MicroBeads human, «Miltenyi Biotec», Германия). Для позитивной селекции СD45RA+ лимфоцитов повторяли процедуру, аналогичную для CD45RO+ клеток. Выделенные методом автоматической ИМС клетки с фенотипом CD45RA + и CD45RO +, помещали в бессывороточную культуральную среду Искова, объемом 1 мл. Подсчёт клеточности в культурах Т-клеток разной степени дифференцировки проводили с помощью автоматического счётчика клеток (Countess TM Automated Cell Counter, «Invitrogen», США) с использованием слайдов и красителя Тrypan blue 0,4% («Invitrogen», США). Жизнеспособность составляла не менее 98% от общего числа клеток (рисунок 5). Отсутствие моноцитов (СD14+) и В-лимфоцитов (CD19 +) в культурах CD45RA +и CD45RО+- Т-клеток до культивирования подтверждали c помощью проточной 51 цитометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с FITC, PE, PE-Cy7 и PerCP (“Abcam”, Великобритания и “e-Bioscience”, США). Анализ поверхностных маркеров проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant (“Miltenyi Biotec”, Германия), согласно протоколам производителей. В эксперименте использовали клеточные культуры, содержание CD3 +CD45RA +CD14CD19- и CD3+CD45RO +CD14- CD19- Т-клеток в которых, составляло, в среднем 98,5 ± 1,5 % (рисунок 5). Parameters applied Sensitivity : 5 Min Cell Size: 7 um Max Cell Size: 18 um Circularity: 80 Gating Applied: 7um - 18um Results Total cell concentration : 6.5 X 10 6 cells/mL Viable cell concentration : 6.2 X 10 6 cells/mL Dead cell concentration : 2.2 X 10 5 cells/mL Viability : 97% Average viable cell size : 7.6 um Average dead cell size : 7.6 um Total Cells Counted : 1282 Viable Cells Counted : 1238 Dead Cells Counted : 44 Рисунок 5. Количество живых и мёртвых клеток в культуре CD45RO+ Т-лимфоцитов 52 2.2.3. Культивирование CD45RA + и CD45RO+ Т-клеточных культур CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетки (1,0 × 10 6 кл/мл) культивировали в 48-луночных планшетах в бессывороточной среде Искова («Sigma-Aldrich», США), содержащей 0,5% сывороточного альбумина человека («Микроген», Россия), 5×10-5 M β-меркаптоэтанола («Acros Organics», США) и 30 мкг/мл гентамицина в течение 24 и 48 ч при 37 0С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2. В эксперименте были использованы разные концентрации рекомбинантных форм цитокинов – IL-2, IL-7 и IL-15 и Т-клеточный активатор (все реагенты «Miltenyi Biotec», Германия). В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ac/Exp) («Miltenyi Biotec», Германия) - антибиотиновые частицы MACSiBeadтм с биотинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+ человека. Нагруженные антителами анти-биотиновые частицы MACSiBeadтм используются в качестве имитации АПК и активации покоящихся Т-клеток. В зависимости от условий культивирования, экспериментальный блок исследований, выполненный на Т-лимфоцитах, включал в себя 2 модели. I модель (гомеостатическая, стационарная) (рисунок 6): Для реализации были использованы следующие варианты культивирования: 1) интактная проба; 3) пробы с добавлением rIL-2 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл); 4) пробы с добавлением rIL-7 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл); 5) пробы с добавлением rIL-15 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл); II модель (активационная), отражает процесс взаимодействия Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки с антиген-презентирующими клетками (рисунок 6). Для реализации были использованы следующие варианты культивирования 1) интактная проба; 2) проба с добавлением Ac/Exp; 3) пробы с добавлением Ac/Exp и rIL-2 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл); 53 4) пробы с добавлением Ac/Exp и rIL-7 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл); 5) пробы с добавлением Ac/Exp и rIL-15 (0,1х10-9 г/мл; 0,5х10-9 г/мл; 1,0х10-9 г/мл). Ac/Exp А. Б. Рисунок 6. Культуры CD45RO+ -лимфоцитов без (А) и с добавлением (Б) Т-клеточного активатора (Ac/Exp). 2.2.4. Определение общего числа клеток (в мл) и количества жизнеспособных лимфоцитов в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток методом проточной цитометрии Принцип метода. Дифференциальная проницаемость для ДНК-связывающих красителей позволяет разграничивать живые и мертвые клетки в любых клеточных суспензиях. Для подсчёта количества клеток в мл в культурах Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки, а также для определения их жизнеспособности, после культивирования, клеточные образцы тщательно ресуспендировали и отбирали 12,5 мкл, добавляли 125 мкл ViaCount Reagent (фактор разведения 10), тщательно ресуспендировали и оставляли на 5 минут в темном месте. Регистрацию жизнеспособности и подсчёт числа клеток в исследуемых клеточных культурах с проводили с использованием программы «Guava ViaCount» (Millipore, США), методом цитометре «Guava EasyCite проточной Plus» лазерной (Millipore, цитометрии США), на проточном согласно протоколу производителя (рисунок 7). 54 Рисунок 7. Стандартный протокол с использованием реагента и одноименной программы «GuavaViacount» (Millipore, США). 2.2.5. Определение поверхностных маркеров CD4, CD8, CD69, CD25, CD71, CD95, HLA-DR, CD62L, CD27 на CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетках методом проточной цитометрии Принцип метода заключается в определении рассеивания света лазерного луча при прохождении через него клеток, окрашенных МАТ, меченными флуоресцентными метками. После культивирования, образцы тщательно ресуспендировали. Клеточную взвесь в объеме 50 мкл переносили в микроцентрифужные пробирки (типа эппедорф) и вносили 9 мкл коктейля моноклональных антител (pH=7,4). Инкубирование осуществляли в течение 30-45 мин в темноте при температуре 40С. После инкубации добавляли 200 мкл ФСБ (Sigma, США) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем удаляли надосадочную жидкость. Доводили общий объем клеточной пробы ФСБ до 200 мкл, тщательно ресуспендировали автоматическим 55 дозатором и переносили в лунки иммунологического планшета. Измерение образцов проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant (“Miltenyi Biotec”, Германия). Иммунофенотипирование CD45RO+ и CD45RA+ Т-лимфоцитов проводили с использованием коктейлей моноклональных антител («eВioscience», США; «Abcam», Великобритания; “Miltenyi Biotec”, Германия), приготовленных ex temporo: CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-FITC/CD8-PerCp.Cy5.5/CD62L-PE, CD27-PE.Cy7; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-FITC/CD8-PerCp.Cy5.5/CD69-PE; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PE/CD25-FITC; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PE/CD71-FITC; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/HLA-DRFITC/ CD62L-PE; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/CD95FITC/CD62L-PE. CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/HLA-DRFITC/ CD62L-PE/ CD95- APC-Vio770; Все результаты цитометрического анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman Coulter, США). 2.2.5.1. Оценка экспрессии Т-клетками маркеров, определяющих степень их дифференцировки Современные способы разделения Т-клеток на популяции наивных Т-клеток и Тлимфоцитов памяти, базируются на выявлении экспрессии молекул, отвечающих за миграцию клеток (CD62L и/или CCR7) и/или ко-стимулирующих рецепторов - CD27 и/или CD28 (Picker L.J. et al., 1993; Кудрявцев И.В., Савицкий В.П., 2012; Mahnke T.M. et al., 2013; Кудрявцев И.В., 2014). Определение разных фенотипов Т-клеток по степени дифференцировки: наивных (CD45RA+CD62L+CD27+), центральных (CD45RО+CD62L+CD27+) и гетерогенных популяций эффекторных T-клеток: CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L-, в 56 CD45RA - и CD45RО - Т-культурах, осуществлялось методом проточной цитометрии с применением многопараметрического анализа, с использованием коктейля моноклональных антител - CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-FITC/CD8PerCp.Cy5.5/CD62L-PE/CD27-PE.Cy7. Процедура преаналитического этапа подготовки образцов к цитометрическому анализу описана в п.п 2.2.5. Гейтинг исследуемой популяции клеток проводился в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Затем данную популяцию клеток анализировали на наличие флуоресценции в различных координатах (флуоресценция по шести цветам на основе Dot Plot, либо по одному цвету на основе гистограммы). Использовалось автоматическое программное обеспечение и методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала). Сбор данных осуществляли до тех пор, пока не набиралось 10 000 событий (т.е. 10 000 клеток). Для получения корректных статистических данных, вводили необходимые логистические ограничения в гистограммы распределения клеток по SSC-A (боковое светорассеивание, характеризующее цитоплазматические и мембранные особенности клетки) и флуоресценции СD45RO или CD45RA (APC). Затем, гейтирование проводили в области [CD45RO+] или [CD45RА+] по SSC-A и интенсивности флуоресценции СD3-Viablue (рисунок 8). На основании построенного гейта [CD45RO+CD3+] или [CD45RА+CD3+], анализировали информацию об цитотоксических основных (CD8) субпопуляциях (рисунок 8). Т-лимфоцитов: Далее, в хелперных выделенных (CD4) - и областях [CD45RA+CD3+CD4+]/[CD45RO+CD3+CD4+] и [CD45RA+CD3+CD8+]/[CD45RO+CD3+CD8+], используя интенсивность флуоресценции - CD62L и CD27, определяли относительное (%) число наивных (CD45RA+CD62L+CD27+), центральных (CD45RО+CD62L+CD27+) и гетерогенные группы эффекторных Т-клеток (CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L-) (рисунок 9). Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих мембранные молекулы хоуминга CD62L (L-селектин) и костимуляции - CD27 представлены на рисунке 9. 57 Рисунок 8. Алгоритм выявления популяций (тактика «гейтирования») Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих CD45RО. Гистограммы распределения СD3-Т-лимфоцитов (а) и основных субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток (б) в популяциях CD45RO+ Т-клеток, полученные в результате многоцветного анализа с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8. а - анализ распределения клеток по боковому светорассеянию (SSC) и CD3 проведен с использованием гейтирования по CD45RO. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD3; по оси ординат – боковое светорассеяние, характеризующее структуру цитоплазмы клеток. На гистограмме приведены только лимфоциты, экспрессирующие на сво ей поверхности CD45RО. б - анализ проведен с использованием гейтирования по CD3. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD4. Область «CD45R0+ CD3+ » содержит лимфоциты только данного фенотипа. 2.2.5.2. Оценка экспрессии Т-клетками молекул активации и пролиферации Определение мембранной экспрессии молекул активации (CD69; CD25) и пролиферации (CD71) в CD45RA+ - и CD45RО+ - Т-культурах in vitro, осуществляли аналогичным методом, описанном выше. Иммуннофенотипирование проводили согласно протоколу производителя, используя коктейли моноклональных антител ex temporo: CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-FITC/CD8-PerCp.Cy5.5/CD69-PE; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PE/CD25-FITC; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PE/CD71-FITC. Процедура преаналитического этапа подготовки образцов к цитометрическому анализу описана в п.п 2.2.5. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т58 клеток, экспрессирующих мембранные молекулы активации (CD69 и CD25) и пролиферации (CD71), представлены на рисунках 10, 11, 12. Рисунок 9. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих мембранные молекулы хоуминга CD62L (L-селектин) и костимуляции - CD27 (на примере CD45RO – позитивных клеток). Гистограммы распределения СD3+ CD4+ и CD3+ CD8+ - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Т-клеток по CD62L и CD27, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD62L/CD27. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в - анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD27; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD62L. Область «CD45RО+CD3 + CD4+ » содержит лимфоциты только данного фенотипа. г - анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD8. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD27; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD62L. Область «CD45R0+ CD3+ CD8+ » содержит лимфоциты только данного фенотипа. 59 Рисунок 10. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих молекулу ранней активации - CD69 (на примере CD45RO – позитивных клеток). Гистограммы распределения СD3 +CD4 + и CD3 +CD8 + - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Тклеток по CD69, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD69. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г- анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4 (в) и по CD3 и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD69. Область «CD45RО+ CD3 +CD4 + » (в)/«CD45RО+ CD3+ CD4+» (г) содержит лимфоциты только данного фенотипа (гомеостатическая модель); д/е – обозначения как для п/п - в/г (активационная модель). Рисунок 11. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих IL-2Ra (CD25) (на примере CD45RO – позитивных клеток). 60 Гистограммы распределения СD3 +CD4 + и CD3 +CD8 + - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Тклеток по CD25 и CD71, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD69. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г- анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4 (в) и по CD3 и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD25. Область «CD45RО+ CD3+ CD4+ » (в) /«CD45RО+ CD3+ CD4+ » (г) содержит лимфоциты только данного фенотипа. Рисунок 12. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих CD71 (на примере CD45RO – позитивных клеток). Гистограммы распределения СD3 +CD4 + и CD3 +CD8 + - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Тклеток по CD25 и CD71, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD69. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г- анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4 (д) и по CD3 и СD8 (е). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD71. Область «CD45RО+ CD3+ CD4+ » (в) /«CD45RО+ CD3+ СD4+ » (г) содержит лимфоциты только данного фенотипа. 2.2.5.3. Оценка экспрессии Т-клетками молекул поздней активации и апоптоза Определение мембранной экспрессии молекул поздней активации (HLA-DR) и апоптоза (CD95) в разных субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD4; CD8), в CD45RA+ – и CD45RО+ - Т-культурах, проводили согласно протоколу производителя, используя коктейли моноклональных антител ex temporo: 61 CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/HLA-DRFITC/ CD62L-PE; CD45RA или CD45RО-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/CD95FITC/CD62L-PE. Процедура преаналитического этапа подготовки образцов к цитометрическому анализу описана в п.п 2.2.5. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Тклеток, экспрессирующих мембранные молекулы поздней активации (HLA-DR) и апоптоза (CD95), представлены на рисунках 13, 14, 15, 16. Рисунок 13. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих молекулу поздней активации - HLA-DR (на примере CD45RO – позитивных клеток). Гистограммы распределения СD3 +CD4 + и CD3 +CD8 + - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Тклеток по HLA-DR и CD62L, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/HLA-DR/CD62L. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г- анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4 (в) и по CD3 и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против HLA-DR. Область «CD45RО+ CD3 +CD4 + » (в) /«CD45RО+ CD3+ CD4+ » (г) содержит лимфоциты только данного фенотипа. 62 Рисунок 14. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих молекулу поздней активации - HLADR в CD62L – позитивных и негативных субпопуляциях CD45RO культур. Гистограммы распределения СD3+ CD4+ и CD3 +CD8+ - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Т-клеток по HLA-DR и CD62L, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных а нтител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/HLA-DR/CD62L. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г - анализ проведен с использованием гейтирования по CD62L и СD4 (в) и по CD62L и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против СD62L; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8. Области «CD45RО+CD3+CD4+» (в) /«CD45RО+CD3+CD8+» (г) содержат лимфоциты только данного фенотипа. д/е – однопараметрические гистограммы, «гейтированные» по областям «CD45RО+CD3+CD4+CD62L-» (д) и «CD45RО+CD3+CD4+CD62L+» (е). ж/з – однопараметрические гистограммы, «гейтированные» по областям «CD45RО+CD3+CD8+CD62L-» (ж) и «CD45RО+CD3+CD8+CD62L+» (з). Ось абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против HLA-DR, по оси ординат – количество клеток. 63 Рисунок 15. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих молекулу апоптоза CD95 (на примере CD45RO – позитивных клеток). Гистограммы распределения СD3+ CD4+ и CD3 +CD8+ - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Т-клеток по CD95, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD95/CD62L. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г- анализ проведен с использованием гейтирования по CD3 и СD4 (в) и по CD3 и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против HLA-DR. Область «CD45RО+ CD3+ CD4+ » (в) /«CD45RО+ CD3+ CD4+» (г) содержит лимфоциты только данного фенотипа. 64 Рисунок 16. Тактика «гейтирования» Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих молекулу CD95 в CD62L – позитивных и негативных субпопуляциях CD45RO культур. Гистограммы распределения СD3 +CD4 + и CD3+ CD8+ - лимфоцитов в популяциях CD45RO+ Т-клеток по CD95 и CD62L, полученные в результате многоэтапного гейтирования с использованием коктейля моноклональных антител – CD45RO/CD3/CD4/CD8/CD95/CD62L. а – комментарии как в рисунке 8 (п/п а); б - комментарии как в рисунке 8 (п/п б); в/г - анализ проведен с использованием гейтирования по CD62L и СD4 (в) и по CD62L и СD8 (г). По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против СD62L; по оси ординат – интенсивность флуоресценции антител против CD4/CD8. Области «CD45RО+CD3+CD4+» (в) /«CD45RО+CD3+CD8+» (г) содержат лимфоциты только данного фенотипа. д/е – однопараметрические гистограммы, «гейтированные» по областям «CD45RО+CD3+CD4+CD62L-» (д) и «CD45RО+CD3+CD4+CD62L+» (е).ж/з – однопараметрические гистограммы, «гейтированные» по областям «CD45RО+CD3+CD8+CD62L-» (ж) и «CD45RО+CD3+CD8+CD62L+» (з). Ось абсцисс – интенсивность флуоресценции антител против CD95, по оси ординат – количество клеток. 65 Распределение экспериментальных клеточных моделей in vitro в соответствии с использованными методами исследования (число культур/число проб) представлено в таблице 3. Таблица 3. Распределение экспериментальных клеточных моделей in vitro в соответствии с использованными методами исследования (число культур/число проб) Методы исследования Определение общего числа клеток (в мл) и количества жизнеспособных лимфоцитах в культурах Тклеток методом проточной цитометрии Оценка соотношений основных субпопуляций CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии Оценка фенотипов Тлимфоцитов по степени дифференцировки: CD62L+CD27+;CD27+CD62L, CD27-CD62L+; CD27CD62L- в CD45RA - и CD45RО - Т-культурах методом проточной цитометрии Оценка числа лимфоцитов, несущих на своей мембране маркеры активации, пролиферации и апоптоза: CD69, CD25, CD71, HLADR и CD95 в CD45RA - и CD45RО - Т-культурах методом проточной цитометрии Условия культивирования Экспериментальные клеточные модели CD45RA+ CD45RO+ Интактная проба + rIL-2 0,1х10-9 г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл + rIL-7 0,1х10-9 г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл 58/1218 58/1218 58/1218 58/1218 58/1218 58/1218 58/1218 58/1218 + rIL-15 0,1х10-9г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл Интактная проба + Ac/Exp Ac/Exp + rIL-2 0,1х10-9 г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл Ac/Exp + rIL-7 0,1х10-9 г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл Ac/Exp + rIL-15 0,1х10-9 г/мл 0,5х10-9 г/мл 1,0х10-9г/мл 66 2.2.6. Методы статистического анализа данных Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences). Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез (Кремер Н.Ш., 2004). При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: для нормально распределенных выборок вычисляли среднее арифметическое (Х), ошибку среднего (m); для выборок, распределение которых отличалось от нормального: медиану (М), первый и третий квартили (Q1, Q3). Для оценки достоверности различий выборок, использовали параметрический (t-критерий Стьюдента) или непараметрический (критерий Вилкоксона) для зависимых выборок. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный и/или регрессионный анализы. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 (Кремер Н.Ш., 2004). 67 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.4. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на жизнеспособность и общее количество клеток (106/мл) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro Общее количество клеток в интактных культурах CD45RA+- и CD45RO+ - Тлимфоцитов после окончания срока культивирования (48 ч) составляло, в среднем 1,08±0,09×106 кл/мл. Добавление рекомбинантного IL-2 в пробы CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, независимо от концентрации, приводило к статистически достоверному повышению количества клеток в мл (в среднем, на 20%) (рисунок 17). Рисунок 17. Общее количество клеток (106/мл) в культурах CD45RA + и CD45RO+ Тлимфоцитов в условиях культивирования in vitro с добавлением цитокинов (rIL-2, rIL-7, rIL-15) в различной концентрации. К – количество клеток в контрольной пробе; rIL-2/rIL7/rIL-15 - 0,1–0,5-1,0 - в клеточных культурах с добавлением rIL-2, rIL-7 или rIL-15 (0,10,5-1,0 н г/мл). rIL-15 только в максимальной концентрации (1,0x10-9 г/мл) приводил к достоверному росту общего числа CD45RO+ Т-клеток (в мл) и не оказывал влияния на CD45RA+ Т-клетки. Добавление rIL-7 не изменяло числа клеток в CD45RA + и CD45RO +-популяциях Т-клеток. В популяциях CD45RA+ Т-клеток 68 число жизнеспособных Т-клеток, оцениваемых в тесте с добавлением реагента «GuavaViacount», составило, в среднем - 79,45 ± 8,94%, а в популяции CD45RO+ Тклеток, в среднем, 87,56 ± 7,98%, соответственно. rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) способствовал снижению числа живых Т-лимфоцитов в CD45RA+ и CD45RO+ культурах (в среднем, на 22% и 25%, соответственно) (рисунок 18). IL-7 и rIL-15 в гомеостатической модели культивирования in vitro, не оказывали значимого влияния на соотношение живых/мертвых Т-клеток в CD45RA+ и CD45RO+ культурах. Рисунок 18. Содержание живых клеток (%) в культурах CD45RA + и CD45RO+лимфоцитов в условиях культивирования in vitro с добавлением цитокинов (rIL-2, rIL-7 или rIL-15) в различной концентрации. Обозначения как в рисунке 17. Результаты нашего исследования позволили констатировать, что TCRактивация CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, наряду с увеличением общего числа клеток (в мл), приводила к снижению содержания живых клеток в обеих популяциях CD45RA+ (в среднем, на 38%) и CD45RO+ Т-клеток (в среднем, на 33%) (р<0,05) (рисунок 20). Действие rIL-2 на жизнеспособность TCR-активированных CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов носило однонаправленный характер и сопровождалось 69 достоверным снижением числа живых Т-клеток при добавлении максимальной концентрации цитокина, по сравнению с пробой только с добавлением антиCD2/CD3/CD28–частиц (рисунок 20). Интересно, что добавление rIL-2 (0,5-1,0х10-9 г/мл) приводило к увеличению числа клеток (в мл) в обеих культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток (рисунок 19). Рисунок 19. Общее количество клеток (106/мл) в культурах CD45RA + и CD45RO+ Тлимфоцитов в условиях культивирования in vitro с добавлением активатора и цитокинов (rIL-2, rIL-7, rIL-15) в различной концентрации. К – количество клеток в контрольной пробе; АК – с Т-клеточным активатором; АК / rIL-2/rIL-7/rIL-15 - 0,1–0,5-1,0 - в клеточных культурах с активатором и цитокинами - rIL-2, rIL-7 или rIL-15 (0,1-0,5-1,0 н г/мл). Инкубация TCR-активированных CD45RO+ Т-клеток с rIL-15 сопровождалась тенденцией к повышению общего числа клеток (в среднем, в 1,5 раза); однако изменения носили недостоверный характер (рисунок 19). Цитокины rIL-7 и rIL-15 в высокой концентрации (1,0х10-9 г/мл) повышали жизнеспособность активированных Т-клеток памяти (в среднем, на 20%) по сравнению с пробами только с добавлением активатора. CD45RA+ T-лимфоциты оказались чувствительными только к протективному эффекту rIL-7 (рисунок 20). 70 Рисунок 20. Содержание живых клеток (%) в культурах CD45RA + и CD45RO +- Тлимфоцитов в условиях культивирования in vitro с добавлением активатора и цитокинов (rIL-2, rIL-7 или rIL-15) в различной концентрации. Обозначения как в рисунке 19. 3.2. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), на соотношение основных субпопуляций Т-клеток: CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro Относительное число лимфоцитов в СD45RА+ - культурах с фенотипом CD3+CD4+ и CD3+CD8+ было равным 59,56 (46,01 – 61,49) и 39,02 (25,89 – 41,19)% и оставалось неизменным в течение всего времени инкубации (48 ч), независимо от варианта культивирования (в условиях гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro) (таблицы 4, 5). Соотношение CD4/CD8 в культурах CD45RO+ Т-клеток составляло, в среднем 3:1. Относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в СD45RO+ культурах было равным 78,84 (66,63 – 84,29) и 21,83(16,91 – 27,84)% и оставалось неизменным в течение всего времени инкубации (48 ч), независимо от варианта культивирования (в условиях гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro) (таблицы 4, 5). 71 3.3. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7, IL-15) на мембранную экспрессию молекул CD62L и CD27, определяющих соотношение разных фенотипов Т-клеток по степени дифференцировки: наивный (CD45RA+CD45R0-CD62L+CD27+), центральный (CD45RО+ CD62L+CD27+) и гетерогенные популяции эффекторных T-клеток: CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L-, в CD45RA - и CD45RО - Ткультурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro В контрольных CD45RА+ - образцах Т-клеток, число CD62L-позитивных лимфоцитов было равным 54,61 (48,18 - 71,66)%. Количество CD4+CD62L+ Тклеток значимо (более чем в 4 раза) превышало число CD8+CD62L+ Т-лимфоцитов и составляло: 40,01 (25,32 – 60,00)% и 11,02 (6,62 – 19,93)%, соответственно. Содержание CD27+ Т-клеток в CD45RА+ - культурах составило 62,05 (43,02 – 79,42)%. Количество CD4+CD27+ и CD8+CD27+ Т-клеток было равным – 35,41 (24,99 – 62,63) и 15,84 (12,40 – 19,52)%, соответственно. На основе дифференциальной экспрессии молекул - CD27 и CD62L, нами были выявлены популяции Т-клеток с наивным фенотипом (CD45RA+ CD62L+CD27+) и гетерогенные популяции эффекторных T-клеток: CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L- в CD45RA+ - и в CD45RО+ - Т-культурах. Так, в контрольных образцах CD45RA+ культур, распределение по субпопуляциям среди CD3+CD4+ Т-клеток, несущих на своей поверхности маркеры - CD27 и CD62L, было следующим (таблица 4): - CD45RA+CD4+CD27-CD62L- - 2,36 (1,16 – 13,44)% (зрелые хелперные эффекторные клетки (TEMRA); - CD45RA+CD4+CD27+CD62L- - 0,66 (0,43 – 1,58)% (незрелые «ранние» TEMRA Т-лимфоциты); - CD45RA+CD4+CD27+CD62L+ - 95,49 (79,79 – 96,28)% (наивные хелперные Тлимфоциты); - CD45RA+CD4+CD27-CD62L+ - 1,69 (1,64 – 4,24)% (предположительно TEMRA Т-лимфоциты, у которых сохраняется экспрессия CD62L, индуцируемая in vitro). Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) приводила к повышению числа CD45RA+CD27+CD62L- и CD45RA+CD27-CD62L- Т-клеток в 72 CD4+ - популяциях (р<0,05). rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) достоверно снижал число CD4+CD45RA+CD27+CD62L+ Т-лимфоцитов (таблица 6) (р<0,05). rIL-15 (1,0х10-9 г/мл) индуцировал повышение числа CD45RA+CD4+ клеток с фенотипом CD27-CD62L+ (р<0,05). CD45RA+CD4+ Т-клетки были нечувствительны к действию rIL-7 (р>0,05). Процентное распределение маркеров CD62L и CD27 внутри субпопуляции CD3+CD8+ в культурах CD45RA+ Т-лимфоцитов в контрольных образцах было следующим (таблица 6): - CD45RA+CD8+CD27-CD62L- - 23,42 (13,79 – 45,76)% (зрелые эффекторные клетки (TEMRA, Е)); - CD45RA+CD8+CD27+CD62L- - 4,91 (4,33 – 5,91)% (незрелые «ранние» TEMRA Т-лимфоциты, так называемые, пре-эффекторы I и II типов - рЕ1 и рЕ2); - CD45RA+CD8+CD27+CD62L+ - 64,49 (36,60 – 75,08)% (наивные цитотоксические Т-лимфоциты); - CD45RA+CD8+CD27-CD62L+ - 17,87 (66,80 – 10,74)% (предположительно TEMRA Т-лимфоциты, у которых сохраняется экспрессия CD62L, индуцируемая in vitro). Действие rIL-2 (во всем спектре концентраций) на популяцию CD3+CD8+ Тклеток сопровождалось увеличением числа только зрелых TEMRA (CD45RA+CD27CD62L-) Т-клеток и снижением количества Т-клеток с наивным фенотипом CD45RA+CD27+CD62L+; IL-2 индуцируемые изменения в CD8+CD45RA+ популяции носили равномерный характер (таблица 6). Следует отметить, что в популяции цитотоксических Т-клеток, добавление максимальной концентрации rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) индуцировало образование Тклеток центральной памяти с фенотипом - CD45RA-CD62L+CD27+. Увеличение числа CD8+CD27-CD62L- регистрировалось при добавлении максимальной концентрации rIL-7 (1,0х10-9 г/мл). Одновременно, rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) индуцировал достоверное снижение числа незрелых TEMRA (CD8+CD27+CD62L-) Т-клеток. В целом, эффекты rIL-15 на CD8+CD45RA+ Т-клетки, были аналогичными rIL-2. Добавление rIL-15 (0,5-1,0х10-9 г/мл) в среду культивирования приводило к 73 повышению числа зрелых TEMRA (CD45RA+CD8+CD27-CD62L-) Т-клеток и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (CD45RA-CD8+CD27+CD62L+) на фоне снижения лимфоцитов с наивным фенотипом (CD45RA+CD8+CD27+CD62L+). Добавление Т-клеточного активатора в культуры CD45RA+ Т-клеток, сопровождалось повышением числа CD45RA-негативных (CD45RA-CD62L-CD27+) Т-клеток в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, так называемых незрелых эффекторных Т-клеток памяти, на фоне снижения содержания Тлимфоцитов с наивным фенотипом. Также, на фоне активации CD45RA+ Т-клеток, происходило резкое снижение числа TEMRA цитотоксических лимфоцитов (в среднем, на 30%). Процентное содержание CD45RA+CD4+CD62L-CD27- Т-клеток оставалось на прежнем уровне (таблица 7). Интересным представляется тот факт, что на фоне активации, регистрировался рост числа CD3+CD27- CD62L+ Т-клеток в обеих популяциях. Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) и rIL-15 (0,5х10-9 г/мл), сопровождалась увеличением (по сравнению с пробой только с добавлением активатора) зрелых цитотоксических TEMRA (CD45RA+CD8+CD27-CD62L-) Т-клеток (р < 0,05) (таблица 7). В субпопуляции активированных хелперных Т-клеток, эффекты rIL-2 и rIL15 (1,0х10-9 г/мл), напротив, были направлены на снижение числа зрелых TEMRA (CD45RA+CD4+CD27-CD62L-) Т-клеток (таблица 7). Соотношение наивных и эффекторных популяций в CD45RA+CD4+ - культурах, достоверно не изменялось. Сочетанное действие активатора и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) сопровождалось появлением в популяции хелперных и цитотоксических CD45RA+ Т-клеток, лимфоцитов, утративших экспрессию молекулы CD45RA, фенотип которых соответствовал центральным клеткам памяти - CD45RA- CD4+/CD8 +CD27 +CD62L+. Все изменения регистрировались на фоне снижения Т-клеток с наивным фенотипом (таблица 7). В контрольных образцах CD45RО+ Т-клеток, число CD62L-позитивных лимфоцитов было равным 52,64 (45,17 - 61,53)%. Количество CD4+CD62L+ Тклеток значимо (более, чем в 8 раз) превышало число CD8+CD62L+ Т-лимфоцитов 74 и составляло: 44,15 (37,66 - 51,12)% и 5,71 (4,10 – 7,17)%, соответственно. Содержание CD45RО+CD27+ Т-клеток составило 59,6 (48,56-63,73)%. Количество CD4+CD27+ и CD8+CD27+ Т-клеток было равным - 45,25 (37,28-47,33) и 12,12 (9,07 – 14,29)%, соответственно. На момент окончания срока инкубации (48ч), число центральных Т-клеток памяти с фенотипом CD3 +CD8+CD62L+CD27+ (TCM) в интактных популяциях CD45RО+ Т-клеток составило 21,19 (20,76 – 27,24)%; незрелых эффекторных клеток - CD3+CD8+CD62L-CD27+ (TEM: Em1; Em2) – 31,90 (28,51 – 42,48)%; зрелых эффекторов - CD3+CD8+CD62L-CD27- (TEM: Em3; Em4) - 37,90 (34,51 – 45,48)%; а клеток с фенотипом - CD3+CD8+CD62L+CD27- (предположительно – которая может рассматриваться в качестве переходной формы между TCM и TEM, индуцируемая in vitro) 13,38 (11,51 – 15,98)% (таблица 8). Субпопуляционное распределение хелперных CD45RO+ Т-клеток по степени дифференцировки было следующим: число CD3 +CD4+CD62L +CD27+, так называемые центральные Т-клетки памяти, в интактных популяциях CD45RО + Т-клеток составило 54,12 (49,02 – 58,66)%, что почти в 2 раза превышало содержание Т-клеток с аналогичным фенотипом в CD8 + популяции (таблица 8). Содержание незрелых эффекторных клеток - CD3+CD4 +CD62LCD27+ и зрелых эффекторов - CD3+CD4+CD62L- CD27+ было равным - 10,36 (8,07 – 13,26) и 18,47 (18,28-20,16)%, соответственно. Также, как и в популяциях цитотоксических клеток, нами были обнаружены Т-клетки с фенотипом - CD3+CD4+CD62L +CD27 -, содержание которых составило 13,38 (11,51 – 15,98)%. Инкубация in vitro CD45RO+ Т-клеток с rIL-2, rIL-7 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл), сопровождалась достоверным увеличением числа зрелых эффекторных цитотоксических (CD8+) Т-лимфоцитов с фенотипом - CD62L-CD27(Tem: Em3 и Em4) (таблица 8). Добавление максимальных концентраций rIL-2 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл) в культуры CD45RO+ Т-клеток приводило к образованию CD45RО - CD62L- CD27- Тклеток, которые, как уже упоминалось ранее – являются терминальнодифференцированными эффекторами (TEMRA). Все регистрируемые нами изменения происходили на фоне снижения содержания Т-клеток с фенотипом 75 центральной памяти (CD62L+CD27+, TCM) и незрелых цитотоксических эффекторов (CD62L-CD27+, TEM: Em1 и Em2) (таблица 8). В CD45RO+CD4+- популяции, IL-2 (1,0х10-9 г/мл) индуцировал повышение числа зрелых эффекторных (CD45RO+CD62L-CD27-) Т-клеток на фоне снижения содержания незрелых эффекторов - CD45RO+CD4+CD62L- CD27+. Добавление rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) в культуры CD4+CD45RO + Т-клеток индуцировало образование CD45RО - CD62L- CD27+ - популяции (незрелые TEMRA Т-хелперы), в целом, за счет снижения числа Т-клеток с фенотипом центральной памяти. Хелперные популяции CD45RO+ Т-клеток оказались нечувствительными к действию rIL-15. Добавление Т-клеточного активатора в культуры CD45RO+ Т-клеток, сопровождалось ростом содержания зрелых цитотоксических эффекторных Тклеток (CD8+CD62L-CD27-) и TEMRA (CD45RA+CD62L-CD27-) Т-клеток на фоне снижения числа CD62L+CD27+ (TCM) Т-лимфоцитов (таблица 9). Интересно, что в хелперной популяции CD45RO+ Т-клеток, добавление in vitro активатора, напротив, приводило к повышению содержания незрелых эффекторных Т-клеток (таблица 9). Инкубация TCR-активированных CD8+CD45RO+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-15 (0,5 - 1,0х10-9 г/мл) а также с rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) приводила к дифференцировке и созреванию цитотоксических Т-лимфоцитов в эффекторные Т-клетки, что фенотипически выражалось повышением числа цитотоксических лимфоцитов: CD62L-CD27- (TEM: Em3 и Em4) и CD62L-CD27+ (TEM: Em1 и Em2) на фоне снижения содержания клеток с фенотипом центральной памяти CD62L+CD27+ (ТCM). Добавление в среду культивирования TCR-активированных хелперных CD45RO+ Т-клеток rIL-2 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) сопровождалось повышением числа клеток с фенотипом зрелых эффекторов CD62L-CD27- за счет снижения Т-клеток с фенотипом центральной памяти (таблица 9). CD45RO+CD4+ Т-клетки были нечувствительны к действию rIL-15. Следует особо подчеркнуть, что сочетанная стимуляция CD45RO+CD4+ Т-клеток TCRактиватором и цитокинами, имеющими общую γ-цепь рецепторов (CD132), не сопровождалась образованием Т-клеток, реэкспрессирующих высокомолекулярную изоформу CD45 рецептора – CD45RA. 76 Таблица 4. Содержание CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба IL-2 (0,1 нг/мл) IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) IL-7 (0,1 нг/мл) IL-7 (0,5 нг/мл) IL-7 (1,0 нг/мл) IL-15 (0,1 нг/мл) IL-15 (0,5 нг/мл) IL-15 (1,0 нг/мл) CD45RА CD45RО CD4 CD8 CD4 59,56 (46,01-61,49) 39,02 (25,89-41,19) 78,84 (66,63-84,29) 56,14 (45,30-60,68) 36,39 (25,89-40,73) 77,57 (68,25-84,29) 58,39 (44,03-60,68) 36,47 (25,89-41,10) 77,77 (68,90-84,29) 56,95 (44,03-60,68) 36,47 (31,63-40,73) 77,32 (68,10-84,29) 59,03 (44,03-60,68) 35,56 (25,89-40,73) 77,37 (69,93-84,29) 59,45 (44,03-60,68) 36,47 (20,65-40,73) 78,54 (69,04-84,29) 59,09 (44,03-60,68) 36,47 (21,35-40,73) 77,92 (68,31-84,29) 57,62 (44,03-60,68) 32,17 (19,65-40,73) 77,32 (67,74-84,29) 56,92 (44,03-60,68) 36,47 (25,89-40,23) 78,84 (69,49-84,29) 57,65 (44,03-60,68) 33,69 (25,89-40,73) 77,68 (69,73-84,29) CD8 21,83 (16,91-27,84) 22,43 (16,91-26,62) 21,93 (16,91-27,60) 21,89 (16,91-29,60) 21,66 (16,91-26,34) 21,91 (16,91-25,08) 21,98 (16,91-27,73) 21,41 (16,91-26,34) 21,11 (16,91-26,34) 20,08 (16,91-26,34) Примечание: здесь и в таблицах 6,8,10,12,14,16: р0 - достоверность различий по сравнению с интактной пробой р1 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением rIL-2 (0,1 нг/мл)/rIL-7(0,1 нг/мл)/rIL-15 (0,1 нг/мл) р2 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением rIL-2 (0,5 нг/мл)/rIL-7(0,5 нг/мл)/rIL-15 (0,5 нг/мл) р3 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением rIL-2 (1,0 нг/мл)/rIL-7(1,0 нг/мл)/rIL-15 (1,0 нг/мл) 77 Таблица 5. Содержание CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в условиях активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования CD45RА+CD3+ CD45RО+CD3+ CD4 CD8 CD4 CD8 Контрольная проба 59,56 (46,01-61,49) 39,02 (25,89-41,19) 78,84 (66,63-84,29) 21,83 (16,91-27,84) Ac/Exp 59,48 (50,26-64,99) 38,73 (26,63-40,07) 78,84 (69,53-84,29) 21,59 (16,91-26,34) Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) 52,86 (44,95-71,05) 35,61 (17,52-43,53) 78,84 (70,05-84,29) 22,67 (16,91-27,76) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) 59,73 (56,95-64,99) 37,66 (34,01-39,94) 78,84 (68,84-84,29) 22,26 (16,91-26,34) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) 53,37 (44,13-70,05) 34,79 (17,24-41,65) 78,84 (70,71-84,29) 20,99 (16,91-25,51) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) 50,42 (42,73-55,98) 36,10 (33,37-42,24) 78,84 (68,81-84,29) 20,67 (16,91-26,24) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) 54,74 (48,53-72,06) 35,85 (19,54-41,45) 78,84 (69,39-84,29) 21,11 (16,91-25,84) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) 53,00 (41,71-70,93) 36,37 (18,00-41,06) 78,84 (69,72-84,29) 20,43 (16,91-26,34) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) 52,30 (47,16-70,72) 35,57 (17,95-40,75) 78,84 (69,82-84,29) 21,11 (16,91-26,07) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) 51,80 (46,68-73,72) 37,60 (22,02-40,75) 78,84 (69,61-84,29) 21,73 (16,91-25,87) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) 55,06 (54,75-73,07) 33,54 (17,10-44,00) 78,84 (70,14-84,29) 21,06 (16,91-25,35) Примечание: здесь и в таблицах 7,9,11,13,15,17: р0 - достоверность различий по сравнению с интактной пробой р1 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением активатора Ac/Exp р2 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением Ac/Exp + rIL-2 (0,1 нг/мл)/ + rIL-7(0,1 нг/мл)/ + rIL-15 (0,1 нг/мл) р3 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением Ac/Exp + rIL-2 (0,5 нг/мл)/ + rIL-7(0,5 нг/мл)/ + rIL-15 (0,5 нг/мл) р4 - достоверность различий по сравнению с пробой с добавлением Ac/Exp + rIL-2 (1,0 нг/мл)/ + rIL-7(1,0 нг/мл)/ + rIL-15 (1,0 нг/мл) 78 Таблица 6. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранные молекулы CD62L и CD27, ассоциированные со степенью дифференцировки Т-клеток, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба IL-2 (0,1 нг/мл) IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) IL-7 (0,1 нг/мл) IL-7 (0,5 нг/мл) IL-7 (1,0 нг/мл) IL-15 (0,1 нг/мл) IL-15 (0,5 нг/мл) IL-15 (1,0 нг/мл) CD62L-CD272,36 (1,16-3,44) 2,50 (2,06-3,02) CD45RА+CD3+CD4+ CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ 0,66 95,49 (0,43-1,58) (79,79-96,28) 1,04 89,93 (0,72-1,94) (72,51-94,37) CD62L+CD271,69 (1,64-3,24) 2,93 (1,53-3,47) CD62L-CD2723,42 (13,79-28,76) 34,09 (27,69-51,02) р0<0,05 35,98 (25,52-47,54) р0<0,05 37,58 (29,17-41,48) р0<0,05 CD45RА+CD3+CD8+ CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ 4,91 64,49 (4,33-5,91) (56,60-75,08) 4,96 45,44 (4,76-5,16) (37,03-53,90) р0<0,05 5,04 47,75 (3,89-5,68) (32,29-53,69) р0<0,05 5,06 45,68 (4,17-6,55) (42,72-53,36) р0<0,05 CD62L+CD277,87 (6,80-10,74) 8,97 (6,84-12,17) 3,02 (2,61-3,19) 1,64 (0,34-1,73) 88,11 (69,26-94,38) 2,28 (0,83-3,06) 7,56 (4,95-8,81) 10,28 (7,32-14,57) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 3,05 (2,69-4,11) 1,92 (1,76-3,17) р0<0,05 83,95 (81,69-94,20) р0<0,05 2,98 (1,54-3,55) 1,48 (0,83-2,19) 93,75 (79,09-97,01) 1,95 (0,89-3,12) 25,75 (23,04-31,68) 5,15 (3,70-6,13) 61,88 (52,14-70,44) 9,21 (6,62-10,29) 2,75 (1,69-3,83) 1,22 (0,73-1,74) 84,14 (75,34-94,72) 2,30 (1,38-4,86) 23,65 (19,39-29,26) 5,02 (3,74-6,26) 48,57 (30,69-73,58) 9,25 (4,76-10,39) 3,33 (2,58-6,59) 1,17 (0,85-1,51) 82,40 (64,48-95,86) 3,22 (1,03-4,63) 7,92 (4,71-10,88) 0,98 (0,90-1,49) 92,26 (72,84-93,71) 1,89 (0,96-3,60) 2,30 (0,40-2,73) р0<0,05 5,85 (4,33-6,03) 61,66 (28,86-74,65) 4,03 (1,93-4,27) 32,99 (29,74-48,62) р0<0,05 24,36 (17,89-31,55) 63,12 (48,34-74,63) 7,89 (6,97-10,56) 3,25 (3,01-4,85) 1,30 (0,68-1,76) 92,86 (72,45-95,25) 1,83 (1,04-3,27) 5,33 (5,08-6,49) 50,91 (44,11-75,03) 8,58 (6,93-11,90) 4,80 (2,25-5,58) 1,81 (0,66-1,62) 88,82 (76,53-94,72) 3,40 (2,73-5,25) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 32,86 (26,36-40,96) р0<0,05 34,70 (24,30-47,25) р0<0,05 5,99 (4,11-6,24) 47,80 (27,96-56,12) р0<0,05 р1<0,05 10,01 (7,29-15,97) 7,40 (6,51-13,20) 79 Таблица 7. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранные молекулы CD62L и CD27, ассоциированные со степенью дифференцировки Т-клеток, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования CD45RА+CD3+CD4+ CD45RА+CD3+CD8+ CD62L-CD27- CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ CD62L+CD27- CD62L-CD27- CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ CD62L+CD27- Контрольная проба Ac/Exp 2,36 (1,16-3,44) 0,66 (0,43-1,58) 0,79 (0,45-0,95) 3,04 (1,54-4,47) 2,97 (2,49-4,23) 1,26 (0,95-1,47) р1<0,05 0,53 (0,42-0,73) 1,80 (0,96-1,66) 1,69 (1,64-3,24) 3,50 (1,90-5,20) р0<0,05 2,93 (2,54-3,20) 3,45 (2,62-3,89) 88,20 (77,15-94,45) 3,93 (2,75-4,98) 64,49 (56,60-75,08) 52,69 (48,25-55,24) р0<0,05 63,50 (54,54-74,41) 66,17 (59,24-71,25) 47,99 (40,46-68,93) р0<0,05 7,87 (6,80-10,74) 14,16 (9,13-16,94) р0<0,05 6,61 (5,69-7,89) 6,16 (3,78-8,36) 0,99 (0,40-1,05) 23,42 (13,79-28,76) 17,11 (13,05-19,08) р0<0,05 26,50 (22,95-29,97) 24,13 (17,15-28,70) 35,89 (27,65-42,16) р0<0,05 4,91 (4,33-5,91) 5,05 (5,80-8,82) Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) 95,49 (79,79-96,28) 82,80 (70,76-94,04) р0<0,05 86,72 (79,98-93,65) 88,29 (77,97-94,43) 3,45 (1,69-13,29) 1,32 (0,61-1,99) 85,52 (77,54-91,60) 2,18 (0,69-2,72) 25,16 (15,50-27,07) 6,25 (5,65-8,93) 1,42 (0,93-16,00) 1,17 (1,02-1,84) 89,24 (74,41-94,08) 1,53 (041-3,27) 28,86 (18,11-38,25) 6,90 (5,41-8,75) 0,94 (0,84-1,88) 81,81 (77,43-84,95) р1<0,05 3,89 (2,53-4,28) 22,92 (19,53-29,40) 1,76 (1,46-1,97) 89,45 (76,52-95,55) 4,63 (3,94-4,93) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) 3,14 (1,72-4,60) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) 4,92 (0,95-14,06) р1<0,05 2,79 (2,17-3,89) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) 2,93 (2,16-3,30) 0,73 (0,38-1,61) 91,34 (75,07-94,94) 3,58 (2,48-4,88) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) 0,99 (0,26-1,59) р1<0,05 0,63 (0,52-1,05) 89,88 (74,00-94,37) 4,52 (3,63-5,22) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) 6,14 (4,42-6,97) 5,04 (4,66-6,57) 7,21 (5,88-10,86) 57,91 (44,20-70,62) 5,83 (5,39-9,99) 6,07 (4,69-9,50) 59,74 (45,78-65,90) 6,62 (3,47-8,28) 6,25 (5,98-7,36) 49,88 (38,25-56,38) р1<0,05 5,99 (3,99-9,38) 26,51 (23,16-31,40) 5,89 (4,21-7,30) 61,19 (54,86-69,41) 33,22 (27,88-37,11) р0<0,05 7,03 (6,49-7,47) 51,13 (46,48-61,59) р0<0,05 27,11 (25,55-33,34) 6,83 (5,85-9,00) 60,68 (51,23-63,57) 4,64 (3,30-6,25) 6,85 (4,25-7,74) 7,50 (6,04-9,91) 80 Таблица 8. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранные молекулы CD62L и CD27, ассоциированные со степенью дифференцировки Т-клеток, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) CD45RО+CD3+CD4+ CD45RО+CD3+CD8+ Варианты культивирования CD62L-CD27- CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ CD62L+CD27- CD62L-CD27- CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ CD62L+CD27- Контрольная проба 18,47 (18,28-20,16) 10,36 (8,07-13,26) 54,12 (49,02-58,66) 13,38 (11,51-15,98) 34, 09 (24,51-39,48) 31,90 (30,51-42,48) 21,19 (20,76-27,24) IL-2 (0,1 нг/мл) 15,80 (13,95-21,62) 11,06 (7,25-14,87) 57,09 (48,78-64,51) 14,40 (11,49-15,69) 32,64 (25,35-36,80) 29,45 (23,39-33,20) 18,60 (17,89-23,60) 13,38 (11,51-15,98) 12,47 (6,29-13,75) IL-2 (0,5 нг/мл) 17,23 (14,88-21,15) 10,11 (8,12-13,40) 58,61 (48,50-63,39) 12,72 (12,29-13,85) 31,77 (25,76-41,40) 5,97 (3,22-6,55) р0<0,05 10,92 (8,42-14,36) 50,93 (48,62-51,87) 13,40 (12,43-14,81) IL-7 (0,1 нг/мл) 26,32 (21,62-28,55) р0<0,05 18,75 (17,91-19,72) 54,67 (48,01-60,33) 13,36 (10,09-15,20) 45,63 (42,10-51,51) р0<0,05 36,75 (28,96-44,82) IL-7 (0,5 нг/мл) 18,94 (16,89-19,68) 9,85 (7,07-12,82) 56,61 (50,22-62,24) 12,45 (12,30-13,78) 33,58 (31,61-41,86) IL-7 (1,0 нг/мл) 17,25 (15,52-18,61) 9,36 (6,45-12,14) 47,71 (45,08-51,50) р0<0,05 12,37 (10,50-15,29) IL-15 (0,1 нг/мл) 20,51 (18,37-21,13) 10,69 (6,94-12,95) 53,28 (48,21-58,56) IL-15 (0,5 нг/мл) 18,97 (16,75-20,67) 11,62 (6,54-12,12) IL-15 (1,0 нг/мл) 19,80 (15,40-20,91) 10,31 (8,37-12,74) IL-2 (1,0 нг/мл) 27,84 (24,59-32,31) 19,56 (17,12-27,63) 20,01 (16,66-28,29) р0<0,05 31,08 (26,27-36,28) 29,73 (28,00-33,85) 17,58 (14,10-18,69) р0<0,05 19,63 (14,05-29,96) 42,80 (36,38-50,98) р0<0,05 22,04 (24,50-26,70) р0<0,05 15,74 (14,55-19,64) р0<0,05 13,86 (11,73-14,53) 35,76 (23,40-43,99) 31,80 (28,22-36,15) 18,21 (15,77-27,65) 54,19 (48,16-61,62) 13,69 (12,23-14,74) 31,85 (25,33-39,43) 32,98 (27,29-37,81) 19,21 (16,00-25,58) 55,46 (49,03-62,70) 13,53 (13,31-14,14) 44,37 (36,51-51,55) р0<0,05 23,49 (17,26-32,37) р0<0,05 15,84 (18,01-27,13) р0<0,05 20,65 (18,29-28,32) 11,24 (8,12-13,22) 11,15 (8,23-16,73) 13,50 (12,57-14,12) 15,72 (13,86-16,57) 7,97 (4,80-9,98) 12,97 (9,15-14,29) 14,83 (12,63-16,74) 13,53 (10,73-17,73) 81 Таблица 9. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранные молекулы CD62L и CD27, ассоциированные со степенью дифференцировки Т-клеток, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба Ac/Exp - CD62L CD27 18,47 (18,28-20,16) 17,74 (13,68-20,25) - CD45RО+CD3+CD4+ CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ 10,36 54,12 (8,07-13,26) (49,02-58,66) 15,20 51,17 (9,94-18,50) (47,25-61,88) р1<0,05 15,10 57,34 (10,21-18,65) (50,94-60,87) + CD62L CD27 13,38 (11,51-15,98) 13,66 (8,07-14,24) Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) 15,09 (13,92-21,00) 15,16 (13,17-17,73) 13,42 (9,32-14,87) 58,24 (54,74-63,87) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) 29,07 (24,38-32,86) р1<0,05 12,66 (9,49-14,39) 48,73 (43,32-52,60) р1<0,05 13,48 (8,02-14,03) 16,49 (14,01-18,44) 13,86 (9,63-15,96) 57,73 (55,30-61,22) 12,44 (6,70-12,72) 17,33 (13,55-21,30) 13,92 (9,66-16,99) 56,67 (51,39-62,99) 31,84 (29,17-38,80) р1<0,05 12,62 (8,38-17,07) 43,97 (41,09-52,67) р1<0,05 16,98 (14,52-21,69) 12,39 (9,10-18,37) 17,27 (14,50-19,45) 17,12 (12,90-21,28) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) 12,20 (8,25-14,22) 11,43 (8,08-13,64) 11,15 (6,91-12,83) - - CD62L CD27 34, 09 (24,51-39,48) 39,94 (38,24-45,96) р0<0,05 38,45 (33,30-41,45) 48,96 (39,55-52,59) р1<0,05 47,02 (43,06-56,29) p1<0,05 36,87 (32,32-41,31) - CD45RО+CD3+CD8+ CD62L-CD27+ CD62L+CD27+ CD62L+CD2731,90 21,19 13,38 (30,51-42,48) (20,76-27,24) (11,51-15,98) 15,29 11,69 29,78 (13,38-21,20) (10,07-12,82) (24,13-33,66) р0<0,05 28,73 19,52 8,29 (24,38-35,10) (18,02-22,59) (7,11-17,97) 36,05 9,96 10,15 (34,81-43,58) (7,71-12,79) (6,09-15,55) р1<0,05 р1<0,05 37,62 8,96 10,89 (33,39-42,85) (7,71-10,79) (6,34-12,75) р1<0,05 р1<0,05 7,98 30,85 21,75 (6,53-17,82) (28,70-32,86) (17,77-26,44) 35,40 (28,41-42,18) 34,99 (31,24-41,84) 21,33 (21,09-23,99) 12,80 (8,26-14,49) 47,99 (45,48-51,50) p1<0,05 38,54 (33,86-41,20) p1<0,05 8,42 (7,10-9,65) p1<0,05 56,33 (49,40-62,55) 13,07 (6,68-13,82) 38,89 (31,05-42,48) 32,21 (29,85-34,92) 21,77 (20,12-25,12) 12,22 (8,49-18,54) 57,18 (43,99-62,75) 11,91 (8,02-13,29) 12,23 (8,82-14,75) 60,70 (52,60-66,24) 11,74 (8,09-13,62) 46,97 (43,61-51,36) p1<0,05 48,66 (43,20-52,78) p1<0,05 39,23 (37,03-41,43) p1<0,05 41,84 (34,64-47,96) p1<0,05 8,29 (19,8-23,06) p1<0,05 7,38 (5,58-8,64) p1<0,05 7,41 (6,35-14,35) 8,93 (6,98-16,81) 7,71 (7,16-14,06) 8,26 (5,56-13,01) 8,64 (5,09-14,03) 82 3.4. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на мембранную экспрессию молекул ранней активации (CD69; CD25), пролиферации (CD71), поздней активации (HLA-DR и CD56) и апоптоза (CD95) в разных субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD4; CD8) в CD45RA - и CD45RО - Т-культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro 3.4.1. Мембранная экспрессия молекулы ранней активации (CD69) В базальных образцах CD45RА+ Т-клеток, число CD69-позитивных лимфоцитов было равным 4,57 (3,50-5,23)%. Количество CD8+CD69+ Т-клеток значимо (более чем в 3 раза) превышало число CD4+CD69+ Т-лимфоцитов и составляло: 3,06 (2,64-4,35) и 0,89 (0,81-2,71)%, соответственно. Оценивая экспрессию молекулы «ранней» активации - CD69 через 24 ч после инкубации с rIL-2, нами было выявлено достоверное увеличение количества активированных лимфоцитов с фенотипом CD45RA+CD69+. Положительная динамика в отношении изучаемого показателя, коррелирующая с увеличением концентрации rIL-2, наблюдалась в СD4+ и CD8+ популяциях CD45RA+ Т-клеток (р < 0,05) (таблица 10). rIL-7 также дозозависимым образом увеличивал число CD69+ в хелперной и цитотоксической популяциях CD45RA+ Т-клеток (r2=0,65, r2=0,80, p < 0,05, соответственно). Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-15, приводила к увеличению числа CD4+/CD8+CD69+ Т-клеток только при использовании максимальной концентрации цитокина (1,0х10-9 г/мл) (таблица 10). При добавлении в CD45RA+ - культуру активатора, регистрировалось увеличение количества CD69+CD45RA+ клеток (р<0,05). При этом экспрессия этой молекулы равномерно возрастала на СD4+ и СD8 + Т-клетках. Эффекты сочетанного действия rIL-2 и активатора на CD45RA+ Т-клетки были дозозависимы: увеличение концентрации rIL-2 было ассоциированно с повышением числа CD69-позитивных клеток, в основном за счет CD8+CD69+ Тлимфоцитов (р<0,05) (таблица 11). CD4+CD45RA+ Т-клетки были чувствительны только к максимальным дозам rIL-2 (1,0х10-9 г/мл). Добавление максимальных концентраций IL-7 в культуры TCR- активированных CD4+/CD8+CD45RA+ Т-клеток не влияло на экспрессию молекулы 83 ранней активации - CD69. Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-15 активации, приводила к повышению (0,5-1,0х10-9 г/мл) на фоне TCR- числа цитотоксических T-клеток, экспрессирующих молекулу ранней активации – CD69, по сравнению с пробами только с добавлением активатора (таблица 11). CD45RA+CD4+ Т-клетки в активационной модели культивирования in vitro оказались нечувствительны к активационному действию цитокина (таблица 11). В интактных пробах CD45RO+ Т-клеток, число CD69-позитивных лимфоцитов было равным 2,51 (0,83-5,3)%, при этом количество CD4+CD69+ и CD8+CD69+ варьировало в одном диапазоне, составляя: 1,13 (0,3-2,48) и 1,14 (0,27-2,98)%, соответственно. Действие rIL-2 на СD45RO+ Т-лимфоциты было дозозависимым (аналогично изменениям в культурах CD45RA+ Т-клеток): увеличение концентрации rIL-2 сопровождалось повышением числа CD69-позитивных клеток. Изменения затрагивали обе субпопуляции Т-клеток (р<0,05) (таблица 10). При культивировании CD45RO+ Т-клеток с rIL-15, рост процентного содержания лимфоцитов, несущих на своей мембране молекулу CD69, регистрировался только при добавлении максимальной концентрации цитокина (1,0х10-9/мл) (р<0,05). Чувствительностью к rIL-15 обладали только CD45RO+CD8+ Т-клетки. rIL-7 не влиял на исследуемый показатель (таблица 10). При добавлении в CD45RO+ - культуру Т-клеточного активатора, число CD69-позитивных лимфоцитов, возрастало. Изменения равномерно затрагивали СD4+ и СD8 + Т-клетки. Добавление rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) в среду TCRактивированных Т-клеток приводило к увеличению числа только CD45RO+CD4+CD69+ Т-клеток (р<0,05) и не влияло на цитотоксические Тклетки. Инкубация с rIL-15 (0,5х10-9 г/мл) была ассоциирована со снижением содержания CD69-позитивных Т-клеток в TCR-активированной СD4+CD45RO+ субпопуляции, и, напротив увеличением числа СD8+CD45RO+CD69+ Т-клеток (по отношению к пробе с активатором) (р<0,05). При инкубации CD45RO+ лимфоцитов в присутствии rIL-7 (в широком диапазоне концентраций) 84 количество клеток, несущих на своей поверхности маркер CD69 +, не изменялось (таблица 11). 3.4.2. Мембранная экспрессия молекулы активации - CD25 (IL2-Ra) В интактных образцах CD45RА+ Т-клеток, число CD25-позитивных лимфоцитов было равным 2,8(2,66 – 3,83)%. Количество CD4+CD25+ и CD8+CD25+ Т-лимфоцитов варьировало в одном диапазоне и составляло: 1,32 (1,11 – 2,50) и 1,28 (0,56 – 1,42)%, соответственно (таблица 12). Эффекты rIL-2 на CD45RA+ Т-клетки носили дозозависимый характер: увеличение концентрации rIL-2 в среде инкубации было ассоциировано с повышением числа CD25+ в обеих субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов (р<0,05) (таблица 12). Рост числа CD4+/CD8+CD45RA+CD25+ Т-клеток (по отношению к контрольной пробе), регистрировался при инкубации Т-клеток во всем спектре действующих концентраций rIL-15. rIL-7 дозозависимым образом увеличивал число CD25+ Т-клеток (r2=0,72, p<0,05) в хелперной популяции. CD45RA+CD8+ Тклетки были чувствительны только к действию максимальной концентрации rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) (таблица 12). Добавление в CD45RA+ - культуры Т-клеточного активатора, приводило к достоверному увеличению числа CD45RА+CD25+ Т-лимфоцитов по сравнению с контрольной пробой (р<0,05) (таблица 13). Изменения затрагивали обе субпопуляции CD45RA+ Т-клеток. На фоне TCR-активации, CD4+ Т-клетки с наивным фенотипом были чувствительны только к максимальным дозам цитокина (0,5-1,0х10-9 г/мл): содержание CD4+CD25+ Т-клеток в CD45RA+ Т-культурах возрастало (в сравнении с добавлением только активатора) (таблица 13). Повышение содержания CD25+ Тклеток – в популяции CD45RA+CD8+ Т-клеток носило равномерный характер и наблюдалось при добавлении всего спектра концентраций цитокина (0,1-1,0х10-9 г/мл) (таблица 13). Добавление максимальных концентраций rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) в культуры TCR-активированных CD4+/CD8+CD45RA+ Т-клеток приводило к достоверному 85 увеличению числа CD25+ Т-клеток. CD4+/CD8+CD45RA+ Т-клетки оказались нечувствительными к более низким концентрациям rIL-7. Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-15 (0,5-1,0х10-9 г/мл) на фоне TCR- активации, приводила к повышению числа CD8+ T-клеток, экспрессирующих молекулe активации СD25+, по сравнению с пробами только с добавлением активатора (таблица 13). CD45RA+CD4+ Т-клетки оказались нечувствительны к цитокину (таблица 13). Число CD25-позитивных лимфоцитов в базальных образцах CD45RО+ Тклеток было равным 3,8 (2,88 – 5,13)%. Количество CD4+CD25+ Т-клеток значимо (более, чем в 3 раза) превышало число CD8+CD25+ Т-лимфоцитов и составляло: 2,99 (1,75 – 4,17) и 0,71 (0,44 – 1,15)%, соответственно (таблица 12). Добавление в среду инкубации rIL-2 сопровождалось дозозависимым увеличением числа CD45RO+CD25+ Т-клеток памяти. Действие rIL-2 затрагивало обе субпопуляции CD45RO+CD4+ и CD45RO+CD8+ Т-клеток (р<0,05) (таблица 12). rIL-7 (во всем спектре действующих концентраций) оказывал влияние на активацию CD45RO+ CD8+ Т-клеток, равномерно увеличивая число лимфоцитов с фенотипом CD8+CD25+. Инкубация CD4+ клеток с rIL-7 сопровождалась ростом количества CD25+ позитивных лимфоцитов только при добавлении максимальной концентрации цитокина (1,0х10-9/мл) (таблица 12). rIL-15 не оказывал значимого влияния на экспрессию молекулы активации – CD25, CD4+ и CD8+ Т-клетками в CD45RO+ культурах (таблица 12). Добавление в культуры CD45RО+ Т-лимфоцитов активатора, сопровождалось ростом числа CD45RО+CD25+ Т-лимфоцитов (более чем в 11 раз) (р<0,05) (таблица 13). Изменения затрагивали обе субпопуляции CD45RO+ Т-лимфоцитов. rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) достоверно повышал содержание CD25+ Т-клеток в обеих субпопуляциях (CD4+/CD8+) CD45RO+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением Ac/Exp (р<0,05) (таблица 13). На фоне TCR-активации in vitro, rIL-15 (0,5; 1,0х10-9 г/мл) обладал угнетающим действием на СD45RO+ цитотоксические Т-клетки, достоверно снижая число CD8+CD25+ Т-лимфоцитов (по отношению к пробе с активатором) (р<0,05). CD45RO+CD4+-клетки оказались менее чувствительны к эффектам rIL15 (таблица 13). 86 Инкубация CD2/CD3/CD28-активированных CD45RO+ Т-лимфоцитов c добавлением rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) приводила к достоверному повышению числа CD4+/CD8+CD25+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением Ac/Exp (р<0,05) (таблица 13). 3.4.3. Мембранная экспрессия молекулы пролиферации – CD71 В контрольных пробах CD45RА+ Т-клеток, число CD71-позитивных лимфоцитов было равным 4,71 (3,97 – 7,35)%, при этом количество CD4+CD71+ и CD8+CD71+ Т-клеток составляло: 2,75 (0,54 – 3,24) и 1,73 (1,27 – 3,24)%, соответственно. Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 приводила к увеличению числа CD71 позитивных Т-лимфоцитов. Интересно, что хелперные Т-клетки с фенотипом CD45RA+, были чувствительны только к максимальной концентрации rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), тогда как число цитотоксических клеток равномерно увеличивалось (в среднем, в 1,7 раза) при добавлении всего спектра концентраций rIL-2 (таблица 14). CD45RA+CD8+ Т-лимфоциты были чувствительны ко всему спектру концентраций rIL-15 – число CD71+ Т-клеток в популяции цитотоксических лимфоцитов увеличивалось, в среднем, в 2 раза по сравнению с контрольными значениями (таблица 14). В популяции CD45RA+CD8+ Т-клеток, рост числа CD71+ Т-клеток происходил только под действием максимальной концентрации rIL-7 (1,0х10-9 г/мл). Хелперные CD45RA+ Т-лимфоциты оказались нечувствительны к пролиферативному действию rIL-7 и rIL-15. Добавление TCR-активатора в среду культивирования CD45RA+ Т-клеток сопровождалось достоверным ростом числа Т-лимфоцитов, несущих мембранную молекулу пролиферации - CD71. Изменения в равной степени затрагивали CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты (таблица 15). Эффекты IL-2 на CD45RA+CD8+ Т-клетки, в целом, носили стимулирующий характер: повышение содержания CD71+ Т-клеток – носило равномерный характер. Число CD4+CD71+ Т-клеток – не изменялось при добавлении rIL-2 (таблица 15). Добавление активированных максимальных концентраций CD4+/CD8+CD45RA+ Т-клеток IL-7 в приводило культуры к TCR- статистически 87 значимому увеличению числа CD71+ Т-клеток. Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-15 (0,5-1,0х10-9 г/мл) на фоне TCR- активации, приводила к повышению числа CD8+CD71+ T-клеток, по сравнению с пробами только с добавлением активатора. CD4+ Т-клетки в активационной модели культивирования in vitro оказались нечувствительны к цитокину (таблица 15). В контрольных образцах CD45RО+ Т-клеток, число CD71-позитивных лимфоцитов было равным 8,93 (5,21 – 12,04)%. Количество CD4+CD71+ Т-клеток значимо (в 2 раза) превышало число CD8+CD71+ Т-лимфоцитов и составляло: 4,57 (2,53 – 6,92) и 2,93 (1,55 – 4,23)% соответственно (таблица 14). rIL-2 индуцировал равномерное (во всем + + + концентраций), повышение числа CD4 /CD8 /CD71 спектре действующих Т-клеток в CD45RO+ - культурах. rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) значимо увеличивал количество лимфоцитов с фенотипом CD8+CD71+. Инкубация CD45RO+CD4+ клеток с rIL-7 не влияла на экспрессию молекулы пролиферации - CD71 (таблица 14). Выявлен дозозависимый эффект rIL-15 на экспрессию CD8+ клетками маркера пролиферации – СD71 (r2=0,70, p<0,05). Как и в культурах CD45RA+ Тклеток, эффекты rIL-15 не затрагивали пролиферативную активность CD4+субпопуляции Т-клеток. TCR-активация примированных (CD45RO+) Т-клеток, приводила к росту числа CD71+ Т-лимфоцитов; изменения, индуцированные активатором, равномерно затрагивали CD4+- и CD8+- субпопуляции (таблица 15). К пролиферативному действию rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), ассоциированному с + достоверным увеличением числа CD71 Т-клеток (р<0,05), были чувствительны только активированные хелперные лимфоциты памяти. Число CD45RO+CD8+CD71+ Т-клеток, подвергнутых TCR-активации, при добавлении rIL-2 - варьировало в пределах значений, полученных только при добавлении активатора (таблица 15). Действие rIL-7 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл) было направлено на увеличение числа CD45RO+CD4+CD71+ Т-клеток (р < 0,05). TCR-активированные CD45RO+CD8+ Т-клетки оказались менее чувствительны к пролиферативным эффектам rIL-7 и rIL-15: их число варьировало на уровне, сопоставимом с пробами с добавлением только активатора (таблица 15). 88 Таблица 10. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу ранней активации – CD69, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба IL-2 (0,1 нг/мл) IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) IL-7 (0,1 нг/мл) IL-7 (0,5 нг/мл) IL-7 (1,0 нг/мл) IL-15 (0,1 нг/мл) IL-15 (0,5 нг/мл) IL-15 (1,0 нг/мл) CD69 4,57 (3,50-5,23) 7,09 (7,01-14,60) р0<0,05 9,98 (8,74-10,60) р0<0,05 р1<0,05 13,88 (11,65-17,57) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 9,00 (8,87-10,54) р0<0,05 14,94 (12,74-16,07) р0<0,05 р1<0,05 18,53 (13,99-21,66) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 5,55 (4,37-6,73) 4,98 (3,49-5,25) 11,43 (7,47-13,06) р0<0,05 р1<0,05 CD45RА+CD3+ CD4/69 0,89 (0,81-2,71) 2,74 (1,71-3,90) р0<0,05 3,37 (2,35-3,86) р0<0,05 р1<0,05 5,35 (4,12-7,62) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,37 (1,25-2,47) р0<0,05 5,60 (3,81-6,79) р0<0,05 р1<0,05 8,12 (7,85-10,64) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 0,75 (0,69-1,01) 1,41 (0,63-3,04) 4,14 (2,87-4,22) р0<0,05 р1<0,05 CD8/69 3,06 (2,64-4,35) 4,16 (3,12-5,68) р0<0,05 6,60 (6,23-7,55) р0<0,05 р1<0,05 8,46 (5,89-11,56) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 5,08 (4,94-6,27) р0<0,05 8,41 (8,34-8,54) р0<0,05 р1<0,05 10,41 (9,30-12,20) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 4,24 (4,14-5,33) 4,54 (3,02-5,61) 6,14 (3,96-9,51) р0<0,05 р1<0,05 CD69 2,51 (0,87 - 5,3) 6,53 (3,71 - 9,21) р0<0,05 10,59 (3,42 – 15,58) р0<0,05 р1<0,05 14,13 (6,06 – 22,15) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 3,61 (2,15 – 4,17) CD45RО+CD3+ CD4/69 1,13 (0,3 - 2,48) 3,62 (1,72 – 5,19) р0<0,05 5,27 (1,65 – 12,21) р0<0,05 р1<0,05 7,47 (3,43 – 12,71) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,24 (0,71 – 2,52) CD8/69 1,14 (0,27 - 2,98) 2,00 (1,15 – 3,91) р0<0,05 3,63 (0,88 – 8,05) р0<0,05 р1<0,05 6,32 (2,69 – 13,46) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,18 (0,74 – 3,16) 3,26 (1,3 – 5,24) 1,51 (0,43 – 2,82) 1,74 (0,65 – 3,2) 3,78 (2,16 – 5,19) 1,58 (0,26 – 2,66) 2,02 (1,11 – 3,29) 2,79 (1,94 – 3,61) 3,05 (2,14 – 5,2) 4,96 (2,71 – 7,07) р0<0,05 р1<0,05 1,19 (0,56 – 1,87) 1,36 (0,65 – 2,89) 2,27 (0,96 – 5,77) 1,52 (0,96 – 2,20) 1,75 (0,82 – 3,14) 2,99 (1,8 – 4,83) р0<0,05 89 Таблица 11. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу ранней активации – CD69, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба Ac/Exp Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) CD69 4,57 (3,50-5,23) 43,59 (38,12-51,66) р0<0,05 50,48 (49,04-55,31) р1<0,05 62,22 (52,37-65,69) р1<0,05 р2<0,05 73,01 (54,16-81,45) р1<0,05 р3<0,05 CD45RА+CD3+ CD4/69 0,89 (0,81-2,71) 31,35 (19,28-38,40) р0<0,05 30,27 (26,36-36,72) 32,17 (25,73-37,21) 36,34 (30,11-42,14) р1<0,05 CD8/69 3,06 (2,64-4,35) 13,29 (10,36-17,68) р0<0,05 20,40 (15,03-22,38) р1<0,05 29,47 (22,76-35,10) р1<0,05 р2<0,05 37,26 (26,67-40,02) р1<0,05 р2<0,05 р3<0,05 CD69 2,51 (0,87 - 5,3) 62,46 (57,97– 70,12) р0<0,05 CD45RО+CD3+ CD4/69 1,13 (0,3 - 2,48) 46,52 (35,57– 60,42) р0<0,05 63,78 (56,09– 72,62) 45,72 (42,24– 55,69) 14,33 (7,9 – 15,23) 65,08 (60,68– 75,92) 47,34 (43,6 – 54,00) 13,56 (9,41 – 16,30) 72,60 (61,96– 85,59) р1<0,05 56,89 (48,84– 69,89) р1<0,05 13,90 (10,69–14,28) CD8/69 1,14 (0,27 - 2,98) 12,97 (7,87 – 13,52) р0<0,05 43,48 (36,16-45,04) 31,61 (20,90-32,58) 13,43 (9,02-13,67) 61,44 (43,49– 77,86) 45,24 (35,50– 53,48) 14,19 (7,02 – 18,95) 46,15 (40,23-50,23) 30,29 (22,35-33,08) 14,07 (10,81-21,18) 64,94 (55,67– 72,36) 47,78 (40,24– 59,29) 15,10 (7,69 – 21,47) 42,91 (42,47-48,24) 30,18 (26,01-30,24) 15,15 (14,38-15,23) 64,49 (43,35– 76,59) 50,31 (40,40– 63,88) 13,19 (8,00 – 19,12) 43,15 (38,90-45,32) 29,30 (22,48-32,71) 13,76 (12,77-14,35) 57,80 (43,88– 70,34) 42,49 (34,32 – 56,5) 15,1 (6,75 – 28,00) 54,15 (21,18 –68,44) 41,73 (34,26– 54,45) р1<0,05 24,84 (5,31 – 80,77) р1<0,05 57,5 (33,69– 75,11) 42,68 (27,48– 56,72) 15,20 (6,76 – 23,33) 46,81 (39,08-55,94) р1<0,05 51,77 (48,49-56,62) р1<0,05 25,85 (21,30-34,07) 23,80 (18,38-29,67) 22,47 (18,52-26,71) р1<0,05 27,17 (23,25-31,30) р1<0,05 90 Таблица 12. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу активации – CD25, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба IL-2 (0,1 нг/мл) IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) IL-7 (0,1 нг/мл) CD25 2,8 (2,66-3,83) 6,49 (4,94-8,39) р0<0,05 12,02 (9,89-13,80) р0<0,05 р1<0,05 16,54 (14,05-18,61) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 4,01 (3,56-9,54) р0<0,05 IL-7 (0,5 нг/мл) 7,52 (6,33-10,15) р0<0,05 IL-7 (1,0 нг/мл) 12,91 (8,10-14,00) р0<0,05 IL-15 (0,1 нг/мл) IL-15 (0,5 нг/мл) IL-15 (1,0 нг/мл) 5,53 (3,13-10,73) р0<0,05 6,67 (3,80-10,96) р0<0,05 4,24 (3,37-5,88) р0<0,05 CD45RА+CD3+ CD4/25 1,32 (1,11-2,50) 3,15 (2,06-6,58) р0<0,05 7,43 (5,45-8,88) р0<0,05 р1<0,05 8,97 (5,08-9,85) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,35 (1,52-3,83) р0<0,05 5,27 (2,85-6,56) р0<0,05 р1<0,05 11,97 (8,18-14,25) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 3,38 (1,83-6,39) р0<0,05 3,91 (2,36-5,91) р0<0,05 2,59 (2,00-4,19) р0<0,05 CD8/25 1,28 (0,56-1,42) 2,68 (1,69-3,53) р0<0,05 4,63 (3,53-6,22) р0<0,05 р1<0,05 7,94 (5,93-8,08) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 1,62 (0,54-2,66) 1,38 (0,87-2,73) 2,10 (1,13-2,65) 2,17 (1,59-3,42) р0<0,05 2,69 (1,53-4,44) р0<0,05 2,24 (1,27-4,65) р0<0,05 CD25 3,80 (2,88–5,13) 8,94 (6,94-11,65) р0<0,05 13,45 (7,18-16,31) р0<0,05 р1<0,05 21,72 (15,49-23,02) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 6,31 (5,43-7,19) р0<0,05 6,97 (5,06-8,83) р0<0,05 CD45RО+CD3+ CD4/25 2,99 (1,75-4,17) 6,64 (5,13-9,48) р0<0,05 9,01 (6,66-12,08) р0<0,05 р1<0,05 13,32 (10,20-16,72) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,92 (2,97-4,06) 3,57 (3,79-4,55) 7,26 (5,43-8,62) р0<0,05 5,04 (3,66-6,92) р0<0,05 3,33 (2,15-4,28) 3,03 (2,36-4,94) 4,08 (2,79-4,21) 4,28 (2,75-4,64) 5,03 (2,27-5,62) 4,31 (3,21-4,37) CD8/25 0,71 (0,44-1,15) 2,44 (2,75-3,12) р0<0,05 4,53 (3,40-5,35) р0<0,05 р1<0,05 6,54 (4,29-9,52) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 2,46 (0,99-3,83) р0<0,05 2,77 (1,02-3,19) р0<0,05 2,43 (2,22-2,76) р0<0,05 1,61 (1,01-1,74) 1,49 (1,34-1,82) 1,47 (1,13-1,50) 91 Таблица 13. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу активации – CD25, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба Ac/Exp Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) CD25 CD45RА+CD3+ CD4/25 CD8/25 CD25 3,80 (2,88–5,13) 42,26 (36,05-54,53) р0<0,05 47,02 (32,03-52,00) 2,99 (1,75-4,17) 35,02 (29,14-40,29) р0<0,05 37,61 (26,06-43,88) 42,52 (31,06-51,50) 34,06 (25,39-48,85) 55,38 (28,96-58,43) р1<0,05 41,05 (22,64-42,57) р1<0,05 44,46 (32,08-59,62) 36,73 (22,68-47,43) 51,08 (34,90-62,55) 36,38 (26,21-48,45) 11,85 (5,87-14,88) 53,68 (37,36-64,85) р1<0,05 39,86 (22,19-43,46) р1<0,05 14,76 (7,26-16,74) р1<0,05 42,66 (30,64-54,99) 30,66 (19,28-42,30) 9,10 (4,80-14,23) 42,58 (32,32-46,43) 37,34 (23,10-42,86) 41,54 (28,65-53,45) 33,97 (20,62-41,38) 2,8 (2,66-3,83) 25,33 (20,51-32,29) р0<0,05 31,17 (22,00-36,35) р1<0,05 32,85 (24,55-46,77) р1<0,05 34,32 (24,55-46,77) р1<0,05 1,32 (1,11-2,50) 16,32 (11,64-20,85) р0<0,05 21,05 (14,53-32,53) р1<0,05 20,00 (16,03-29,51) р1<0,05 1,28 (0,56-1,42) 7,67 (6,06-8,91) р0<0,05 13,95 (8,43-15,86) р1<0,05 12,74 (8,02-13,78) р1<0,05 13,50 (9,64-15,47) р1<0,05 28,27 (25,13-34,46) 18,89 (13,10-27,04) 9,01 (5,84-10,79) 29,62 (24,05-33,64) 18,66 (13,46-25,24) 9,47 (6,28-11,92) 35,19 (31,46-38,96) р1<0,05 27,48 (25,43-35,67) 24,21 (16,23-27,42) р1<0,05 18,86 (13,52-21,00) 11,04 (7,31-13,71) р1<0,05 7,98 (6,88-10,78) 29,99 (24,05-37,60) р1<0,05 30,33 (22,77-34,76) р1<0,05 15,79 (11,8-26,37) 18,87 (13,31-20,82) 18,21 (11,86-21,99) CD45RО+CD3+ CD4/25 10,55 (6,97-13,10) р1<0,05 11,28 (8,57-12,04) р1<0,05 CD8/25 0,71 (0,44-1,15) 9,04 (5,28-10,08) р0<0,05 10,62 (5,97-12,41) 10,23 (6,57-11,07) 14,76 (9,02-16,38) р1<0,05 9,25 (5,23-12,25) 5,90 (4,94-7,15) р1<0,05 6,13 (5,70-8,71) р1<0,05 92 Таблица 14. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу пролиферации – CD71, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) CD71 CD45RА+CD3+ CD4/71 CD8/71 Контрольная проба 4,71 (3,97-7,35) 2,25 (1,54-4,33) 1,93 (1,27-3,24) IL-2 (0,1 нг/мл) 4,98 (4,23-15,24) 2,17 (1,58-4,31) 3,21 (1,86-4,38) Варианты культивирования IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) 5,86 (4,30-14,23) р0<0,05 8,07 (6,19-14,22) р0<0,05 2,27 (2,06-5,29) 4,34 (3,62-8,81) р0<0,05 CD71 CD45RО+CD3+ CD4/71 CD8/71 8,93 (4,21-12,04) 13,46 (7,27-23,40) р0<0,05 16,27 (8,56-24,81) р0<0,05 17,34 (8,43-22,72) р0<0,05 4,58 (2,53-4,17) 8,64 (5,13-10,48) р0<0,05 9,01 (6,66-12,08) р0<0,05 10,32 (7,20-12,72) р0<0,05 2,93 (1,55-4,23) 5,44 (4,75-7,12) р0<0,05 6,53 (4,40-8,35) р0<0,05 5,99 (3,29-16,52) р0<0,05 7,36 (4,57-11,45) 4,92 (3,97-5,06) 2,46 (1,99-3,83) 8,92 (4,15-10,44) 4,57 (3,79-6,55) 3,77 (1,02-4,19) 5,00 (2,15-5,85) р0<0,05 4,22 (1,99-6,51) р0<0,05 12,19 (8,51-15,06) р0<0,05 5,04 (3,66-6,92) 9,32 (6,59-11,65) 4,03 (3,36-4,94) 3,35 (2,35-4,36) р0<0,05 3,77 (2,70-6,25) р0<0,05 2,37 (2,11-3,92) IL-7 (0,1 нг/мл) 6,09 (3,42-15,16) 2,49 (0,97-8,95) IL-7 (0,5 нг/мл) 7,03 (3,47-9,68) р0<0,05 2,45 (0,74-4,37) IL-7 (1,0 нг/мл) 5,48 (3,15-13,14) 1,11 (0,74-4,50) IL-15 (0,1 нг/мл) 7,85 (2,31-9,86) р0<0,05 2,75 (0,19-10,43) IL-15 (0,5 нг/мл) 5,80 (2,57-10,97) 2,25 (0,46-6,74) 3,76 (1,81-4,48) р0<0,05 11,79 (7,45-16,34) р0<0,05 4,28 (3,57-5,64) IL-15 (1,0 нг/мл) 5,84 (2,32-10,21) 2,21 (1,58-11,20) 4,45 (2,06-5,47) р0<0,05 15,03 (9,67-21,03) р0<0,05 4,31 (3,21-7,37) 3,27 (2,91-4,75) 6,43 (5,22-8,76) р0<0,05 4,61 (3,01-5,74) р0<0,05 6,90 (5,34-9,82) р0<0,05 р1<0,05 9,97 (7,13-12,10) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 93 Таблица 15. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу пролиферации – CD71, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба 12,45 (10,83-16,17) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) 23,05 (18,37-26,23) р1<0,05 25,34 (19,59-27,25) р1<0,05 17,46 (13,68-23,61) 10,34 (9,77-16,67) CD8/71 1,93 (1,27-3,24) 5,55 (3,75-6,79) р0<0,05 8,26 (5,68-12,66) р1<0,05 10,96 (9,58-13,78) р1<0,05 11,61 (6,94-15,34) р1<0,05 6,08 (4,41-6,88) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) 15,86 (6,67-23,45) 11,01 (6,42-14,82) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) 29,81 (23,88-31,06) р1<0,05 17,37 (9,77-21,52) 25,43 (18,25-29,66) р1<0,05 26,59 (17,01-29,18) р1<0,05 Ac/Exp Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) CD71 4,71 (3,97-7,35) 18,24 (14,80-24,13) р0<0,05 19,04 (13,22-23,72) CD45RА+CD3+ CD4/71 2,25 (1,54-4,33) 12,10 (9,51-15,21) р0<0,05 10,48 (8,39-16,21) CD71 8,93 (4,21-12,04) 21,93 (15,16-26,88) р0<0,05 22,98 (15,33-24,60) CD45RО+CD3+ CD4/71 4,58 (2,53-4,17) 12,45 (6,28-16,35) р0<0,05 14,68 (7,05-18,24) CD8/71 2,93 (1,55-4,23) 8,56 (5,93-11,05) р0<0,05 7,27 (5,21-9,61) 25,05 (15,86-31,02) 12,70 (5,96-16,73) 9,97 (6,68-11,56) 32,15 (13,44-42,06) р1<0,05 20,73 (14,16-39,75) 23,15 (16,10-29,87) р1<0,05 14,40 (4,80-30,17) 8,67 (7,11-12,38) 4,82 (3,34-7,22) 21,01 (11,79-25,04) 12,30 (8,19-25,48) 8,19 (6,60-9,26) 17,47 (14,86-24,86) р1<0,05 11,41 (10,01-12,29) 12,49 (7,39-15,04) р1<0,05 6,09 (4,59-8,00) 33,09 (25,23-37,29) р1<0,05 21,17 (17,28-24,16) 24,13 (15,07-31,15) р1<0,05 13,05 (9,65-15,21) 8,14 (6,79-9,12) 8,89 (4,13-12,70) 12,92 (10,89-16,62) 12,60 (10,48-16,77) р1<0,05 13,02 (8,69-15,56) р1<0,05 22,14 (10,31-32,75) 16,95 (5,79-18,40) 7,97 (6,68-10,80) 26,78 (24,31-34,65) р1<0,05 17,69 (13,96-25,25) р1<0,05 8,60 (7,01-10,71) 12,52 (10,84-15,71) 11,44 (7,15-14,39) 7,78 (5,41-11,22) 94 3.4.4. Мембранная экспрессия молекулы апоптоза – CD95 Число CD45RA+ и CD45RO+ Т–клеток в контрольных пробах, несущих на своей поверхности молекулу апоптоза - CD95, составило 12,18 (10,02 – 15,51) и 20,84 (16,22-25,60)%, соответственно (таблица 16). Распределение числа CD95+ Т-клеток в CD4+ и CD8+ субпопуляциях CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов было следующим: в популяциях CD45RA+ Тклеток преобладали цитотоксические лимфоциты, несущие маркер CD95+, тогда как в популяции CD45RO+ - содержание CD4+CD95+ Т-клеток было выше, чем число CD8+CD95+ лимфоцитов (таблица 16). Также нами было оценено распределение маркера CD95 в негативных и позитивных по экспрессии CD62L – популяциях CD4+- и CD8+- Т-клеток. Нами были получены следующие результаты: число CD95+ клеток в популяции CD45RA+CD8+CD62L+ - было менее 5,6%; тогда как почти 89% CD8+CD62L- Т-клеток (TEMRA) экспрессировали молекулу CD95. В CD45RO+-культурах, число CD95-позитивных лимфоцитов в популяциях CD8+CD62L+ и CD8+CD62L- было равным, в среднем, 70 и 85% (рисунок 21). В хелперных CD45RA+CD62L+ и CD45RA+CD62L- популяциях, число CD95позитивных клеток не превышало - 2,3 и 10,98%, соответственно. В то же время соотношение центральных (TCM) и эффекторных (TEM) клеток, экспрессирующих молекулу CD95, в CD45RO+CD4+ популяциях составляло, в среднем, 25 и 79% (рисунок 21). Инкубация CD45RA+ и CD45RO+ культур с rIL-2 сопровождалась ростом содержания CD95+ Т-клеток. Изменения, в основном, затрагивали цитотоксическую популяцию лимфоцитов (таблица 16). Распределение маркера CD95 в CD62L+ и CD62L- популяциями CD8+ Тклеток в CD45RA+- и CD45RO+-культурах было следующим: на фоне общего снижения числа CD8+CD62L+ (наивных и центральных) Т-клеток в CD45RA+- и CD45RO+ - культурах, соответственно, содержание CD95+ лимфоцитов в популяциях CD8+CD62L+ - возрастало с повышением концентрации цитокина. Число CD8+CD62L- Т-лимфоцитов, напротив, увеличивалось в CD45RA+ и CD45RO+ популяциях цитотоксических Т-лимфоцитов, а содержание CD95 - Т95 клеток в этих популяциях эффекторных клеток, в целом, оставалось неизменным. В нашем эксперименте, число CD4+CD95+ Т-клеток в CD45RA+ и CD45RO+ популяциях не изменялось при действии rIL-2. Наблюдаемое нами перераспределение экспрессии маркера CD95 в CD62+ и CD62- популяциях хелперных клеток носило недостоверный характер. Добавление рекомбинантных форм цитокинов - IL-7 и IL-15 в культуры CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в гомеостатической модели культивирования in vitro, не оказывало значимого влияния на экспрессию молекулы апоптоза - CD95 и не сопровождалось изменением соотношения живых/мертвых Т-клеток (таблица 16). В то же время, нами было обнаружено изменение содержания CD95+ Тклеток (в сторону увеличения) в цитотоксических CD62L-позитивных CD45RA и CD45RО – популяциях при добавлении максимальных концентраций цитокинов (rIL-7 и rIL-15) (рисунок 21). Добавление в культуры комплекса анти-CD2/CD3/CD28 приводило к увеличению количества CD95+ Т-лимфоцитов в CD45RА+ и CD45RO+ культурах (р<0,05) (таблица 17). Рост содержания CD95+ Т-клеток в CD45RA+ и CD45RO+ пробах с TCR-активатором регистрировался за счет обеих популяций Т-клеток (хелперных и цитотоксических) (таблица 17). В TCR-активированных CD45RA и CD45RО - пробах регистрировалось значительное увеличение CD95+ клеток в CD62L-позитивных популяциях, тогда как в CD62L- - эти цифры значимо не изменялись (рисунок 21). Действие rIL-2 на TCR-активированные CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоциты носило однонаправленный характер и сопровождалось повышением числа CD95+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением анти-CD2/CD3/CD28– частиц (таблица 17). Перераспределение маркера CD95 в популяциях CD8+ клеток было однонаправленным: число CD95+ Т-клеток возрастало в CD62L – позитивных популяциях наивных клеток и клеток с центральным фенотипом, тогда как в популяциях эффекторных клеток (CD62L-) – по прежнему оставалось на прежнем уровне (>90%) (рисунок 21). Хелперные Т-клетки в обеих популяциях оказались нечувствительными к действию цитокина (таблица 17, рисунок 21). 96 Таблица 16. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу апоптоза – CD95, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба IL-2 (0,1 нг/мл) IL-2 (0,5 нг/мл) IL-2 (1,0 нг/мл) IL-7 (0,1 нг/мл) IL-7 (0,5 нг/мл) IL-7 (1,0 нг/мл) IL-15 (0,1 нг/мл) IL-15 (0,5 нг/мл) IL-15 (1,0 нг/мл) CD95 12,18 (10,02-14,51) 14,67 (12,77-18,78) 19,33 (16,98-21,45) р0<0,05 р1<0,05 22,91 (23,05-31,35) р0<0,05 р1<0,05 р2<0,05 13,87 (10,33-15,72) CD45RА+CD3+ CD4/95 2,89 (1,52-4,81) 3,30 (1,37-4,35) 2,76 (0,98-6,99) CD45RО+CD3+ CD4/95 12,01 (10,96-14,67) 11,85 (9,66-14,14) 12,75 (10,24-13,22) CD8/95 9,89 (7,36-12,31) 10,82 (9,52-12,11) 15,33 (13,30-18,82) р0<0,05 р1<0,05 18,22 (16,54-21,43) р0<0,05 р1<0,05 CD95 20,84 (16,22-25,60) 19,96 (18,36-23,66) 28,02 (25,14-31,54) р0<0,05 р1<0,05 31,71 (28,93-35,23) р0<0,05 р1<0,05 4,04 (1,06-4,50) 8,21 (7,35-10,46) 18,78 (14,84-16,36) 11,91 (10,63-13,57) 6,53 (4,99-7,33) 12,56 (9,90-14,68) 2,64 (1,66-4,61) 9,86 (7,98-12,25) 19,19 (15,23-23,41) 10,47 (8,41-13,47) 7,17 (6,28-9,73) 13,07 (9,47-15,37) 2,31 (1,18-2,77) 9,53 (8,78-13,00) 20,96 (18,87-24,18) 12,22 (10,82-14,18) 7,99 (6,27-9,30) 12,05 (10,71-13,48) 1,73 (0,86-2,20) 10,32 (8,60-12,71) 18,92 (15,59-23,10) 10,96 (7,72-13,46) 7,16 (5,30-9,18) 13,18 (10,85-15,51) 1,29 (0,84-2,67) 12,39 (10,46-14,27) 21,27 (18,98-23,48) 11,25 (10,31-14,96) 9,57 (8,28-12,81) 13,08 (9,63-14,50) 1,77 (1,27-2,19) 11,23 (10,69-14,20) 22,05 (20,18-25,35) 15,99 (13,23-18,23) 7,19 (4,48-12,53) 3,57 (1,12-4,28) 11,33 (9,20-13,71) CD8/95 7,43 (6,11-9,96) 8,08 (7,85-17,38) 15,56 (13,79-18,09) р0<0,05 р1<0,05 18,72 (16,02-22,10) р0<0,05 р1<0,05 97 Таблица 17. Содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток (%) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу апоптоза – CD95, в условиях инкубации с цитокинами, имеющими общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в активационной модели культивирования in vitro (Me (Q1-Q3)) Варианты культивирования Контрольная проба Ac/Exp Ac/Exp / IL-2 (0,1 нг/мл) CD95 12,18 (10,02-14,51) 21,60 (14,96-23,23) р0<0,05 21,43 (15,03-25,29) CD45RА+CD3+ CD4/95 2,89 (1,52-4,81) 6,69 (4,72-12,05) р0<0,05 6,97 (5,88-10,66) CD8/95 9,89 (7,36-12,31) 15,31 (9,96-18,14) р0<0,05 13,54 (12,43-18,75) CD95 20,84 (16,22-25,60) 34,45 (26,36-39,48) р0<0,05 33,50 (27,27-36,22) CD8/95 7,43 (6,11-9,96) 14,90 (12,63-16,05) р0<0,05 13,62 (11,90-16,30) 22,17 (16,57-27,52) р1<0,05 25,22 (22,78-29,37) р1<0,05 13,12 (12,16-17,08) 23,04 (15,63-27,70) р1<0,05 21,82 (13,03-29,17) р1<0,05 13,21 (10,18-16,53) 38,87 (29,50-43,83) р1<0,05 46,37 (31,34-50,51) р1<0,05 31,99 (27,96-35,88) 40,12 (33,22-47,46) р1<0,05 42,25 (36,26-49,48) р1<0,05 36,60 (24,82-37,61) 17,03 (16,89-23,86) 23,73 (29,87-28,52) 21,52 (17,47-27,29) р1<0,05 24,74 (15,55-28,48) р1<0,05 14,25 (12,98-16,96) 19,35 (13,05-28,57) р1<0,05 21,29 (18,79-23,73) р1<0,05 14,73 (10,40-18,66) Ac/Exp / IL-7 (0,1 нг/мл) Ac/Exp / IL-7 (0,5 нг/мл) 29,17 (21,78-32,00) р1<0,05 32,58 (24,40-38,39) р1<0,05 21,95 (13,89-26,43) 26,56 (14,91-31,63) Ac/Exp / IL-7 (1,0 нг/мл) 25,01 (16,37-32,05) Ac/Exp / IL-15 (0,1 нг/мл) 19,13 (15,59-23,35) 7,98 (5,57-8,37) 2,88 (1,48-5,23) р1<0,05 2,49 (1,51-3,86) р1<0,05 5,49 (4,32-6,99) Ac/Exp / IL-15 (0,5 нг/мл) 22,05 (6,15-13,68) 6,00 (4,40-8,30) 16,15 (14,10-19,76) 32,42 (25,71-38,95) 19,05 (16,05-26,80) 13,69 (10,24-17,35) Ac/Exp / IL-15 (1,0 нг/мл) 21,15 (17,21-24,70) 5,99 (4,06-8,32) 14,09 (12,23-19,62) 33,18 (22,89-35,06) 10,29 (3,36-12,60) р1<0,05 24,11 (16,57-27,29) р1<0,05 Ac/Exp / IL-2 (0,5 нг/мл) Ac/Exp / IL-2 (1,0 нг/мл) 7,96 (5,09-10,74) CD45RО+CD3+ CD4/95 12,01 (10,96-14,67) 21,47 (8,62-23,09) р0<0,05 19,18 (18,09-22,31) 5,50 (4,58-7,05) 22,77 (18,02-25,51) 18,14 (15,94-21,74) 21,77 (20,17-24,20) 18,36 (17,85-25,48) 98 Рисунок 21. Относительное содержание (%) СD3+СD4+CD95+ и СD3+СD8+CD95+ клеток в CD62L+ и CD62L- популяциях CD45RA- и CD45RОкультур, в условиях гомеостатической (А, Б) и активационной (В, Г) моделей культивирования in vitro, с добавлением разных концентраций ɣсцитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) 99 Действие rIL-7 на изменение числа СD95+ в CD45RA+ - культурах на фоне TCR-активации, сопровождалось достоверным ростом числа CD8+CD95+CD62L+ (rIL-7 - 0,5-1,0х10-9 г/мл) и, напротив, снижением - CD4+CD95+ CD62L+ Т-клеток (rIL-7 - 0,5х10-9 г/мл), соответственно (р<0,05) (таблица 17). Содержание СD95+ Тклеток в CD62L+ - популяциях цитотоксических Т-клеток, значимо возрастало, и не изменялось в хелперных (рисунок 21). Эффекты rIL-7 (0,5-1,0х10-9 г/мл) на активированные CD45RО+ Т-клетки сопровождались увеличением числа CD8+CD95+CD62L+ Т-клеток по сравнению с активационной пробой (р < 0,05) (таблица 17), и не затрагивали хелперные популяции Т-лимфоцитов памяти (таблица 17). Добавление rIL-15 сопровождалось достоверным снижением числа хелперных CD45RO+CD95+ Т-лимфоцитов, и напротив, повышением содержания цитотоксических CD45RO+CD95+ Т- лимфоцитов (р<0,05) (таблица 17). Перераспределение экспрессии молекулы CD95 в популяциях центральных (CD62L+) и эффекторных (CD62L-) клеток выражалось достоверным увеличением числа CD8+CD95+CD62L+ Т-клеток, а в популяции хелперных лимфоцитов – не изменялось (рисунок 21). 3.4.5. Мембранная экспрессия молекулы поздней активации – HLA-DR В контрольных пробах число CD45RA+ Т–клеток, несущих на своей поверхности маркер поздней активации - HLA-DR+, составило 9,42±2,28 %. Количество CD4+HLA-DR+ и CD8+HLA-DR+ Т-лимфоцитов было равным: 3,13 ±0,98 и 5,54±1,39 %, соответственно (рисунок 22). Распределение маркера HLADR+ в негативных и позитивных по экспрессии CD62L – популяциях CD4 - и CD8 Т-клеток, было следующим: в популяциях наивных - CD45RA+ CD4+/CD8+CD62L+ Т-клеток экспрессия HLA-DR детектировалась на неопределяемом уровне; тогда как почти 18 и 32% CD4+/CD8+CD62L- Т-лимфоцитов экспрессировали HLA-DR на своей поверхности (рисунок 23). Следует отметить, что в эффекторных популяциях (CD62L-) CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, все CD3+HLA-DR+ - Т-клетки, экспрессировали маркер CD95. Однако, не все CD95-позитивные Т-лимфоциты несли на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. 100 Инкубация CD45RA-культур с rIL-2, rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) и rIL-15 (0,1-1,0 х10-9 г/мл), + сопровождалась + + CD3 CD8 HLA-DR (р < 0,05) (рисунок достоверным снижением общего числа Т-клеток по сравнению с уровнем интактных значений 22). Однако, несмотря на снижение общего числа CD3+CD8+HLA-DR+ Т-клеток, нами было обнаружено достоверное повышение, в среднем в 1,5 раза, содержания цитотоксических CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов в популяции, негативной по экспрессии молекулы CD62L (зрелые и незрелые TEMRA эффекторы) (рисунок 23). В культурах CD45RО+ Т-клеток преобладали хелперные CD3+HLA-DR+ Тлимфоциты (рисунок 22). Число HLA-DR-позитивных лимфоцитов, в популяциях CD8+/CD4+CD62L+ было равным, в среднем, 1,5 и 1,9%; в CD8+/CD4+CD62L - - негативных популяциях это процентное распределение составило: 15 и 8% (рисунок 22). Инкубация CD45RО+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10 -9 г/мл) сопровождалась увеличением + относительного количества хелперных и цитотоксических + CD3 HLA-DR лимфоцитов (в среднем, в 2 раза). Интересно, что рост числа HLADR+ Т-клеток регистрировался в CD62L+ и CD62L- субпопуляциях цитотоксических Т-лимфоцитов, тогда как в хелперных - число HLA-DR+Т-клеток возрастало только в эффекторной (CD62L-) популяции и не затрагивало Т-клетки с центральным фенотипом. Более 99% CD3+HLA-DR+ клеток в эффекторых популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток экспрессировали молекулу CD95. rIL-7 и rIL-15 не оказывали значимого влияния на изменение числа CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов в CD45RO+ - культурах (рисунок 22), способствуя, однако, в максимальных концентрациях -значимому росту числа CD3+CD8+HLADR+CD95+ в эффекторных Т-клеток памяти (рисунок 23). Добавление CD2/CD3/CD28-комплекса в среду культивирования Т-клеток, сопровождалось ростом числа CD3+CD8+HLA-DR+ в популяции CD45RA+-Тлимфоцитов (р < 0,05) и равномерным увеличением числа СD3+СD4+HLA-DR+ и СD3+СD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RО+-культурах (р < 0,05) (рисунок 22). TCRактивация способствовала увеличению числа CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD62Lнегативных популяциях CD45RO и CD45RA – культур. Кроме того, TCRактивация приводила к росту числа СD4+/СD8+СD62L+HLA-DR+ клеток в CD45RO+ популяции. 101 Рисунок 22. Относительное содержание (%) СD3+СD4+HLA-DR+ и СD3+СD8+HLA-DR+ клеток в CD45RA+- и CD45RО+-культурах Т-клеток, в условиях гомеостатической (А) и активационной (Б) моделей культивирования in vitro, с добавлением разных концентраций ɣс-цитокинов (rIL2, rIL-7 и rIL-15) 102 Рисунок 23. Относительное содержание СD3+СD4+HLA-DR+ и СD3+СD8+HLA-DR+ клеток (%) в CD62L+ и CD62L- популяциях CD45RA+- и CD45RО+- культур, в условиях гомеостатической (А, Б) и активационной (В, Г) моделей культивирования in vitro, с добавлением разных концентраций ɣс-цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) 103 Добавление rIL-2 (0,5-1,0х10-9 г/мл) и IL-15 (0,1-1,0х10-9 г/мл) в CD45RAкультуры на фоне TCR-активации, сопровождалось достоверным снижением числа CD3+CD8+HLA-DR+ по сравнению с пробами только с добавлением активатора (рисунок 22). rIL-7 не оказывал влияния на содержание CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RA-культурах. Действие цитокинов было направлено на снижение числа HLA-DR+ Т-клеток в CD62L- негативных популяциях CD45RA-клеток, тогда как процентное содержание СD3+СD8+СD62L-HLA-DR+CD95+, возрастало. Инкубация TCR-активированных CD45RО+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-15 (1,0х109 г/мл), также приводила к снижению числа цитотоксических CD3+HLA-DR+ Т- лимфоцитов. rIL-2 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) оказывали аналогичное действие на хелперные CD4+HLA-DR+ Т-лимфоциты (р < 0,05) (рисунок 22). В CD45RO – культурах, регистрировалось перераспределение маркера HLA-DR в негативных и позитивных по экспрессии CD62L-популяциях в сторону уменьшения, тогда как относительное содержание СD3+ СD8+СD62L- HLA-DR+CD95+, аналогично TEMRA эффекторам, возрастало (рисунок 23). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в ходе выполненного исследования получены данные, характеризующие эффекты цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на функциональную активность CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих проходящие в клетке процессы: активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в условиях гомеостатической и антигеннезависимой TCR – стимуляции. 104 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Процессы дифференцировки, пролиферации и программированной гибели, которым подвергаются основные участники иммунного ответа – лимфоциты, определяют сущность ответной иммунной реакции организма на различные агенты инфекционной и неинфекционной природы. В результате активационного (дифференцировочного) процесса, на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются молекулы активации (ранней и поздней), костимуляции, пролиферации и апоптоза (Shipkova M., Wieland E., 2012; Литвинова Л.С. и др., 2014). Становится очевидным, что оценка уже известных, а также выявление новых поверхностных биомаркеров, принимающих участие в процессах клеточного гомеостаза иммунокомпетентных клеток, позволит расширить существующие на сегодняшний день представления о функциональной активности иммунокомпетентных клеток в норме и при формировании патологического процесса. Многочисленные данные свидетельствуют, что цитокины семейства I типа (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21), имеющие общую γ-цепь рецепторов (CD132), способны оказывать комплексное воздействие на дифференцировку и клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов (Seddon B. et al., 2003; Burchill M.A. et al., 2007; Boyman O. et al., 2007; Lee B., Hong C., 2015). Установлено, что чувствительность Тлимфоцитов к цитокинам, имеющим общую γ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL15), зависит от стадии их дифференцировки (Geginat J. et al., 2002). Учитывая это обстоятельство, одни и те же цитокины могут проявлять разнонаправленные эффекты на наивные клетки-предшественницы и Т-клетки иммунной памяти. В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования явилась комплексная оценка эффектов иммунорегуляторных цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15) на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих проходящие в клетке процессы: активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в условиях гомеостатической и антиген-независимой TCR – стимуляции. 105 Для реализации экспериментальные поставленной модели цели нами культивирования in были vitro: использованы гомеостатическая две и активационная: Гомеостатическая модель культивирования предполагает создание in vitro условий гомеостатического влияния рекомбинантных форм цитокинов семейства I типа, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15) на Т-клетки разной степени дифференцировки. Активационная модель - имитирует процесс взаимодействия Т-лимфоцитов с антигенпрезентирующими клетками (АПК) (активация Т-клеток через CD2, CD3 и CD28) в присутствии рекомбинантных форм цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15). Известно, что клетки, отвечающие за формирование иммунной памяти, на протяжении всей жизни человека, подвергаются динамическим изменениям при встрече с различными антигенами, которые включают в себя дифференцировку от наивных клеток-предшественниц до антиген-специфических лимфоцитов иммунной памяти и эффекторных клеток, а так же самообновление и поддержание пула Т-клеток памяти (Kinjyo I. et al., 2015). Расшифровка путей дифференцировки Т-клеток, с выявлением новых «игроков» в этом сложном процессе является актуальной задачей физиологии иммунного ответа (Ярилин А.А., 2010; Martinez M.N., Lynch W.K., 2013; Rodrigues R. et al., 2013). Оценка влияния цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL7 и IL-15) на процессы дифференцировки CD4 и CD8 Т-клеток в CD45RA и CD45RO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro Как уже упоминалось в обзоре, еще в 90-х годах прошлого столетия были предприняты первые попытки разделения Т-лимфоцитов на наивные и зрелые клетки по различиям в экспрессии изоформ общелейкоцитарного рецептора - CD45 (Fang K.S. et al., 1994; Young J.L. et al., 1997). Современные исследования доказали, что молекула CD45 структурно близка к Т-клеточному рецептору (TCR) и является критическим регулятором сигнализации, опосредованной Т-клеточным рецептором (Mustelin T. et al., 2003; Julenius K. et al., 2005; McNeill L. et al., 2007). 106 Основным признаком дифференцировки наивных Т-клеток в Т-клетки иммунной памяти принято считать изменение их фенотипа - CD45RO–CD45RAbright на CD45RObrightCD45RA– (Young J.L. et al., 1997). Однако концепция, основанная на экспрессии CD45RA на поверхности «наивных» клеток и CD45RO на Т-клетках памяти не в полной мере объясняет наличие выраженных эффекторных свойств у цитотоксических (CD8+) Т-клеток с фенотипом CD45RA+CD45RO–, равно как и их способности быстро отвечать на повторный контакт с антигеном (Кудрявцев И.В., 2014). В связи с этим, современные способы разделения Т-клеток на популяции наивных и Т-клеток памяти, базируются на выявлении экспрессии молекул, отвечающих за миграцию клеток (CD62L и/или CCR7) и/или ко-стимулирующих рецепторов - CD27 и/или CD28. В нашей работе были использованы поверхностные маркеры: CD62L, молекула L-селектина, которая способствует миграции клеток во вторичные лимфоидные органы (Picker L.J., 1993; Picker L.J. et al., 1993; Кудрявцев И.В., Савицкий В.П., 2012; Mahnke T.M. et al., 2013) и костимуляторную молекулу - СD27 (молекула семейства TNFα, имеющая свой лиганд CD70 на АПК) (Libregts S. et al., 2011; Van Montfrans J.M. et al., 2012; Coquet J.M. et al., 2013; Ribeiro S.T. et al., 2015), выявляемые в CD4 и CD8 популяциях CD45RA и CD45RО Т-клеток. На основе дифференциальной экспрессии молекул CD27 и CD62L, нами были выявлены популяции Т-клеток с наивным фенотипом (CD45RA+CD45R0-CD62L+CD27+) и гетерогенные популяции эффекторных Tклеток: CD27+CD62L-, CD27-CD62L+; CD27-CD62L- в CD45RA+ и в CD45RО+ Ткультурах. Согласно популяциям в полученным контрольных результатам, образцах распределение по основным CD4+/CD8+CD45RA+-культур было следующим: как и ожидалось, число Т-клеток с «наивным» фенотипом CD4+CD27+CD62L+ - было равным 95,49 (79,79 – 96,28), тогда как содержание «наивных» цитотоксических - CD8+CD27+CD62L+ Т-клеток не превышало 64,49 (36,60 – 75,08)% (таблица 6), что, в целом, не противоречит данным литературы (Кудрявцев И.В., 2014). 107 Логичным оказалось обнаружение в CD8+-популяции Т-лимфоцитов с фенотипом зрелых эффекторных клеток (TEMRA, Е) - CD45RA+CD27-CD62L- - их содержание составило 1/3 часть от числа CD8+ Т-клеток в популяции и было равным - 23,42 (13,79 – 45,76)%; содержание зрелых эффекторных клеток (TEMRA) в популяции хелперных (CD4+CD27-CD62L-) Т-лимфоцитов было незначительным (в 10 раз меньше, чем TEMRA цитотоксических) и было равным 2,36 (1,16 –3,44)% (таблица 6). Особый интерес для нас также представляли минорные популяции хелперных (CD4+) и цитотоксических (CD8+) клеток с фенотипом: CD45RA+CD27CD62L+ и CD45RA+CD27+CD62L-. Согласно данным нашего исследования, число CD45RA+CD27-CD62L+ клеток в контрольных пробах CD4+ Т-клеток было в 4 раза ниже, чем в CD8+CD45RA+-популяциях Т-клеток (таблица 6). Тщательный анализ современной отечественной и зарубежной литературы позволил констатировать, что клетки с таким фенотипом не встречаются в периферической крови здоровых доноров. Можно предположить, что эта популяция представляет собой прямой переход от наивных (CD45RA+CD27+CD62L+) Т-клеток в терминально- дифференцированные Т-клетки (CD45RA+CD27-) (TEMRA), на которых, однако, сохраняется экспрессия молекулы CD62L. Тогда как Т-клетки с фенотипом CD4+/CD8+CD45RA+CD27+CD62L- являются незрелыми «ранними» TEMRA Тлимфоцитами (Sallusto F. et al., 2004; Кудрявцев И.В., 2014). Популяцию эффекторных или «терминально-дифференцированных» CD45RA-позитивных (TEMRA) Т-клеток в современной литературе рассматривают в качестве финальной стадии созревания Т-лимфоцитов, которую можно обнаружить в периферической крови. Отсутствие экспрессии костимуляторных молекул CD27 и CD28 свидетельствует, что активация эффекторных клеток может происходить под действием «не-профессиональных» антигенпрезентирующих клеток (в случае Т-хелперов), или же клетками-мишенями (в случае цитотоксических) (Sallusto F. et al., 2004). В то же время наличие адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов, отвечающих за миграцию этих клеток в «воспаленную» ткань, таких как PSGL-1, CD44 и лиганд-1 Е-селектина, является характерным отличием этих клеток от 108 CD4+ и CD8+ «наивных» клеток-предшественниц и клеток центральной памяти (Tcm) (Ley K., Kansas G.S., 2004). На сегодняшний день, для цитотоксических TEMRA Т-клеток разработана классификация (Rufer N. et al., 2003; Кудрявцев И.В., 2014). Так, клетки с фенотипом CD3+CD8+CD45RA+CD62L– разделены на три популяции исходя из уровня экспрессии костимуляторных молекул - CD27 и CD28: «пре-эффекторы» 1 типа (рЕ1; CD27+CD28+); «пре-эффекторы» 2 типа, (рЕ2; CD27+CD28-) и «зрелые» эффекторы (Е; CD27-CD28-). Rufer N. и др. (2003) была предложена модель дифференцировки эффекторных клеток из «наивных»: N → pE1 → pE2 → E (Rufer N. et al., 2003). Выявленная нами популяция CD8+CD45RA+CD62L-CD27+ Т-клеток в CD45RA+-культурах, согласно данным литературы (Rufer N. et al., 2003; Di Mitri D. et al., 2011; Chang J.T. et al., 2014) представляет собой пре-эффекторы I и II типов рЕ1 и рЕ2. Интересны данные, свидетельствующие, что уровень активности теломеразы у пре-эффекторов I и II типа сопоставим с таковым у «наивных» клеток, тогда как у эффекторных клеток он находится на неопределяемом уровне. Так же было отмечено постепенное увеличение уровней относительной экспрессии таких поверхностных антигенов, характерных для «терминально-дифференцированных» эффекторов, как CD11a, CD56, CD57, CD94 и CD158b (Rufer N. et al., 2003; Di Mitri D. et al., 2011). В линии pE1 → pE2 → E, уровень внутриклеточных эффекторных молекул, таких как перфорин и гранзим В, возрастает (Rufer N. et al., 2003). Кроме того, максимальные уровни экспрессии генов перфорина, гранзима В, адгезионной молекулы CD94 обнаруживались в зрелых эффекторных клетках с фенотипом CD27-CD28- (Takata H. et al., 2012). CD8+ Т-клетки, реэкспрессирующие CD45RA, были описаны как апоптоз-устойчивые клетки, с высоким уровнем экспрессии Bcl-2 (Dunne P.J. et al., 2002); другие авторы получили прямо противоположные результаты (Geginat J. et al., 2003). Сведения современной литературы, описывающие хелперную популяцию терминально-дифференцированных Т-клеток, крайне ограничены. Многие исследователи, в виду низкой частоты обнаружения этих клеток, опровергают их 109 существование (Sallusto F. et al., 2004; Carrasco J. et al., 2006).Тем не менее, CD4+ TEMRA Т-клетки описаны как популяция терминально-дифференцированных Тклеток с короткими теломерами и отсутствием пролиферативной способности, с высоким уровнем экспрессии CD57 (Harari A. et al., 2004; Silva de Azevedo R.I., 2011). Для них, как и для TEMRA CD8+ Т-клеток, характерна продукция таких провоспалительных цитокинов, таких как IFN-γ, но не IL-2 или IL-4 (Okada R. et al., 2008). Аналогично цитотоксическим TEMRA Т-клеткам, проявление эффекторных свойств TEMRA Т-хелперов с фенотипом CD45RA+CD62L–, происходит под влиянием таких цитокинов как IL-6, IL-8, IL-12, IL-18 и TNFα, продуцируемых клетками врожденного иммунитета (моноциты, тканевые макрофаги и т.д.) или патоген-ассоциированными молекулярными паттернами непосредственно в воспаленных тканях и эти клетки не нуждаются в дополнительном костимулирующем сигнале (Caron G. et al., 2005). Особый интерес для нас представляли данные о влиянии иммунорегуляторных цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15) на перераспределение популяций с наивным и эффекторным фенотипом в CD45RA+- культурах Т-клеток. IL-2 - плейотропный цитокин, играет важную и сложную роль в регуляции функций иммунокомпетентных клеток (Stittrich A.B. et al., 2010). Выступая в качестве основного антигензависимую фактора роста дифференцировку Т-лимфоцитов, и IL-2 пролиферацию поддерживает разных клеточных субпопуляций, а также является регулятором апоптотической гибели клеток, опосредованной активацией, ограничивая, тем самым, чрезмерные иммунные реакции (Létourneau S. et al., 2009; Шатрова А.Н. и др., 2009; Liao W. et al., 2011; Liao W. et al., 2013). Добавление rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) в CD45RA+ - культуры приводило к повышению числа незрелых (CD45RA+CD27+CD62L -) и зрелых (CD45RA+CD27CD62L-) TEMRA Т-клеток в хелперных популяциях, в целом, за счет снижения содержания Т-лимфоцитов с наивным фенотипом CD4+CD45RA+CD27+CD62L+ (таблица 6). Действие rIL-2 (во всем спектре концентраций) на популяцию CD8+ Тклеток сопровождалось увеличением числа только зрелых эффекторных 110 (CD45RA+CD27-CD62L-) TEMRA Т-клеток; IL-2 индуцируемые изменения в CD8+CD45RA+ популяции носили равномерный характер (таблица 6). Следует отметить, что в популяции цитотоксических Т-клеток, максимальная концентрация rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) индуцировала образование Т-клеток центральной памяти с фенотипом - CD45RA-CD62L+CD27+ (TCM) (таблица 6, рисунок 24). Выявленное нами, IL-2-индуцированное повышение числа цитотоксических и хелперных Т-лимфоцитов с фенотипом CD45RA+CD62L-CD27– (Е) в культурах CD45RA+ Т-клеток на фоне снижения содержания клеток с наивным фенотипом в популяциях хелперных и цитотоксических лимфоцитов, позволяет предположить факт прямой дифференцировки «наивных» Т-клеток в эффекторные. Этот тезис подтвержден сильными корреляциями между содержанием зрелых TEMRA (CD45RA+CD62L-CD27–) Т-клеток и числом лимфоцитов с наивным фенотипом (TN) (r= - 0,67, r= - 0,70, p<0,05 для CD45RA+CD8+ Т-клеток при действии IL-2 (0,51,0х10-9 г/мл) и r= - 0,85б p<0,05 для CD45RA+CD4+ Т-клеток при действии IL-2 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). Кроме того, данные литературы свидетельствуют, что у клеток с фенотипом CD45RA+CD27–, длина теломеров снижена относительно «наивных» клеток, однако значительно превосходит таковую у популяций клеток ТСМ и ТЕМ (Кудрявцев И.В., 2014). Зрелые наивные Т-клетки, покинувшие тимус, нечувствительны к действию IL-2, поскольку мембранная экспрессия IL-2Rа и IL-2/15Rβ у этих клеток минимальна. In vivo основная физиологическая роль IL-2-сигнализации в регуляции гомеостаза наивных Т-клеток заключается в поддержке популяции Treg, которая, в свою очередь, регулирует активацию наивных Т-клеток и Т-лимфоцитов памяти (Ma A. et al., 2006). В то же время, в научной периодике встречаются публикации, наивных освещающие Т-клеток факт в CD45R0+CD62L+CCR7+CD27+CD28+) цитокин-индуцированной клетки и/или дифференцировки центральной эффекторной (CD45RA– (CD45RA– CD45R0+CD62L–CCR7–) памяти (Manjunath N. et al., 2001; Surh C.D., Sprent J., 2008). В частности, речь идет о прайминге in vitro наивных CD8+ Т-лимфоцитов высокими концентрациями IL-2 или IL-15 (Cho J. H. et al., 2007; Surh C.D., Sprent J., 2008). 111 Увеличение числа зрелых (CD8+CD27-CD62L-) эффекторов TEMRA регистрировалось только при добавлении максимальной концентрации rIL-7 (1,0х10-9 г/мл). Перераспределение популяционного состава эффекторных CD8+ Тклеток регистрировалось на фоне снижения числа Т-лимфоцитов с незрелым эффекторным (CD8+CD27+CD62L-) фенотипом и не затрагивало наивные Т-клетки (таблица 6, рисунок 24). Возможно, что действие цитокина на CD8+ Т-лимфоциты может быть обусловлено способностью IL-7 активировать продукцию IL-2 Тклетками, который, действуя аутокринно и паракринно, может способствовать дифференцировке и созреванию Т-клеток в «эффекторы», для которых характерна потеря экспрессии молекул хоуминга и костимуляции (Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008). CD4+ субпопуляция CD45RA+ Т-клеток была нечувствительна к действию rIL-7 в отношении дифференцировки и созревания (таблица 6, рисунок 24). Известно, что in vivo, наивные покоящиеся Т-клетки получают сигналы низкого уровня через контакт с IL-7 и молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые позволяют клеткам выживать в течение длительного времени в состоянии покоя, не подвергаясь антигеннезависимой дифференцировке (Sprent J., Surh C.D., 2002; Boyman O. et al. 2007; Ярлин А.А., 2010; Le Campion A. et al., 2012). Некоторые работы также констатируют, что наивные CD4+CD45RA+ Тлимфоциты, количество которых увеличено под влиянием IL-7, поддерживают «наивный» фенотип, тогда как хелперные центральные Т-клетки памяти дифференцируются, изменяя экспрессию хемокиновых рецепторов и приобретая эффекторные функции (Geginat J. et al., 2001; 2002; Silva de Azevedo R. I., 2011). Действие IL-15 на CD8+CD45RA+ Т-клетки, в целом, носило аналогичный rIL-2, характер. Так, добавление rIL-15 (0,5-1,0х10-9 г/мл) в среду культивирования приводило к повышению числа CD45RA+CD8+CD27-CD62L- и CD45RA- CD8+CD27+CD62L+ Т-клеток на фоне снижения CD45RA+CD8+CD27+CD62L+. CD4+ Т-лимфоциты были чувствительны только к максимальной концентрации цитокина. rIL-15 индуцировал повышение числа хелперных клеток с фенотипом CD4+CD27-CD62L+ (таблица 6, рисунок 24). 112 Данные научной периодики крайне противоречивы. Wallace D.L. и др. (2006) выявлено, что IL-15 in vitro опосредует экспансию CD8+ Т-клеток без изменения фенотипа наивных клеток в течение длительного времени культивирования. Этот процесс авторы тесно ассоциируют с повышением активности фермента теломеразы, что, возможно, связано с резким увеличением числа пролиферирующих клеток, начиная примерно с 1 недели культивирования, достигая пика ≈ на 14 день. У клеток, обработанных IL-7, регистрируется более медленная реакция (Wallace D.L. et al., 2006). Значимость этих результатов для Тклеточного гомеостаза активно свидетельствуют, что наивные периферического кровотока обсуждаются. Другие CD45RA+CD27+ взрослого человека работы, Т-клетки, или напротив, выделенные пуповинной из крови новорожденного, быстро пролиферируют в ответ на стимуляцию IL-15, а также меняют свои фенотипические и функциональные свойства (Alves N.L. et al., 2003). Liu K. и др. (2002) было показано, что IL-15 имитирует связывание с TCR, что приводит к индукции клеточной пролиферации и повышению цитотоксической активности CD8+ Т-клеток памяти (Liu K. et al., 2002). rIL-2, rIL-15 rIL-2 CD45RA CD27 CD62 (ТЕМRA) CD45RA-CD27+CD62+ (ТCM) + - - CD45RA+СD27+CD62+(TN) CD45RA+СD27+CD62+(TN) CD8 + CD45RA+CD27-CD62- (зр ТЕМRA) CD45RA+CD27+CD62- (н/зр ТЕМRA) CD4 + rIL-7 н/ч CD45RA+CD27-CD62- (ТЕМRA, Е) CD45RA+СD27-CD62+ rIL-7 CD45RA+СD27+CD62+(TN) rIL-15 Рисунок 24. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на дифференцировку и созревание CD4+/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов в гомеостатической модели культивирования in vitro Таким образом, цитокины, имеющие общую ɣ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), способствуют образованию зрелых TEMRA (Е) Т-клеток и Т-клеток памяти с центральным фенотипом (TCM) в популяции CD45RA+CD8+ Т113 лимфоцитов, на фоне снижения содержания наивных CD8+ клеток (TN). rIL-2опосредованный рост числа CD45RA+CD4+ Т-клеток с фенотипом зрелых и незрелых TEMRA Т-клеток, происходит за счет уменьшения Т-лимфоцитов с наивным фенотипом (TN). rIL-15 в хелперной популяции CD45RA+ Т-клеток, способствует образованию лимфоцитов с фенотипом - CD27-CD62L+ (рисунок 24). После антигенной стимуляции, при контакте TCR с комплексом «пептид – HLA» больше порогового значения, наивные Т-лимфоциты активируются и претерпевают клональную пролиферацию и дифференцировку в эффекторные клетки (Rufer N. et al., 2003). Этот процесс сопровождается качественным изменением набора поверхностных молекул адгезии, которые направляют уже эффекторные Т-клетки из лимфоидных тканей в места локализации патогена (Ивашкин В.Т., 2008; Sallusto F., Lanzavecchia A., 2010). Имитируя действие антиген-презентирующих клеток, CD2/CD3/CD28частицы стимулируют Т-клеточный рецептор (TCR) и корецепторные молекулы (CD28, CD58), что способствует формированию иммунного синапса, активации клетки и экспрессии многих генов, способствующих пролиферации лимфоцитов, в частности, IL-2 и его рецептора – IL-2-IL-2R (Ивашкин В.Т., 2008; Хаитов Р.М. и др., 2009; Хоченков Д.А., 2010; Ярилин А.А., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Результаты, полученные нами при инкубации CD45RA+ Т-клеток с TCRактиватором, представляются нам вполне логичными и укладываются в рамки действия активатора. В нашем эксперименте, добавление Т-клеточного активатора, имитирующего действие АПК, в культуры CD45RA+ Т-клеток, на фоне резкого сокращения числа живых Т-клеток, и напротив, усиления их пролиферативной активности, сопровождалось повышением числа CD45RA-негативных Т-клеток в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток (CD45RA-CD62L-CD27+, TEM) за счет снижения содержания Т-лимфоцитов с наивным фенотипом. На фоне активации CD45RA+ Т-клеток, происходило резкое снижение числа TEMRA (Е) цитотоксических лимфоцитов (в среднем, на 30%). Процентное содержание CD45RA+CD4+CD62L-CD27- Т-клеток оставалось на прежнем уровне (таблица 7, рисунок 25). 