2 378 015(13) C2

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 378 015
(13)
C2
(51) МПК
A61K 39/385 (2006.01)
A61P 37/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21), (22) Заявка: 2008112497/15, 02.04.2008
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
02.04.2008
(45) Опубликовано: 10.01.2010 Бюл. № 1
(73) Патентообладатель(и):
Атауллаханов Равшан Иноятович (RU)
носителем - кислым пептидогликаном с
молекулярной
массой
1200-40000
кДа,
имеющим
массовое
соотношение
между
глюкозой и уроновыми кислотами, равное 1:24. Преимущество изобретения заключается в
повышении иммуногенности в 10-100 раз, что в
свою очередь позволяет снизить дозы
иммуногена в 10-100 раз для достижения того
же эффекта. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл.
R U
2 3 7 8 0 1 5
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины
и иммунологии и касается конъюгата для
иммунизации и вакцинации
и способа
повышения
иммуногенности.
Сущность
изобретения
включает
конъюгат
для
иммунизации и вакцинации, представляющий
собой
иммуноген,
ковалентно
соединениненный
с
высокомолекулярным
Ñòð.: 1
ru
C 2
C 2
(54) КОНЪЮГАТ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ И ВАКЦИНАЦИИ И СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ
ИММУНОГЕННОСТИ
2 3 7 8 0 1 5
Адрес для переписки:
103104, Москва, Малая Бронная, 20, стр.2,
кв.28, Р.И.Атауллаханову
R U
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2195308 C1, 27.12.2002. RU 2249463 C2,
10.04.2005. RU 2046799 C1, 27.10.1995. US
6534065 A, 18.03.2003. US 7169903 C1,
30.01.1997.
(72) Автор(ы):
Атауллаханов Равшан Иноятович (RU),
Мельникова Татьяна Михайловна (RU),
Пичугин Алексей Васильевич (RU),
Хаитов Рахим Мусаевич (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 378 015
(13)
C2
(51) Int. Cl.
A61K 39/385 (2006.01)
A61P 37/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
Ataullakhanov Ravshan Inojatovich (RU),
Mel'nikova Tat'jana Mikhajlovna (RU),
Pichugin Aleksej Vasil'evich (RU),
Khaitov Rakhim Musaevich (RU)
(21), (22) Application: 2008112497/15, 02.04.2008
(24) Effective date for property rights:
02.04.2008
(45) Date of publication: 10.01.2010 Bull. 1
C 2
R U
2 3 7 8 0 1 5
is acidic peptidoglycane of molecular weight 120040000 KDa, and having the mass ratio of glucose and
uronic acids 1:2-4.
EFFECT: advantage of the invention consists in
improved immunogenicity 10-100 times higher, that
in turn allows reducing immunogen doses in 10-100
times to achieve the same effect.
6 cl, 6 ex, 3 tbl
Ñòð.: 2
en
C 2
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention refers to medicine and
immunology and concerns a conjugate for
immunisation and vaccination and method for
improving immunogenicity. Substance of the
invention involves said conjugate for immunisation
and vaccination representing an immunogen
covalently bonded with a high-molecular carrier that
2 3 7 8 0 1 5
(54) CONJUGATE FOR IMMUNISATION AND VACCINATION AND METHOD FOR IMPROVING
IMMUNOGENICITY
R U
(73) Proprietor(s):
Ataullakhanov Ravshan Inojatovich (RU)
Mail address:
103104, Moskva, Malaja Bronnaja, 20, str.2,
kv.28, R.I.Ataullakhanovu
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
Изобретение относится к области иммунологии, а именно к разработке вакцинных
препаратов.
Вакцинация в масштабах всего мира позволила избавить человечество от
натуральной оспы и сократить заболеваемость полиомиелитом до единичных случаев.
Несмотря на эти и другие успехи, создание вакцин против многих актуальных
инфекций остается нерешенной проблемой. ВИЧ-инфекция, малярия, гепатит С,
многие вирусные, бактериальные и гельминтные инфекции остаются широко
распространенными заболеваниями, против которых до сих пор не удалось
разработать эффективных вакцин.
Одной из основных проблем, тормозящих создание новых вакцин, является
отсутствие безопасного и эффективного иммуностимулирующего носителя, функция
которого состоит в обеспечении интенсивного иммунного ответа на инфекционные
антигены, включенные в состав вакцины.
Еще в первой половине XX века было установлено, что очищенные инфекционные
антигены, в большинстве случаев, не обладают достаточной иммуногенностью, то
есть их введение в организм млекопитающих не вызывает иммунной реакции,
достаточной для защиты от последующего заражения. За последующие десятилетия
было изобретено множество способов повышения иммуногенности антигенов, среди
которых адсорбция антигенов на коллоидных микрочастицах (например, соли
алюминия или гидроокись алюминия), эмульгирование антигенов в водно-масляных
смесях, а также совместное введение антигена с различными стимуляторами
иммунных реакций (например, убитые бактерии или компоненты бактерий, такие как
липополисахарид, липопетид, пептидогликан и другие).
Один из способов повышения иммуногенности антигенов состоит в их химическом
соединении с иммуногенным носителем. Приблизительно 70 лет назад Карл
Ландштейнер показал, что неиммуногенные антигены можно превратить в
иммуногенные, если их химически соединить с белковыми веществами. В частности,
введение в организм млекопитающих небольших молекул, названных гаптенами, не
приводит к индукции синтеза антител, связывающих введенный гаптен. Если гаптен
соединен ковалентной (химической) связью с белковым носителем, то такие
конъюгаты <гаптен-носитель> могут индуцировать продукцию антител,
распознающих как гаптен, так и носитель.
Со времени открытия К.Ландштейнера было предложено множество самых разных
конъюгированных иммуногенов. Иммуногенные свойства антигенов и вакцин
повышали путем их ковалентного соединения с липополисахаридом
40
45
50
Ñòð.: 3
DE
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòð.: 4
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
В качестве аналога изобретения могут быть рассмотрены иммуногенные
конъюгаты β-пропионамидсвязанного полисахарида и N-пропионамидсвязанного
олигосахарида с белком, а также способ получения этих конъюгатов. Конъюгаты
используют для получения вакцин против инфекционных заболеваний и рака (патент
РФ 2249463). Недостатками предложенных конъюгатов является трудоемкость
изготовления и недостаточная эффективность, обусловленная тем, что белок является
«инертным» носителем в незначительно степени активирующий иммунный ответ.
Ближайшим аналогом изобретения может быть метод усиления иммуногенности
молекул антигена, обладающих слабыми иммуногенными свойствами, который
превращает их в пригодные для иммунизации антигены. Метод состоит в
приготовлении конъюгатов антигена со слабыми иммуногенными свойствами и
синтетического пептидного носителя, который обладает способностью существенно
повышать иммуногенность указанного антигена (заявка РФ 95105991 или патент
США 5736146). Недостатками указанного изобретения является необходимость
применения потенциально опасных пептидов в качестве носителя и сложность
конструкции предложенных конъюгатов.
Также, в качестве аналога изобретения может быть рассмотрен кислый
пептидогликан (далее - КПГ), обладающий свойствами активатора иммунитета. КПГ
представляет собой водорастворимый кислый пептидогликан полученный из растений
Ñòð.: 5
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
с молекулярной массой 1200-40000 кДа. Сахарный состав полисахаридной части
следующий: галактуроновая кислота 18±6%, глюкоза 9±3%, галактоза 5,5±2%,
арабиноза 3,8±1,3%, рамноза 1,9±0,9%, манноза 0,7±0,25%. Пептидная часть
составляет 13±3%, содержит аминокислоты с первичными аминогруппами (аргинин
2,6%, лизин 1,8%), а также аминокислоты с карбоксильными группами (аспарагиновая
кислота 10,6%, глутаминовая кислота 11,1%). КПГ и способ его получения описан в
патенте РФ 2195308.
КПГ является сильным иммуностимулятором: активирует NK-клетки, дендритные
клетки, макрофаги, моноциты, усиливает выработку цитокинов и интерферона. КПГ
является адъювантом. При совместном введении экспериментальным животным смеси
белкового антигена и КПГ усиливается продукция антител, специфически
связывающих использованный антиген. По данным патента РФ2195308 при
совместном введении мышам 20 мкг КПГ и 50 мкг яичного альбумина концентрация
антител в крови мышей достигала титров 1: 22000, что было достоверно выше ответа
на введение 50 мкг яичного альбумина без КПГ (1:13000). Адъювантный эффект КПГ
был сопоставим с эффектом известного адъюванта липопептида Pam3Cys-Ser-Lys4.