114 Интересным представляется тот факт, что на фоне активации, в обеих популяциях значительно повышалось число клеток с фенотипом - CD27- CD62L+ (таблица 7, рисунок 25). Как уже упоминалось ранее, эта популяция, индуцируемая in предположительно, vitro, терминально-дифференцированные Т-клетки (CD45RA+CD27-) (TEMRA), на которых, однако, сохраняется экспрессия молекулы CD62L. Возможно, что одной из причин снижения числа CD45RA+CD27-CD62L(TEMRA) Т-клеток в культурах CD45RA+ Т-лимфоцитов в условиях их активации, может быть повышенная гибель этих клеток, крайне чувствительных к дисбалансу инициирующих сигналов. Согласно данным литературы, стимуляция TCR антителами против CD3 в условиях in vitro, сопровождается массовой гибелью терминально-активированных эффекторов - TEMRA (Di Mitri D. et al., 2011; Libri V. et al., 2011). В то же время ряд публикаций свидетельствуют, что CD45RA+CD4+/CD8+ CD62- Т-клетки, in vivo – покоящиеся клетки, на фоне активации - подвергаются пролиферации (Faint J.M. et al., 2001; Dunne P.J. et al., 2002; Carrasco J. et al., 2006). TCR-активатор (Exp) СD8 + СD4 + CD45RA- CD27+CD62L- (TEM: Em1; Em2) CD45RA+CD27-CD62L+ CD45RA- CD27+CD62L- (TEM) CD45RA+CD27-CD62L+ CD45RA+СD27-CD62- (ТЕМRA) CD45RA+СD27+CD62+(TN) CD45RA+CD4+СD27+CD62+(TN) Рисунок 25. Влияние TCR-активатора (Exp) на дифференцировку и созревание CD4+ /CD8+ Т-клеток в популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов in vitro Интересные данные были получены при культивировании CD45RA+ Тклеток с цитокинами, имеющими общую γ-цепь рецепторов на фоне TCRактивации. Так, инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) и rIL-15 (0,5х10-9 г/мл), сопровождалась увеличением (по сравнению с пробой только с добавлением активатора) зрелых цитотоксических TEMRA - CD45RA+CD8+CD27115 CD62L- (р < 0,05) (таблица 7, рисунок 26). Обнаруженная нами взаимосвязь между содержанием зрелых TEMRA эффекторов и количеством наивных CD8+ Т-клеток, может свидетельствовать об цитокинопосредованной дифференцировке TCRактивированных клеток (r=0,60, p<0,05 при действии IL-2 (1,0х10-9 г/мл) и r= - 0,72 p<0,05 при действии IL-15 (0,5х10-9 г/мл), соотвественно). В субпопуляции TCR-активированных CD4+ Т-клеток, эффекты rIL-2 и rIL15 (1,0х10-9 г/мл), напротив, были направлены на снижение числа CD45RA+CD4+CD27-CD62L- Т-клеток, что может быть связано с их повышенной гибелью, опосредованной сочетанным воздействием активатора и цитокинов (Sallusto F. et al., 2004; Кудрявцев И.И., 2014). Интересно, что сочетанное действие активатора и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл), сопровождалось появлением в популяции хелперных и цитотоксических CD45RA+ Т-клеток, лимфоцитов, утративших экспрессию CD45RA, фенотип которых соответствовал центральным клеткам памяти - CD45RA- CD4+/ CD8+CD27 +CD62L+. Все изменения происходили на фоне снижения Т-клеток с наивным фенотипом (таблица 7, рисунок 26). Мы предполагаем, что IL-7индуцированное образование Т-клеток с центральным фенотипом в популяциях хелперных и цитотоксических CD45RA+ Т-клеток на фоне TCRактивации, может осуществляться за счет дифференцировки лимфоцитов с наивным фенотипом, что подтверждают обнаруженные нами корреляционные взаимосвязи между числом TCM и TN (r= - 0,60, p<0,05 для CD45RA+CD8+ Тклеток при действии IL-7 (1,0х10-9 г/мл) и r= - 0,55 p<0,05 для CD45RA+CD4+ Тклеток при действии IL-7 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). Полученные нами данные частично согласуются с модель прогрессивной дифференцировки Т-клеток, согласно которой, главным фактором для определения судьбы клетки после активации является величина сигнала/стимула, который включает в себя комбинированное воздействие антигена, костимуляции и воспалительных факторов (сигналы 1, 2 и 3). Так, чрезмерные сигналы, наряду с увеличением клональной экспансии, способствуют дифференцировке клеток в направлении терминально-дифференцированных эффекторов (TEMRA); средней 116 силы – клеток-эффекторов памяти (TEM), а слабые – способствуют образованию Тклеток центральной памяти (TCM) (Kaech S.M., Wherry E.J., 2007). rIL-2, rIL-15/Exp rIL-2, rIL-15/Exp + - - CD45RA CD27 CD62 (ТЕМRA, Е) CD45RA+СD27-CD62- (ТЕМRA) CD45RA+СD27+CD62+(TN) CD8+ CD4+ CD45RA-CD27+CD62+ (ТCM) rIL-7/Exp CD45RA+СD27+CD62+(TN) CD45RA-CD27+CD62+ (ТCM) rIL-7/Exp CD45RA+СD27+CD62+(TN) Рисунок 26. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на дифференцировку и созревание CD4+/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов, в активационной модели культивирования in vitro Таким образом, на фоне TCR-активации, цитокины - rIL-2 и rIL-15, способны индуцировать образование только зрелых цитотоксических TEMRA (E) Т-клеток (рисунок 26). Действие rIL-7 на TCR-активированные CD45RA+CD4+ и CD45RA+CD8+ Т-клетки ассоциировано с образованием Т-клеток памяти c центральным фенотипом (TСM). Все выявленные изменения, индуцированные цитокинами на фоне TCR-активации, протекают на фоне снижения числа лимфоцитов с наивным фенотипом (TN). rIL-2 и rIL-15 в активационной модели культивирования in vitro, способствуют снижению числа зрелых эффекторных CD4+ TEMRA Т-клеток (рисунок 26), что может быть связано с их повышенной гибелью. На момент окончания срока инкубации (48ч), число центральных Т-клеток памяти с фенотипом CD3 +CD8+CD62L+CD27+ (TCM) в интактных популяциях CD45RО+ Т-клеток составило 21,19 (20,76 – 27,24)%; незрелых эффекторных клеток CD3+CD8+CD62L-CD27+ (TEM: Em1; Em2) – 31,90 (28,51 – 42,48)%, а зрелых эффекторов - CD3+CD8+CD62L-CD27- (TEM: Em3; Em4) - 34,90 (32,51 – 39,48)% (таблица 8). Также, в популяции CD8+CD45RO+ Т-клеток нами была обнаружена минорная популяция - CD3+CD8+CD62L+CD27- (предположительно – 117 которая может рассматриваться в качестве переходной формы между TCM и TEM, индуцируемая in vitro). Не менее интересным было субпопуляционное распределение хелперных CD45RO+ Т-клеток. Следует отметить, что классификация для хелперных CD45RO+ Т-клеток в настоящее время не разработана. Число CD3+CD4+CD62L+CD27 +, так называемые центральные Т-клетки памяти, в интактных популяциях CD45RО + Т-клеток составило 54,12 (49,02 – 58,66)%, что почти в 2 раза превышало содержание Т-клеток с аналогичным фенотипом в CD8+ популяции (таблица 8). Количество незрелых эффекторных клеток CD3+CD4+CD62L- CD27 + и зрелых эффекторов - CD3 +CD4+CD62L-CD27 + было равным - 10,36 (8,07 – 13,26) и 18,47 (18,28-20,16)%, соответственно. Как и в популяции цитотоксических Т-клеток, нами были обнаружены Т-клетки с фенотипом - CD3+CD4+CD62L +CD27 -, содержание которых составило 13,38 (11,51 – 15,98)%. Эффекты rIL-2, rIL-7 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл) in vitro на культуры CD45RO+ Т-клеток были ассоциированы с увеличением числа зрелых эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипом - CD62L-CD27- (Tem: Em3 и Em4) и CD45RО- CD62L- CD27- Т-клеток, которые, как уже упоминалось ранее – являются терминально-дифференцированными эффекторами (TEMRA, Е). Все изменения регистрировались на фоне снижения содержания CD62L+CD27+ (TCM) и CD62L-CD27+ (TEM: Em1 и Em2) Т-клеток (таблица 8, рисунок 27). В подтверждение вышесказанному, нами были выявлены отрицательные ассоциации между числом CD8+CD62L+CD27+ Т-клеток и содержанием CD8+CD62L-CD27(Tem: Em3 и Em4) Т-лимфоцитов (r= - 0,70 и r= - 0,65, p<0,05 при действии rIL-2 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно); между содержанием CD8+CD62L+CD27+ Тклеток и CD45RO-CD8+CD62L-CD27- (r= - 0,83, p<0,05 при действии rIL-2 (1,0х109 г/мл), соотвественно); а также между количеством CD8+CD62L-CD27+ Т-клеток содержанием CD8+CD62L-CD27- лимфоцитов (r= - 0,56 и r= - 0,70, p<0,05 при действии rIL-2 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). В CD45RO+CD4+ - популяции, IL-2 (1,0х10-9 г/мл) способствовал повышению числа CD45RO+CD62L-CD27- Т-клеток на фоне снижения содержания 118 незрелых эффекторов - CD45RO+CD4 +CD62L- CD27+ (r=0,80, p<0,05). Интересно, что действие rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) на CD4+CD45RO + Т-клетки индуцировало образование популяции CD45RО- CD62L- CD27+ Т-клеток (незрелые T EMRA Тхелперы), в целом, за счет снижения Т-клеток с центральным фенотипом (r=0,58, p<0,05). rIL-15 не оказывал действия на хелперные популяции CD45RO+ Тклеток (таблица 8, рисунок 27). Источники литературы, касающиеся молекулярных механизмов реэкспрессии молекулы CD45RA на примированных Т-клетках, крайне ограничены. Предполагают, что in vivo, клетки ре-экспрессирующие молекулу CD45RA, обеспечивают устойчивую иммунную память против антигенов, которые элиминированы из организма, например, литические антигены во время латентной стадии хронической инфекции (Bell E.B. et al., 1998; Carrasco J. et al., 2006). В соответствии с этой точкой зрения, клетки, ре-экспрессирующие молекулу CD45RA, представляют собой популяцию покоящихся Т-клеток памяти, которые могут быть повторно активированы для выполнения эффекторных функций (Dunne P.J. et al., 2002). Как уже отмечалось выше, для TEMRA Т-клеток характерен высокий цитотоксический потенциал, ассоциированный с высоким уровнем экспрессии FasL, перфорина и гранзима В и продукцией провоспалительных цитокинов, как IFN-γ и TNF-α, но не IL-2 и IL- 4 (Faint J.M. et al., 2001; Dunne P.J. et al., 2002; van Leeuwen E.M. et al., 2002). Феномен дифференцировки примированных Т-лимфоцитов в эффекторные Т-клетки памяти и терминально-дифференцированные CD45RA-позитивные Тклетки (TEMRA) под действием цитокинов in vivo, широко представлен в мировой литературе (Silva de Azevedo R.I., 2011; Кудрявцев И.В., 2014). Группой зарубежных авторов было установлено, что CD8+ Т-клетки, повторно экспрессирующие молекулу CD45RA, дифференцируются из клеток центральной памяти - CD8+CD45RA-CCR7+ в присутствии IL-7 и IL-15, путем гомеостатической пролиферации в отсутствие антигена. При этом авторами было высказано предположение, что in vivo эта субпопуляция цитотоксических клеток постоянно пополняется за счет гомеостатической пролиферации CD45RA-CCR7+ прекурсоров, в связи с повышенной гибелью CD45R+CCR7- клеток и их низкой 119 способностью к рециркуляции в организме (Geginat J. et al., 2003). Вызывают интерес результаты, полученные R.I. de Azevedo (2011). Автор экспериментально продемонстрировал, что IL-7 за счет гомеостатической пролиферации индуцирует реэкспресию CD45RA на клетках популяции CD45RA-CD27+CD4+ Т-клеток. Подобным действием на хелперные Т-клетки, в меньшей степени, чем IL-7, обладали IL-2 и IL-15. В этой же работе было показано, что IL-7 обладает способностью индуцировать реэкспрессию молекулы CD45RA только в популяциях хелперных Т-клеток с центральным фенотипом (Silva de Azevedo R.I., 2011). rIL-2, rIL-15 CD45RO+CD27-CD62- (ТЕМ: Em3; Em4) CD45RO-CD27-CD62- (ТEMRA, Е) rIL-2 CD45RO+CD27-CD62- (TEM) CD45RO+СD27+CD62- (н/зр TEM) + + CD45RO СD27 CD62+(TCM) CD45RO+СD27+CD62-(TEM: Em1; Em2) CD8 + rIL-15 CD4 н/ч + CD45RO+CD27+CD62- (н/зр TEM) н/ч rIL-7 rIL-7 CD45RO+СD27+CD62+ (TCM) Рисунок 27. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на дифференцировку и созревание CD4+ /CD8+ Т-клеток в популяции CD45RO+ Т-лимфоцитов в гомеостатической модели культивирования in vitro В литературе также встречаются сведения, что изоформа CD45RO со временем может замещаться исходным вариантом CD45RA; и лишь при повторной стимуляции клеток антигеном происходит образование устойчивых конечных изоформ CD45RO (Селедцов В.И. и др., 2010; Ярилин А.А, 2010). Таким образом, rIL-2 и rIL-15 в гомеостатической модели культивирования in vitro, способствуют образованию зрелых эффекторных Т-лимфоцитов CD8+CD27-CD62L- (TEM: Em3; Em4) и TEMRA Т-клеток - CD45RO-CD27-CD62(ТEMRA, Е), за счет снижения содержания цитотоксических Т-клеток центральной памяти CD62L+CD27+ (TCM) и незрелых эффекторов - CD62L-CD27+ (TEM: Em1 и Em2) (рисунок 27). rIL-2 опосредует созревание хелперных CD45RO+ 120 Т-клеток в зрелые эффекторные Т-клетки (TEM) за счет снижения незрелых эффекторов - CD62L-CD27+ (TEM); эффекты rIL-7 на СD45RO+CD4+ Т-клетки ассоциированы с дифференцировкой незрелых эффекторов - CD62L-CD27+ (TEM) за счет Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM) (рисунок 27). Добавление Т-клеточного активатора в культуры CD45RO+ Т-клеток, сопровождалось ростом содержания зрелых цитотоксических эффекторных Тклеток (CD62L-CD27-) и TEMRA (CD45RО-CD62L-CD27-) Т-лимфоцитов на фоне снижения числа CD62L+CD27+ (TCM) Т-клеток. Выявленые взаимосвязи между содержанием CD62L-CD27- (TEM) и CD45RО-CD62L-CD27- (E) Т-клеток и числом CD62L+CD27+ Т-лимфоцитов (r= - 0,60 и r= - 0,70, p<0,05, соотвественно) может свидетельствовать об дифференцировке центральных цитотоксических Т-клеток памяти в эффекторные лимфоциты (таблица 9). Интересно, что в популяции CD4+ Т-клеток памяти, добавление in vitro активатора, напротив, приводило к повышению содержания незрелых эффекторных Т-клеток (таблица 9, рисунок 28). TCR-активатор (Exp) CD8+ CD45RO-CD27-CD62L- (ТEMRA, Е) CD45RO+CD27-CD62L- (TEM: Em3; Em4) CD4+ CD45RO+CD27+CD62L- (н/зр TEM) CD45RO+СD27+CD62+(TCM) Рисунок 28. Влияние TCR-активатора (Exp) на дифференцировку и созревание CD4+ /CD8+ Т-клеток в популяции CD45RO+ Т-лимфоцитов in vitro TCR-активация Т-клеток памяти, аналогично CD45RA + Т-лимфоцитам, сопровождалась двумя противоположными процессами: усилением пролиферации и, напротив, ростом мертвых клеток (рисунки 17,18). Возможно, что высокий процент мертвых клеток был обусловлен гибелью зрелых эффекторных Т-клеток – СD45RO+CD62L-CD27-, как уже упоминалось, крайне чувствительных к активирующим сигналам, тогда как повышение числа клеток – пролиферацией центральных Т-клеток памяти, которые дифференцируясь, приобретают фенотип эффекторных клеток. Некоторые авторы свидетельствуют, что активация Т121 клеток памяти моноклональными антителами к СD28 может играть определенную роль в антиген-независимой дифференцировке и пролиферации примированных Т-клеток (Siefken R. et al., 1997; Singh M. et al., 2008). Инкубация TCR-активированных CD8+CD45RO+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-15 (0,5 - 1,0х10-9 г/мл) а также с rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) приводила к дифференцировке и созреванию цитотоксических Т-лимфоцитов в эффекторные Т-клетки, что фенотипически выражалось повышением числа цитотоксических лимфоцитов: CD62L-CD27- (TEM: Em3 и Em4) и CD62L-CD27+ (TEM: Em1 и Em2) на фоне снижения содержания CD62L+CD27+ (ТCM) (таблица 9, рисунок 29). Нами были выявлены отрицательные корреляции между содержанием CD8+CD62L-CD27- Тклеток и числом CD8+CD62L+CD27+ Т-лимфоцитов (r= - 0,50, r= - 0,70, r= - 0,62, p<0,05 при действии rIL-2, rIL-15 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно), а также между содержанием CD8+CD62L-CD27+ лимфоцитов и количеством CD8+CD62L+CD27+ Т-клеток (r= - 0,70, p<0,05 при действии rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). На фоне TCR-активации, добавление в среду культивирования примированных Т-клеток rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) и rIL-15 (0,5х10-9 г/мл), сопровождалось достоверным (по сравнению с пробами только с добавлением активатора), увеличением числа Т-клеток, реэкспрессирующих молекулу CD45RACD62L-CD27- (таблица 9, рисунок 29). Инкубация TCR-активированных хелперных CD45RO+ Т-клеток c rIL-2 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) приводила к дифференцировке TCM клеток в лимфоциты с фенотипом зрелых эффекторов CD62L-CD27- (r= - 0,59, r= - 0,70, p<0,05 при действии rIL-2 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). CD45RO+CD4+ Т-клетки были нечувствительны к действию rIL-15. Сочетанная стимуляция CD45RO+CD4+ Т-клеток TCR-активатором и цитокинами, имеющими общую γ-цепь рецепторов (CD132), не сопровождалась образованием Т-клеток, реэкспрессирующих высокомолекулярную изоформу CD45 рецептора – CD45RA. Согласно мнению многих авторов, процесс реэкспрессии молекулы CD45RA опосредован только гомеостатическими механизмами и не требует участия воспаления и TCR-стимуляции (Geginat J. et al., 2003; Dunne P.J. et al., 2005) Однако, по мнению других ученых, цитокиновые стимулы самостоятельно не 122 способны привести к реэкспрессии молекулы CD45RA и утрате CD27, так как потеря экспрессии CD27 требует TCR-стимуляции или участия других факторов, которые могут снизить экспрессию костимулирующих молекул. Показано, что после нескольких раундов стимуляции, Т-клетки последовательно теряют экспрессию молекул - CCR7, CD27 и CD28 (Ma C.S. et al., 2004; Van Leeuwen E.M. et al., 2004). Так, экспрессия CD27 временно повышается при TCR-стимуляции с последующим прогрессивным и необратимым снижением при хронической антигенной стимуляции in vivo (De Jong R. et al., 1992; Baars P.A. et al., 1995). В то же время, было показано, что провоспалительные цитокины, в частности, TNFα и IFNy, обладают способностью снижать экспрессию экспрессии CD28 на CD8+ Т-клетках (Borthwick N.J. et al., 2000; Bryl E. et al., 2001; Lewis D.E. et al., 2004), что позволяет предполагать возможность цитокин-индуцированной регуляции экспрессии костимулирующих молекул на иммунокомпетентных клетках. rIL-2, rIL-7, rIL-15/Exp rIL-2, rIL-7/Exp + - CD45RO+СD27-CD62-(ТЕМ) - CD45RO CD27 CD62 (ТЕМ: Em3; Em4) CD45RO+CD27+CD62- (TEM: Em1; Em2) CD45RO-CD27-CD62- (TEMRA, E) CD8 + CD45RO+СD27+CD62+ (TCM) CD45RO+СD27+CD62+ (TCM) CD4 + н/ч rIL-15/Exp Рисунок 29. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на дифференцировку и созревание CD4+/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RO+ Т-лимфоцитов, в активационной модели культивирования in vitro Кроме того, исследования in vitro показывают, что присутствие цитокинов в среде инкубации: IL-15 или IL-2 при TCR-активации могут предопределить фенотипические и миграционные свойства генерируемых Т-клеток памяти (Geginat J. et al., 2001; Weninger W. et al., 2001). В частности, мышиные CD8+ Т-клетки при добавлении IL-15 приобретали фенотип клеток центральной памяти, в то время как цитотоксические Т-клетки, индуцированные IL-2, становились эффекторными клетками памяти. Интересно, что при адоптивном переносе IL-15-индуцированных Тклеток in vivo, Т-клетки мигрировали в лимфатические узлы и Пейеровы бляшки 123 (Weninger W. et al., 2001), тогда как IL-2-активированные, преимущественно, в воспаленные очаги в брюшине. Таким образом, на фоне TCR-активации, цитокины (rIL-2, rIL-15 и rIL-7) способны индуцировать образование цитотоксических зрелых (TEM: Em3; Em4) и незрелых (TEM: Em1; Em1) эффекторных Т-клеток, а также ТEMRA (Е) Тлимфоцитов из центральных Т-клеток памяти (TСM). Эффекты rIL-2 и rIL-7 на дифференцировку TCR-активированных СD45RO+CD4+ Т-клеток in vitro ассоциированы с увеличением числа зрелых эффекторных Т-клеток (TEM), на фоне снижения Т-клеток с центральным фенотипом (TCM) (рисунок 29). Оценка влияния цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL7 и IL-15), на процессы активации и пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток в CD45RA и CD45RO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro Наивные (CD45RA+CD62L+) Т-лимфоциты и (CD45RO+) Т-клетки памяти человека в естественных условиях (in vivo) поддерживают свое численное постоянство без антигенной стимуляции, за счет гомеостатической пролиферации, опосредованной действием цитокинов (Geginat J. et al., 2002). Стадия дифференцировки Т-клеток определяет их чувствительность к цитокинам, имеющим общую γ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) (Geginat J. et al., 2001; 2002; Jaleco S. et al., 2003; Huang W., August A., 2015), демонстрируя разные условия к передаче активирующего сигнала. Так, выживание и гомеостатическая пролиферация in vivo наивных зрелых Т-лимфоцитов, определяется наличием в микроокружении цитокинов: IL-2, IL-7 и IL-15 (Ma A. et al., 2006) и зависит от взаимодействия их рецепторных структур с продуктами MHC I (для CD8+) и MHC II (для CD4+) класса (Geginat J. et al., 2002; Krawczyk C.M. et al., 2007; Purton J.F. et al., 2007; Singh M. et al., 2008; Tanel A. et al., 2009). Одним из первых фенотипических признаков активации Т-клеток является появление мембранного рецептора - CD69, экспрессия которого опосредует увеличение концентрации внутриклеточного Ca++ и синтез различных цитокинов и их рецепторов, включая IL-2 и IL-2Rα (Marzio R. et.al., 1999; Graca L., Cobbold S.P., 124 2002; Clausen J. et al., 2003; Martín P. et al., 2010; Ярилин А.А., 2010; González-Amaro R. et al., 2013; Литвинова Л.С. и др., 2014; De la Fuente H. et al., 2014). Как уже упоминалось ранее, IL-2 принимает участие во многих аспектах Tклеточной биологии: как мощный активатор пролиферации и дифференцировки Тлимфоцитов, участвуя в созревании их предшественников и стволовых клеток памяти (Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004). В гомеостатической модели культивирования in vitro, добавление rIL-2 в CD45RA+ Т-культуры приводило к значительному повышению числа CD69 + (через 24 ч) и CD25+ (через 48ч) Т-клеток (таблицы 10, 12, рисунок 30). Следует отметить, что эффекты, оказываемые rIL-2 на CD45RA+ Т-клетки имели четкую зависимость от концентрации цитокина (r2=0,87, p<0,05, в отношении CD69+ Т-клеток; r=072, p<0,05, в отношении CD25+ Т-клеток, соответственно) и равномерно затрагивали обе субпопуляции: CD4+ и CD8+. Выявленные нами изменения, индуцируемые IL-2, были вполне ожидаемы и обусловлены биологическими свойствами цитокина (Liao W. et al., 2013). Одним из механизмов стимулирующего действия IL-2 на Т-клетки, является активация транскрипционного фактора STAT5, необходимого для клеточного роста, реализации эффекторных функций и дифференцировки Т-клеток (Malek T.R., Castro I., 2010; Lin J.X. et al., 2012). Следующим этапом эффективной активации Т-лимфоцита является появление на его мембране рецептора к трансферину (CD71/TfR1), который, как правило, экспрессируется пролиферирующими клетками (Beguin Y., 1992; Marsee D.K. et al., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Рецептор CD71 связывает комплекс железотрансферрин на клеточной мембране, после чего, образовавшийся комплекс поглощается клеткой путем эндоцитоза, и, тем самым, обеспечивается вхождение в активированную клетку ионов железа, необходимых для дальнейшего процесса пролиферации (Baynes R.D. et al., 1994; Marsee D.K. et al., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 приводила к увеличению числа CD71 позитивных Т-лимфоцитов. Интересно, что CD45RA+ Т-клетки были чувствительны только к максимальной концентрации rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), тогда как число 125 цитотоксических клеток равномерно увеличивалось (в среднем, на 30%) при добавлении всего спектра концентраций rIL-2 (таблица 14, рисунок 30). Известно, что аутокринная и паракринная IL-2-сигнализация в ходе иммунного ответа усиливает пролиферацию и дифференцировку активированных Т-клеток, экспрессирующих, преимущественно, тримерный IL-2R-комплекс (αβγ). Последний имеет высокую афинность к IL-2, обеспечивая эффективную передачу активационного сигнала, регулирующего вступление покоящихся Т-лимфоцитов в клеточный цикл (Ярилин А.А., 2010; Sprent J., 2012). Как уже упоминалось ранее, наивные Т-клетки экспрессируют, преимущественно, димерный IL-2R-комплекс (Ma A. et al., 2006). Однако данные литературы свидетельствуют, что действие высоких концентраций IL-2 (или IL-15) индуцирует in vivo и in vitro наивные CD8+ Т-клетки, несущие димерный IL-2Rкомплекс, опосредуя их интенсивную пролиферацию и дифференцировку (Cho J. H. et al., 2007; Bayer A.L. et al., 2013). Интересно, что такая пролиферация наивных Т-клеток in vivo зависит от молекул МНС I класса и напоминает IL-7-зависимую гомеостатическую пролиферацию Т-клеток в условиях лимфопении (Boyman O. et al., 2009). Согласно сведениям литературы и полученным нами данным, IL-2индуцированная экспансия наивных CD8+ Т-клеток носит интенсивный характер и приводит к генерации эффекторных Т-клеток даже без антигенного воздействия (Cho J. H. et al., 2007). В тоже время, низкая чувствительность хелперных Т-клеток к действию rIL2 можно объяснить как минимальной экспрессией IL-2Rа и IL-2/15Rβ, так и наличием механизмов, сдерживающих их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro (Geginat J. et al., 2001; Moses C.T. et al., 2003). В научной периодике встречается большое количество работ, акцентированных на разнице требований (условий) для активации и клональной экспансии наивных CD4 и CD8 Т-клеток (Crispe I.N. et al., 1985; Foulds K.E. et al., 2002; Moses C.T. et al., 2003). В частности, эти различия могут дать ответ, почему величина CD8 Т-клеточных ответов значительно превышает реакционную способность хелперных (CD4) популяций при воздействии патогенов инфекционной и неинфекционной природы (Liu J. et al., 2001). Некоторые авторы также свидетельствуют, что in vivo, для гомеостатической 126 пролиферации наивных СD4+CD45RA+CD62L+ Т-лимфоцитов, требуется костимуляция цитокинами (TNF-α, IL-6, IL-10 и IL-12) дендритных клеток, которые положительно регулируют экспрессию IL-2/15Rβ и γc-цепи (Nakarai T. et al., 1994; Schluns K.S. et al., 2000; Geginat J. et al., 2001; 2002; Tan J.T. et al., 2001; Surh C.D. et al., 2006; Mengus C. et al., 2011). IL-15 принадлежит важная роль в процессах врожденного и адаптивного иммунитета. IL-15 необходим для развития, гомеостаза и функционирования Тклеток, NK-клеток, NKT-клеток, CD8α интраэпителиальных лимфоцитов и др. (Nishimura H. et al., 2000; Fehniger T.A., Caligiuri M.A., 2001; Chen J. et al., 2013; Lee N. et al., 2014; Marçais A. et al., 2014). Конститутивная экспрессия IL-15Rα обнаружена только на NK-клетках, что объясняет их способность реагировать на низкие дозы IL-15. После активации, экспрессия IL-15Rα исчезает на всех субпопуляциях клеток, что может быть обусловлено перераспределением IL-15Rα во внутриклеточное пространство (Nishimura H. et al., 2000; Fehniger T.A., Caligiuri M.A., 2001). Добавление в среду культивирования CD45RA+ Т-клеток rIL-15, приводило к увеличению числа CD4+/CD8+CD69+ Т-клеток только при использовании максимальной концентрации цитокина (1,0х10-9 г/мл). Интересно, что равномерный рост числа CD45RA+CD4+/CD8+CD25+ Т-клеток регистрировался при инкубации Тклеток с rIL-15 во всем спектре действующих концентраций (таблицы 10, 12, рисунок 30). Хелперные Т-лимфоциты оказались нечувствительны к пролиферативному действию rIL-15, что, вероятно, может быть связано с низким уровнем экспрессии IL-2/IL-15Rβ этими клетками (Geginat J. et al., 2001). Интересным является тот факт, что CD45RA+CD8+ Т-лимфоциты отвечали на весь спектр концентраций rIL-15 – число CD71+ Т-клеток в популяции цитотоксических лимфоцитов увеличивалось, в среднем, в 2 раза по сравнению с контрольными значениями (таблица 14, рисунок 30). Как уже упоминалось, IL-15 может индуцировать in vitro многие реакции, опосредованные IL-2 (Cooper M.A. et al., 2002; Waldmann T.A., 2006; Croce M. et al., 2012), что обусловлено аналогичной структурой рецепторов: на наивных Т-клетках регистрируются крайне низкие уровни экспрессии IL-15Rα и цепи IL-2/15Rβ, 127 которые индуцируются при активации Т-клеток, в том числе, добавлением экзогенного IL-15, что повышает чувствительность наивных клеток к этому цитокину (Alves N.L. et al., 2003). Следует отметить интересный факт, выявленный Alves N.L. и др. (2003): реакция наивных Т-клеток на IL-15 не ограничена уровнем экспрессии IL-2/15Rβ: даже относительно небольшое количество CD122 на наивных Т-клетках человека достаточно, чтобы инициировать активацию в ответ на IL-15 (Alves N.L. et al., 2003). Важное значение IL-15 в гомеостазе наивных Тклеток подтверждено экспериментально: количество нормальных наивных CD8+ Тклеток снижено в 2 раза у IL-15Rα и IL-15-дефицитных мышей (Lodolce J.P. et al., 1998; Kennedy M.K. et al., 2000). Однако другие авторы свидетельствуют, что in vivo, в ответ на IL-15, пролиферируют только CD4+ и CD8+ Т-клетки памяти, но не наивные (Picker L.J. et al., 2006). Интересными являются результаты зарубежной группы: Liu K. и др. (2002) показали, что IL-15 имитирует не только связывание с TCR при индукции клеточной пролиферации, но и профиль экспрессии генов, а также усиливает цитотоксическую активность CD8+ Т-клеток (Liu K. et al., 2002). Многие авторы отмечают, что действие IL-15 на наивные CD8+ Т-клетки трудно отличить от антиген-зависимого прайминга и сопровождается фенотипическими и функциональными изменениями (Cho B.K. et al., 2000; Goldrath A.W. et al., 2000; Murali-Krishna K. et al., 2000). IL-7, наряду с IL-2 и IL-15, играет важную роль в процессах клеточного гомеостаза Т-лимфоцитов (Peschon J.J. et al., 1994; Von Freeden-Jeffry U. et al., 1995). Комплекс IL-7R конституционно экспрессируется на покоящихся Т-клетках, его высокий уровень регистрируется на наивных, центральных и эффекторных Тклетках; низкий – на Т-регуляторных клетках (CD4+FOXP3+); активированные и терминально - дифференцированные клетки - характеризуются отсутствием экспрессии CD127 (Seddiki N. et al., 2006; Mengus C. et al, 2011; Carrette F., Surh C.D., 2012; Sprent J. et al. 2012). IL-7-сигнализация инициируется связыванием IL-7 c IL-7Rα, индуцируя гетеродимеризацию IL-7Rα с ɣ-цепью, с последующей активацией рецептора, связанного с JAK-киназами – 1 и 3, которые, фосфорилируясь, создают сайты стыковки для STAT5a/5b (Leonard W.J., 2001; 128 Chehtane M. et al., 2010; Catalfamo M. et al., 2011). Согласно полученным нами результатам, rIL-7 дозозависимым образом увеличивал число CD69+ (r2=0,65, p<0,05) и CD25+ (r2=0,72, p<0,05) в хелперной популяции Т-клеток, не влияя при этом, на экспрессию этими клетками молекулы пролиферации CD71. В популяции CD45RA+CD8+ Т-клеток, добавление rIL-7 также способствовало увеличению числа CD69+ T-лимфоцитов (r2=0,80, p<0,05). Повышение числа CD8+CD25+ и CD8+CD71+ Т-клеток происходило только под действием максимальной концентрации rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) (таблицы 10, 12, 14, рисунок 30). Многочисленные исследования свидетельствуют, что in vivo IL-7 необходим для выживания и гомеостатической пролиферации наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток (Schluns K.S. et al., 2000; Tan J.T. et al., 2001; Bradley L.M. et al., 2005; Fry T.J., Mackall C.L., 2005). Экспериментально доказано, что введение in vivo IL-7 увеличивает число Т-клеток и усиливает их функциональный потенциал с помощью гомеостатических процессов, без антигенной активации. Авторы этой работы предполагают уникальную клиническую нишу для использования IL-7 с целью увеличения числа Т-клеток и усиления иммунных реакций в ответ на конкретные антигенные мишени, избегая общей, неспецифической активации клеточной популяции (Geiselhart L.A. et al., 2001). Отсутствие IL-7R-сигнализации влияет не только развитие Т-клеток в тимусе, но также приводит к накоплению функционально неактивных Т-клеток на периферии (Maraskovsky E. et al., 1996). В тоже время in vitro показано, что наивные Т-клетки, выделенные из периферической крови взрослых доноров, в отличие от наивных Т-клеток пуповинной крови (Hassan J., Reen D.J., 2001), не пролиферируют при добавлении rIL-7 (Dardalhon V. et al., 2001; Jaleco S. et al., 2003). Выявленное нами в эксперименте повышение числа CD4+/CD8+CD25+ и CD71+ Т-клеток, может быть обусловлено способностью IL-7 выступать в качестве кофактора при субпороговой TCR-стимуляции Т-лимфоцитов, обеспечивая их гомеостатическую пролиферацию. В тоже время, регистрируемые изменения могут быть обусловлены способностью IL-7 повышать экспрессию рецептора к α-цепи (CD25) на поверхности Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, усиливает 129 восприимчивость клеток к активационным сигналам (Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008). В литературе описано взаимное влияние IL-2 и IL-7. Т-клетки с генотипом IL-2-/-, экспрессируют более высокие уровни IL-7R (Hoyer K.K. et al., 2008) и блокируют IL-2Ra цепи (CD25), что индуцирует увеличение продукции IL-7, опосредующего гомеостатическую пролиферацию Т-клеток (Monti P. et al., 2009). С другой стороны, IL-2 положительно влияет на формирование IL-7Rhi клеток памяти (Dooms H., Abbas A.K., 2010; Kameyama K. et al., 2010). Возможно, что в условиях нашего эксперимента, одного только цитокинового стимула оказалось недостаточно для пролиферации хелперной популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов. Очевидной причиной также может быть недостаточно высокая концентрация цитокина. Известно, что низкие дозы IL-7 (<1 нг/мл) поддерживают только выживание Т-клеток, а высокие >1 нг/мл пролиферацию (Kittipatarin C., Khaled A.R., 2007). Кроме того, наивные CD4+ Тклетки, как упоминалось выше, характеризуются наличием механизмов, сдерживающих их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro (Moses C.T. et al., 2003). CD45RA+ rIL-2 rIL-7 CD69 CD8 + (1,0) CD25 CD71 (0,1-1,0) (1,0) (0,1-1,0) (1,0) (0,1-1,0) CD69 CD4 + (1,0) CD25 CD71 rIL-15 (0,1-1,0) (1,0) н/ч н/ч Рисунок 30. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на активацию и пролиферацию CD4 +/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов в гомеостатической модели культивирования in vitro. Обозначения. Здесь и в рисунках 31, 32 : (0,1-0,5-1,0) концентрация цитокинов в нг/мл; дозозависимые эффекты цитокинов; отсутствие изменений; изменение значений показателей во всем спектре действующих концентраций цитокинов Необходимо отметить, что выявленное нами цитокин-индуцированное 130 повышение числа Т-клеток, экспрессирующих молекулы активации – CD69+ и CD25+ и пролиферации CD71+ в популяциях хелперных и цитотоксических CD45RA+ Т-лимфоцитов, на наш взгляд, осуществляется за счет наивных CD4+/CD8+ Т-клеток, а не эффекторных TEMRA Т-клеток. Как уже упоминалось ранее, терминально-дифференцированные эффекторные CD45RA+CD27-CD62- Тклетки (TEMRA) относительно резистентны к цитокиновой стимуляции, поскольку у них отсутствует экспрессия CD62L, IL-7 (CD127) и костимуляторных молекул, таких как - CD27 и CD28, что, по сути, означает утрату пролиферативной активности этими клетками в ответ на внесение цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов: IL-7 и IL-15 (Wherry E.J. et al., 2003; Boyman O. et al., 2009; Кудрявцев И.В., 2014). Таким образом, эффекты цитокинов - rIL-2, rIL-7 и rIL-15, в равной степени затрагивают процессы активации CD4+ и CD8+- субпопуляций CD45RA+ Т-клеток in vitro. CD45RA+CD4+ T-лимфоциты, в отличие от CD45RA+CD8+ Т-клеток, оказались менее нечувствительными к пролиферативному действию цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) (рисунок 30), что может быть опосредовано механизмами, сдерживающими их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro. Эффекты цитокинов опосредованы дифференциальной экспрессией их рецепторов на клеточной мембране. Экспрессия наивными Т-клетками IL-7R, IL15R, IL-2R позволяет предположить участие этих цитокинов на ранних стадиях иммунного ответа в условиях TCR-активации (Schluns K.S., Lefrançois L., 2003). Добавление TCR-активатора в среду культивирования CD45RA+ Т-клеток сопровождалось достоверным ростом числа Т-лимфоцитов, несущих мембранные молекулы активации (CD69, CD25) и пролиферации (CD71). Изменения в равной степени затрагивали CD4+ и CD8+ субпопуляции лимфоцитов (таблицы 11, 13, 15, рисунок 31). Кроме того, действие CD2/CD3/CD28–комплекса было направлено на увеличение числа клеток (в мл) в исследуемых CD45RA+- культурах (рисунок 19). Учитывая механизм действия активатора, выявленные нами изменения представляются вполне логичными. Как уже упоминалось, имитируя действие антиген-презентирующих клеток, CD2/CD3/CD28-частицы стимулируют Т- клеточный рецептор (TCR) и корецепторные молекулы (CD28, CD58), что способствует формированию иммунного синапса, активации клетки и экспрессии 131 многих генов, способствующих пролиферации лимфоцитов, в частности, IL-2 и его рецептора - IL-2R (Ивашкин В.Т., 2008; Хаитов Р.М. и др., 2009; Хоченков Д.А., 2010; Ярилин А.А., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Взаимодействие IL-2 с высокоаффинным тримерным (αβγ) рецептором на Т-лимфоцитах обеспечивает запуск сигнальных событий после стимуляции, непосредственно регулирующих вступление покоящихся Т-лимфоцитов в клеточный цикл (Leonard W.J., Lin J.X., 2000; Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004). Инкубация TCR-активированных CD45RA+ Т-клеток с добавлением rIL-2, сопровождалась изменениями (разной степени выраженности) активационного статуса хелперных и цитотоксических клеток. CD4+ Т-клетки с наивным фенотипом были чувствительны только к максимальным дозам цитокина (1,0х10-9 г/мл): содержание CD4+CD69+ и CD4+CD25+ Т-клеток в CD45RA+ Т-культурах возрастало (в сравнении с добавлением только активатора), тогда как число CD71+ Т-клеток – не изменялось (таблицы 11, 13, 15, рисунок 31). Эффекты IL-2 на CD45RA+CD8+ Тклетки, в целом, носили стимулирующий характер: число CD69+ Т-клеток увеличивалось дозозависимым образом (по сравнению с пробами только с добавлением активатора, r2=0,87, p<0,05), возможно, за счет наивных CD8+ Т-клеток, а повышение содержания CD25+ и CD71+ Т-клеток – носило равномерный характер (таблицы 11, 13, 15, рисунок 31). Как ни парадоксально, но данные литературы свидетельствуют, что in vivo IL-2 не является необходимым медиатором для пролиферации Т-клеток в ходе иммунного ответа. У мышей, дефицитных по IL-2 или IL-2Rα, регистрируется поликлональная экспансия Т- и В-клеток. С использованием IL-2-/- и IL-2R-/мышиных моделей было выявлено, что IL-2 требуется только на начальном этапе активации цитотоксических Т-клеток - для создания эффективной популяции вирусспецифических эффекторных CD8+-Т-клеток памяти и является необязательным в фазу клональной экспансии наивных CD8+ Т-клеток (Williams M.A. et al., 2006). Интересно, что в отсутствии IL-2/IL-2R – быстрая пролиферация, кинетика, абсолютное число и функции цитотоксических CD8+ Т-клеток находятся на субоптимальных уровнях (Malek T.R., 2008). 