При введении 20 мкг липопептида совместно с 50 мкг яичного альбумина в крови
мышей накапливались антитела к яичному альбумину в титре 1:20000.
Недостатком способа повышения интенсивности иммунной реакции путем
смешивания антигена и КПГ является необходимость введения достаточно больших
доз антигена. Так, в эксперименте при иммунизации мышей белковыми антигенами
(яичный альбумин, бычий сывороточный альбумин) добавление КПГ не позволяет
существенно снизить дозу антигена, приходится применять обычные дозы порядка 50
мкг антигена в расчете на мышь.
Несмотря на обилие предложенных вариантов, все еще не найден универсальный
иммуностимулирующий носитель, имеющий оптимальное сочетание эффективности и
безопасности. Чаще всего, эффективные иммуностимулирующие носители
оказываются небезопасными для человека и животных, вызывают более или менее
выраженные побочные (токсические) эффекты. Напротив, безопасные носители
оказываются недостаточно эффективными иммуностимуляторами.
Настоящее изобретение направлено на создание безопасного препарата
обладающего высокой эффективностью в качестве иммуностимулирующего носителя
и пригодного для конструирования иммуногенов и вакцин.
Задачей изобретения является повышения удельной иммуногенности антигена,
снижение дозы антигена, необходимой для индукции иммунного ответа, расширение
арсенала иммуностимулирующих носителей. Указанная задача решается путем
ковалентной сшивки КПГ и антигена.
Изобретение осуществляется следующим образом. КПГ может быть получен
различными способами из растительного сырья. Ниже приведен способ получения
КПГ, который иллюстрирует изобретение, но не ограничивает объем притязаний.
Для получения КПГ 5 кг проростков картофеля семейства Solanaceae (S. tuberosum)
измельчают, прибавляют 10 л воды и экстрагируют при комнатной температуре при
перемешивании в течение 2 часов. Смесь отжимают с помощью механического пресса.
Водный экстракт диализуют и концентрируют до объема 1 л путем ультрафильтрации
на фильтре 10 кДа. К концентрату прибавляют хлористый натрий из расчета 100 мг
на 100 мл и 3 объема 96% этилового спирта. Осадок выделяют центрифугированием
при 4000 об/мин в течение 30 мин.
Осадок промывают 300 мл 96% этилового спирта, центрифугируют и сушат на
Ñòð.: 6
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
воздухе. Затем проводят повторное переосаждение полученного осадка солевым
агентом - хлористым кальцием. Для этого 10 г сухого полупродукта растворяют в 1 л
дистиллированной воды при перемешивании при комнатной температуре в течение 1
часа. Нерастворившийся осадок отбрасывают, а к маточнику прибавляют 150 мл 5%
раствора хлористого кальция. Выпавший осадок, представляющий собой кислый
пептидогликан-сырец, отделяют центрифугированием. Затем переводят его в
растворимую форму путем добавления насыщенного раствора хлористого натрия и
выдерживают смесь при перемешивании и нагревании при 50°С до полного
растворения. Полученный раствор наносят на колонку TSK HW-75F. Колонку
элюируют водой, собирают первый высокомолекулярный пик с молекулярной массой
от 1200 до 40000 кДа. Раствор концентрируют на роторном испарителе и сушат
лиофильно. Выход кислого пептидогликана составляет 170 мг. Массовое соотношение
между глюкозой и уроновыми кислотами составляет 1:4. Далее осуществляют
ковалентное соединение КПГ с иммуногенами.
1. Ковалентное соединение КПГ с антигеном, содержащим сульфгидрильные
группы, осуществляется с помощью водорастворимого гетеробифункционального
реагента, содержащего малеимидную и N-гидрокси-сукцинимидную группы. Реакция
конъюгации проводится в две стадии. На первой стадии реакции проводится активация
КПГ путем с помощью гетеробифункционального реагента сульфосукцинимидил
4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксалата (Sulfo-SMCC). При этом
N-гидрокси-сукцинимидная группа Sulfo-SMCC реагирует с аминогруппами КПГ (по
аргинину и лизину). После активации КПГ удаляют непрореагировавший Sulfo-SMCC
и другие низкомолекулярные продукты путем диализа или гель-фильтрации с
порогом 500 кДа. На второй стадии реакции осуществляется взаимодействие
малеимидной группы, присоединенной к активированному КПГ, с сульфгидрильной
группой антигена. В результате реакции образуется ковалентный комплекс
(конъюгат) формулы:
KПГ-NH-R1-SH-R2,
где R1 - любой водорастворимый гетеробифункциональный реагент, содержащий
малеимидную и N-гидрокси-сукцинимидную группы, R2 - любой антиген, содержащий
35
40
45
50
сульфгидрильную группу.
Отсутствие SH-групп в КПГ позволяет избежать образования комплексов КПГ-NHR1-SH-KПГ. После конъюгации несвязавшийся антиген удаляют гель-фильтрацией или
ультрафильтрацией с порогом 500 кДа. Факт ковалентного соединения КПГ и
антигена доказывается любым методом - спетрофотометрически, флуориметрически,
красителями на белок, антителами, специфически связывающимися с антигеном - по
появлению белкового сигнала в высокомолекулярной области (хроматография,
электрофорез или другие методы разделения), свойственной КПГ.
2. Ковалентное соединение КПГ с любым антигеном, содержащим аминогруппы,
проводится с помощью гетеробифункционального реагента, способного вступать в
реакцию с карбоксильными группами и аминогруппами. Примером такого
гетеробифункционального реагента является 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)
карбодиимида гидрохлорид (EDC).
Реакция проводится в две стадии. На первой стадии проводят реакцию КПГ с EDC.
При этом EDC реагирует с карбоксильными группами КПГ: (галактуроновая,
аспарагиновая и глутаминовая кислоты). Образуется активированный КПГ,
модифицированный O-ацилизомочевиной. Этот промежуточный продукт нестабилен.
Ñòð.: 7
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Поэтому первая стадия реакции проводится в присутствии стабилизатора
N-гидроксисульфосукцинимида (Sulfo-NHS). На второй стадии проводят реакцию
между КПГ, модифицированным O-ацилизомочевиной, и антигеном, имеющим
первичные аминогруппы. В результате реакции образуется ковалентный комплекс
(конъюгат) формулы:
КПГ-CO-NH-R,
где R - любой антиген, содержащий первичную аминогруппу.
Несвязавшийся антиген удаляют гель фильтрацией или ультрафильтрацией с
порогом 500 кДа. Факт ковалентного соединения антигена и КПГ доказывается
любым методом - флуриметрически, спетрофотометрически, красителями на белок,
специфическими антителами - по появлению белкового сигнала в
высокомолекулярной области (хроматография, электрофорез или другие методы
разделения), свойственной КПГ.
3. Использование конъюгатов, полученных в соответствии с п.1 и п.2, для
иммунизации экспериментальных животных индуцирует интенсивный иммунный
ответ, специфичный в отношении введенного антигена. Причем максимальный по
интенсивности иммунный ответ достигается при введении в 10-100 раз меньших доз
антигена по сравнению с дозами того же антигена, необходимыми при иммунизации
смесью антиген+КПГ.
Преимущества данного способа заключаются в следующем:
- в 10-100 раз снизится расход антигена при проведении иммунизации;
- существенно уменьшится побочное действие токсических антигенов, обладающих
реактогенностью (местные и общие токсические реакции на антиген), например,
микробных токсинов и токсоидов, вирусных гемагглютининов, нейраминидаз и
других веществ, введение которых приводит не только к развитию иммунной реакции,
но и к развитию каких-то патологических (побочных) эффектов.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Конъюгация овальбумина с КПГ с использованием Sulfo-SMCC.
В качестве антигена использовали природный белок овальбумин. Конъюгацию
овальбумина с КПГ проводили с помощью гетеробифункционального реагента SulfoSMCC (коммерческий продукт фирмы Pierce, cat.N 22322). Реакцию проводили в
соответствии с протоколом фирмы-производителя, адаптировав к особенностям КПГ.