132 Способность IL-2 стимулировать пролиферацию наивных CD8+ Т-клеток связывают с высокой плотностью на этих клетках липидных рафтов, содержащих ганглиозиды GM1, которые активируются после взаимодействия TCR с CD122-кластером (Boyman O., Sprent J., 2012). Некоторые авторы свидетельствуют, что IL-2 необходим для роста CD4+ Тклеток in vitro, однако данные научной периодики не подтверждают важную роль IL-2 в клональной экспансии наивных CD4 + T-клеток in vivo (Kneitz B. et al., 1995; Khoruts A. et al., 1998; Leung D.T. et al., 2000). Lantz O. и др. (2000) высказали предположение, что γс-цитокины, возможно, не участвуют в формировании CD4+ ответов (Lantz O. et al., 2000). С другой стороны, исследования Almeida A.R. и др. (2002) позволили установить, что экспрессия IL-2Ra – является ключевым требованием для развития Т-регуляторных клеток - CD25+CD4+, которые, в свою очередь, регулируют периферический гомеостаз CD4+ популяций; в то время как IL-2 необходим для увеличения числа CD4+ Т-клеток на периферии (Almeida A.R. et al., 2002). В отношении наивных CD4+ Т-клеток также было показано, что, несмотря на отсроченную кинетику ответа и снижение пролиферации в отсутствии IL-2/IL-2Rсигналинга, они оставались функционально активными (Létourneau S. et al., 2009). Добавление активированных максимальных концентраций CD45RA+CD4+/CD8+ Т-клеток IL-7 в приводило культуры к TCR- достоверному увеличению числа CD25+ и CD71+ Т-клеток и не влияло на экспрессию молекулы ранней активации - CD69. Изменения равномерно затрагивали обе субпопуляции клеток (таблицы 11, 13, 15, рисунок 31). CD45RA+CD4+/CD8+ Т-клетки оказались нечувствительными к более низким концентрациям rIL-7. Согласно данным литературы, в случае оптимальной аутокринной IL-2активации Т-клеток, происходит снижение экспрессии IL-7Rα (через PI3K/ Aktзависимый механизм), и напротив, усиливается - IL-2Rα, IL-4Rα и IL-15Rα, что позволяет Т-клеткам выживать в течение фазы клональной экспансии, независимо от IL-7 (Schluns K.S. et al., 2000; Xue H.H. et al., 2002; Mackall C.L. et al., 2011; Carrette F., Surh C.D., 2012) Угнетение экспрессии IL7Rα во время антигензависимой активации и клональной экспансии является важным гомеостатическим механизмом, 133 максимизирующим доступность IL-7 для наивных клеток (Park J.H. et al., 2004). В то же время, формирование комплекса - IL-7-IL-7R приводит к усилению TCRиндуцированной передачи сигналов при прайминге активированных Т-клеток, стимулируя их к пролиферации и продукции IL-2 (Fry T.J., Mackall C.L., 2001). Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-15 (0,5-1,0х10-9 г/мл) на фоне TCR- активации, приводила к повышению числа CD8+ T-клеток, экспрессирующих молекулы активации и пролиферации по сравнению с пробами только с добавлением активатора (таблицы 11, 13, 15). CD4+ Т-клетки в активационной модели культивирования in vitro оказались нечувствительны к цитокину (таблица 11, 13, 15, рисунок 31). Несмотря на доказанный факт того, что IL-15 связывается с IL-2Rβ и γ цепью гетеродимера идентичным образом, что и IL-2, и имеет аналогичный профиль индукционных генов (Cornish G.H. et al., 2006; Ring A.M. et al., 2012), спектр биологического действия этих цитокинов отличается (Waldmann T.A., 2006). Как уже упоминалось ранее, IL-15 является более сильным фактором запуска клеточного цикла, чем IL-2. В свою очередь, IL-2 является более мощным сигналом для пролиферации и дифференцировки антиген-активированных CD8+ Т-клеток, чем IL-15. Эффекты IL-2 коррелируют с быстрой экспансией короткоживущих эффекторных клеток, в то время как IL-15 способствует поддержанию долгоживущих клеток памяти (Cornish G.H. et al., 2006; Waldmann T.A., 2006; Croce M. et al., 2012; Ring A.M. et al., 2012; Liao W. et al., 2013). IL-15, секретируемый моноцитами или дендритными клетками при вирусной или бактериальной инфекции in vivo, способствует повышению клеточной пролиферации при TCR-стимуляции. Высокую экспрессию IL-15R, можно наблюдать на стадии образования эффекторных клеток (СD8+ Т-клетки) и Т-клеток памяти (Alves N.L. et al., 2007). Экспериментально установлено, что in vivo, уровень клональной экспансии наивных CD8+ Т-клеток в IL-15-дефицитных мышах, инфицированных вирусом везикулярного стоматита (VSV), почти вдвое ниже в сравнении с мышами дикого типа (Schluns K.S., Lefrançois L., et al., 2003). В дополнение к пролиферативным эффектам, IL-15 также опосредует выживаемость Т-клеток в фазу сокращения иммунного ответа. У IL-15- и IL-15Rα- мышей, 134 дефицит антиген-специфических CD8+ Т-клеток становится очевидным уже в начале фазы сокращения иммунной реакции, независимо от того, есть ли дефекты в общем пике ответа или нет (Becker T. C. et al., 2002; Schluns K.S., Lefrançois L., et al., 2003). В отношении наивных хелперных Т-клеток данные, касающиеся действия IL-15 на процессы их пролиферации и дифференцировки в условиях антигензависимой активации in vivo и in vitro, носят крайне ограниченный характер. CD45RA+ rIL-2/Exp rIL-7/Exp CD69 CD8 + CD25 CD71 н/ч (0,5-1,0) (0,1-1,0) (1,0) (0,5-1,0) (0,1-1,0) (1,0) (0,5-1,0) н/ч н/ч CD69 (1,0) CD4+ CD25 CD71 rIL-15/Exp (1,0) (1,0) н/ч (1,0) н/ч н/ч Рисунок 31. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на активацию и пролиферацию CD4+/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RA+ Т-лимфоцитов в активационной модели культивирования in vitro. Таким образом, на фоне TCR-стимуляции, rIL-2 и rIL-15 обладают способностью усиливать процессы активации и пролиферации цитотоксических CD45RA+ Т-клеток, ассоциированные с экспрессией молекул CD69, CD25 и CD71; сочетанное применение TCR-активатора и цитокинов - rIL-2 и rIL-15 сопровождалось только активацией, но не пролиферацией хелперных CD45RA+ Тлимфоцитов, что фенопитически проявлялось повышением числа CD69+ и CD25+ Тклеток по сравнению только с добавлением антиCD2/CD3/CD28-частиц. IL-7 в равной степени способствовал активации и пролиферации TCR-стимулированных CD4+ и CD8+ субпопуляций CD45RA+ Т-клеток (рисунок 31). Не менее интересные результаты были получены при оценке действия цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы 135 активации и пролиферации хелперных и цитотоксических CD45RO+ Т-клеток in vitro. Выявленное нами повышение количества CD45RO+CD4+/CD8+CD69+-клеток (через 24 ч) и CD45RO+CD4+/CD8+CD25+ (через 48 ч), индуцированное добавлением rIL-2, как и в случае CD45RA+ Т-клеток, обусловлено его биологическими свойствами (Ellery J.M., Nicholls P.J, 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004; Литвинова Л.С. и др., 2013) (таблицы 11, 13). Действие rIL-2 на CD4+ и CD8+ субпопуляции CD45RO-клеток имело четко выраженный дозозависимый характер (r2 = 0,76 и r2=0,82, р<0,05, соответственно в случае CD4+ Т-клеток и r2 = 0,56 и r2=0,82, р<0,05, соответственно в случае CD8+ Т-клеток). В связи с вышесказанным, увеличение количества CD71+-клеток в культурах примированных CD4+ и CD8+ клеток памяти, индуцированное IL-2, было вполне прогнозируемым. Данные научной периодики свидетельствуют, что in vivo и in vitro действие rIL2 на цитотоксические Т-клетки имеет разнонаправленный характер. Так, in vivo IL-2 значительно усиливает апоптоз (Ku C.C. et al., 2000) и подавляет пролиферацию CD8+Т-клеток памяти, преимущественно за счет его опосредованного влияния на другие субпопуляции клеток, включая Т-клетки с регуляторной активностью - CD25+CD4+ Тлимфоциты (Kamimura D. et al., 2004). In vitro, IL-2, напротив, необходим для пролиферации и выживания цитотоксических клеток, а также активации их эффекторных функций, связанных с продукцией IFNy и экспрессией перфорина и гранзима (Northrop J.K. et al., 2006; Spierings D.C. et al., 2006). В тоже время некоторые авторы отрицают роль IL-2 в экспансии хелперных популяций Т-клеток памяти (Lantz O. et al., 2000), тогда как другие, напротив, указывают на участие IL-2 в этом процессе, за счет индукции их апоптотической гибели (Khoruts A. et al., 1998; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003). Не менее важным в гомеостазе антиген-специфичных Т-клеток памяти является IL-7. Регулируя процессы апоптотической гибели, а также уровень их фоновой (т. е. не связанной с антигенной стимуляцией) пролиферации, IL-7 in vivo поддерживает численное постоянство этих популяций (Schluns K.S. et al., 2000; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003; Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008). Согласно полученным результатам, rIL-7 оказывал влияние на активацию и пролиферацию 136 CD45RO+CD8+ Т-клеток, значимо увеличивая количество лимфоцитов с фенотипом CD8+CD25+ и CD8+CD71+; не затрагивая, при этом экспрессию маркера ранней активации – СD69. Инкубация CD4+ клеток с rIL-7 (1,0х10-9/мл) сопровождалась ростом количества CD25+ позитивных лимфоцитов, и не влияла на экспрсессию молекул CD69 и CD71 (таблицы 11, 13, 15, рисунок 32). Выявленное нами повышение числа клеток, экспрессирующих молекулу активации CD25 в обеих субпопуляциях примированных Т-лимфоцитов, может быть обусловлено способностью IL-7, как уже упоминалось ранее, повышать синтез IL-2 и экспрессию его рецептора на поверхности Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, усиливает восприимчивость клеток к активационным сигналам (Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008), и как следствие – приводит к повышению их пролиферативной активности. CD45RO+CD4+ клетки оказались менее чувствительны к пролиферативному эффекту IL-7. Согласно данным литературы, CD4+ Т-клетки памяти, в сравнении с цитотоксическими Т-лимфоцитами, более чувствительны именно к антигенному воздействию, их функциональная активность менее зависима от цитокиновой и мембранной костимуляции. Кроме того, генерация CD4+ Тклеток памяти нуждается в более длительной антигенной стимуляции, нежели цитотоксические лимфоциты (Nijhuis E.W. et al., 1995; Williams M.A., Bevan M.J., 2004; Селедцов В.И. и др., 2010). Добавление максимальной концентрации rIL-15 (1,0х10-9г/мл) приводило к росту количества клеток, несущих на своей мембране CD69, за счет субпопуляции CD8+ лимфоцитов памяти и не оказывало значимого действия на экспрессию молекулы активации CD25. Был выявлен дозозависимый эффект rIL-15 на экспрессию CD8+ клетками маркера пролиферации – СD71 (r2=0,70, p<0,05) (таблицы 11, 13, 15, рисунок 32). Как и в культурах CD45RA+ Т-клеток, эффекты rIL-15 не затрагивали субпопуляцию CD4+ клеток (таблицы 11, 13, 15, рисунок 32). Известно, что долгоживущие CD8+ Т-клетки памяти в естественных условиях характеризуются низкой пролиферативной активностью, которая регулируется IL-15 (Moniuszko M. et al., 2004; Ramanathan S. et al., 2009). CD8+ Тклетки памяти (CD44hi (у мышей) или CD122hi (у человека) проявляют большую 137 чувствительность к IL-15-индуцированной пролиферации, нежели наивные CD8+ лимфоциты, а также CD4+ клетки разной степени дифференцировки. Данное обстоятельство, как уже упоминалось, связывают с высокой экспрессией IL-15R на цитотоксических лимфоцитах памяти (Lodolce J.P. et al., 1998; Kennedy M.K. et al., 2000). In vivo, IL-15 является более мощным агентом пролиферации для CD8+ Тклеток памяти, чем IL-2 (Schluns K.S., Lefrançois L., 2003). Согласно данным литературы, способность пролиферировать в ответ на IL15, увеличивается в линии от наивных Т-клеток к клеткам T центральной памяти (TCM) и, наконец, T-клеткам эффекторной памяти (TEM), в соответствии высокой экспрессией IL-2/IL-15Rβ этими субпопуляциями (Geginat J.A. et al., 2001; 2003). Таким образом, гомеостатической продемонстрировано, модели культивирования что in vitro, эффекты в равной rIL-2 в степени, затрагивают процессы активации и пролиферации CD4+ и CD8+-субпопуляций Тклеток памяти. Выявлено разнонаправленное действие IL-7 и IL-15 на процессы активации и пролиферации цитотоксических CD8+ лимфоцитов памяти in vitro. CD4+-лимфоциты памяти обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию rIL-7 и rIL-15, в сравнении с эффектами rIL-2. TCR-активация примированных (CD45RO+) Т-клеток, приводила к резкому росту числа CD69+ (через 24 ч), CD25+ и CD71+ (через 48 ч) Т-лимфоцитов; изменения, индуцированные активатором, равномерно затрагивали CD4+ и CD8+субпопуляции (таблицы 11, 13, 15). Так, добавление Т-клеточного активатора увеличивало количество CD45RO+CD69+ Т-лимфоцитов, в среднем, в 25 раз (р<0,05); CD4+/CD8+CD25-позитивных Т-лимфоцитов, в среднем, в 11 раз (р<0,05) и 2-х кратному увеличению числа CD4+/CD8+CD71 + Т-клеток по сравнению с контролем (р<0,05). Как уже упоминалось, IL-2 считается самым ранним цитокином, индуцированным после активации Т-клеточного рецептора. Т-клетки памяти находятся в G1 фазе клеточного цикла - это способствует их более быстрому входу в IL-2-зависимую фазу иммунного ответа (Ярилин A.A., 1999; Литвинова Л.С. и др., 2013). In vivo, продукция IL-2 осуществляется менее дифференцированными 138 клетками, такими как - TSCM и TCM и играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и выживании антиген-специфических Т-клеток (Ellery J.M., Nicholls P.J., 2002; Benczik M., Gaffen S.L., 2004; Yui M.A. et al., 2004; Setoguchi R. et al., 2005; Malek T.R., 2008). Показана четкая зависимость продукции IL-2 от степени экспрессии CD25: самый высокий уровень продукции IL-2 демонстрируют CD4+ Т-клетки, экспрессирующие промежуточные уровни CD25, меньшие - CD25lowCD4+ Т-клетки, CD25hiCD + Т-клетки, NKT и NK-клетки, а также CD8+ Т-лимфоциты (Yui M.A. et al., 2004; Setoguchi R. et al., 2005; Malek T.R., 2008). Инкубация TCR-активированных CD45RO+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) сопровождалась ростом числа CD69+ Т-клеток за счет хелперной субопуляции (р<0,05) и не затрагивала цитотоксические Т-клетки (р>0,05). В то же время rIL-2 (1,0х10-9 г/мл) достоверно повышал содержание CD25+ Т-клеток в обеих субпопуляциях примированных CD4+/CD8+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением Ac/Exp (р<0,05). Интересно, что к пролиферативному действию rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), ассоциированному с достоверным увеличением числа CD71+ Т-клеток (р <0,05), были чувствительны только активированные хелперные лимфоциты памяти. Число CD45RO+CD8+CD71+ Т-клеток, подвергнутых TCR-активации, варьировало в пределах значений, полученных только при добавлении активатора. Добавление в среду культивации rIL-15 (0,5х10-9 г/мл) было ассоциировано со снижением количества CD69-позитивных Т-клеток в TCR-активированной CD45RO+СD4+ субпопуляции, и, напротив увеличением числа CD45RO+ СD8+CD69+ Т-клеток (р < 0,05). На фоне TCR-активации in vitro, rIL-15 (0,5; 1,0х109 г/мл) обладал угнетающим действием на цитотоксические Т-клетки памяти, достоверно снижая число CD8+CD25+ Т-лимфоцитов (по отношению к пробе с активатором) (р<0,05). CD45RO+CD4+-клетки оказались менее чувствительны к эффектам rIL-15. Тем не менее, rIL-15 (1,0х10-9 г/мл) способствовал увеличению числа пролиферирующих CD4+CD71+ Т-клеток (р<0,05). Число CD45RO+CD8+клеток варьировало на уровне, сопоставимом с пробами только с добавлением TCR-активатора (таблицы 11, 13, 15, рисунок 32). 139 Можно сделать заключение, что сочетанное действие TCR-активатора и цитокинов (rIL-2 и rIL-15), в большей степени, направлено на генерацию короткоживущих CD8+ клеток-эффекторов за счет индукции центральных Т-клеток иммунной памяти, а не на усиление их пролиферативной активности. Частично, данный тезис получил подтверждение в наших исследованиях и публикациях научной периодики (Kalia V. et al., 2010; Pipkin M.E. et al., 2010). В то же время, выявленное нами увеличение числа СD45RO+CD4+CD71+ Тклеток может быть подтверждением тому, что для активации и пролиферации хелперных Т-клеток нужны цитокиновая и мембранная стимуляция, в отличие от их наивных предшественников. Следует отметить, что многие экспериментальные работы, выполненные in vivo на грызунах, демонстрируют важную роль IL-15 в регуляции индуцированной инфекционными возбудителями пролиферацию CD8+ Тклеток, и не касаются популяций CD4+ Т-клеток (Tan J.T. et al., 2001; Surh C.D., Sprent J., 2005). Результаты, полученные группой авторов подтверждают способность IL-15индуцировать in vivo пролиферацию CD8+ эффекторных клеток (Т EM), и в меньшей степени, Т-клеток центральной памяти. Кроме того, они выявили аналогичное действие IL-15 на активность эффекторных CD4+ Т-клеток (ТEM). Авторы показали, что IL-15 увеличивает миграцию долгоживущих CD4+ Т-клеток в экстралимфоидные ткани и индуцирует пролиферацию CD4+ TEM-клеток у SIVинфицированных приматов на фоне ретровирусной терапии. Выявленные изменения свидетельствуют об избирательности действия IL-15, в отличие от IL-2 или IL-7, на рост числа эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клеток. Вышесказанное позволяет сделать предположение об использовании этого цитокина в терапевтических целях для эффективного восстановления CD4+ эффекторных Тклеток в экстралимфоидных тканях ВИЧ-инфицированных пациентов с эффективным снижением вирусной нагрузки (Picker L.J. et al., 2006). rIL-7 не оказывал влияния на изменение количества активированных CD45RO+CD69+ Тклеток. Культивирование CD2/CD3/CD28-активированных CD45RO+ Т- лимфоцитов c добавлением rIL-7 приводило достоверному повышению числа CD4+/CD8+CD25+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением Ac/Exp 140 (р<0,05). Цитотоксические и хелперные Т-клетки памяти были чувствительны только к максимальным концентрациям (1,0х10-9 г/мл) цитокина (таблицы 11, 13, 15). Действие rIL-7 (0,5х10-9 г/мл) было направлено на увеличение числа CD4+CD71+ Т-клеток (р < 0,05). TCR-активированные CD45RO+CD8+-клетки оказались менее чувствительны к пролиферативным эффектам rIL-7: их число варьировало на уровне, сопоставимом с пробами с добавлением только активатора. CD45RO+ rIL-2 CD69 CD8 + rIL-15 rIL-7 н/ч CD25 Exp (1,0) (0,1-1,0) н/ч CD4 + CD25 CD71 н/ч н/ч (1,0) н/ч н/ч н/ч (0,1-1,0) н/ч н/ч н/ч (1,0) CD69 rIL-7/Exp (0,5-1,0) CD71 (0,1-1,0) rIL-2/Exp (1,0) rIL-15/Exp (0,5) (0,5-1,0) (1,0) н/ч н/ч н/ч (0,5) (0,5-1,0) (1,0) н/ч (1,0) (1,0) (0,5-1,0) Рисунок 32. Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на активацию и пролиферацию CD4+/CD8+ Т-клеток в популяции CD45RO+ Т-лимфоцитов в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro. Таким образом, нами было выявлено, что в условиях инкубации in vitro, TCRстимуляция Т-клеток памяти способствует активации и пролиферации CD4+ и CD8+ - субпопуляций. Установлено, что процессы активации и пролиферации CD45RO+CD8+ Т-клеток, ассоциированные с мембранной экспрессией молекул CD69, СD25 и СD71, на фоне TCR-стимуляции, относительно резистентны к действию цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), по сравнению с CD45RO+CD4+ Т-клетками (рисунок 32). Выявленная нами in vitro относительная резистентность процесса активации и пролиферации TCR- стимулированных цитотоксических Т-клеток памяти к эффектам цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), наряду с дифференцировкой в эффекторные клетки, может обеспечивать их устойчивость к активационному апоптозу, а также создавать необходимые предпосылки для 141 эффективной реализации их цитотоксического потенциала в процессе развития вторичного иммунного ответа. Оценка эффектов цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на этапы поздней активации и апоптотической гибели CD4 и CD8 Т-клеток в CD45RA и CD45RO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro Клеточная гибель играет важную роль в функционировании иммунной системы: как в поддержании гомеостаза иммунных клеток на периферии в отсутствие антигена, так и в процессе реализации иммунного ответа (Zhang N. et al., 2005; Селедцов В.И. и др., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Наивные долгоживущие Тклетки, выйдя из тимуса, постоянно циркулируют через кровь, лимфу и вторичные лимфоидные органы, включая селезенку, лимфатические узлы и пейеровы бляшки. Баланс между стареющими и молодыми наивными Т-клетками, сохранение численности их пула за счет процессов гомеостатической пролиферации и апоптотической гибели регулируются различными внешними сигналами (цитокины, хемокины, MHC-сигналинг и др.) (Bouillet Ph., O’Reilly L.A., 2009; Селедцов В.И. и др., 2010; Banerjee H. et. al., 2012; Prabhu S.B. et. al., 2013). Инициация иммунного ответа происходит после TCR-стимуляции Тклеток. TCR-рестимуляция уже активированных Т-клеток приводит к развитию клеточной гибели, индуцированной активацией (activation-induced cell death, AICD) (Dhein H. et al., 1995). Чувствительность к AICD строго контролируется в соответствии со статусом активации Т-клеток (Klas C. et al., 1993). Становится очевидным, если активированные Т-клетки не подвергнутся апоптозу в фазу сокращения иммунного ответа, то вся система будет «забита» большим количеством бесполезных клеток. Кроме того, вырабатываемые эффекторными Т-клетками многочисленные медиаторы, аутоиммунного генеза могут способствовать развитию заболеваний (Bouillet Ph., O’Reilly L.A., 2009). Таким образом, индуцированная активацией клеточная гибель является важным механизмом, обеспечивающим толерантность на периферии, за счет устранения аутореактивных лимфоцитов (Krueger A. et al., 2003). Рецепторный (внешний) путь гибели клеток, 142 инициируемый через FAS (APO-1/CD95)/FasL - сигналинг, является преобладающим при гибели TCR-стимулированных Т-клеток (Ярилин А.А., 2010). Кроме того, клеточная гибель, опосредованная CD95, играет значительную роль в сокращении пула наивных и центральных CD8+ и CD4+ Т-клеток при старении организма (Gupta S., Gollapudi S., 2008). Наше исследование позволило установить, что общее число CD45RA+ и CD45RO+ Т–клеток в контрольных пробах, несущих на своей поверхности молекулу CD95, составило соответственно (таблица 12,18 (10,02 – 15,51) и 20,84 (16,22-25,60)%, 16). В популяциях CD45RA+ Т-клеток, число жизнеспособных Т-клеток, оцениваемых в тесте «GuavaViacount», было равным, в среднем - 75,45 (71,98-78,23)%, а в популяции CD45RO+ Т-клеток - 87,56 (83,2390,10)%, соответственно (рисунок 18). Интересным оказалось распределение числа CD95+ Т-клеток в CD4+ и CD8+ субпопуляциях CD45RA+ и CD45RO+ Т- лимфоцитов. Так, в популяциях CD45RA+ Т-клеток преобладали цитотоксические лимфоциты, несущие маркер CD95+, тогда как в CD45RO+ - популяции, число CD4+CD95+ Т-клеток было выше, чем содержание CD8+CD95+ лимфоцитов (таблица 16). Кроме того, мы предприняли попытку оценить распределение маркера CD95 в негативных и позитивных по экспрессии CD62L – популяциях CD4 - и CD8 - Т-клеток. Нами были получены следующие результаты: число CD95+ клеток в популяции CD45RA+CD8+CD62L+ - было менее 5,6%; тогда как почти 89% CD8+CD62L- Т-клеток (TEMRA) экспрессировали молекулу CD95. В CD45ROкультурах, число CD95-позитивных лимфоцитов в популяциях - CD8+CD62L+ и CD8+CD62L- было равным, в среднем, 70 и 85% (рисунок 21). Интересно, что в хелперных CD45RA+CD62L+ и CD45RA+CD62L- популяциях, число CD95-позитивных клеток не превышало - 2,3 и 10,98%, соответственно. В то же время соотношение центральных (TCM) и эффекторных (TEM) клеток, экспрессирующих молекулу CD95, в CD45RO+CD4+ популяциях составляло, в среднем, 25 и 79% (рисунок 21). Вышесказанное позволяет предположить конститутивную экспрессию молекулы CD95 – цитотоксическими и хелперными клетками - эффекторами, а также цитотоксическими Т-клетками центральной памяти. Согласно данным научной периодики, конститутивная 143 экспрессия молекулы СD95 на эффекторных лимфоцитах и Т-клетках памяти, является не только признаком, определяющим их готовность к запуску активационного апоптоза, но и маркером их созревания и дифференцировки (Хайдуков С.В., Литвинов И.С., 2003; Селедцов В.И. и др., 2010). Некоторые авторы свидетельствуют, что, экспрессия молекулы CD95 сама не является мерой чувствительности Т-клеток к Fas-опосредованному апоптозу (Jaleco S. et al., 2003). Периферические Т-клетки иммунной памяти устойчивы к гибели, индуцированной добавлением моноклональных антител к α-Fas, несмотря на детектируемые высокие уровни экспрессии CD95 (Robertson M.J. et al., 1995). Инкубация CD45RA+ и CD45RO+ культур с rIL-2, сопровождалась ростом содержания CD95+ Т-клеток. Изменения, в основном, затрагивали цитотоксическую популяцию лимфоцитов (таблица 16). Распределение маркера CD95 между CD62L+ и CD62L- популяциями CD8+ Т-клеток в CD45RA - и CD45RO - культурах было следующим: на фоне общего снижения числа CD8+CD62L+ (наивных и центральных) Т-клеток в CD45RA - и CD45RO - культурах, соответственно, содержание CD95+ лимфоцитов в популяциях CD8+CD62L+ возрастало с повышением концентрации цитокина. Число CD8+CD62L- Тлимфоцитов, напротив, увеличивалось в CD45RA - и CD45RO - популяциях цитотоксических Т-лимфоцитов, а содержание CD95 - Т-клеток в этих популяциях эффекторных клеток, в целом, оставалось неизменным (рисунок 21). Кроме того, в пробах с максимальной концентрацией IL-2 (1,0х10-9) г/мл, снижение числа CD62L+ Т-клеток коррелировало с ростом содержания CD95+ лимфоцитов (r=-0,86 и r=-0,69, p<0,05 соответственно). Следует также отметить, что при инкубации CD45RA - и CD45RO - культур с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), регистрировалось достоверное снижение числа живых Т-клеток, в среднем, на 22% и 25%, соответственно (рисунок 18). В нашем эксперименте, число CD4+CD95+ Тклеток в CD45RA и CD45RO - популяциях не изменялось при действии rIL-2. Наблюдаемое нами перераспределение экспрессии маркера CD95 в CD62+ и CD62популяциях хелперных клеток носило недостоверный характер (рисунок 21). Регистрируемое нами rIL-2-индуцированное увеличение числа мертвых клеток, а также рост содержания СD8+CD95+ лимфоцитов в культурах CD45RA+ и 144 CD45RO+ Т-клеток (в том числе, в CD62L+ - популяциях), может быть обусловлено способностью IL-2, в отсутствии антигена, значительно усиливать апоптоз цитотоксических Т-клеток памяти и эффекторов in vivo (Ku C.C. et al., 2000; Kamimura D. et al., 2004). Кроме того, выявленная нами IL-2-опосредованная активация и пролиферация CD8+ Т-клеток in vitro, может значительно повышать их чувствительность к активационному апоптозу. Авторы отмечают, что IL-2 является фактором, одновременно обеспечивающим пролиферацию и сенсибилизацию клеток к AICD (Van Parijs L. et al., 1999). Так, активация системы IL-2-IL-2R усиливает транскрипцию и поверхностную экспрессию FasL с участием IL-2индуцибельной киназы Т-клеток (Itk) (Refaeli Y. et al., 1998; Потапнев М.П., 2002; Kovanen P.E. et al., 2004; McKinstry K.K. et al., 2010). Как уже упоминалось ранее, в реализации проапоптотического эффекта IL-2 основную роль играет β-цепь и сигнальный путь белков STAT5 в то время как γ-цепь, индуцируя PKB/PI3K-путь, напротив, ингибирует IL-2-зависимую индукцию апоптоза (Dai Z. et al., 1999; Van Parijs L. et al., 1999; Cheng L.E. et al., 2002). В то же время, для реализации апоптозиндуцирующего эффекта rIL-2 на лимфоциты крови в условиях in vitro, необходим определенный порог концентрации цитокина (Сазонова Е.В., 2010). Кроме того, одной из причин гибели CD8+ и CD4+ Т-клеток может быть IL-2индуцированное угнетение экспрессии IL-7Rα (Schluns K.S., Lefrançois L., 2003; Xue H.H. et al., 2002; Dooms H. et al., 2007). Несмотря на то, что добавление рекомбинантных форм цитокинов - IL-7 и IL-15 в культуры CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, в гомеостатической модели культивирования in vitro, не оказывало значимого влияния на экспрессию молекулы апоптоза - CD95 и не сопровождалось изменением соотношения живых/мертвых Т-клеток, мы обнаружили изменение содержания CD95+ Т-клеток (в сторону увеличения) в цитотоксических CD62L-позитивных CD45RA и CD45RО – популяциях при добавлении максимальных концентраций цитокинов (рисунок 21). В научной периодике широко представлены данные о цитокинопосредованной регуляции гомеостатических механизмов генерации и выживания СD4+ и CD8+ наивных Т-клеток и Т-клеток памяти in vivo (Marsden 145 V.S., Strasser A., 2003; Ma A. et al., 2006; Van Leeuwen E.M. et al., 2009; D'Cruz et al., 2009). В частности, IL-7 и IL-15 способны усиливать в Т-клетках экспрессию антиапоптотических молекул, таких как Bcl-2 и Мсl-1 (Marsden V.S., Strasser A., 2003), через JAK/STAT и PI3K/AKT сигнальные пути (Тяжелова В.Г., 2013; Shenoy A.R. et al., 2014), и, напротив, ингибировать проапоптогенные факторы - Bax и Bad (Kondrack R.M. et al., 2003; Li J. et.al., 2003; Jiang Q. et al., 2004, Dooms H. et al., 2007; Cai K. et al., 2013; Ярилин А.А., 2010). В контексте изучаемой тематики интерес представляют данные, свидетельствующие, что выживание наивных Т-клеток in vivo зависит от присутствующего в ограниченном количестве - IL-7, в результате чего, наивные Тклетки должны конкурировать за IL-7-опосредованные сигналы выживания. Описан механизм регуляции, который специфически подавляет IL-7Rα транскрипцию в ответ на действие IL-7 и других цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6 и IL15), ответственных за самоподдержание Т-клеток. Авторы предполагают, что цитокин-индуцированное снижение экспрессии IL7Rα - важный гомеостатический механизм для увеличения доступности IL-7 для наивных клеток - как во время гомеостатической пролиферации, так и при антигензависимой активации и клональной экспансии (Park J.H. et al., 2004). Результаты нашего исследования позволили констатировать, что TCRактивация CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, наряду с увеличением общего числа клеток (в мл) и CD71+ Т-лимфоцитов, приводила к снижению содержания живых клеток в обеих популяциях CD45RA+ (в среднем, на 38%) и CD45RO+ Т-клеток (в среднем, на 33%) (р0<0,05) (рисунок 21). Увеличение содержания CD95+ Т-клеток в CD45RA+ и CD45RO+ пробах с TCR-активатором, регистрировалось за счет обеих популяций Т-клеток (хелперных и цитотоксических) (таблица 17). В TCR-активированных CD45RA и CD45RО - пробах регистрировалось значительное увеличение CD95+ клеток в CD62L-позитивных популяциях, тогда как в CD62L- - эти цифры значимо не изменялись (рисунок 21). На наш взгляд, TCR-индуцированное повышение числа мертвых Т-клеток в обеих культурах CD45RA+ и CD45RO+, происходит, как за счет эффекторных Т-клеток, в том числе TEMRA Т-лимфоцитов, так и наивных Т-клеток, крайне чувствительных к 146 дисбалансу инициирующих сигналов, усиленных продукцией IL-2 активированными Т-клетками (Самуилов В.И., 2000; Норкин М.Н. и др., 2002; Krueger A. et al., 2003; Bouillet Ph., O’Reilly L.A., 2009). Несмотря на тот факт, что Т-клетки приобретают чувствительность к запуску активационного апоптоза после реакции TCR-взаимодействия, наивных лимфоцитов и T-клеток памяти на активацию, не эквивалентны: Т-клетки памяти более устойчивы к запуску активационного апоптоза после антигенной рестимуляции (это связано с высоким уровнем экспрессии белков Bcl-X (L) и Bcl2), чем антиген-активированные наивные Т-лимфоциты (Kishimoto H., Sprent J., 1999; Mueller Y.M. et al., 2003; Fas S.C. et al., 2006; Strasser A. et al., 2009). В отношении TEMRA Т-клеток установлено, что in vitro стимуляция их Т-клеточного рецептора анти-CD3, сопровождается их массовой гибелью (Libri V. et al., 2011; Кудрявцев И.В., 2014), в связи с низким уровнем экспрессии этими клетками белков семейства Bcl-2, и напротив, высоким - gH2AX и уровнем фосфорилирования р38 (Di Mitri D. et al., 2011). Установлено, что рецепторы для большинства цитокинов γ-семейства индуцируются при активации Т-клеток. После TCR-активации, на большинстве Тклеток экспрессия IL-7Ra быстро снижается (Schluns K.S. et al., 2000; Kaech S.M. et al., 2003; Alves N.L. et al., 2007; Albareda M.C. et al., 2015), тогда как экспрессия IL-2Rα, IL-15Rα и IL-2Rβ – увеличивается, и только небольшая популяция активированных Т-клеток, преимущественно – CD8+, сохраняет экспрессию CD127 на должном уровне: в дальнейшем они дифференцируются в Т-клетки памяти (Schluns K.S. et al., 2000; Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008; Osborne L.C., Abraham N., 2010; Carrette F., Surh C.D., 2012), а антиген-специфические эффекторные клетки с фенотипом - IL-7Rαlow, подвергаются апоптозу в фазу сокращения иммунного ответа (Schluns K.S. et al., 2000; Kaech S.M. et al., 2003; Kondrack R.M. et al., 2003; Huster K.M. et al., 2004; Klonowski K.D. et al., 2006; Dooms H. et al., 2007). Возможно, выявленное нами увеличение числа мертвых Т-клеток и содержания CD95+ Т-клеток в популяциях CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, может быть связано с индуцированным активацией низким уровнем экспрессии IL-7Rα на 147 наивных лимфоцитах и эффекторных Т-клетках, в том числе, на TEMRA Тлимфоцитах. Действие rIL-2 на жизнеспособность TCR-активированных CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов носило однонаправленный характер и сопровождалось повышением числа мертвых Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением анти-CD2/CD3/CD28–частиц (рисунок 20). Рост числа CD95+ Т-клеток в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов регистрировалось, преимущественно, за счет цитотоксических Т-клеток (таблица 17, рисунок 21). Перераспределение маркера CD95 в популяциях CD8+ клеток было однонаправленным: число CD95+ Т-клеток возрастало в CD62L – позитивных популяциях наивных клеток и клеток с центральным фенотипом, тогда как в популяциях эффекторных клеток (CD62L-) – по прежнему оставалось на прежнем уровне (>90%) (рисунок 21). rIL-2-индуцированное изменение числа CD95+ Тклеток в популяциях CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов имело четкую взаимосвязь с содержанием мертвых клеток (r=0,60, r=0,78, p<0,05 - для CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов при действии rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), соотвественно). Сведения, касающиеся роли IL-2 в клональной экспансии CD4+- и CD8+- Тлимфоцитов в условиях in vivo носят весьма разнородный характер. Многие авторы указывают на участие IL-2 в экспансии CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов in vivo за счет индукции их апоптотической гибели, которая должна произойти до клонального пика (Kneitz B. et al., 1995; Khoruts A. et al., 1998; Lantz O. et al., 2000; Leung D.T. et al., 2000; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003). Разнонаправленное действие IL-2 на Т-клетки зависит от стадии их дифференцировки: введение IL-2 во время клональной экспансии Т-клеток при вирусной инфекции весьма негативно для быстроделящихся эффекторных Т-клеток и является вполне своевременным в фазу сокращения иммунного ответа – приводит к увеличению пролиферации и выживанию вирус-специфических Т-клеток (Blattman J.N. et al., 2003). В отношении CD4+ Т-клеток, в научной периодике встречаются данные, свидетельствующие, что IL-2-сигнализация во время антиген-специфического прайминга CD4+ Т-клеток in vivo и in vitro значительно повышает долгосрочную 148 выживаемость эффекторных клеток после устранения антигена (Dooms H. et al., 2007; Malek T.R. et al., 2010). Добавление rIL-7 и rIL-15 в максимальной концентрации (1,0х10-9/мл) в культуру активированных Т-клеток, увеличивало число живых СD45RO+ Тлимфоцитов памяти (по сравнению с пробами только с добавлением активатора, в среднем, на 20%), что согласуется биологическим действием этих медиаторов (Schluns K.S. et al., 2000; Schluns K.S., Lefrançois L., 2003; Бойчук С.В., Дунаев П.