Активация КПГ с помощью Sulfo-SMCC.
27,7 мг КПГ растворяют в 15 мл дистиллированной воды при перемешивании на
магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре. К полученному
раствору прибавляют 10 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,35 и присыпают 3,1
мг Sulfo-SMCC. Смесь оставляют в термостате при 37°С в течение 1 часа,
периодически перемешивая. По окончании инкубации раствор охлаждают до
комнатной температуры и наносят на хроматографическую колонку с
гелем TOYOPEARL HW-65F. Элюцию проводят дистиллированной водой, детекцию
пиков - рефрактометром. Собирают первый высокомолекулярный пик с
молекулярной массой более 500 кДа. Раствор активированного КПГ упаривают на
роторном испарителе до 13 мл. Подготовка овальбумина к конъюгации.
Коммерческий препарат овальбумина предварительно растворяют,
обрабатывают 2-меркаптоэтанолом для восстановления сульфгидрильных групп,
затем освобождают от микроагрегатов методом гель-проникающей хроматографии.
17,6 мг Овальбумина (Calbiochem cat.N 32467) растворяют в 7 мл восстанавливающего
Ñòð.: 8
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
буфера (0,1 М фосфатного буфера рН 7,4, 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной
кислоты натриевая соль - ЭДТА, 0,6% 2-меркаптоэтанола). Полученный раствор
выдерживают при комнатной температуре в течение 2 часов при перемешивании на
магнитной мешалке, затем фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и
наносят на хроматографическую колонку (950×30 мм) с гелем TOYOPEARL HW-75F.
Фракции элюируют водой очищенной, детектируют методом рефрактометрии.
Собирают фракцию 40-50 кДа, соответствующую молекулярной массе овальбумина.
Методом спектрофотометрии определяют максимальное поглощение УФ-света (280
нм), что в сравнении с калибровочными растворами овальбумина позволяет
определить концентрацию белка в собранной фракции, она составила 0,31 мг/мл.
Конъюгация.
К 4 мл активированного КПГ приливают 3 мл раствора овальбумина и 3 мл
конъюгирующего буфера (150 мМ хлорида натрия, 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,2
с добавлением 1 мМ ЭДТА). Реакционную смесь выдерживают в холодильнике при
4°С в течение 15 часов, после чего наносят на колонку с гелем TOYOPEARL HW -75 F.
Фракции элюируют водой очищенной, детектор - рефрактометр. Собирают первый
пик с молекулярной массой более 500 кДа. Собранный первый пик упаривают на
роторном испарителе до 10 мл и сушат на лиофильной сушке. Получают 2,3 мг
конъюгата КПГ-овальбумин.
Содержание овальбумина в конъюгате определяют по флуоресценции
(флуориметр Hitachi 850, возбуждение 280 нм, щель 3 нм, флуоресценция 320 нм,
щель 3 нм) при калибровке овальбумином. Содержание овальбумина в конъюгате
КПГ-овальбумин составляло около 1%.
Пример 2.
Конъюгация рекомбинантного белка вируса иммунодефицита человека (рВИЧ) и
КПГ с использованием Sulfo-SMCC.
В качестве антигена использовали рекомбинантный белок (коммерческий продукт
фирмы ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Cat. No. HI V-110), представляющий собой
полипептид, в котором содержатся иммунодоминантные фрагменты четырех белков
ВИЧ-1, в частности gag pl7, р24, gp120 и gp41. Белок рВИЧ поставляется в виде
раствора 1 мг/мл в буфере 20 mM PBS рН7.8, 20 тМ NaCl 0.5M, содержащем 1 тМ
дигиотреигола и 8 М мочевины.
Смену буфера проводили на колонке TOYOPEARL HW-40F (440×10 мм),
предварительно уравновешенной буфером, содержащим 0,02 М фосфата натрия, 0,02
М NaCl и 0,1 мМ ЭДТА. Фракции элюировали буфером, содержащим 0,02 М фосфата
натрия, 0,02 М NaCl и 0,1 мМ ЭДТА. Детектор - рефрактометр. Собирали фракцию
объемом 7 мл, соответствующую пику белка рВИЧ (молекулярная масса ~100 кДа),
которую затем концентрировали до 2 мл.
Активацию КПГ с помощью Sulfo-SMCC и конъюгацию рВИЧ с активированным
КПГ проводили в соответствии с методами, описанными в примере 1. Выход
конъюгата КПГ-рВИЧ составил 10,6 мг. Содержание рВИЧ в конъюгате составило
0,33%.
Пример 3.
Конъюгация рекомбинантного Е-белка (рЕ) коронавируса и КПГ с
использованием EDC.
В качестве антигена использовали рЕ - рекомбинантный белок оболочки
коронавируса, ассоциированного с атипичной пневмонией (severe acute respiratory
syndrom, SARS). Белок рЕ представляет собой полипептидную цепь длиной 76
Ñòð.: 9
RU 2 378 015 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
аминокислотных остатков. В работе использовали коммерческий продукт
фирмы ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Cat.No. SARS-252), который поставляется в виде
раствора 1 мг белка рЕ в 1 мл буфера 50 mM Tris-HCl и 60 mM NaCl, содержащего 50%
глицерина.
Смену буфера проводят, как в примере 2. Получают 2 мл раствора белка рЕ в
фосфатном буфере. Конъюгацию рЕ и КПГ проводят с помощью
гетеробифункционального реагента EDC (в работе использован коммерческий
продукт фирмы Pierce, Cat. No. 77149) в присутствии сульфо-N-гидроксисукцинимида
(сокращенно, Sulfo-NHS, коммерческий продукт фирмы Pierce, Cat. No. 24510). Реакцию
проводят по протоколу фирмы Pierce, адаптировав к особенностям КПГ. Для этого
10,2 мг КПГ растворяют в 5 мл 0,1 М 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты рН
4,16, перемешивая на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30
мин. К полученному раствору активированного КПГ присыпают 2,2 мг EDC и 3
мг Sulfo-NHS, перемешивают 30 мин. Затем добавляют 2 мл раствора белка рЕ, и
смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1,5 часов.
Конъюгат КПГ-рЕ выделяют на хроматографической колонке с гелем TOYOPEARL
HW-75F, как описано в примере 1. Получают 7 мг конъюгата.
Содержание рЕ-белка в конъюгате КПГ-рЕ составляло 1,6%.
Пример 4.
Оценка иммуногенности конъюгата КПГ-овальбумин, полученного в Примере 1.
Иммуногенность конъюгата КПГ-овальбумин изучали у лабораторных мышей
самцов (СВА×C57B1/6)F1 весом 20 г. Конъюгат сравнивали с исходным антигеном
овальбумином и физической смесью овальбумина с КПГ. Антигены растворяли в
физиологическом растворе 0,9% NaCl, вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 0,2
мл. Повторную иммунизацию той же дозой и в том же объеме проводили через 1 месяц.
Кровь получали через 1 неделю после повторной иммунизации. Кровь от 10 мышей
одной экспериментальной группы пулировали, получали сыворотку, которую
разливали на несколько порций по 100 мкл и замораживали до тестирования.
Содержание в сыворотке антител, специфически связывающихся с овальбумином,
определяли иммуноферментным методом по стандартной методике. Коммерческий
препарат овальбумина производства фирмы Calbiochem растворяли в карбонатном
буфере (0,05 М, рН 9,5) в концентрации 10 мкг/мл, вносили по 100 мкл в лунки 96-лу
ночного планшета (Nunc, Maxisorb, Cat. No. 442404), инкубировали ночь в
холодильнике. Лунки отмывали 3 раза 200 мкл фосфатного буфера (0,15 М хлорида
натрия, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,4), содержащего 0,1% Tween-20 (Serva). «Забивку»
проводили 1% раствором казеина в фосфатном буфере, содержащем 0,1% Tween-20 в
течение 45 мин (при 37°С), по 150 мкл на лунку. После 3-кратной отмывки 250 мкл
фосфатного буфера с 0,1% Tween-20 в лунки планшета вносили разведения
исследуемой сыворотки экспериментальных мышей. Серийные разведения сыворотки
в фосфатном буфере с 0,1% Tween-20 готовили, начиная с исходного разведения 1:50, с
шагом разведения 3. После внесения в лунки серийных разведении исследуемых
сывороток планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Отмывку проводили
3-кратным внесением 250 мкл фосфатного буфера с 0,1% Tween-20.