Д., 2008). CD45RA+ T-лимфоциты оказались чувствительными только к протективному эффекту rIL-7 (таблица 17). Интересно, что на фоне TCRактивации, rIL-7 не оказывал значимого влияния на изменение содержания СD95+ клеток в CD45RA+ - культурах (таблица 17). Однако нами было выявлено, индуцированное rIL-7, достоверное перераспределение содержания СD95+ клеток в хелперных и цитотоксических популяциях – относительное число CD4+CD95+ Т-клеток снижалось (rIL-7 - 0,5х10-9 г/мл), тогда как содержание CD8+CD95+ (rIL-7 - 0,5-1,0х10-9 г/мл), напротив, возрастало (р<0,05) (таблица 17). CD45RA+ Т-клетки были нечуствительны к действию rIL-15. При этом, число СD95+ Т-клеток в CD62L+ - популяциях цитотоксических Т-клеток, значимо возрастало, и не изменялось в хелперных (рисунок 21). Эффекты rIL-7 (0,5-1,0х10-9 г/мл) на активированные CD45RО+ Т-клетки сопровождались увеличением общего числа CD95+ Т-клеток, за счет цитотоксической популяции (по сравнению с активационной пробой) (р < 0,05) (таблица 17). Добавление rIL-15 в активированные культуры CD45RO+ Т-клеток, сопровождалось достоверным снижением числа хелперных CD45RO+CD95+ Тлимфоцитов, CD45RO+CD95+ и напротив, повышением Т-лимфоцитов (р<0,05) содержания (таблица 17, цитотоксических рисунок 21). Перераспределение экспрессии молекулы CD95 в популяциях центральных (CD62L+) и эффекторных (CD62L-) CD45RO+ клеток выражалось достоверным увеличением числа CD8+CD95+CD62L+ Т-клеток, а в популяции хелперных лимфоцитов – не изменялось (рисунок 21). Несмотря на то, что цитокины - IL-2, IL-7 и IL-15, являются мощными индукторами пролиферации Т-клеток, IL-7 и IL-15 обладают способность 149 подавлять IL-2-индуцированную чувствительность клеток к AICD (Brenner D. et al., 2008), что было продемонстрировано нами в отношении хелперных популяций CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток. Таким образом, эффекты rIL-2 в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, на жизнеспособность CD45RA+ и CD45RO+ Тлимфоцитов, носят однонаправленный характер и сопровождаются увеличением числа CD95+ Т-лимфоцитов (в основном, в CD62L-позитивной популяции), на фоне снижения содержания живых Т-клеток. Изменения, индуцированные IL-2, затрагивают, в основном, цитотоксические Т-клетки. Выявлено, что IL-7 и IL-15 в активационной модели in vitro, увеличивают число живых Т-лимфоцитов в СD45RO - культурах (по сравнению с пробами только с добавлением активатора) и не влияют на CD45RA+ Т-клетки. На фоне TCR-активации, эффекты IL-7 и IL15 направлены на рост числа CD8+CD95+Т-клеток и, напротив, снижение содержания CD4+CD95+ Т-клеток в CD45RA+ и CD45RО+- культурах. ɣсцитокины (IL-2, IL-7 и IL-15), в разных моделях культивирования, способствуют росту числа CD3+CD95+ Т-клеток в цитотоксических популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM), тогда как экспрессия CD95 эффекторными CD8+ Т-клетками, а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется. Вероятно, цитокин-индуцированное повышение числа СD95+ Т-клеток в популяциях цитотоксических и хелперных CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, на фоне отсутствия динамики изменений содержания живых и мертвых клеток, может быть признаком активации наивных лимфоцитов и созревания – Т-клеток памяти. Еще одной из поверхностных молекул, характеризующих активационный статус Т-клеток, является HLA-DR. Согласно современным представлениям, HLA-DR является маркером не только поздней, но и длительной активации Тклеток (Чередеев А.Н. и др., 1999; Bertho N. et al., 2000; Хаитов Р.М., 2009). Несмотря на то, что роль CD3+HLA-DR+ клеток, в целом, остается неясной, их появление и персистенция in vivo свидетельствуют, что CD3+HLA-DR+ лимфоциты могут быть частью нормальной иммунорегуляции (Imamichi H., et.al., 2012). Научные публикации последних лет позволили пересмотреть роль 150 CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов в поддержании иммунного гомеостаза на периферии. Предполагают, что CD3+HLA-DR+ представляют собой зрелые регуляторные Тклетки с высокой супрессивной активностью (Imamichi H. et al., 2012; Arruvito L. et al., 2014), механизмы которой опосредованы контактными взаимодействиями между соседними клетками, включая CTLA-4-сигнализацию (Arruvito L. et al., 2014). В связи с вышесказанным, CD3+HLA-DR+ Т-клетки активно изучают в контексте формирования противоопухолевого иммунитета (Starska K. et al., 2011), патогенеза вирусной инфекции (ВИЧ) (Imamichi H. et al., 2012), сепсисе (Moon H. et al., 2007), некоторых аутоиммунных заболеваний (Weitz M. et al., 2011; Nada A.M., Hammouda M., 2014), при старении и др. (Imamichi H. et al., 2012; Kobayashi H. et al., 2012). Imamichi H. и др. (2012) относительно недавно было установлено, что CD3+HLA-DR+ Т-клетки, полученные из периферической крови здоровых доноров, несут, в основном, низкомолекулярную изоформу рецептора CD45 – CD45RО (до 78-88%); характеризуются отсутствием маркеров недавней TCR-активации и низким уровнем экспрессии белков семейства Bcl-2, в сравнении с HLA-DRнегативными наивными и Т-клетками памяти (Imamichi H. et al., 2012). Согласно полученным нами результатам, в интактных CD45RA-культурах, содержание CD3+CD8+HLA-DR+ Т-клеток почти в 2 раза превышало количество CD3+CD4+HLA-DR+ Т-лимфоцитов и было равным 5,54 (4,05-6,22) и 3,13 (3,013,46) %, соответственно. Оценив распределение маркера HLA-DR+ в негативных и позитивных по экспрессии CD62L – популяциях CD4 - и CD8 - Т-клеток, нами были получены следующие результаты: в популяциях наивных - CD45RA+ CD4+/CD8+CD62L+ Т-клеток маркер HLA-DR обнаружен не был; тогда как почти 18 и 32% и CD4/+CD8+CD62L- Т-лимфоцитов экспрессировали HLA-DR на своей поверхности. В культурах CD45RО+ Т-клеток, в отличие от CD45RA – популяций, преобладали хелперные CD3+HLA-DR+ Т-лимфоциты (рисунок 22). Как и ожидалось, число HLA-DR-позитивных лимфоцитов, в популяциях - CD8+/CD4+CD62L+ было равным, в среднем, 1,5 и 1,9%; в CD8+/CD4+CD62L негативных популяциях это процентное распределение составило: 15 и 8% (рисунок 23). Следует отметить, что в эффекторных популяциях (CD62L-) 151 CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, более CD3+HLA-DR+ 99% Т-клеток - экспрессировали маркер CD95. Однако, не все CD95-позитивные Т-лимфоциты несли на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. Таким образом, обнаруженные нами в CD45RA- и CD45RО-культурах CD3+HLA-DR+ Т-лимфоциты, представляют собой зрелые и/или незрелые эффекторные Т-клетки и TEMRA Т-лимфоциты (Sallusto F. et al., 2004). Можно предположить, что высокая (CD3+CD4+/CD8+CD27-CD62L-) экспрессия Т-клетками зрелыми молекулы эффекторными HLA-DR, наряду с мембранной экспрессией CD95, могут являться признаками терминальной фазы дифференцировки и созревания Т-клеток. Многие авторы утверждают, что экспрессия Т-клетками HLA-DR и CD57, являются маркерами так называемого «иммунного истощения» (и/или анергии) и репликативного старения (Wang E.C. et al., 1993; Imamichi H. et al., 2012).В то же время, обнаруженные нами в CD45RO+ культурах минорные популяции CD8+/CD4+CD62L+HLA-DR+ Т-клеток, могут представлять интерес с позиций последних исследований в отношении этих клеток, касающихся их супрессивных свойств. Заслуживающими внимания оказались данные о влиянии in vitro цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), на экспрессию молекулы HLA-DR цитотоксическими и хелперными Т-клетками в CD45RA - и CD45RО - культурах. Инкубация CD45RA-культур с rIL-2, rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) и rIL-15 (0,1-1,0 х10-9 г/мл), сопровождалась достоверным снижением общего числа CD3+CD8+HLA-DR+ Т-клеток по сравнению с уровнем интактных значений (р < 0,05) (рисунок 22). Однако, несмотря на снижение общего числа CD3+CD8+HLA-DR+ Т-клеток, нами было обнаружено достоверное повышение, в среднем в 1,5 раза, содержания цитотоксических CD3+HLA-DR+CD95+ Тлимфоцитов в популяции, негативной по экспрессии молекулы CD62L (зрелые и незрелые TEMRA эффекторы) (рисунок 23). Известно, что протективные эффекты IL-7 и IL-15 на Т-клетки затрагивают регуляцию Bcl-2 семейства: индуцируя экспрессию антиапоптотических факторов Bcl-2 и Мсl-1 и, напротив, инактивируя факторы апоптоза - Bax и Bad (Jiang Q. et al., 2004). Полученные нами результаты могут быть обусловлены гибелью 152 цитотоксических TEMRA эффекторов, в связи с их низкой чувствительностью к антиапоптотическому влиянию этих цитокинов (Di Mitri D. et al., 2011; Imamichi H. et al., 2012). В то же время, в отношении IL-2 известно, что он способен усиливать экспрессию таких проапоптотических белков как TRAIL, каспаза-3, DAP (deathassociatedprotein) и STK 17B (серин/треониновая киназа 17B) (Kovanen P.E. et al., 2004). Действительно, относительно недавно было выявлено, что CD8+HLA-DR+ Тклетки имеют более низкий уровень экспрессии Bcl-2, чем HLA-DR-негативные наивные Т-лимфоциты или Т-клетки памяти. Интересно, что для CD8+HLA-DR+ Тклеток характерна более высокая экспрессия белка сурвивина (Survivin) по сравнению с HLA-DR – Т-лимфоцитами. Тем не менее, различий в уровнях экспрессии проапоптотических генов: Bax, Bid и Bim с HLA-DR-негативными наивными и Т-клетками памяти, выявлено не было. Авторы предполагают, что низкие уровни экспрессии Bcl-2 могут объяснить более высокий уровень гибели CD3+HLA-DR + клеток во время культивирования in vitro. Однако высокие уровни экспрессии сурвивина у этих клеток дают им преимущество в условиях выживания in vivo (Imamichi H. et.al., 2012). С другой стороны, цитокин-опосредованное снижение общего числа цитотоксических СD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RA+ культурах, может быть обусловлено повышением содержания эффекторных (CD3+CD8+CD62L-, TEMRA) Тклеток в результате дифференцировки из наивных Т-лимфоцитов или незрелых эффекторных TEMRA. Выявленные нами изменения, индуцированные действием максимальных концентраций цитокинов (rIL-2 и rIL-15), имели положительную взаимосвязь между содержанием CD3+CD62L-HLA-DR+СD95+ лимфоцитов и количеством зрелых цитотоксических (CD62L-CD27-) ТЕМRА (r=0,67, p<0,05 для IL2; r=0,80, p<0,05 для rIL-15). Инкубация CD45RО+ Т-клеток с rIL-2 (1,0х10-9 г/мл), напротив, приводила к росту относительного количества хелперных и цитотоксических CD3+HLADR+ лимфоцитов (в среднем, в 2 раза) (рисунок 22). Интересно, что увеличение числа HLA-DR+ Т-клеток регистрировалось в CD62L+ и CD62L- субпопуляциях цитотоксических Т-лимфоцитов, тогда как в хелперных - число HLA-DR+Т-клеток возрастало только в эффекторной (CD62L-) популяции и не затрагивало Т-клетки с 153 центральным фенотипом (рисунок 23). Следует отметить, что все CD3+HLA-DR+ клетки в эффекторых популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток, экспрессировали молекулу CD95. Возможно, что rIL-2-индуцированное увеличение числа CD3+CD4+/CD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD62L-негативной популяции CD45ROкультур, опосредовано пополнением этого пула клеток за счет прекурсоров – CD3+HLA-DR–, индуцированный rIL-2 в условиях культивирования in vitro. Подтверждением этому тезису явилось обнаружение взаимосвязи между снижением числа незрелых цитотоксических эффекторов (CD62L-CD27+, TEM: Em1 и Em2) и увеличением CD8+HLA-DR+ (r=-0,80, p<0,05) при действии rIL-2 (1,0x10-9 г/мл). В то же время повышение числа цитотоксических CD3+HLA-DR+ лимфоцитов в CD62L+ популяции CD45RO+ Т-клеток, может быть обусловлено их пролиферацией. Данные литературы свидетельствуют, что CD8+ T-клетки периферической крови взрослых доноров и пуповинной крови новорожденных, конститутивно экспрессирующие молекулу HLA-DR, обладают способностью к пролиферации in vitrо, с сохранением супрессивных свойств, аналогичных извлеченным ex vivo CD8+HLA-DR+ клеткам (Arruvito L. et al., 2014). Согласно данным литературы, IL-2-зависимая активность эффекторов и регуляторных клеток in vivo находятся под жестким физиологическим и антигензависимым контролем (Malek T.R., Castro I., 2010). Многими авторами было описано, что дефицит IL-2 приводит к формированию аутоиммунной патологии, вследствие нарушения функциональной активности Treg (Bayer A.L. et al., 2008, O'Gorman W.E. et al., 2009; Garg G. et al., 2012; Russell S.E. et al., 2012). Дефицит IL2, CD25 или IL-2Rβ приводит к полиорганному воспалению и системному аутоиммунитету у мышей и человека (Yamanouchi J. et al., 2007; Cénit M.C. et al., 2013). Уникальная роль IL-2 в регуляции иммунитета связана скорее не с выполнением функции ростового фактора лимфоцитов, где его действие дублируется другими цитокинами, а больше с контролем за гиперактивацией иммунной системы или индукцией толерантности за счет стимуляции 154 дифференцировки Тreg лимфоцитов (Malek T.R., Bayer A.L., 2004; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). rIL-7 и rIL-15 не оказывали значимого влияния на изменение числа CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов в CD45RO – культурах, однако в максимальных концентрациях, способствовали значимому росту числа CD3+CD8+HLA-DR+CD95+ в эффекторных популяциях (рисунок 23). Добавление CD2/CD3/CD28-комплекса в среду культивирования Т-клеток, сопровождалось ростом числа CD3+CD8+HLA-DR+ в популяции CD45RA-Тлимфоцитов (р < 0,05) и равномерным увеличением числа СD3+СD4+HLA-DR+ и СD3+СD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RО-культурах (р < 0,05). Мы предполагаем, что повышение числа CD3+HLA-DR+ Т-клеток, обнаруженное нами в CD45RA- и CD45RО - культурах, может быть индуцировано в условиях активации эффекторных/ТЕМRА in vitro Т-лимфоцитов из наивных/центральных (CD3+CD27+CD62L–), или поскольку незрелых зрелые эффекторы и TEMRA Т-клетки, утратив экспрессию молекул костимуляции CD27+ и CD28+, по сути, не способны к пролиферации. Вполне ожидаемым явилось TCR-индуцированное увеличение числа CD3+HLA-DR+CD95+ Т-клеток в CD62L-негативных популяциях CD45RO и CD45RA – культур. Рост числа СD3+HLA-DR+CD95+ в CD62L-негативных CD45RА и CD45RО популяциях, опосредованный TCR-активацией, вероятно, может свидетельствовать созревания эффекторных о процессах клеток. терминальной Данный позитивной корреляции между содержанием тезис дифференцировки подтверждается и фактами СD3+СD8+СD62L- HLA-DR+CD95+ клеток и числом зрелых (CD62L-CD27-) TEMRA эффекторов (r=0,67, p<0,05 – для CD45RA+ культур); и СD3+СD8+СD62L-HLA-DR+CD95+ клеток и числом зрелых (CD62L-CD27-) эффекторов (r=0,70, p<0,05 – для CD45RО+ культур). По мнению Bertho N. и др. (2000), экспрессия HLA-DR на клеточных мембранах, является одним из механизмов реализации апоптотической гибели клеток, особенно в отношении Т-лимфоцитов, утративших способность к экспрессии Fas-антигена. Сигналы, генерируемые с помощью HLA-DR, приводят к гибели зрелых профессиональных АПК и активированных Т- и В-лимфоцитов 155 (каспаз-независимый механизм), обеспечивая тем самым, ограничение иммунного ответа (Bertho N. et al., 2000). Кроме того, TCR-активация приводила к росту числа СD4+/СD8+СD62L+HLA-DR+ предположить, что клеток в CD45RO+ CD2/CD3/CD2-индуцированное популяции. повышение Можно числа СD4+/СD8+СD62L+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RO+ Т-культурах, может быть механизмом, предотвращающим чрезмерную активацию реактивированных лимфоцитов в отсутствие антигенной стимуляции. Добавление rIL-2 (0,5-1,0х10-9 г/мл) и IL-15 (0,1-1,0х10-9 г/мл) на фоне TCRактивации, в CD45RA-культуры, сопровождалось достоверным снижением числа CD3+CD8+HLA-DR+ по сравнению с пробами только с добавлением активатора. rIL-7 не оказывал влияния на содержание CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RAкультурах (рисунок 22). Действие цитокинов было направлено на снижение числа HLA-DR+ Т-клеток в CD62L- негативных популяциях CD45RA-клеток, тогда как процентное содержание СD3+СD8+СD62L- HLA-DR+CD95+ возрастало (рисунок 23). Инкубация TCR-активированных CD45RО+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-15 (1,0х10-9 г/мл), также приводила к снижению числа цитотоксических CD3+HLA-DR+ Тлимфоцитов. rIL-2 и rIL-7 (1,0х10-9 г/мл) оказывали аналогичное действие на хелперные CD4+HLA-DR+ Т-лимфоциты (р < 0,05) (рисунок 22). В CD45RO – культурах, регистрировалось перераспределение маркера HLA-DR в негативных и позитивных по экспрессии CD62L-популяциях в сторону уменьшения, тогда как относительное содержание СD3+ СD8+СD62L- HLA-DR+CD95+, аналогично TEMRA эффекторам, возрастало (рисунки 22, 23). Одним из механизмов снижения числа CD45RА+HLA-DR+ и CD45RO+HLADR+ Т-клеток в CD62L-негативных популяциях, опосредованных сочетанным действием цитокинов и Т-клеточного активатора, как уже упоминалось ранее, может быть их повышенная гибель, обусловленная низкой экспрессией белков семейства Bcl-2 (Jiang Q. et al., 2004; Imamichi H. et al., 2012), а также увеличение содержания фракции CD62L- Т-лимфоцитов, вследствие цитокинопосредованной пролиферации и дифференцировки TCR-активированных Т-клеток. Как уже упоминалось, что на фоне сочетанного влияния цитокинов и активатора, относительное число CD3+CD4+/CD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD62-позитивных 156 пробах CD45RO-культур, значимо снижалось. Можно сделать предположение, что цитокин-индуцированное уменьшение числа CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RОкультурах, на фоне TCR-активации, в большей степени, направлено на поддержание экспансии и дифференцировки Т-клеток, а не на ограничение этих процессов. Таким образом, цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической модели культивирования in vitro, обладают разнонаправленным действием на изменение содержания CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RА- и CD45RO-культурах. TCRактивация Т-клеток приводит в к росту CD45RА-культурах числа Т-клеток CD3+CD8+HLA-DR+ и содержания CD3+CD4+HLA-DR+ и CD3+CD8+HLA-DR+ в пробах Т-клеток памяти. Цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на фоне TCR-активации in vitro, снижают число CD3+HLADR+ Т-клеток в CD45RА- и CD45RО-культурах. Однако, независимо от тенденций изменения содержания CD3+HLA-DR+ клеток (в сторону уменьшения или увеличения), ɣс-цитокины, в разной степени, способствуют повышению числа СD3+HLA-DR+CD95+ в эффекторных популяциях хелперных и цитотоксических лимфоцитов (CD62L-негативных). 157 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Резюмируя вышесказанное, цитокинопосредованной можно регуляции выделить функциональной ряд закономерностей активности Т-клеток, ассоциированных с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих проходящие процессы активации, пролиферации, дифференцировки и апоптоз, в разных условиях культивирования in vitro (рисунок 33). Наше исследование позволило выявить, что в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, ɣс-цитокины (IL-2, IL-7 и IL-15), в разной степени, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ наивных клеток (TN) и CD4+ и CD8+ Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM) в эффекторные клетки разной степени зрелости (рисунок 33). Установлено, что влияние цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD4+/CD8+ CD45RA+Т-клеток, в разных моделях культивирования in vitro, носят однонаправленный характер, но имеют разную степень выраженности. Продемонстрирована меньшая чуствительность хелперных CD45RA+ Tлимфоцитов к пролиферативному действию ɣс-цитокинов, в сравнении с CD45RA+CD8+ Т-клетками (рисунок 33), что может быть связано с механизмами, сдерживающими их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro. Показано, что в гомеостатической модели культивирования in vitro, хелперные популяции СD45RO+ Тлимфоцитов обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию ɣс-цитокинов, в сравнении с цитотоксическими СD45RO+ Т-клетками. Напротив, цитотоксические CD45RO+ Т-клетки в активационной модели in vitro, менее чувствительны к активирующим и пролиферативным эффектам ɣсцитокинов, в сравнении с хелперными CD45RO+ Т-лимфоцитами (рисунок 33). Установлено, что эффекты rIL-2 в гомеостатической и активационной моделях in vitro, на жизнеспособность CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов, носят однонаправленный характер и сопровождаются увеличением числа CD95+ Тлимфоцитов (в основном, в CD62L-позитивной популяции), на фоне снижения содержания затрагивают, жизнеспособных в основном, Т-клеток. Изменения, цитотоксические индуцированные Т-клетки. IL-7 и IL-2, IL-15, в гомеостатической модели культивирования не оказывают влияния на Т-клетки, 158 тогда как в активационной модели in vitro, увеличивают число живых Тлимфоцитов в СD45RO - культурах (по сравнению с пробами только с добавлением активатора) и не влияют на CD45RA+ Т-клетки. Показано, что влияние ɣсцитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на экспрессию молекулы CD95 (Fas/APO-1) CD4+ и CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток имеют разную направленность и разную степень выраженности. ɣс-цитокины (IL-2, IL-7 и IL-15), в разных моделях культивирования, способствуют росту числа CD3+CD95+ Т-клеток в цитотоксических популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM), тогда как экспрессия CD95 эффекторными CD8+ Тклетками, а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется (рисунок 33). Установлено, что в хелперных и цитотоксических популяциях эффекторных (CD62L-) CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток более 99% CD3+HLA-DR+ Т-клеток экспрессируют маркер CD95. Однако, не все CD95-позитивные Т-лимфоциты несут на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. Продемонстрировано, что ɣс-цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в гомеостатической и активацитнной моделях in vitro, обладают разнонаправленным действием на изменение содержания CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RА- и CD45RO-культурах. Выявлена способность ɣс-цитокинов (в разных условиях культивирования) повышать содержание СD3+HLA-DR+CD95+ Т-клеток в эффекторных популяциях хелперных и цитотоксических лимфоцитов (CD62L-негативных) (рисунок 33), что может свидетельствовать о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток под действием ɣс-цитокинов. Подводя итог вышесказанному, изучение физиологических аспектов регуляции функциональной активности Т-клеток, опосредованных биомолекулами, может быть основополагающим компонентом для дальнейшего, более детального исследования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе адаптивного иммунитета. 159 Гомеостатическая модель in vitro rIL-15 ТЕМRA: E,ТCM TN (CD3+CD62L-) ТЕМRA: Е TN (CD3+CD62L-) ТЕМRA: Е,ТCM TN (CD3+CD62L-) ТЕМRA: н/зр и зр TN CD95 HLA-DR (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) TCM TEM: Em1; Em2 (CD3+CD62LCD3+CD62L+) (CD3+CD62L-) ТЕМ: Em3; Em4 ТEMRA: Е rIL-15 CD4+ TCM TEM: Em1; Em2 TEM зр TEM н/зр TEM н/зр TCM (CD3+CD62L-) (CD3+CD62L-) (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) HLA-DR+CD95+ ТЕМ: Em3; Em4 ТEMRA: Е rIL-7 CD45RО CD8+ Поздняя активация, апоптоз CD45RA+CD27-CD62+ rIL-2 CD4+ Дифференцировка, созревание CD27, CD62L, CD45RA/RO HLA-DR+CD95+ CD71 rIL-7 CD45RA CD8+ CD25 rIL-2 CD69 Пролиферация HLA-DR+CD95+ Активация Активационная модель in vitro CD4+ Exp/rIL-15 Exp/rIL-7 CD45RО CD8+ ТЕМRA: Е ТСM ТЕМRA: Е Поздняя активация, апоптоз CD95 HLA-DR TN (CD3+CD62L-) TN (CD3+CD62L-) TN (CD3+CD62L-) HLA-DR+CD95+ CD71 Дифференцировка, созревание CD27, CD62L, CD45RA/RO (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) ТЕМRA зр ТСM TN ТЕМRA зр (CD3+CD62LCD3+CD62L+) ТЕМ: Em3; Em4 TEM: Em1; Em2 ТEMRA: Е TEM зр TCM (CD3+CD62L-) (CD3+CD62LCD3+CD62L+) TCM (CD3+CD62LCD3+CD62L+) (CD3+CD62LCD3+CD62L+) (CD3+CD62L-) HLA-DR+CD95+ CD4+ Exp/rIL-2 Exp/rIL-15 CD45RA Exp/rIL-7 CD8+ CD25 Exp/rIL-2 CD69 Пролиферация (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) (CD3+CD62L+) HLA-DR+CD95+ Активация Рисунок 33. Влияние цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с (по результатам собственных исследований). Обозначения: дозозависимые эффекты цитокинов; отсутствие изменений изучаемых показателей; изменение значений показателей во всем спектре действующих концентраций цитокинов; 160 ВЫВОДЫ 1. Эффекты цитокинов, имеющих общую ɣ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на функциональную активность CD4+ и CD8+ Т-клеток, фенотипически проявляющуюся мембранной экспрессией молекул активации (CD69, CD25), пролиферации (CD71), созревания (CD27, CD62L, HLA-DR) и апоптоза (CD95), определяются степенью зрелости Т-лимфоцитов (наивные, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями культивирования in vitro (гомеостатическая и активационная модели). 2. В гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, ɣсцитокины (IL-2, IL-7 и IL-15) в CD45RA- культурах Т-клеток, в разной степени, способствуют образованию зрелых и незрелых эффекторных CD4+ и CD8+ Тлимфоцитов (TEMRA и TEM), а также Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM) за счет снижения содержания наивных CD4+ и CD8+ клеток (TN). 3. В культурах CD45RO+ Т-клеток цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), в разных условиях культивирования in vitro, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ лимфоцитов с фенотипом центральной памяти (TCM) в эффекторные Т-клетки (TEM и TEMRA). 4. Влияние ɣс-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD45RA+CD4+ и CD45RA+CD8+ Т-клеток, ассоциированные с экспрессией молекул - CD69 и CD25, в гомеостатической модели культивирования и на фоне TCR-стимуляции in vitro, имеет однонаправленный характер, но разную степень выраженности. CD45RA+CD4+ Tлимфоциты, в отличие от CD45RA+CD8+ Т-клеток, менее чувствительны к пролиферативному действию ɣс-цитокинов. 5. В гомеостатической модели культивирования in vitro, СD45RO+CD4+ Т-лимфоциты обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию ɣс-цитокинов по сравнению с СD45RO+CD8+ Т-клетками. На фоне TCRактивации in vitro, CD45RO+CD8+ Т-клетки менее чувствительны, по сравнению с СD45RO+CD4+ Т-лимфоцитами, к активирующим и пролиферативным сигналам цитокинов, имеющих общую γ-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15). 6. В разных условиях культивирования in vitro, ɣс-цитокины (IL-2, IL-7 и IL-15) инициируют экспрессию молекулы CD95(Fas/APO-1), преимущественно, CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов. Цитокины, в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, способствуют росту числа CD3+CD8+CD95+ Т-клеток в популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (TCM); экспрессия CD95 эффекторными CD8+ Тклетками (CD62L-) а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется. 7. Рост числа СD3+HLA-DR+CD95+ клеток в CD4+ и CD8+ эффекторных (CD62Lнегативных) популяциях CD45RА- и CD45RО- Т-лимфоцитов в разных условиях культивирования in vitro свидетельствует о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток под действием ɣс-цитокинов. 161 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Антонеева, И.И. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника / Антонеева И.И., Петров С.Б. // Онкология. — 2008. — Т. 10, №2. — С. 234-237. 2. Артамонова, Е.В. Рецептор трансферина (CD71) на клетках рака молочной железы / Артамонова Е.В., Тупицын Н.Н., Летягин В.П. // Молекулярная медицина. – 2007. - №1. – С. 16-20. 3. Барышников А.Ю., Иммунологические проблемы апоптоза / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин, - М.: Эдитория, 2002. – 320 с. 4. Бойчук, С.В. Роль интерлейкина 7 в патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции / С.В. Бойчук, П.Д. Дунаев // Цитокины и воспаление. - 2008. - № 7 (1). - С. 37. 5. Воробьёва, А.А. Атлас по микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие / А.А. Воробьёва, А.С. Быкова. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. – 236 с. 6. Галактионов, В.Т. Иммунология: Учебник. / В.Т. Галактионов. - М.: МГУ, 1998. – 480 с. 7. Динамика экспрессии CD25 в лимфоцитах периферической крови человека, стимулированных фитогемагглютинином или интерлейкином-2 / А.Н. Шатрова, Н.Д. Аксенов, В.В. Зенин и др. // Цитология. - 2009. – № 6.- С. 506-510. 8. Жукова, О.Б. Апоптоз и вирусная инфекция / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2006. – 142 с. 9. Ивашкин, В.Т. Основные понятия и положения фундаментальной иммунологии / В.Т. Ивашкин // РЖГГК. – 2008. – № 4. – С. 4–14. 10. Иммунология / Д. Мейл, Дж. Бростофф, Д.Б. Рот, А. Ройтт - М.: Логосфера, 2007. – 568 с. 11. Иммунология. Учебник для студентов медицинских вузов / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И. Г. Сидорович - М.: Медицина, 2000.- 432 с. 12. Кайгородова, Е.В. Белки теплового шока и митогенактивированные протеинкиназы JNK, р38: роль в адаптации и дизрегуляции клетки при стресс-индуцированном апоптозе / Е.В. Кайгородова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Молекулярная медицина. - 2012. - №1. - С. 3-11. 162 13. Кетлинский, С. А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб: Фолиант, 2008. - 550 c. 14. Клеточные механизмы генерации иммунологической памяти / В.И. Селедцов, Л.С. Литвинова, Е.В. Кириенкова и др. / Цитокины и воспаление. 2010. - Т. 9, № 4. – С. 9-15. 15. Кремер, Н.Ш. Теория вероятностей и математическая статистика / Н.Ш. Кремер. – М.: ЮНИТИ-ДАНА, 2004. – 573 с. 16. Кудрявцев, И.В. Многоцветный анализ основных субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток методом проточной цитофлуориметрии / И.В. Кудрявцев, В.П. Савицкий // Российский иммунологический журнал.- 2012.Т. 6(14), № 3(1). - С. 94-97. 17. Кудрявцев, И.В. Т-клетки памяти: основные популяции и стадии дифференцировки / И.В. Кудрявцев // Российский иммунологический журнал.- 2014.- Т. 6(17), №4. - С. 947-964. 18. Лимфоциты : выделение, фракционирование и характеристика : пер. с англ. [Текст] / ред.: Дж. Б. Натвиг, П. Перлманн, Х. Вигзелль. - М. : Медицина, 1980. - 280 с. 19. Луговская С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицын, - M.: 2005. — 166 c. 20. Москалева, Е.Ю. Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программированную гибель. Связь с патологией / Е.Ю. Москалева, С.Е. Северин // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2006. - № 2. - С. 2-14. 21. Новые иммунологические маркеры (CD71, LU-BCRU-G7) взаимосвязанные с прогнозом рака молочной железы / Н.Н. Тупицын, В.П. Летягин, А.В. Паниченко и др. // Современная онкология. – 2001. – Т. 3, №4. – С. 161-163. 22. Олейник, Е.К. Маркеры активации лимфоцитов крови (CD25, CD71, CD95 и HLA-DR) у онкологических больных / Е.К. Олейник, В.М. Олейник, М.И. Шибаев // Гематология и трансфузиология. – 2006. – Т. 51, №1. – C. 18-22. 23. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т- лимфоцитов / Л.С. Литвинова, А.А. Гуцол, Н.А. Сохоневич и др. // Медицинская иммунология. – 2014. - Т. 6, № 1. - С. 7-26. 163 24. Особенности клеточного иммунитета и цитокинового репертуара у пациентов с метаболическим синдромом / Л.С. Литвинова, Е.В. Кириенкова, Н.Н. Аксенова и др. // Бюллетень СибГМУ. – 2012. - № 3. – С. 53-58. 25. Петухов, В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта α-интерферона при хроническом миелолейкозе / В.И. Петухов // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т. 45, № 4. - С. 2933. 26. Поверхностная экспрессия CD25 у лимфоцитов человека на разных стадиях запуска пролиферативного ответа. I. Роль тирозинкиназ семейств JAK и Src по данным ингибиторного анализа / В.В. Зенин, Н.Д. Аксенов, Е.В. Митюшова и др. // Цитология. – 2011. – T. 53, № 8. – С. 645-651. 27. Поверхностная экспрессия CD25 у лимфоцитов человека на разных стадиях запуска пролиферативного ответа. II. Действие интерлейкина-2 / А.Н. Шатрова, В.В. Зенин, Н.Д. Аксенов и др. // Цитология. – 2011. – T. 53, №8. – С. 652-658. 28. Потапнев, М.П. Aпоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М.П. Потапнев // Иммунология. - 2002. - №4. - C. 237-243. 29. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний / М.Н. Норкин, О.Ю. Леплина, М.А. Тихонова и др. // Медицинская иммунология. - 2000. - Т. 2., №1. - С.35-42. 30. Сазонова, Е.В. Механизмы реализации регуляторного влияния интерлейкина-2 на апоптоз лимфоцитов крови. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Е.В. Сазонова. Кемерово, 2010. - 24 с. 31. Самойлова, Р.С. Иммунофенотипическая диагностика хронических лимфопролиферативных заболеваний: опыт практической работы / Р.С. Самойлова, Т.Н. Булычева // Лабораторная диагностика Terra Medica. – 2005. – Т. 8, №4. – С. 27-31. 32. Самуилов, В.Д. Программируемая клетчная смерть / В.Д. Самуилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова // Биохимия. – 2000. – T. 65, №8. – С. 1029-1046. 33. Степанов, Ю.М. Система Fas/Fas-лиганд / Ю.М. Степанов, А.А. Фильченков, Н.Е. Кушлинский, - Дн.: ДИА, 2000. – 48 с. 164 34. Тяжелова, В.Г. Закономерности регулирования митохондриального апоптоза нейтрофилов / В.Г. Тяжелова // Фундаментальные исследования. – 2013. - №8. – C. 108-113. 35. Хайдуков, С.В. Иономицин-резистентная субпопуляция CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови человека. Функциональная характеристика / С.В. Хайдуков, И.С. Литвинов // Биологические мембраны. – 2003. – Т. 20, №4. – С. 333-340. 36. Хайдуков, С.В. Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медикобилогических исследований. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук / С.В. Хайдуков. - Санкт-Петербург, 2008. – 55 с. 37. Хаитов, P.M. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов, - М.: ВНИРО, 1995. - 57 с. 38. Хаитов, Р.М. Иммунология: учебник для студентов медицинских вузов / Р.М. Хаитов. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 311 с. 39. Хаитов, Р.М. Роль паттернраспознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете / Р.М. Хаитов, М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2009. – № 1. – С. 66–74. 40. Хоченков, Д.А. Роль дендритных клеток в иммунном ответе на Тнезависимые антигены типа 2. / Д.А. Хоченков // Биологические мембраны. – 2010. – Т. 27, № 4. – С. 307–313. 41. Чередеев, А.Н. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий / А.Н. Чередеев, Н.К. Горлина, И.Г. Козлов // Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. – № 6. – С. 25-31. 42. Эффекты иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации, пролиферации и апоптотической гибели Т-клеток иммунной памяти in vitro / Л.С. Литвинова, А.А. Гуцол, Н.А. Сохоневич и др. // Цитология. – 2013. – Т. 55, № 8. – С. 566-571. 43. Ярилин А.А. Иммунология. Учебник / А.А. Ярилин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 c. 44. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин, - М.: Медицина, 1999. - 608 с. 45. A function for IL-7R for CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells / A.L. Bayer, J.Y. Lee, A. de la Barrera et al. // J Immunol. – 2008. – Vol. 181(1). – P. 225-234. 165 46. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells / A. Vogelzang, H.M. McGuire, D. Yu et al. // Immunity. – 2008. – Vol. 29(1). P. 127-137. 47. A human memory T cell subset with stem cell-like properties / L. Gattinoni, E. Lugli, Y. Ji et al. // Nat. Med. - 2011. – Vol. 17. – P. 1290–1297. 48. A natural immunological adjuvant enhances T-cell clonal expansion through a CD28-dependent, interleukin (IL)-2-independent mechanism / A. Khoruts, A. Mondino, K.A. Pape et al. //J. Exp. Med. - 1998. – Vol. 187. – P. 225—236. 49. A naturally processed HLA-DR-bound peptide from the IL-9 receptor alpha of HTLV-1-transformed T cellsserves as a T helper epitope / H. Kobayashi, T. Kumai, S. Hayashi et al. // Cancer Immunol Immunother. – 2012. - Vol. 61(12). P. 2215-2225. 50. A novel and effective cancer immunotherapy mouse model using antigen-specific B cells selected in vitro [Electronic resource] / T. Moutai, H. Yamana, T. Nojima et al. // PLoS One. - 2014. – Vol. 9(3). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0092732. 51. A role for apoptosis-inducing factor in T cell development / H. Banerjee, A. Das, S. Srivastava et al. // J Exp Med. – 2012. – Vol. 209(9). – P. 1641-1653. 52. A synaptic basis for paracrine interleukin-2 signaling during homotypic T cell interaction / C.A. Sabatos, J. Doh, S. Chakravarti et al. // Immunity. – 2008. – Vol. 29(2). – P. 238-248. 53. A transmembrane protein-tyrosine phosphatase contains spectrin-like repeats in its extracellular domain / K.S. Fang, K. Barker, M. Sudol et al. // J Biol Chem. – 1994. – Vol. 269(19). – P. 14056-14063. 54. A validated assay to measure soluble IL-7 receptor shows minimal impact of IL-7 treatment / C. Janot-Sardet, B. Assouline, R. Cheynier et al. // J Immunol Methods. - 2010. - Vol. 353(1-2). - P. 115-123. 55. Activated CD69+ T cells foster immune privilege by regulating IDO expression in tumor-associated macrophages / Q. Zhao, D.M. Kuang, Y. Wu et al. // J Immunol. – 2012. – Vol. 188(3). – P. 1117-1124. 56. Activated lymphocytes during acute Epstein-Barr virus infection / B.E. Tomkinson, D.K. Wagner, D.L. Nelson et al. // J Immunol. – 1987. – Vol. 139. – P. 3802-3807. 166 57. Activation interferes with the APO-1 pathway in mature human T cells / C. Klas, K.M. Debatin, R.R. Jonker et al. // Int Immunol. – 1993. – Vol. 5(6). - P. 625-630. 58. Altemus, M. Immune function in PTSD / M. Altemus, F.S. Dhabhar, R. Yang // Ann N Y Acad Sci. – 2006.– Vol. 1071. – Р. 167-83. 59. Alves, N.L. Common γ chain cytokines: dissidence in the details / N.L. Alves, F.A. Arosa, R.A. W. van Lier // Immunology Letters. – 2007. - V. 108 (2). – P. 113–120. 60. An intense form of homeostatic proliferation of naive CD8+ cells driven by IL2 / J.H. Cho, O. Boyman, H.O. Kim et al. // J. Exp. Med. – 2007. – Vol. 204. – P. 1787–1801. 61. Analysis of indoleamine 2-3 dioxygenase (IDO1) expression in breast cancer tissue by immunohistochemistry / H. Soliman, B. Rawal, J. Fulp et al. // Cancer Immunol Immunother. – 2013. – Vol. 62(5). – P. 829-837. 62. Antiviral CD4+ memory T cells are IL-15 dependent / J.F. Purton, J.T. Tan, M.P. Rubinstein et al. // J Exp Med. - 2007. - Vol. 204. - P. 951–961. 63. Astrocytes protect the CNS: antigen-specific T helper cell responses are inhibited by astrocyte-induced upregulation of CTLA-4 (CD152) / U. Gimsa, A. Oren, P. Pandiyan et al. // Journal of Molecular Medicine-Jmm. – 2004. – Vol. 82. – Р. 364–372. 