Для детекции мышиных антител в лунки планшета вносили по 100 мкл конъюгата
козьих антител, специфичных к IgG мыши, с пероксидазой хрена (фирма «Сорбент»,
Москва) в разведении 1:1000 в фосфатном буфере, содержащем 0,1% Tween-20,
инкубировали 1 час при 37°С. После 3-кратной отмывки 250 мкл фосфатного буфера
с 0,1% Tween-20 в лунки планшета вносили субстрат для детекции пероксидазы (0,6
Ñòð.: 10
RU 2 378 015 C2
5
10
15
мг/мл ортофенилендиамина гидрохлорида в 0,1 М цитратном буфере, рН 5, 3%
перекись водорода), инкубировали 10 мин. Цветную реакцию останавливали, заливая
в лунки планшета по 100 мкл 1 М серной кислоты. Измерение интенсивности реакции
проводили фотометрически при 492 нм на планшетном фотометре MRX фирмы Dynex
(США).
В таблице 1 представлены результаты тестирования иммуногенности конъюгата
КПГ-овальбумин (30 мкг конъюгата, что составляет 0,3 мкг овальбумина в расчете на
мышь) в сравнении с овальбумином (0,3 мкг и 30 мкг на мышь) и физической смесью
КПГ плюс овальбумин (30 мкг КПГ плюс 0,3 мкг и 30 мкг овальбумина в расчете на
мышь). Введение мышам конъюгата КПГ-овальбумин вызывало продукцию антител,
более интенсивную, чем введение овальбумина или смеси КПГ с овальбумином. При
сравнении уровня иммунной реакции на малые дозы овальбумина (0,3 мкг на мышь)
можно определить, что удельная иммуногенность овальбумина в составе конъюгата
в 100 или более раз выше по сравнению с самим овальбумином или смесью КПГ плюс
овальбумин.
Таблица 1.
Иммунная реакция мышей (СВА × C57B1/6)F (в ответ на введение конъюгата КПГ-овальбумин в сравнении с введением
1
20
овальбумина или смеси КПГ с овальбумином.
Иммуноген
25
30
35
40
45
Титры антител в сыворотке мышей, иммунизированных разными дозами антигена*
0,3 мкг овальбумина
30 мкг овальбумина
Конъюгат КПГ-овальбумин, 30 мкг
55000
н.и.**
Смесь: 30 мкг КПГ плюс овальбумин
500
30000
Овальбумин
100
20000
Примечания:
(*) представлены титры антител через 1 неделю после повторного введения указанных доз иммуногенов (указаны дозы по
овальбумину);
(**)н.и. означает - не исследовали.
Пример 5.
Оценка иммуногенности конъюгата КПГ-рВИЧ, полученного в Примере 2.
Иммуногенность конъюгата КПГ-рВИЧ изучали у лабораторных мышей самцов
(СВА × C57Bl/6)F1. Конъюгат сравнивали с исходным антигеном рВИЧ и физической
смесью КПГ плюс рВИЧ.
Иммунизацию лабораторных мышей и определение титров антител проводили, как
в примере 4. В качестве иммуногена экспериментальным мышам вводили конъюгат
КПГ-рВИЧ (дозы по и 0,1 мкг на мышь, дозы по КПГ - 30 мкг), или смесь КПГ плюс
рЕ (дозы - 0,1 мкг или 1 мкг рВИЧ на мышь плюс 30 мкг КПГ), или рВИЧ (дозы - 0,1
мкг, 1 мкг, или 5 мкг на мышь).
В таблице 2 представлена интенсивность продукции антител, специфичных к рВИЧ,
через 1 неделю после повторного введения указанных иммуногенов. Очевидно, что
удельная иммуногенность антигена рВИЧ в составе конъюгата КПГ-рВИЧ была в 50
раз выше иммуногенности рВИЧ и в 10 раз выше иммуногенности смеси КПГ плюс
рВИЧ.
Таблица 2.
Иммунная реакция мышей (СВА × C57B1/6)F1 в ответ на введение конъюгата КПГ-рВИЧ в сравнении с введением рВИЧ или смеси
КПГ с рВИЧ.
50
Иммуноген
Титры антител в сыворотке мышей, иммунизированных разными дозами
антигена*
0,1 мкг рВИЧ
1 мкг рВИЧ
Конъюгат КПГ-рВИЧ (30 мкг)
22000
н.и.**
н.и.**
Смесь 30 мкг КПГ плюс рВИЧ
500
20000
н.и.**
Ñòð.: 11
5 мкг рВИЧ
RU 2 378 015 C2
рВИЧ
100
2500
20000
Примечания:
(*) представлены титры антител через 1 неделю после повторного введения указанных доз иммуногенов (указаны дозы по
овальбумину);
(**)н.и. означает - не исследовали.
5
10
15
20
Пример 6. Оценка иммуногенности конъюгата КПГ-рЕ, полученного в Примере 3.
Иммуногенность конъюгата КПГ-рЕ изучали у лабораторных мышей самцов (СВА
× C57B1/6)F1. Конъюгат сравнивали с исходным антигеном рЕ и физической смесью
КПГ плюс рЕ.
Иммунизацию лабораторных мышей и определение титров антител проводили, как
в примере 4. В качестве иммуногена экспериментальным мышам вводили конъюгат
КПГ-рЕ (дозы по рЕ - 0,5 мкг на мышь, дозы по КПГ - 30 мкг), или смесь КПГ плюс
рЕ (дозы - 0,5 мкг или 5 мкг рЕ на мышь плюс 30 мкг КПГ), или рЕ (дозы - 0,5 мкг
или 5 мкг на мышь).
В таблице 3 представлена интенсивность продукции антител, специфичных к рЕ,
через 1 неделю после повторного введения указанных иммуногенов. Из
представленных данных видно, что удельная иммуногенность антигена рЕ в составе
конъюгата КПГ-рЕ была в 8-10 раз выше иммуногенности рЕ и смеси рЕ с КПГ.
Таблица 3. Иммунная реакция мышей (СВА × C57B1/6)F1 в ответ на введение конъюгата КПГ-рЕ в сравнении с введением рЕ или
смеси КПГ с рЕ.
Иммуноген
25
30
35
40
45
50
Титры антител в сыворотке мышей, иммунизированных разными дозами
антигена*
0,5 мкг рЕ
5 мкг рЕ
Конъюгат КПГ-рЕ, 30 мкг
8000
н.и.**
Смесь 30 мкг КПГ плюс рЕ
500
10000
рЕ
100
10000
Примечания:
(*) представлены титры антител через 1 неделю после повторного введения указанных доз иммуногенов (указаны дозы по
овальбумину);
(**)н.и. означает - не исследовали.
Формула изобретения
1. Конъюгат для иммунизации и вакцинации, содержащий иммуноген, ковалентно
соединенный с высокомолекулярным носителем, отличающийся тем, что в качестве
высокомолекулярного носителя используют кислый пептидогликан с молекулярной
массой 1200-40000 кДа, имеющий массовое соотношение между глюкозой и
уроновыми кислотами равное, 1:2-4.
2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что пептидная часть молекулы кислого
пептидогликана составляет (13±3) мас.%.
3. Конъюгат по п.2, отличающийся тем, что сахарный состав полисахаридной части
кислого пептидогликана содержит галактуроновую кислоту 18±6%, глюкозу 9±3%,
галактозу 5,5±2%, арабинозу 3,8±1,3%, рамнозу 1,9±0,9%, маннозу 0,7±0,25%, а
пептидная часть содержит аргинин 2,6%, и лизин 1,8%, а также аспарагиновую
кислоту 10,6% и глутаминовую кислоту 11,1%.
4. Конъюгат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что иммуноген представляет
собой рекомбинантный белок вируса иммунодефицита человека.
5. Конъюгат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что иммуноген представляет
собой рекомбинантный Е-белок (рЕ) коронавируса, ассоциированного с атипичной
пневмонией.
6. Способ повышения иммуногенности путем ковалентного соединения иммуногена
Ñòð.: 12
CL
RU 2 378 015 C2
с кислым пептидогликаном с молекулярной массой 1200-40000 кДа, имеющим
массовое соотношение между глюкозой и уроновыми кислотами, равное 1:2-4.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòð.: 13