64. Autocrine and paracrine calcium signaling by the CD38/NAD+/Cyclic ADPribose system / A. Flora, E. Zocchi, L. Guida et al. //Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1028. - P. 176-191. 65. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/ CD95) / J. Dhein, H. Walczak, C. Baumler et al. // Nature. – 1995. – Vol. 373. – P. 438–441. 66. Bacterial lipoproteins differentially regulate human primary and memory CD4+ T and B cell responses to pneumococcal protein antigens through Toll-like receptor 2 / Q. Zhang, L. Bagrade, E. Clarke et al. // J Infect Dis. - 2010. - Vol. 201(11).-P. 1753-1763. 67. Banatvala, J. Lifelong protection against hepatitis B: the role of vaccine immunogenicity in immune memory / J. Banatvala, P. Van Damme, S. Oehen // Vaccine. - 2000. - Vol. 19(7-8). - Р. 877-885. 68. Barata, J.T. Interleukin-7 in T-cell acute lymphoblastic leukemia: an extrinsic factor supporting leukemogenesis? / J.T. Barata, A.A. Cardoso, V.A. Boussiotis // Leuk Lymphoma. – 2005. – Vol. 46(4). – P. 483-495. 167 69. Bax-induced cytochrome C release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ ions / R. Eskes, B. Antonsson, A. Osen-Sand et al. // J Cell Biol. – 1998. – Vol. 143. – Р. 217–224. 70. Bayer, A.L. The IL-2/IL-2R system: from basic science to therapeutic applications to enhance immune regulation / A.L. Bayer, A. Pugliese, T.R. Malek // Immunol Res. – 2013. – Vol. 57(1-3). – P. 197-209. 71. Baynes, R.D. Circulating transferrin receptors and assessment of iron status / R.D. Baynes, B.S. Skikne, J.D. Cook // J. Nutr. Biochem. – 1994. – Vol. 5. – Р. 322– 330. 72. Beguin, Y. The soluble transferring receptor: biological aspects and clinical usefulness as quantitative measure of erythropoiesis / Y. Beguin // Hematologica. – 1992. – Vol. 77(1). – Р. 1-10. 73. Bell, E.B. CD4+ T-cell memory, CD45R subsets and the persistence of antigen--a unifying concept / E.B. Bell, S.M. Sparshott, C. Bunce // Immunol Today. – 1998. – Vol.19. – P. 60-64. 74. Benczik, M. The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes / M. Benczik, S.L. Gaffen // Immunol Invest. – 2004. – Vol. 33(2). – P. 109-142. 75. Bim mediates apoptosis of CD127(lo) effector T cells and limits T cell memory / S. Wojciechowski, M.B. Jordan, Y. Zhu et al. // Eur J Immunol. – 2006. - Vol. 36 (7). - P. 1694-1706. 76. Binding and uptake of H-ferritin are mediated by human transferrin receptor-1 / L. Li, C.J. Fang, J.C. Ryan et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010 – Vol. 107(8). – Р. 3505-3510. 77. Biochemical mechanisms of IL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis / Y. Refaeli, L. Van Parijs, C.A. London et al. // Immunity. – 1998. – Vol. 8(5). – P. 615-623. 78. Bouillet, P. CD95, BIM and T cell homeostasis / P. Bouillet, L.A. O'Reilly // Nat Rev Immunol. – 2009. – Vol. 9(7). – P. 514-519. 79. Boyman, O. The role of interleukin2 during homeostasis and activation of the immune system / O. Boyman, J. Sprent // Nat Rev Immunol. – 2012. Vol. 12(3). – P. 180-190. 168 80. Bradley, L.M. IL-7: maintaining T-cell memory and achieving homeostasis / L.M. Bradley, L. Haynes, S.L. Swain // Trends Immunol. – 2005. – Vol. 26. – P. 172176. 81. Brenner, D. Concepts of activated T cell death / D. Brenner, P.H. Krammer, R. Arnold //Crit Rev Oncol Hematol. – 2008. – Vol. 66(1). – P. 52-64. 82. Brincks, E.L. Novel roles for IL-15 in T cell survival / E.L. Brincks, D.L. Woodland // Biol Rep. – 2010. – Vol. 2. – P. 67. 83. Bromley, S.K. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics / S.K. Bromley, S.Y. Thomas, A.D. Luster // Nat Immunol. – 2005. - Vol. 6(9). - Р. 895-901. 84. Buchholz, V.R. The smallest unit: effector and memory CD8(+) T cell differentiation on the single cell level [Electronic resource] / V.R. Buchholz , P. Gräf , D.H. Busch // Front Immunol. – 2013. – Vol. 4(31). - Mode of access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2013.00031/full. 85. Cai, K. Interleukin-7 expression in tears and orbital tissues of patients with Graves' ophthalmopathy / K. Cai, R. Wei // Endocrine. - 2013. - Vol. 44(1). - P. 140-144. 86. Carrette, F. IL-7 signaling and CD127 receptor regulation in the control of T cell homeostasis / F. Carrette, C.D. Surh // Semin Immunol. – 2012. - Vol. 24(3). - P. 209-217. 87. Castillo, E.F. Regulating the immune system via IL-15 transpresentation / E.F. Castillo, K.S. Schluns // Cytokine. – 2012. – Vol. 59(3). – P. 479-490. 88. Cauley, L.S. Guarding the perimeter: protection of the mucosa by tissue-resident memory T cells / L.S. Cauley, L. Lefrançois // Mucosal Immunol. – 2013. – Vol. 6(1). – P. 14-23. 89. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans / J.J. Campbell, K.E. Murphy, E.J. Kunkel et al. // J Immunol. – 2001. – Vol. 166(2). - Р. 877-884. 90. CCR7 signaling inhibits T cell proliferation / E. Ziegler, M. Oberbarnscheidt, S. Bulfone-Paus et al. // J Immunol. – 2007. - Vol. 179(10). - Р. 6485-6493. 91. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells / W. Liu, A.L. Putnam, Z. Xu-Yu et al. // J Exp Med. – 2006. - Vol. 203(7). – P. 1701-1711. 92. CD127+CCR5+CD38+CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of 169 interleukin-2+ memory CD4+ T cells / J.J. Zaunders, W.B. Dyer, M.L. Munier et al. // J Virol. – 2006. -Vol. 80(20). – P. 10151-10161. 93. CD152 (CTLA-4) determines the unequal resistance of Th1 and Th2 cells against activation-induced cell death by a mechanism requiring PI3 kinase function / P. Pandiyan, D. Gartner, O. Soezeri et al. // J Exp Med. – 2004. – Vol. 199. – Р. 831– 842. 94. CD25-expressing CD8+ T cells are potent memory cells in old age / D. HerndlerBrandstetter, S. Schwaiger, E. Veel et al. // J Immunol. – 2005. - Vol. 175(3). - P. 1566-1574. 95. CD27 deficiency is associated with combined immunodeficiency and persistent symp tom atic EBV viremia / J.M. van Montfrans, A.I. Hoepelman, S. Otto et al. // J Allergy Clin Immunol. – 2012. – Vol. 129(3). – P. 787-793. 96. CD38: a new paradigm in lymphocyte activation and signal transduction / F.E. Lund, D.A. Cockayne, T.D. Randall et al. // Immunol Rev.-1998. - Vol. 161. - P. 79-93. 97. CD4 and CD8 T cell immune activation during chronic HIV infection: roles of homeostasis, HIV, type I IFN, and IL-7 / M. Catalfamo, C. Wilhelm, L. Tcheung et al. // J Immunol. - 2011. - Vol. 186(4). - P. 2106-2116. 98. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood / C. BaecherAllan, J.A. Brown, G.J. Freeman et al. //J Immunol. – 2001. – Vol. 167(3). – P. 1245-1253. 99. CD45 isoform expression on human neonatal T cells: expression and turnover of CD45 isoforms on neonatal versus adult T cells after activation / A. Yamada, T. Kaneyuki, A. Hara et al. // Cell Immunol. - 1992. – Vol. 142(1). – P. 114–124. 100. CD45 isoforms expression on CD4+ and CD8 +T cells throughout life, from newborns to centenarians: implications for T cell memory / A. Cossarizza, C. Ortolani, R. Paganelli et al. // Mech. Ageing Dev. - 1996. – Vol. 86. – P. 173– 195. 101. CD45RA on human CD8 T cells is sensitive to the time elapsed since the last antigenic stimulation / J. Carrasco, D. Godelaine, A. Van Pel et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108. – P. 2897-2905. 102. CD69 association with Jak3/Stat5 proteins regulates Th17 cell differentiation / P. Martín, M. Gómez, A. Lamana et al. // Mol Cell Biol. – 2010. – Vol. 30(20). – P. 4877-4889. 170 103. CD73 expression is dynamically regulated in the germinal center and bone marrow plasma cells are diminished in its absence [Electronic resource] / L.J. Conter, E. Song, M.J. Shlomchik et al. // PLoS One. – 2014. – Vol. 9(3). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0092009. 104. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability / G.J. van der Windt, D. O'Sullivan, B. Everts et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2013. – Vol. 110(35). – P. 14336-14341. 105. Cellular and molecular mechanisms of memory T-cell survival / A. Tanel, S.G. Fonseca, B. Yassine-Diab et al. // Expert Rev. Vaccines. - 2009. - Vol. 8. - P. 299312. 106. Central memory CD4+ T cells dominate the normal cerebrospinal fluid / M.T. de Graaf, P.A. Smitt, R.L. Luitwieler et al. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2011. – Vol. 80. – P. 43–50. 107. Chan, T.D. Affinity-based selection and the germinal center response / T.D. Chan, R. Brink // Immunol Rev. – 2012. – Vol. 247(1). – P. 11-23. 108. Chang, J.T. Molecular regulation of effector and memory T cell differentiation / J.T. Chang, E.J. Wherry, A.W. Goldrath // Nat Immunol. – 2014. – Vol. 15(12). – P. 1104-1115. 109. Changes in CD69, CD25 and HLA-DR expressions in peripheral blood T cells in Kawasaki disease / Y.Y. Zhang, X.M. Huang, M.L. Kang et al. // Zhonghua Er Ke Za Zhi. – 2006. – Vol. 44(5). – P. 329-332. 110. Characteristics of acute myeloid leukemia without HLA-DR expression / H. Moon, S. Lee, J. Huh et al. // Korean J Lab Med. – 2007. – Vol. 27(5). – P. 313317. 111. Chatila, T.A. Role of regulatory T cells in human diseases / T.A. Chatila // J Allergy Clin Immunol. – 2005. – Vol. 116(5). – P. 949-959. 112. Chehtane, M. Interleukin-7 mediates glucose utilization in lymphocytes through transcriptional regulation of the hexokinase II gene / M. Chehtane, A.R. Khaled // Am J Physiol Cell Physiol. - 2010. - Vol. 298(6). – P. 1560-15671. 113. Chijioke, O. Dendritic cell derived cytokines in human natural killer cell differentiation and activation [Electronic resource] / O. Chijioke, C. Münz // Front Immunol. – 2013. – Vol. 4. – Mode of access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2013.00365/full. 171 114. Competition for self ligands restrains homeostatic proliferation of naive CD4 T cells / C.T. Moses, K.M. Thorstenson, S.C. Jameson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100. – P. 1185–1119. 115. Control of homeostasis of CD8+ memory T cells by opposing cytokines. / C.C. Ku, M. Murakami, A. Sakamoto et al. // Science. - 2000. – Vol. 288. – P. 675— 678. 116. Control of lymphocyte recirculation in man. I. Differential regulation of the peripheral lymph node homing receptor L-selectin on T cells during the virgin to memory cell transition / L. J. Picker, J. R. Treer, B. Ferguson-Darnell et al. // J. Immunol. - 1993. – Vol. 150. – P. 1105–1121. 117. Convergence of TCR and cytokine signaling leads to FOXO3a phosphorylation and drives the survival of CD4 +central memory T cells / C. Riou, B. YassineDiab, J. Van Grevenynghe et al. // J. Exp. Med. - 2007. – Vol. 204. – P. 79–91. 118. Coordinate expression of beta 1 and beta 2 integrin "activation" epitopes during T cell responses in secondary lymphoid tissue / L.J. Picker, J.R. Treer, M. Nguyen et al. // Eur J Immunol. – 1993. – Vol. 23(11). – P. 2751-2757. 119. Cope, A.P. Immune-mediated pathways in chronic inflammatory arthritis / A.P. Cope, C.L. Gorman // Best Pract Res Clin Rheumatol. – 2008. – Vol. 22(2). – P. 221-38. 120. Coupled IL-2-dependent extracellular feedbacks govern two distinct consecutive phases of CD4 T cell activation / N. Waysbort, D. Russ, B.M. Chain et al. // J Immunol. – 2013. – Vol. 191(12). – P. 5822-5830. 121. Crawley, A.M. The influence of HIV on CD127 expression and its potential implications for IL-7 therapy / A.M. Crawley, J.B. Angel // Semin Immunol. – 2012. – Vol. 24(3). – P. 231-240. 122. Crispe, I. N. Selective activation of Lyt 2+precursor T cells by ligation of the antigen receptor / I. N. Crispe, M. J. Bevan, U. D. Staerz // Nature. - 1985. – Vol. 317. – P. 627-629. 123. Critical Role of STAT5 transcription factor tetramerization for cytokine responses and normal immune function / J.X. Lin, P. Li, D. Liu et al. // Immunity. – 2012. – Vol. 36(4). – P. 586-599. 124. Crotty, S. Immunological memory in humans / S. Crotty, R. Ahmed // Seminars in Immunology. – 2004. – Vol. 16(3). – P. 197–203. 172 125. Crystal structure of the IL-2 signaling complex: paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor / D.J. Stauber, E.W. Debler, P.A. Horton et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2006. – Vol. 103(8). – P. 2788-2793. 126. CTLA-4 (CD152) controls homeostasis and suppressive capacity of regulatory T cells in mice / P. Kolar, K. Knieke, J.K. Hegel et al. // Arthritis Rheum. – 2009. – Vol. 60. – P. 123–132. 127. CTLA-4-Mediated inhibition of early events of T cell proliferation / M.C. Brunner, C.A. Chambers, F.K. Chan et al. // J Immunol. – 1999. – Vol.162. – Р. 5813–5820. 128. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses / K.E. Foulds, L.A. Zenewicz, D.J. Shedlock et al. // J Immunol. – 2002. – Vol. 168(4). – P. 1528-1532. 129. Cutting edge: IL-7-independent regulation of IL-7 receptor alpha expression and memory CD8 T cell development / K.D. Klonowski, K.J. Williams, A.L. Marzo et al. //J Immunol. – 2006. – Vol. 177(7). – P. 4247-4251. 130. Cytokine synergy in antigen-independent activation and priming of naive CD8+ T lymphocytes / S. Ramanathan, J. Gagnon, S. Dubois et al. // Crit Rev Immunol. – 2009. – Vol. 29(3). – P. 219-239. 131. Cytokines and T-cell homeostasis / O. Boyman, J.F. Purton, C.D. Surh et al. /Curr Opin Immunol. – 2007. – Vol. 19(3). – P. 320-326. 132. Cytomegalovirus infection induces the accumulation of short-lived, multifunctional CD4+CD45RA+CD27+ T cells: the potential involvement of interleukin-7 in this process / V. Libri, R.I. Azevedo, S.E. Jackson et al. // Immunology. – 2011. – Vol. 132. – P. 326–339. 133. D'Cruz, L.M. Surviving the crash: transitioning from effector to memory CD8+ T cell / L.M. D'Cruz, M.P. Rubinstein, A.W. Goldrath // Semin Immunol. – 2009. – Vol. 21(2). – P. 92-98. 134. Deficiency of naive T cells in patients with sudden deafness / J.R. GarcíaBerrocal, J.A. Vargas, R.A. Ramírez-Camacho et al. // Arch Otolaryngol Head Neck Surg. – 1997. – Vol. 123(7). – Р. 712-714. 135. Dendritic cells drive memory CD8 T cell homeostasis via IL-15 trans-presentation / S.W. Stonier, L.J. Ma, E.F. Castillo et al. // Blood. – 2008. - Vol. 112(12). – P. 4546–4554. 173 136. Deng, X.M. IL-21 acts as a promising therapeutic target in systemic lupus erythematosus by regulating plasma cell differentiation / X.M. Deng, S.X. Yan, W. Wei // Cell Mol Immunol. – 2015. – Vol. 12(1). – P. 31-39. 137. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15 / G.H. Cornish, L.V. Sinclair, D.A. Cantrell // Blood. – 2006. – Vol. 108(2). – P. 600-608. 138. Differential roles of interleukin 15 mRNA isoforms generated by alternative splicing in immune responses in vivo / H. Nishimura, T. Yajima, Y. Naiki et al. // Exp Med. – 2000. – Vol. 191(1). – P. 157-170. 139. Differential sensitivity of human naive and memory CD4+ T cells for dexamethasone / E.W. Nijhuis, B. Hinloopen, R.A. van Lier et al // Int Immunol. – 1995. - V. 7(4). – P. 591-595. 140. Direct stimulation of human T cells via TLR5 and TLR7/8: flagellin and R-848 upregulate proliferation and IFN-gamma production by memory CD4+ T cells / G. Caron, D. Duluc, I. Fremaux et al. // J. Immunol. – 2005. – Vol.175. – P.1551–1557. 141. Disengaging the IL-2 receptor with daclizumab enhances IL-7-mediated proliferation of CD4(+) and CD8(+) T cells / P. Monti, C. Brigatti, A.K. Heninger et al. // Am J Transplant. – 2009. - Vol. 9(12). – P. 2727-2735. 142. Distinct functions of autoreactive memory and effector CD4+ T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis / W. Elyaman, P. Kivisäkk, J. Reddy et al. // Am J Pathol. – 2008. – Vol. 173(2). – P. 411-422. 143. Distinct regions of the interleukin-7 receptor regulate different Bcl2 family members / Q. Jiang, W.Q. Li, R.R. Hofmeister et al. // Mol Cell Biol. – 2004. – Vol. 24(14). – P.6501-6513. 144. Diversity of clonal T cell proliferation is mediated by differential expression of CD152 (CTLA-4) on the cell surface of activated individual T lymphocytes / F. Maszyna, H. Hoff, D. Kunkel et al. // J Immunol. – 2003. –Vol. 171. – P. 3459– 3466. 145. Dooms, H. Revisiting the role of IL-2 in autoimmunity / H. Dooms, A.K. Abbas // Eur J Immunol. – 2010. – V. 40(6). – P. 1538-1540. 146. Dörner, T. B cells in autoimmunity / T. Dörner, A.M. Jacobi, P.E. Lipsky //Arthritis Res Ther. - 2009. - Vol. 11(5). - P. 247-260. 147. Down-regulation of CD28 expression by TNF-alpha / E. Bryl, A.N. Vallejo, C.M. Weyand, J.J. Goronzy // J Immunol. – 2001. – Vol. 167. – P. 3231-3238. 174 148. Drappa, J. The Fas protein is expressed at high levels on CD41CD81 thymocytes and activated mature lymphocytes in normal mice but not in the lupus-prone strain, MRL lpr/lpr / J. Drappa, N. Brot, K. Elkon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – Vol. 90(21). – Р. 10340–10344. 149. Dual-reactive B cells are autoreactive and highly enriched in the plasmablast and memory B cell subsets of autoimmune mice / E.M. Fournier, M.G. Velez, K. Leahy et al. // Exp Med. – 2012. – Vol. 209(10). – P. 1797-1812. 150. Duration of CTL activation regulates IL-2 production required for autonomous clonal expansion / D.C. Spierings, E.E. Lemmens, K. Grewal et al. // Eur J Immunol. – 2006. – Vol. 36. – P. 1707-1717. 151. Dynamic analysis of CD127 expression on memory CD8 T cells from patients with chronic hepatitis B during telbivudine treatment [Electronic resource] / G. Lv, L. Ying, W.J. Ma et al. // Virol J. - 2010 - Vol.7(207). - Mode of access: http://www.virologyj.com/content/7/1/207. 152. Early lymphocyte expansion is severely impaired in interleukin 7 receptor-deficient mice / J.J. Peschon, P.J. Morrissey, K.H. Grabstein et al. // J. Exp. Med. 1994. – Vol. 180. – P. 1955–1960. 153. Ecto-5'-nucleotidase (CD73) -mediated extracellular adenosine production plays a critical role in hepatic fibrosis / Z. Peng, P. Fernandez, T. Wilder et al. // FASEB J. – 2008. – Vol. 22(7). – P. 2263-2272. 154. Ectonucleotidase CD38 demarcates regulatory, memory-like CD8+ T cells with IFN-γ-mediated suppressor activities [Electronic resource] / R. Bahri, A. Bollinger, T. Bollinger et al. // PLoS One. – 2012. - Vol.7 (9). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0045234. 155. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes / N. Manjunath, P. Shankar, J. Wan et al. // J. Clin. Invest. – 2001. – Vol. 108. – P. 871–878. 156. Effects of recombinant human interleukin 7 on T-cell recovery and thymic output in HIV-infected patients receiving antiretroviral therapy: results of a phase I/IIa randomized, placebo-controlled, multicenter study / Y. Lévy, I. Sereti, G. Tambussi et al. // Clin Infect Dis. - 2012. – Vol. 55(2). – P. 291-300. 157. Egen, J.G. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 accumulation in the immunological synapse is regulated by TCR signal strength / J.G. Egen, J.P. Allison // Immunity. – 2002. – Vol. 16. – Р. 23–35. 175 158. Eicher, D.M. Oligomerization of IL-2Ralpha / D.M. Eicher, S. Damjanovich, T.A. Waldmann // Cytokine. – 2002. – Vol. 17(2). – P. 82-90. 159. Elevated IL-7 availability does not account for T cell proliferation in moderate lymphopenia / L.C. Osborne, D.T. Patton, J.H. Seo et al. // J Immunol. - 2011. Vol. 186(4). - P. 1981-1988. 160. Elevated levels of circulating IL-7 and IL-15 in patients with early stage prostate cancer / C. Mengus, C. Le Magnen, E. Trella et al. // J Transl Med. - 2011. - Vol. 9. - P. 162-172. 161. Ellery, J.M. Possible mechanism for the alpha subunit of the interleukin-2 receptor (CD25) to influence interleukin-2 receptor signal transduction / J.M. Ellery, P.J. Nicholls // Immunol. Cell Biol. - 2002. – Vol. 80. – P. 351—359. 162. Elucidation of the interleukin-15 binding site on its alpha receptor by NMR / N.A. Hanick, M. Rickert, L. Varani et al. // Biochemistry. - 2007. – Vol. 46(33). – P. 9453-9461. 163. Emergence of a CD4+CD28- granzyme B+, cytomegalovirus-specific T cell subset after recovery of primary cytomegalovirus infection / E.M. van Leeuwen, E.B. Remmerswaal, M.T. Vossen, et al. // J Immunol. – 2004. - Vol. 173. – P. 1834-1841. 164. Enhanced CD4+ T cell proliferation and Th2 cytokine production in DR6deficient mice / J. Liu, S. Na, A. Glasebrook et al. // Immunity. - 2001. – Vol. 15(1). – P. 23-34. 165. Enhanced signaling through the IL-2 receptor in CD8+ T cells regulated by antigen recognition results in preferential proliferation and expansion of responding CD8+ T cells rather than promotion of cell death / L.E. Cheng, C. Ohlén, B.H. Nelson et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2002. – Vol. 99(5). – P. 3001-3006. 166. Epigenetic remodeling of the IL-2 and IFN-g loci in memory CD8 T cells is influenced by CD4 T cells / J.K. Northrop, R.M. Thomas, A.D. Wells et al. // J Immunol – 2006. – Vol. 177. – P. 1062-1069. 167. Epstein-Barr virus-specific CD8(+) T cells that re-express CD45RA are apoptosisresistant memory cells that retain replicative potential / P.J. Dunne, J.M. Faint, N.H. Gudgeon et al. // Blood. – 2002. – Vol. 100. – P. 933-940. 168. Ets-1 maintains IL-7 receptor expression in peripheral T cells / R. Grenningloh, T.S. Tai, N. Frahm et al. // J Immunol. - 2011. - Vol. 186(2). - P. 969-976. 176 169. Evaluation of the IL2/IL21, IL2RA and IL2RB genetic variants influence on the endogenous non-anterior uveitis genetic predisposition [Electronic resource] / M.C. Cénit, A. Márquez, M. Cordero-Coma et al. // BMC Med Genet. – 2013. – Vol. 14 - Mode of access: http://www.biomedcentral.com/1471-2350/14/52. 170. Evidence of a novel IL-2/15R beta-targeted cytokine involved in homeostatic proliferation of memory CD8+ T cells / D. Kamimura, N. Ueda, Y. Sawa et al. // J. Immunol. – 2004. – Vol. 173(10). – P. 6041—6049. 171. Ex vivo characterization of human CD8+ T subsets with distinct replicative history and partial effector functions / N. Rufer, A. Zippelius, P. Batard, et al. // Blood. – 2003. – Vol. 102(5). – P. 1779-1787. 172. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells / J.M. Brenchley, N.J. Karandikar, M.R. Betts et al., // Blood. - 2003. – Vol. 101. – P. 2711–2720. 173. Expression of the interleukin-7 receptor alpha chain (CD127) on virus-specific CD8+ T cells identifies functionally and phenotypically defined memory T cells during acute resolving hepatitis B virus infection / T. Boettler, E. Panther, B. Bengsch et al. // J Virol. – 2006. - Vol. 80(7). - P. 3532-3540. 174. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated Tcells / N. Seddiki, B Santner-Nanan, J. Martinson et al. // J Exp Med. – 2006. - Vol. 203(7). – P. 1693-1700. 175. Faller, E.M. IL-7 Receptor Recovery on CD8 T-Cells Isolated from HIV+ Patients Is Inhibited by the HIV Tat Protein [Electronic resource] / E.M. Faller, M.J. McVey, P.A. MacPherson // PLoS One. – 2014. – Vol. 9(7). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0102677. 176. Farber, D.L. Biochemical signaling pathways for memory T cell recall / D.L. Farber // Semin. Immunol. — 2009. — Vol. 21(2). — P. 84–91. 177. Farber, D.L. Human memory T cells: generation, compartmentalization and homeostasis / D.L. Farber, N.A. Yudanin, N.P. Restifo // Nat Rev Immunol. – 2014. – Vol. 14(1). – P. 24-35. 177 178. Fehniger, T.A. Ontogeny and expansion of human natural killer cells: clinical implications / T.A. Fehniger, M.A. Caligiuri //Int Rev Immunol. – 2001. – Vol. 20(3-4). – P. 503-534. 179. Ferrero E. The making of a leukocyte receptor: origin, genes and regulation of human CD38 and related molecules / E. Ferrero // Chem. Immunol. - 2000. - Vol. 75. - P. 1-19. 180. Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence / D. Stites, C. Casavant, T. McHugh et al. // Clin Immunol Immunopathol. – 1986. – Vol. 38. – P. 161-177. 181. Follicular helper T cells: new insights into mechanisms of autoimmune diseases / X. Zhang, S. Ing, A. Fraser et al. // Ochsner J. – 2013. – Vol. 13(1). – P. 131-139. 182. Förster, R. CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance / R. Förster, A.C. Davalos-Misslitz, A. Rot // Nat Rev Immunol. – 2008. - Vol. 8(5). - Р. 362371. 183. Four functionally distinct populations of human effector-memory CD8+ T lymphocytes / P. Romero, A. Zippelius, I. Kurth et al. // J. Immunol. - 2007. – Vol. 178. – P. 4112–4119. 184. Fry, T.J. The many faces of IL-7: from lymphopoiesis to peripheral T cell maintenance / T.J. Fry, C. L. Mackall // J. Immunol. - 2005. – Vol. 174. – P. 6571–6576. 185. Fry, T.J., Interleukin-7: master regulator of peripheral T-cell homeostasis? / T. J. Fry, C.L. Mackall // Trends Immunol. - 2001. – Vol. 22. – P. 564–571. 186. Function of CD27 in helper T cell differentiation / S. Libregts, R.W. van Olffen, K.F. van der Sluijs et al. // Immunol Lett. – 2011. – Vol. 136(2) – P. 177-186. 187. Functional consequences of APO-1/Fas (CD95) antigen expression by normal and neoplastic hematopoietic cells / M.J. Robertson, T.J. Manley, G. Pichert et al. // Leuk Lymphoma. – 1995. – Vol. 17(1-2). – P. 51-61. 188. Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells / J. Clausen, B. Vergeiner, M. Enk // Immunobiology. – 2003. – Vol. 207(2). – P. 85-93. 189. Functionally competent antigen-specific CD127(hi) memory CD8+ T cells are preserved only in HIV-infected individuals receiving early treatment / S. Sabbaj, S.L. Heath, A. Bansal et al. // J Infect Dis. – 2007. - Vol. 195(1). - P. 108-117. 178 190. Gaffen, S.L. Signaling domains of the interleukin 2 receptor / S.L. Gaffen // Cytokine. – 2001. – Vol. 14(2). – P. 63-77. 191. Gamma chain required for naive CD4+ T-cell survival but not for antigen proliferation / O. Lantz, I. Grandjean, P. Matzinger et al. // Nature Immunol. – 2000. – Vol. 1(1). – P. 54-58. 192. Geginat, J. Cytokine-driven proliferation and differentiation of human naive, central memory, and effector memory CD4(+) T cells / J. Geginat, F. Sallusto, A. Lanzavecchia // J Exp Med. - 2001. – Vol. 194(12). – P. 1711–1719. 193. Geginat, J. Proliferation and differentiation potential of human CD8+ memory T-cell subsets in response to antigen or homeostatic cytokines / J. Geginat, A. Lanzavecchia, F. Sallusto // Blood. – 2003. – Vol. 101. – P. 4260-4426. 194. Goldrath, A.W. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis-driven proliferation / A.W. Goldrath, L.Y. Bogatzki, M.J. Bevan // J Exp Med. – 2000. – Vol. 192. – P. 557-564. 195. Gong, C. Harnessing the heterogeneity of T cell differentiation fate to fine-tune generation of effector and memory T cells [Electronic resource] / C. Gong, J.J. Linderman, D. Kirschner // Front Immunol. – 2014. – Vol. 5(57). - Mode of access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2014.00057/full. 196. Graca, L. Identification of regulatory T cells in tolerated allografts / L. Graca, S.P. Cobbold // J Exp Med. – 2002. – Vol. 195(12). – P. 1641-1646. 197. Gupta, S. CD95-mediated apoptosis in naïve, central and effector memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in aged humans / S. Gupta, S. Gollapudi // Exp Gerontol. -2008. - Vol. 43(4). - P. 266-274. 198. Hamel, K.M. Germinal center B-cells / K.M. Hamel, V.M. Liarski, M.R. Clark // Autoimmunity. – 2012. – Vol. 45(5). – P. 333-347. 199. Harari, A. Phenotypic heterogeneity of antigen-specific CD4 T cells under different conditions of antigen persistence and antigen load / A. Harari, F. Vallelian, G. Pantaleo // Eur J Immunol. – 2004. –Vol. 34. – P. 3525-3533. 200. Hasegawa A. [Role of CD69 in the pathogenesis of inflammation] / A. Hasegawa, T. Nakayama // Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi. – 2010. – Vol. 33(4). – P. 189-195. 201. Hassan, J. Human recent thymic emigrants--identification, expansion, and survival characteristics / J. Hassanm, D.J. Reen // J Immunol. – 2001. – Vol. 167. – P. 1970-1976. 179 202. Henson, S.M. KLRG1–more than a marker for T cell senescence / S.M. Henson, A.N. Akbar // Age (Dordr). - 2009. – Vol. 31. – P. 285–291. 203. Heterogeneity of the circulating human CD4+ T cell population. Further evidence that the CD4+CD45RACD27- T cell subset contains specialized primed T cells / P.A. Baars, M.M. Maurice, M. Rep et al. // J Immunol. – 1995. – Vol. 154. - P. 1725. 204. HLA-DR-mediated apoptosis susceptibility discriminates differentiation stages of dendritic/monocytic APC / N. Bertho, B. Drénou, B. Laupeze et.al. // J Immunol. – 2000. – Vol. 164(5). – P. 2379-2385. 205. Homeostasis of memory T cells / C.D. Surh, O. Boyman, J.F. Purton et al. // Immunol Rev. – 2006. – Vol. 211. – P. 154-163. 206. Homeostasis of naive and memory CD4+ T cells: IL-2 and IL-7 differentially regulate the balance between proliferation and Fas-mediated apoptosis / S. Jaleco, L. Swainson, V. Dardalhon et al. // J Immunol. - 2003. – Vol. 171(1). - P. 61–68. 207. Homeostasis of peripheral CD4+ T cells: IL-2R alpha and IL-2 shape a population of regulatory cells that controls CD4+ T cell numbers / A.R. Almeida, N. Legrand, M. Papiernik et al. // J Immunol. - 2002. - Vol. 169 (9). - P. 4850-4860. 208. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells / B.K. Cho, V.P. Rao, Q. Ge et al. // J Exp Med. – 2000. – Vol. 192. – P. 549-556. 209. Homeostatic control of T-cell generation in neonates / S.O. Schonland, J.K. Zimmer, C.M. Lopez-Benitez et. al. // Blood. – 2003. – Vol. 102(4). – P. 1428– 1434. 210. Homeostatic maintenance of natural Foxp3+ CD25+ CD4+ regulatory T cells by interleukin (IL)2 and induction of autoimmune disease by IL2 neutralization / R. Setoguchi, S. Hori, T. Takahashi et al. // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201. – P. 723–735. 211. Homeostatic proliferation and survival of naı¨ve and memory T cells / O. Boyman, S. Le´tourneau, C. Krieg et al. // Eur. J. Immunol. - 2009. – Vol. 39. – P. 2088– 2094. 212. Huang, W. The signaling symphony: T cell receptor tunes cytokine-mediated T cell differentiation / W. Huang, A. August // J Leukoc Biol. – 2015. – Vol. 97(3). – P. 477-485. 180 213. Human CD4(+)CD25(+) regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10-producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells [corrected] / D. Dieckmann, C.H. Bruett, H. Ploettner et al. // J Exp Med. - 2002. – Vol.196(2). – P. 247-253. 214. Human IL2RA null mutation mediates immunodeficiency with lymphoproliferation and autoimmunity / K. Goudy, D. Aydin, F. Barzaghi et al. // Clin Immunol. - 2013. - Vol. 146(3). - P. 248-261. 215. Human monocytes have increased IFN-γ-mediated IL-15 production with age alongside altered IFN-γ receptor signaling / N. Lee, M.S. Shin, K.S. Kang et al. // Clin Immunol. - 2014. - Vol. 152(1-2). - P. 101-110. 216. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death / W.J. Grossman, J.W. Verbsky, W. Barchet et al. // Immunity. – 2004. – Vol. 21(4). – P. 589-601. 217. Identification and clinical relevance of naturally occurring human CD8+HLADR+ regulatory T cells / L. Arruvito, F. Payaslián, P. Baz et al. // J Immunol. – 2014. – Vol. 193(9). – P. 4469-4476. 218. Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood / H. Jonuleit, E. Schmitt, M. Stassen et al. // J Exp Med. – 2001. - Vol. 193(11). - P. 1285-1294. 219. IgM memory B cells: a mouse/human paradox / C.A. Reynaud, M. Descatoire, I. Dogan et al. // Cell Mol Life Sci. – 2012. – Vol. 69(10). – P. 1625-1634. 220. IL-15 availability conditions homeostasis of peripheral natural killer T cells / T. Ranson, C.A. Vosshenrich, E. Corcuff et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2003. – Vol. 100(5). – P. 2663–2668. 221. IL-15 enhances survival and function of HIV-specific CD8+ T cells / Y.M. Mueller, P.M. Bojczuk, E.S. Halstead et al. // Blood. – 2003. – Vol. 101(3). – P. 1024–1029. 222. IL-15 induces antigen-independent expansion and differentiation of human naive CD8+ T cells in vitro / N.L. Alves, B. Hooibrink, F.A. Arosa et al. // Blood. – 2003. – Vol. 102. – P. 2541–2546. 223. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates / L.J. Picker, E.F. Reed-Inderbitzin, S.I. Hagen et al. // J. Clin. Invest. - 2006. – Vol. 116. – P. 1514–1524. 181 224. IL-15 mimics T cell receptor crosslinking in the induction of cellular proliferation, gene expression, and cytotoxicity in CD8+ memory T cells / K. Liu, M. Catalfamo, Y. Li et al.// Proc Natl Acad Sci USA. – 2002. – Vol. 99. – P. 61926197. 225. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation / J.P. Lodolce, D.L. Boone, S. Chai et al. // Immunity. – 1998. – Vol. 9(5). – P. 669-676. 226. IL-2- and CD25-dependent immunoregulatory mechanisms in the homeostasis of T-cell subsets / S. Létourneau, C. Krieg, G. Pantaleo et al. // Allergy Clin Immunol. – 2009. – Vol. 123(4). – P. 758-762. 227. IL-2 and IL-7 determine the homeostatic balance between the regulatory and conventional CD4+ T cell compartments during peripheral T cell reconstitution / A. Le Campion, A. Pommier, A. Delpoux et al. // J Immunol. – 2012. – Vol. 189(7). – P. 3339-3346. 228. IL-2 is positively involved in the development of colitogenic CD4+ IL-7R alpha high memory T cells in chronic colitis / K. Kameyama, Y. Nemoto, T. Kanai et al. // Eur J Immunol. – 2010. – Vol. 40(9). – P. 2423-2436. 229. IL-21 Promotes Germinal Center Reaction by Skewing the Tfr/Tfh Balance in Autoimmune BXD2 Mice / Y. Ding, J. Li, P. Yang et al. // Arthritis Rheumatol. – 2014. – Vol. 66(9). – P. 2601-2612. 230. IL-7 administration alters the CD4:CD8 ratio, increases T cell numbers, and increases T cell function in the absence of activation / L.A. Geiselhart, C.A. Humphries, T.A. Gregorio et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol.166. – P. 3019– 3027. 231. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors / N. Cieri, B. Camisa, F. Cocchiarella et al. // Blood. – 2013. – Vol. 121(4). – P. 573-584. 232. IL-7 differentially regulates cell cycle progression and HIV-1-based vector infection in neonatal and adult CD4+ T cells / V. Dardalhon, S. Jaleco, S. Kinet, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98(16). – P. 9277-9282. 233. IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T cells / J.T. Tan, E. Dudl, E. LeRoy et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2001. - Vol. 98(15). – P. 8732-8737. 182 234. IL-7 promotes CD95-induced apoptosis in B cells via the IFN-γ/STAT1 pathway [Electronic resource] / S. Sammicheli, V.P. Dang, N. Ruffin et al. // PLoS One. 2011. - Vol. 6(12). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0028629. 235. IL-7 restores lymphocyte functions in septic patients / F. Venet, A.P. Foray, A. Villars-Méchin et al. // J Immunol. - 2012. - Vol. 189(10). - P. 5073-5081. 236. Immunobiology: the immune system in health and disease. 6th edition / Ch. Janeway, P. Travers, M. Walport et al. // Publisher: Garland, 2004. - 635 p. 237. Immunophenotype and gene expression profiles of cell surface markers of mesenchymal stem cells derived from equine bone marrow and adipose tissue / B. Ranera, J. Lyahyai, A. Romero // Vet Immunol Immunopathol. – 2011. – Vol. 144(1-2). – P. 147-154. 238. Immunotherapeutic applications of IL-15 / M. Croce, A.M. Orengo, B. Azzarone et al. // Immunotherapy. - 2012. – Vol. 4(9). – P. 957-969. 239. Impaired survival and proliferation in IL-7 receptor-deficient peripheral T cells / E. Maraskovsky, M. Teepe, P.J. Morrissey et al. // J. Immunol. – 1996. – Vol. 157. – P. 5315–5323. 240. In vitro generated human memory-like T cells are CD95 type II cells and resistant towards CD95-mediated apoptosis / S.C. Fas, S. Baumann, A. Krueger et al. // Eur. J. Immunol. – 2006. - Vol. 36(11). – P. 2894-2903. 241. In vitro responses of human CD45RObrightRA– and CD45RO–RAbright T cell subsets and their relationship to memory and naive T cells / J.L. Young, J.M. Ramage, J.S. Gaston et al. //Eur. J. Immunol.- 1997. – Vol. 27. – P. 2383–2390. 242. In vivo evidence for a dependence on interleukin 15 for survival of natural killer cells / M.A. Cooper, J.E. Bush, T.A. Fehniger et al. // Blood. - 2002. - Vol. 100 (10). - P. 3633-3638. 243. Increased CD127 expression on activated FOXP3+CD4+ regulatory T cells / F. Simonetta, A. Chiali, C. Cordier et al. // Eur J Immunol. – 2010. - Vol. 40(9). – P. 2528-2538. 244. Insulin-dependent diabetes induced by pancreatic beta cell expression of IL-15 and IL-15Rα / J. Chen, L. Feigenbaum, P. Awasthi et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2013. - Vol. 110(33). - P. 13534-13539. 183 245. Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virus-specific memory CD8 T cells / T.C. Becker, E.J. Wherry, D. Boone et al. // J Exp Med. – 2002. – Vol. 195(12). – P. 1541–1548. 246. Interleukin 2 receptor gamma chain expression on resting and activated lymphoid cells / T. Nakarai, M.J. Robertson, M. Streuli et al. // J. Exp. Med. -1994. – Vol. 181(1) – P. 241–251. 247. Interleukin 7 regulates the survival and generation of memory CD4 cells / R.M. Kondrack, J. Harbertson, J.T. Tan et al. // J Exp Med. – 2003. – Vol. 198(12). – P. 1797-1806. 248. Interleukin-2 and inflammation induce distinct transcriptional programs that promote the differentiation of effector cytolytic T cells / M. E. Pipkin, J. A. Sacks, F. Cruz-Guilloty et al. // Immunity. - 2010. – Vol. 32(1). - P. 79–90. 249. Interleukin-2 enhances CD4+ T cell memory by promoting the generation of IL7R alpha-expressing cells / H. Dooms, K. Wolslegel, P. Lin et al. //J Exp Med. – 2007. – Vol. 204(3). – P. 547-557. 250. Interleukin-2 gene variation impairs regulatory T cell function and causes autoimmunity / J. Yamanouchi, D. Rainbow, P. Serra et al. // Nat Genet. – 2007. – Vol. 39(3). – P. 329-337. 251. Interleukin-2 in the development and control of inflammatory disease / K.K. Hoyer, H. Dooms, L. Barron et al. // Immunol Rev. – 2008. - Vol. 226. – P. 19-28. 252. Interleukin-2 receptor signaling in regulatory T cell development and homeostasis / M.A. Burchill, J. Yang, K.B. Vang et al. // Immunol Lett. - 2007. –Vol. 114(1). – P. 1-8. 253. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naïve and memory CD8 T cells in vivo / K.S. Schluns, W.C. Kieper, S.C. Jameson et al. // Nat Immunol. – 2000. – Vol. 1(5). – P. 426-432. 254. Inverse expression of bcl-2 protein and Fas antigen in lymphoblasts in peripheral lymph nodes and activated peripheral blood T and B lymphocytes / T. Yoshino, E. Kondo, L. Cao et al. // Blood. – 1994. – Vol. 83(7). – Р. 1856–1861. 255. Involvement of p21ras activation in T cell CD69 expression / D. D'Ambrosio, D.A. Cantrell, L. Frati et al. // Eur J Immunol. – 1994. – Vol. 24(3). – P. 616-620. 184 256. Is CD69 an effective brake to control inflammatory diseases? / R. GonzálezAmaro, J.R. Cortés, F. Sánchez-Madrid et al. // Trends Mol Med. – 2013. – Vol. 19(10). – P. 625-632. 257. Janeway, C. A. Immunobiology: The immune system in health and disease / C. A. Janeway, P. Travers. - London: Current Biology Ltd, 1994. – P. 1-28. 258. Joly, M. Modeling interleukin-2-based immunotherapy in AIDS pathogenesis / M. Joly, D. Odloak // J Theor Biol. - 2013. - Vol. 335. - P. 57-78. 259. Kaech, S.M. Heterogeneity and cell-fate decisions in effector and memory CD8+ T cell differentiation during viral infection / S.M. Kaech, E.J. Wherry // Immunity. – 2007. – Vol. 27(3). – P. 393-405. 260. Karim, M. Regulatory T cells in transplantation / M. Karim, A.R. Bushell, K.J. Wood // Curr Opin Immunol. – 2002. – Vol. 14(5). – P. 584-591. 261. Ki-67 expression reveals strong, transient influenza specific CD4 T cell responses after adult vaccination / X. Li, H. Miao, A. Henn et al. // Vaccine. – 2012. - Vol. 30(31). – P. 4581-4584. 262. Kidney transplant recipients show an increase in the ratio of T-cell effector memory/central memory as compared to nontransplant recipients on the waiting list / D.S. Segundo, G. Fernández-Fresnedo, M. Gago et al. // Transplant. Proc. 2010. – Vol. 42. – P. 2877 – 2879. 263. Kinetic of regulatory CD25high and activated CD134+ (OX40) T lymphocytes during acute and chronic graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation / J. Sanchez, J. Casano, M.A. Alvarez et al. // Br. J. Haematol. – 2004. – Vol. 126(5). – Р. 697-703. 264. Kinetics of IL-7 and IL-15 levels after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation following nonmyeloablative conditioning [Electronic resource] / M. De Bock, M. Fillet, M. Hannon et al. // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(2). – Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0055876. 265. Kishimoto, H. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells / H. Kishimoto, J. Sprent //J Immunol. – 1999. – Vol. 163(4). – P. 1817-1826. 266. Kittipatarin, C. Interlinking interleukin-7/ C. Kittipatarin, A.R. Khaled // Cytokine. – 2007. – Vol. 39(1). – P. 75–83. 185 267. Kolber, M.A. CD38+CD8+ T-cells negatively correlate with CD4 central memory cells in virally suppressed HIV-1-infected individuals / M.A. Kolber // AIDS. – 2008. - Vol. 22(15). - P. 1937-1941. 268. Kovanen, P.E. Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the gamma(c)-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15, and 21, and their signaling pathways / P.E. Kovanen, W.J. Leonard // Immunol Rev. – 2004. – Vol. 202. – P. 67-83. 269. Krampe, B. Cell death in mammalian cell culture: molecular mechanisms and cell line engineering strategies / B. Krampe, M. Al-Rubeai //Cytotechnology. – 2010. – Vol. 62(3). – P. 175-188. 270. Krawczyk, C.M. Functional plasticity in memory T helper cell responses / C.M. Krawczyk, H. Shen, E.J. Pearce // J Immunol. - 2007. - Vol.178. - P.4080–4088. 271. Lanzavecchia, A. Progressive differentiation and selection of the fittest in the immune response / A. Lanzavecchia, F. Sallusto // Nat. Rev. Immunol. - 2002. – Vol. 2(12). – P. 982–987. 272. Lee, B. The role of soluble common gamma chain in autoimmune disease / Lee B, Hong C. // Anat Cell Biol. – 2015. – Vol. 48(1). – P. 10-15. 273. Lee, H.C. Enzymatic functions and structures of CD38 and homologs / H.C. Lee // J. Chem. Immunol. - 2000. - Vol.75. - P. 39-59. 274. Leonard, W.J. Cytokine receptor signaling pathways./ W.J. Leonard, J.X. Lin // J Allergy Clin Immunol. – 2000. – Vol. 105(5). – P. 877-888. 275. Leonard, W.J. Role of Jak kinases and STATs in cytokine signal transduction / W.J. Leonard // Int J Hematol. - 2001. – Vol. 73(3). – P. 271-277. 276. Leung, D.T. Regulation of lymphoid homeostasis by IL-2 receptor signals in vivo / D.T. Leung, S. Morefield, D.M. Willerford // J. Immunol. - 2000. – Vol. 164(7). – P. 3527—3534. 277. Ley, K. Selectins in T-cell recruitment to non-lymphoid tissues and sites of inflammation / K. Ley, G.S. Kansas // Nat. Rev. Immunol. – 2004. – Vol. 4. – P. 325– 335. 278. Li, J. IL-7 promotes the transition of CD4 effectors to persistent memory cells / J. Li, G. Huston, S.L. Swain. //J Exp Med. – 2003. – Vol. 198(12). – P. 1807-1815. 279. Liao, W. IL-2 family cytokines: new insights into the complex roles of IL-2 as a broad regulator of T helper cell differentiation / W. Liao, J.X. Lin, W.J. Leonard // Curr Opin Immunol.- 2011 - Vol. 23(5). - Р. 598-604. 186 280. Liao, W. Interleukin-2 at the crossroads of effector responses, tolerance, and immunotherapy / W. Liao, J.X. Lin, W.J. Leonard // Immunity. – 2013. – Vol. 38(1). – P. 13-25. 281. Lin, J. T cell receptor signalling / J. Lin, A. Weiss // J Cell Sci. – 2001. – Vol. 114(2). – P. 243-244. 282. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets / E. J Wherry, V. Teichgraber, V. Becker et al. // Nat. Immunol. - 2003. – Vol. 4. – P. 225–234. 283. Loss of CD28 expression on CD8(+) T cells is induced by IL-2 receptor gamma chain signalling cytokines and type I IFN, and increases susceptibility to activation-induced apoptosis / N.J. Borthwick, M. Lowdell, M. Salmon et al. // Int Immunol. – 2000. – Vol.12. – P. 1005-1013. 284. Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine / U. von Freeden-Jeffry, P. Vieira, L. A. Lucian et al. // J. Exp. Med. – 1995. – Vol. 181. – P. 1519–1526. 285. Ma, A. Diverse functions of IL-2, IL-15, and IL-7 in lymphoid homeostasis / A. Ma, R. Koka, P. Burkett // Annu Rev Immunol. – 2006. – Vol. 24. – P. 657-679. 286. Ma, C.S. Automatic generation of lymphocyte heterogeneity: Division-dependent changes in the expression of CD27, CCR7 and CD45 by activated human naive CD4+ T cells are independently regulated / C.S. Ma, P.D. Hodgkin, S.G. Tangye // Immunol Cell Biol. – 2004. - Vol. 82. – P. 67-74. 287. Mackall, C.L. Harnessing the biology of IL-7 for therapeutic application / C.L. Mackall, T.J. Fry, R.E. Gress // Nat Rev Immunol. – 2011. – Vol. 11(5). – P. 330342. 288. Maecker, H.T. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project / H.T. Maecker, J.P. McCoy, R. Nussenblatt // Nat. Rev. Immunol. - 2012. – Vol. 12. – P. 191 – 200. 289. Mahnke, Y.D. OMIP-013: differentiation of human T-cells / Y.D. Mahnke M.H. Beddall, M. Roederer // Cytometry Part A. - 2012. – Vol. 81. –P. 935–936. 290. Malek, T.R. Interleukin-2 Receptor Signaling: At the Interface between Tolerance and Immunity / T.R. Malek, I. Castro // Immunity. - 2010. – Vol. 33(2). – P. 153 – 165. 291. Malek, T.R. The biology of interleukin-2 / T.R. Malek // Annu Rev Immunol. 2008 - Vol. 26 - Р. 453-479. 187 292. Malek, T.R. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2 / T.R. Malek, A.L. Bayer // Nat Rev Immunol. – 2004. – Vol. 4(9). – P. 665-674. 293. Marsden, V.S. Control of apoptosis in the immune system: Bcl-2, BH3-only proteins and more / V.S. Marsden, A. Strasser // Annu. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 21. – P. 71—105. 294. Marsee, D.K. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens / D.K. Marsee, G.S. Pinkus, H. Yu // Am J Clin Pathol. – 2010. – Vol. 134(3). – P. 429-435. 295. Martinez, M.N. Control of alternative splicing in immune responses: many regulators, many predictions, much still to learn / M.N. Martinez, W.K. Lynch // Immunological Reviews. - 2013. - Vol. 253. – P. 216–236. 296. Marzio, R. CD69 and regulation of the immune function / R. Marzio, J. Mauël , S. Betz-Corradin // Immunopharmacol Immunotoxicol. – 1999. – Vol. 21(3). – P. 565-582. 297. Mazzucchelli, R. Interleukin-7 receptor expression: intelligent design / R. Mazzucchelli, S.K. Durum // Nat Rev Immunol. – 2007. – Vol. 7(2). – P.144-154. 298. Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between interleukin-2 and interleukin-15 / A.M. Ring, Jian-Xin Lin, Dan Feng et al. // Nat Immunol. – 2012. – Vol. 13(12). – P. 1187–1195. 299. Memory T and memory B cells share a transcriptional program of self-renewal with long-term hematopoietic stem cells / C.J. Luckey, D. Bhattacharya, A.W. Goldrath et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2006. – Vol. 103(9). – P. 3304-3309. 300. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence / S.N Mueller, T. Gebhardt, F.R. Carbone et al. // Annu. Rev. Immunol. - 2013. – Vol. 31. – P. 137– 161. 301. Memory T cells constitute a subset of the human CD8+CD45RA+ pool with distinct phenotypic and migratory characteristics / J.M. Faint, N.E. Annels, S.J. Curnow et al. // J Immunol. - 2001. – Vol. 167. – P. 212-220. 302. Memory T cells have gene expression patterns intermediate between naive and effector / S. Holmes, M. He, T. Xu et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. – Vol. 102. – P. 5519–5523. 303. Migratory properties of naive, effector and memory CD8+ T cells / W. Weninger, M. A. Crowley, N. Manjunath, et al. // J. Exp. Med. – 2001. – Vol. 194. – P. 953–966. 188 304. Mockler, M.B. Targeting T cell immunometabolism for cancer immunotherapy; understanding the impact of the tumor microenvironment [Electronic resource] / М.В. Mockler, M.J. Conroy, J. Lysaght // Front Oncology. – 2014. – Vol. 4(107). - Mode of access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fonc.2014.00107/full. 305. Moschovakis, G.L. Multifaceted activities of CCR7 regulate T-cell homeostasis in health and disease / G.L. Moschovakis, R. Förster // Eur J Immunol. – 2012. - Vol. 42(8). - Р. 1949-1955. 306. Murali-Krishna, K. Cutting edge: naive T cells masquerading as memory cells / K. Murali-Krishna, R. Ahmed // J Immunol. – 2000. – Vol.165. – P. 1733-1737. 307. Mustelin, T. Positive and negative regulation of T-cell activation through kinases and phosphatases / T. Mustelin, K. Tasken // Biochem. J. - 2003. - Vol. 371. - P. 15–27. 308. Nada, A.M. T cells, LFA-3 and HLA-DR in autoimmune thyroid diseases / A.M. Nada, M. Hammouda // Indian J Endocrinol Metab. – 2014. – Vol. 18(4). – P. 574–581. 309. Naïve and central memory T-cell lymphopenia in end-stage renal disease / J.W. Yoon, S. Gollapudi, M.V. Pahl et al. // Kidney Int. - 2006. – Vol. 70(2). – P. 371 – 376. 310. Nanoparticle-Mediated Combinatorial Targeting of Multiple Human Dendritic Cell (DC) Subsets Leads to Enhanced T Cell Activation via IL15-Dependent DC Crosstalk / K. Sehgal, R. Ragheb, T.M. Fahmy et al. // J Immunol. – 2014. – Vol. 193(5). – P. 2297-2305. 311. Noel, P.J. Regulation of T cell activation by CD28 and CTLA4 / P.J. Noel, L.H. Boise, C.B. Thompson // Adv Exp Med Biol. – 1996. – Vol. 406. – Р. 209-217. 312. Normal clonal expansion but impaired Fas-mediated cell death and anergy induction in interleukin-2 deficient mice / B. Kneitz, T. Herrmann, S. Yonehara et al. // Eur. J. Immunol. - 1995. – Vol. 25. – P. 2572—2577. 313. Okamoto, H. Recent advances in the okamoto model: the CD38-cyclic ADPribose signal system and the regenerating gene protein (reg)-reg receptor system in beta-cells / H. Okamoto, S. Takasawa // Diabetes. - 2002. - Vol. 51. - P. 462-473. 314. Opposing functions of IL-2 and IL-7 in the regulation of immune responses / S.D. Katzman, K.K. Hoyer, H. Dooms et al. // Cytokine. – 2011. – Vol. 56. – P. 116– 121. 189 315. Optimization of methodology for production of CD25/CD71 allodepleted donor T cells for clinical use / S.J. Albon, C Mancao, K. Gilmour et al. // Cytotherapy. – 2013. – Vol. 15(1). – P. 109-121. 316. Osborne, L.C. Regulation of memory T cells by γc cytokines / L.C. Osborne, N. Abraham //Cytokine. – 2010. – Vol. 50(2). – P. 105-113 317. Outcome of acute hepatitis C is related to virus-specific CD4 function and maturation of antiviral memory CD8 responses / S. Urbani, B. Amadei, P. Fisicaro et al. // Hepatology. – 2006. – Vol. 44(1). – P. 126–139. 318. Persistent CMV infection correlates with disease activity and dominates the phenotype of peripheral CD8+ T cells in psoriasis / M. Weitz, C. Kiessling, M. Friedrich et al. // Exp Dermatol. – 2011. – Vol. 20(7). – P. 561-567. 319. Perturbed T Cell IL-7 Receptor Signaling in Chronic Chagas Disease / M.C. Albareda, D. Perez-Mazliah, M.A. Natale et al. // J Immunol. – 2015. – Vol. 194(8). – P. 3883-3889. 320. Peter, M.E. The CD95 (APO-1/Fas) DISC and beyond / M.E. Peter, P.H. Krammer // Cell Death Differ. - 2003. - Vol.10. - P. 26-35. 321. Phenotype and function of natural killer cells in systemic lupus erythematosus: excess interferon-γ production in patients with active disease / B. Hervier, V. Beziat, J. Haroche et al. // Arthritis Rheum. – 2011. – Vol. 63(6). – P. 1698-1706. 322. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells / I. Sanz, C. Wei, F.E. Lee et al. // Semin Immunol. - 2008. - Vol. 20(1). - P. 67-82. 323. Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+ T cells / D. Hamann, P.A. Baars, M.H. Rep et al. // J. Exp. Med. - 1997. – Vol. 186. – P. 1407–1418. 324. Phenotypic classification of human CD4+ T cell subsets and their differentiation / R. Okada, T. Kondo, F. Matsuki et al. // Int. Immunol. - 2008. – Vol. 20. – P. 1189–1199. 325. Picker, L.J. Regulation of tissue-selective T-lymphocyte homing receptors during the virgin to memory/effector cell transition in human secondary lymphoid tissues / L.J. Picker // Am Rev Respir Dis. – 1993. - Vol. 148(6 Pt 2). – P. 47-54. 326. Ponchel, F. IL-7 and lymphopenia / F. Ponchel, R.J. Cuthbert, V. Goëb // Clin Chim Acta. – 2011. – Vol. 412(1-2). – P. 7-16. 190 327. Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ T cell in vivo by IL15 / X. Zhang, S. Sun, I. Hwang et al. // Immunity. - 1988. – Vol. 8(5). – P. 591— 599. 328. Prediction, conservation analysis, and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites / K. Julenius, A. Mølgaard, R. Gupta et al. // Glycobiology. – 2005. – Vol. 15(2). – P. 153-164. 329. Preferential activation of an IL2 regulatory sequence transgene in TCR γδ and NKT cells: subset-specific differences in IL2 regulation / M.A. Yui, L.L. Sharp, W.L. Havran et al. // J. Immunol. - 2004. – Vol. – 172. – P. 4691–4699. 330. Prognostic value of bcl-2 expression in invasive breast cancer / P. Hellemans, P.A. van Dam, J. Weyler et al. // Br J Cancer. – 1995. – Vol. 72. – P. 354–360. 331. Progressive activation of CD127+132- recent thymic emigrants into terminally differentiated CD127-132+ T-cells in HIV-1 infection [Electronic resource] / S.C. Sasson, J.J. Zaunders, N. Seddiki et al.// PLoS One. – 2012. - Vol. 7(2). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0031148. 332. Proliferation requirements of cytomegalovirus-specific, effector-type human CD8+ T cells / E.M. van Leeuwen, L.E. Gamadia, P.A. Baars et al. // J Immunol. – 2002. – Vol. 169. – P. 5838-5843. 333. Prolonged exposure of naïve CD8+ T cells to interleukin-7 or interleukin-15 stimulates proliferation without differentiation or loss of telomere length / D.L. Wallace, M. Bérard, M.V. Soares et al. // Immunology. – 2006. – Vol. 119(2). – P. 243-253. 334. Prolonged interleukin-2R alpha expression on virus-specific CD8 +T cells favors terminal-effector differentiation in vivo / V. Kalia, S. Sarkar, S. Subramaniam et al. // Immunity. - 2010. – Vol. 32(1). – P. 91–103. 335. Quiescence and functional reprogramming of Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD8+ T cells during persistent infection / P.J. Dunne, L. Belaramani, J.M. Fletcher et al. // Blood. – 2005. - Vol. 106. – P. 558-565. 336. Radbruch, A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? / A. Radbruch, A. Thiel // Ann Rheum Dis. - 2004. - Vol. 63. - P. 96-101. 337. Real-time tracking of cell cycle progression during CD8+ effector and memory Tcell differentiation [Electronic resource] / I. Kinjyo, J. Qin, S.Y. Tan et al. // Nat Commun. – 2015. – Vol. 6. – Mode of access: 191 http://www.nature.com/ncomms/2015/150224/ncomms7301/full/ncomms7301.ht ml. 338. Recombinant interleukin-7 induces proliferation of naive macaque CD4+ and CD8+ T cells in vivo / M. Moniuszko, T. Fry, W.P. Tsai et al. // J. Virol. - 2004. – Vol. 78(18). – P. 9740—9749. 339. Regulation of innate CD8+ T-cell activation mediated by cytokines / B.E. Freeman, E. Hammarlund, H.P. Raué et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2012. – Vol. 109(25). – P. 9971-9976. 340. Regulation of T cell subsets from naive to memory / L.L. Carter, X. Zhang, C. Dubey et al. // J Immunother. – 1998. – Vol. 21(3). – Р. 181-187. 341. Regulation of human helper T cell subset differentiation by cytokines / N. Schmitt, H. Ueno // Curr Opin Immunol. – 2015. – Vol. 34. - P. 130-136. 342. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice / M.K. Kennedy, M. Glaccum, S.N. Brown et al. // J Exp Med. – 2000. – Vol. 191(5). – P. 771–780. 343. Reversible senescence in human CD4+CD45RA+CD27- memory T cells / D. Di Mitri, R.I. Azevedo, S.M. Henson et al. // J. Immunol. - 2011. – Vol. 187. – P. 2093–2100. 344. Ribeiro, S.T. Five Layers of Receptor Signaling in γδ T-Cell Differentiation and Activation [Electronic resource] / S.T. Ribeiro, J.C. Ribot, B. Silva-Santos // Front Immunol. – 2015. – Vol. 26. - Mode of access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2015.00015/abstract. 345. Rochman,Y. New insights into the regulation of T cells by γc family cytokines / Y. Rochman, R. Spolski, W. J. Leonard // Nat Rev Immunol. – 2009. – Vol. 9(7). – P. 480-495. 346. Rodrigues, R. Genome-wide analysis of alternative splicing during dendritic cell response to a bacterial challenge [Electronic resource] / R. Rodrigues, A.R. Grosso, L. Moita // PLoS One. – 2013. – Vol. 8(4). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0061975. 347. Role of apoptosis-inducing factor (Aif) in the T cell lineage / S.B. Prabhu, J.K. Khalsa, H. Banerjee et al. // Indian J Med Res. – 2013. – Vol. 138(5). – P. 577590. 192 348. Sallusto, F. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance / F. Sallusto, J. Geginat, A. Lanzavecchia // Annu. Rev. Immunol. - 2004. – Vol. 22. - P. 745–763. 349. Sallusto, F.A. Monocytes join the dendritic cell family / F. Sallusto, A. Lanzavecchia // Cell. – 2010. –Vol. 143(3). –P. 339-340. 350. Sanders, M.E. Human naive and memory T cells: reinterpretation of helperinducer and suppressor-inducer subsets / M.E. Sanders, M.W. Makgoba, S. Shaw // Immunol. Today. - 1988. – Vol. 9. – P. 195–199. 351. Sandoval-Montes, C. CD38 is expressed selectively during the activation of a subset of mature T-cells with redused proliferation but improved potential to produce cytokines / C. Sandoval-Montes, L. Santos-Argumedo // Leukocyte Biology. - 2005. - Vol. 77. - P. 513–521. 352. Schlesinger, K.J. Coevolutionary immune system dynamics driving pathogen speciation [Electronic resource] / K.J. Schlesinger, S.P. Stromberg , J.M. Carlson // PLoS One. – 2014. – Vol. 9(7). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0102821. 353. Schluns, K.S. Cytokine control of memory T-cell development and survival / K.S. Schluns, L. Lefrancois // Nat Rev Immunol. – 2003. – Vol. 3(4). – P. 269–279. 354. Schmidlin, H. New insights into the regulation of human B-cell differentiation / H. Schmidlin, S.A. Diehl, B. Blom // Trends Immunol. – 2009. – Vol. 30(6). – P. 277-285. 355. Seddon, B. Interleukin 7 and T cell receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells / B. Seddon, P. Tomlinson, R. Zamoyska // Nat. Immunol. – 2003. – Vol. 4. – P. 680–686. 356. Selective expansion of memory CD4(+) T cells by mitogenic human CD28 generates inflammatory cytokines and regulatory T cells / M. Singh, S. Basu, C. Camell et al. // Eur J Immunol. – 2008. – Vol. 38 (6). – P. 1522-1532. 357. Selective expression of IL-7 receptor on memory T cells identifies early CD40Ldependent generation of distinct CD8+ memory T cell subsets / K.M. Huster, V. Busch, M. Schiemann et al. //Proc Natl Acad Sci USA. – 2004. – Vol. 101(15). – P. 5610-5615. 358. Selective expression of the interleukin 7 receptor identifies effector CD8 T cells that give rise to long-lived memory cells / S.M. Kaech, J.T. Tan, E.J. Wherry et al. //Nat Immunol. – 2003. – Vol. 4(12). – P. 1191-1198. 193 359. Selective reduction of post-selection CD8 thymocyte proliferation in IL-15Rα deficient mice [Electronic resource] / K.P. Chow, J.T. Qiu, J.M. Lee et al. // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(3). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0033152. 360. Sensitive gene expression profiling of human T cell subsets reveals parallel postthymic differentiation for CD4+ and CD8+ lineages / V. Appay, A. Bosio, S. Lokan et al. // J Immunol. – 2007. – Vol. 179(11). – P. 7406-7414. 361. Shenoy, A.R. IL-15 regulates Bcl-2 family members Bim and Mcl-1 through JAK/STAT and PI3K/AKT pathways in T cells / A.R. Shenoy, S. Kirschnek, G. Häcker // Eur J Immunol. – 2014. – Vol. 44(8). – P. 2500-2507. 362. Shin, H. Tissue-resident memory T cells / H. Shin, A. Iwasaki // Immunol Rev. – 2013. – Vol. 255(1). – P. 165-181. 363. Shipkova, M. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation /Shipkova M., Wieland E. // Clin Chim Acta. – 2012. – Vol. 413(1718). – P. 1338-1349. 364. Shlomchik, M.J. Germinal center selection and the development of memory B and plasma cells / M.J. Shlomchik, F. Weisel // Immunol Rev. - 2012. – Vol. 247(1). – P. 52-63. 365. Shortage of circulating naive CD8(+) T cells provides new insights on immunodeficiency in aging / F.F. Fagnoni, R. Vescovini, G. Passeri et al. // Blood. - 2000. – Vol. 95(9). –P. 2860–2868. 366. Siefken, R. CD28-mediated activation of resting human T cells without costimulation of the CD3/TCR complex / R. Siefken, R. Kurrle, R. Schwinzer // Cell Immunol. – 1997. - Vol. 176(1). – P. 59-65. 367. Silva de Azevedo, R. I. The role of IL-7 in the Homeostasis of Human Naive and Memory CD4+ T cell subsets: Doutoramento em Ciências Biomédicas Especialidade em Imunologia. – Portugal; Universidade de Lisboa. – 2011. – P. 251. 368. Soluble IL-2Rα (sCD25) exacerbates autoimmunity and enhances the development of Th17 responses in mice [Electronic resource] / S.E. Russell, A.C. Moore, P.G. Fallon et al. // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(10). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0047748. 369. Sprent, J. Generation and maintenance of memory T cells / J. Sprent, C.D. Surh // Curr Opin Immunol. – 2001. - Vol. 13(2). – P. 248-254. 194 370. Sprent, J. Interleukin 7, maestro of the immune system / J. Sprent, C.D. Surh // Seminars in Immunology. – 2012. - Vol. 24(3). – P. 149–150. 371. Sprent, J. T cell memory / J. Sprent, C.D. Surh // Annu Rev Immunol. – 2002. – Vol. 20. – P. 551-579. 372. Sprent, J. The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system / J. Sprent // Nat Rev Immunol. – 2012. – Vol. 12 (3). – P. 180190. 373. Stem cell-like plasticity of naive and distinct memory CD8+ T cell subsets / C. Stemberger, M. Neuenhahn, F.E. Gebhardt et al. // Semin. Immunol. - 2009. – Vol. 21(2). – P. 62–68. 374. Stepwise differentiation of CD4 memory T cells defined by expression of CCR7 and CD27 / R.D. Fritsch, X. Shen, G.P. Sims et al. // J. Immunol. - 2005. - Vol. 175. – P. 6489–6497. 375. Stoniera, S.W. Trans-presentation: a novel mechanism regulating IL-15 delivery and responses / S.W. Stoniera, K.S. Schlunsa // Immunol Lett. - 2010. - Vol. 127(2). - P. 85–92. 376. Strasser, A. The many roles of FAS receptor signaling in the immune system / A. Strasser, P.J. Jost, S. Nagata // Immunity. – 2009. - Vol. 30(2). – P. 180-192. 377. Study of T cell subsets and IL-7 protein expression in HIV-1-infected patients after 7 years HAART / C. Shou, N. Weng, Y. Jin et al. // Eur J Med Res. - 2011. Vol.16(11). - P. 473-479. 378. Subject classification obtained by cluster analysis and principal component analysis applied to flow cytometric data / E. Lugli, M. Pinti, M. Nasi et al. // Cytometry Part A. - 2007. – Vol. 71(5). – P. 334–344. 379. Subsets of CD8+, CD57+ cells in normal, healthy individuals: correlations with human cytomegalovirus (HCMV) carrier status, phenotypic and functional analyses / E.C. Wang, J. Taylor-Wiedeman, P. Perera et al. // Clin Exp Immunol. – 1993. -94(2). – P. 297-305. 380. Superior T memory stem cell persistence supports long-lived T cell memory / E. Lugli, M.H. Dominguez, L. Gattinoni et al. // J. Clin. Invest. - 2013. – Vol. 123(2). – P. 594–599. 381. Suppression of IL7Ralpha transcription by IL-7 and other prosurvival cytokines: anovel mechanism for maximizing IL-7-dependent T cell survival / J.H. Park, Q. Yu, B. Erman et al. // Immunity. – 2004. – Vol. 21(2). – P. 289-302. 195 382. Surh, C.D. Homeostasis of Naive and Memory T Cells / C.D. Surh, J. Sprent // Immunity. – 2008. – Vol. 29 (6). – P. 848 – 862. 383. Surh, C.D. Regulation of mature T cell homeostasis / C.D. Surh, J. Sprent // Semin Immunol. – 2005. – Vol. 17(3). – P.183-191. 384. Switch in chemokine receptor expression upon TCR stimulation reveals novel homing potential for recently activated T cells / F. Sallusto, E. Kremmer, B. Palermo et al. //Eur J Immunol. – 1999. – Vol. 29(6). – P. 2037-2045. 385. T activation marker evaluation in ARC patients treated with AZT: Comparison with CD4+ lymphocyte count in non-progressors and progressors towards AIDS / M. Levacher, S. Tallet, M. Dazza et al. // Clin Exp Immunol. – 1990. – Vol. 81. – P. 177-182. 386. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion / M. Huse, B.F. Lillemeier, M.S. Kuhns et al. // Nat Immunol. - 2006. – Vol. 7(3). – P. 247255. 387. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice [Electronic resource] / X. Yang, J. Yang, Y. Chu et al. // PLoS One. – 2013. – Vol. 8(4). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0062855. 388. T lymphocytes from chagasic patients are activated but lack proliferative capacity and down-regulate CD28 and CD3ζ [Electronic resource] / N.A. Giraldo, N.I. Bolaños, A. Cuellar et al. // PLoS Negl Trop Dis. – 2013. – Vol. 7(1). - Mode of access: http://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371/journal.pntd.0002038. 389. T cells translate individual, quantal activation into collective, analog cytokine responses via time-integrated feedbacks [Electronic resource] / K.E. Tkach, D Barik, G. Voisinne et al. // Elife (Cambridge). – 2014. – Vol. 3. - Mode of access: http://elifesciences.org/content/3/e01944. 390. Takata, H. Functional heterogeneity of human effector CD8+ T cells / H. Takata, T. Naruto, M. Takiguchi // Blood. - 2012. – Vol. 19(6). – P. 1390 – 1398. 391. T-cell division in human immunodeficiency virus (HIV)-1 infection is mainly due to immune activation: a longitudinal analysis in patients before and during highly active antiretroviral therapy (HAART) / M.D. Hazenberg, J.W. Stuart, S. Otto et al. // Blood. - 2000. – Vol. 95. – P. 249–255. 196 392. TCR-independent proliferation and differentiation of human CD4+ T cell subsets induced by cytokines / J. Geginat, S. Campagnaro, F. Sallusto et al. // Adv Exp Med Biol. - 2002. - Vol. 512. – P. 107–112. 393. The CD27 - subset of peripheral blood memory CD4+ lymphocytes contains functionally differentiated T lymphocytes that develop by persistent antigenic stimulation in vivo / R. De Jong, M. Brouwer, B. Hooibrink et al. // Eur J Immunol. – 1992. – Vol. 22. – P. 993-999. 394. The CD28 and CTLA-4 receptors associate with the serine/threonine phosphatase PP2A / E. Chuang, T.S. Fisher, R.W. Morgan et al. // Immunity. - 2000. – Vol. 13. – Р. 313-322. 395. The CD8+ HLA-DR+ T cells expanded in HIV-1 infection are qualitatively identical to those from healthy controls / H. Imamichi, R.A. Lempicki, J.W. Adelsberger et al. // Eur J Immunol. – 2012. - Vol. 42(10). - P. 2608-2620. 396. The chemokine receptor CCR7 controls lymph node-dependent cytotoxic T cell priming in alloimmune responses / U.E. Höpken, J. Droese, J.P. Li et al.// Eur J Immunol. – 2004. - Vol. 34(2). - Р. 461-470. 397. The differential regulation of Lck kinase phosphorylation sites by CD45 is critical for T cell receptor signaling responses / L. McNeill, R.J. Salmond, J.C. Cooper et al. // Immunity. - 2007. – Vol. 27 (3). – P. 425–437. 398. The initial phase of an immune response functions to activate regulatory T cells / W.E. O'Gorman, H. Dooms, S.H. Thorne et al. // J Immunol. – 2009. – Vol. 183(1). – P. 332-339. 399. The interleukin-7 receptor α chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis / J. Haas, M. Korporal, A. Schwarz et al. // Eur J Immunol. - 2011. - Vol. 41(3). - P. 845-853. 400. The leukocyte activation receptor CD69 controls T cell differentiation through its interaction with galectin-1 / H. de la Fuente, A. Cruz-Adalia, G. Martinez Del Hoyo et al. // Mol Cell Biol. – 2014. – Vol. 34(13). – P. 2479-2487. 401. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells / A. Marçais, J. Cherfils-Vicini, C. Viant et al. // Nat Immunol. - 2014. – Vol. 15(8). - P. 749-757. 402. The microRNA miR-182 is induced by IL-2 and promotes clonal expansion of activated helper T lymphocytes / A.B. Stittrich , C. Haftmann, E. Sgouroudis et al. // Nat Immunol. – 2010. – Vol. 11(11). – P. 1057-1062. 197 403. The phenotype IFNy+cd69- of T-lymphocytes of umbilical blood associated with epidemiologically verified risk factors of atopy formation / SIu. Tereshchenko, V.A. Babushkin, I.A. Ol'khovskiĭ at al. // Klin Lab Diagn. – 2012. –Vol. 6. – P. 50-52. 404. The potential of CD4 T-cell memory / K.K. McKinstry, T.M. Strutt, S.L. Swain // Immunology. – 2010. – Vol. 130(1). – P. 1-9. 405. The role of apoptosis in the development and function of T lymphocytes / N. Zhang, H. Hartig, I. Dzhagalov et al. // Cell Res. – 2005. – Vol. 15(10). – P. 749769. 406. The role of CD95 in the regulation of peripheral T-cell apoptosis / A. Krueger, S.C. Fas, S. Baumann et al. //Immunol Rev. – 2003. – Vol. 193. - P. 58-69. 407. The role of the common cytokine receptor gamma-chain in regulating IL-2dependent, activation-induced CD8+ T cell death / Z. Dai, A. Arakelov, M. Wagener et al. //J Immunol. – 1999. – Vol. 163(6). – P. 3131-3137. 408. The role of tumor cells in the modification of T lymphocytes activity--the expression of the early CD69+, CD71+ and the late CD25+, CD26+, HLA/DR+ activation markers on T CD4+ and CD8+ cells in squamous cell laryngeal carcinoma. Part I / K. Starska, E. Głowacka, A. Kulig et al. // Folia Histochem Cytobiol. – 2011. – Vol. 49(4). – P. 579-592. 409. The structure of the interleukin-15 alpha receptor and its implications for ligand binding / I. Lorenzen, A.J. Dingley, Y. Jacques et al. // Biol Chem. – 2006. – Vol. 281(10). - P. 6642-6647. 410. The transferrin receptor / R. Newman, C. Schneider, R. Sutherland et al. // Trends Biochem Sci. – 1982. – Vol.1. – Р. 397. 411. The who's who of T-cell differentiation: human memory T-cell subsets / Y.D. Mahnke, T.M. Brodie, F. Sallusto et al. // Eur J Immunol. – 2013. – Vol. 43(11). – P. 2797-2809. 412. The CD27 and CD70 costimulatory pathway inhibits effector function of T helper 17 cells and attenuatesassociated autoimmunity / J.M. Coquet, S. Middendorp, G. van der Horst et al. // Immunity. – 2013. – Vol. 38(1). – P. 53-65. 413. Therapeutic use of IL-2 to enhance antiviral T-cell responses in vivo / J.N. Blattman, J.M.Grayson, E.J. Wherry et al. //Nat Med. – 2003. – Vol. 9(5). - P. 540-547. 198 414. Thompson C.B. The emerging role of CTLA-4 as an immune attenuator / C.B. Thompson, J.P. Allison // Immunity. – 1997. – Vol. 7(4). – P. 445-450. 415. Transient and persistent effects of IL15 on lymphocyte homeostasis in nonhuman primates / E. Lugli, C.K. Goldman, L.P. Perera et al. // Blood. - 2010. – Vol. 116. – P. 3238–3248. 416. Triggering of human monocyte activation through CD69, a member of the natural killer cell gene complex family of signal transducing receptors / R. de Maria, M.G. Cifone, R. Trotta et al. // J Exp Med. – 1994. – Vol. 180(5). – P. 1999-2004. 417. Tumor necrosis factor-alpha and CD80 modulate CD28 expression through a similar mechanism of T-cell receptor-independent inhibition of transcription / D.E. Lewis, M. Merched-Sauvage, J.J. Goronzy et al. // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279. – P. 29130-29138. 418. Turner, D.L. Mucosal immunopathology Front Immunol. resident memory CD4 [Electronic – 2014. resource] – Vol. / T D.L. 5(331). cells in protection Turner, D.L. - Mode Farber of and // access: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2014.00331/full. 419. Two subsets of naive T helper cells with distinct T cell receptor excision circle content in human adult peripheral blood / S. Kimmig, G.K. Przybylski, C.A. Schmidt et al. // J Exp. Med. – 2002. – Vol. 195(6). – Р. 789-794. 420. Type 1 diabetes-associated IL2RA variation lowers IL-2 signaling and contributes to diminished CD4+CD25+ regulatory T cell function / G. Garg, J.R. Tyler, J.H. Yang et al. // J Immunol. - 2012. - Vol. 188(9). - P. 4644-4653. 421. Type II membrane protein CD69 regulates the formation of resting T-helper memory / K. Shinoda, K. Tokoyoda, A. Hanazawa et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2012. – Vol. 109(19). – P. 7409-7414. 422. Uncoupling IL-2 signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fasmediated activation-induced cell death / L. Van Parijs, Y. Refaeli, J.D. Lord et al. // Immunity. – 1999. – Vol. 11(3). – P. 281-288. 423. Up-regulation of c-FLIPshort and reduction of activation-induced cell death in CD28-co-stimulated human T cells / S. Kirchhoff, W.W. Muller, M. Li-Weber et al. // European Journal of Immunology. – 2000. – Vol. 30. – Р. 2765–2774. 424. Van Leeuwen, E.M. Generation and maintenance of memory CD4(+) T Cells / E.M. van Leeuwen, J. Sprent, C.D.Surh //Curr Opin Immunol. – 2009. – Vol. 21(2). – P. 167-172. 199 425. Waldmann, T.A. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design / T.A. Waldmann // Nat Rev Immunol. – 2006. – Vol. 6(8). – P. 595–601. 426. Waldmann, T.A. The interleukin-2 receptor / T.A. Waldmann // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 266(5). – P. 2681-2684. 427. Wang, X. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors / X. Wang, M. Rickert, K.C. Garcia // Science. – 2005. – Vol. 310(5751). – P. 1159-1163. 428. Williams, M.A. Shortening the infectious period does not alter expansion of CD8 T cells but diminishes their capacity to differentiate into memory cells / M.A. Williams, M.J.Bevan // J Immunol. – 2004. - V. 173(11). – P. 6694-6702. 429. Williams, M.A. Interleukin-2 signals during priming are required for secondary expansion of CD8+ memory T cells / M.A. Williams, A.J. Tyznik, M.J. Bevan // Nature. – 2006. – V. 441. – P. 890–893. 430. Xue, H.H. IL-2 negatively regulates IL-7 receptor α chain expression in activated T lymphocytes / H.H. Xue, P. E. Kovanen, C. A. Pise-Masison // PNAS. – 2002. – Vol. 99 (21). – P.13759-13764. 431. Yamane, H. Early signaling events that underlie fate decisions of naive CD4(+) T cells toward distinct T-helper cell subsets / H. Yamane, W.E. Paul //Immunol Rev. –2013 – Vol. 252(1). – P. 12-23. 432. Zotos, D. Determining germinal centre B cell fate / D. Zotos, D.M. Tarlinton // Trends Immunol. - 2012. - Vol. 33(6). - P. 281-288. 200
