Диссертация - Центр теоретических проблем физико
advertisement
ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК УНИВЕРСИТЕТ ПЕНСИЛЬВАНИИ (ФИЛАДЕЛЬФИЯ, США) На правах рукописи Зайцев Анатолий Владимирович Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса Специальность 03.01.02. – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н. профессор, Ф.И.Атауллаханов Москва – 2015 СОДЕРЖАНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................ 5 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................................... 10 2.1 Общие сведения о митозе ............................................................................................ 10 2.1.1 Фазы митоза и строение митотического аппарата ............................................. 10 2.1.2 Микротрубочки ...................................................................................................... 13 2.1.3 Общие сведения о кинетохоре ............................................................................. 13 2.2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор ................................................... 16 2.3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора................................................................................................................................ 16 2.4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora B играет ключевую роль в установлении биориентации хромосом ..................................................................... 19 2.5 Комплекс NDC80 – важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки ......................................................................................................................... 23 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................... 28 3.1 Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол .... 28 3.1.1 Изготовление многоразовых проточных камер. ................................................. 28 3.1.2 Подготовка покровных стекол ............................................................................. 31 3.2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80. 32 3.3 Микроскопия полного внутреннего отражения ......................................................... 33 3.4 Анализ данных микроскопии ...................................................................................... 35 3.4.1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF микроскопии. ....................................................................................................................... 41 3.4.2 Анализ кооперативности NDC80-MT взаимодействия с использованием метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP). ............................. 46 3.5 4 Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ. .................................. 46 РЕЗУЛЬТАТЫ ..................................................................................................................... 49 2 4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора................................................................................................................................ 49 4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки ..................................... 53 4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к сайту. 53 4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ. .................. 57 4.2.3 Кооперативность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ. ..................... 59 4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro ..... 65 4.3.1 Взаимодействие NDC80 и MT определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Hec1 . ......................................................................... 65 4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1 приводит к градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ. .................................................................. 70 4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Hec1 градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ. 74 4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие NDC80-MT. .......................................................................................................................... 80 4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при фосфорилировании хвоста Hec1. ....................................................................................... 89 4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80. ....................... 92 4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну фосфомиметическая мутацию в хвосте Hec1 комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок. .......................................................................................................... 92 4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления. .................. 93 4.4.3 Алгоритм симуляции............................................................................................. 95 4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора................................... 97 3 4.5 Модель кинетохора, содержащая сайты связывания КМТ не может описать наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при фосфорилировании. ............................................................................................................... 101 4.6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных. ................... 105 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................. 107 6 ВЫВОДЫ ........................................................................................................................... 109 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..................................... 110 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................. 111 4 1 ВВЕДЕНИЕ Митоз является важнейшим этапом в клеточном цикле, в результате которого из одной материнской клетки образуются две дочерние клетки. Митотическое деление клеток лежит в основе развития и роста многоклеточных организмов, обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни организма, а также регенерацию после повреждений. Важнейшей задачей митоза является точное распределение генетической информации материнской клетки по двум дочерним клеткам, что обеспечит их нормальное функционирование и последующее деление. Это происходит через распределение сестринских хромосом материнской клетки по двум дочерним клеткам. Хромосомы перемещаются в процессе митоза посредством взаимодействия с митотическим веретеном - сложным митотическим аппаратом, который состоит главным образом из двух полюсов деления и растущих из них микротрубочек. Микротрубочки представляют собой динамические полимеры белка тубулина, которые случайным образом переходят из состояния полимеризации в состояние быстрой деполимеризации. Взаимодействие хромосом и микротрубочек происходит через специальные белковые структуры на хромосомах, называемые кинетохорами. Кинетохор играет ключевую роль в установлении закрепления хромосомы и веретена деления, регуляции этих закреплений в процессе митоза и поддержании этих закреплений в процессе деполимеризации микротрубочки. Механизмы того, как кинетохор взаимодействует с микротрубочками, однако, остаются плохо изученными. Цель работы: Исследовать взаимодействие микротрубочки с кинетохорным комплексом NDC80, изучить влияние фосфорилирования белка Hec1 на это взаимодействие. Построить математическую модель кинетохора, позволяющую описать наблюдаемую in vivo регуляцию закрепления микротрубочек и кинетохора на основе полученных в экспериментах in vitro данных о взаимодействии комплекса NDC80 и микротрубочки. Задачи исследования: 1. Построить математическую модель кинетохора, в которой взаимодействие микротрубочки и кинетохорных белков будет динамическим. 2. Экспериментально изучить взаимодействие как единичных комплексов NDC80, так и ансамблей комплексов NDC80 с микротрубочками in vitro. 5 3. Экспериментально изучить влияние фосфорилирования гибкого N-концевого участка белка Hec1 на взаимодействие комплекса NDC80 с микротрубочкой и на кооперативность взаимодействия комплекса NDC80. 4. Использовать полученные in vitro молекулярные параметры взаимодействия комплекса NDC80 и его фосфорилированных форм в построенной математической модели для анализа влияния фосфорилирования комплекса NDC80 на регуляцию взаимодействия кинетохора и микротрубочек. Научная новизна: В данной работе была впервые предложена теоретическая модель закрепления микротрубочки и кинетохора через ансамбль независимо связывающихся с микротрубочкой кинетохорных комплексов, в которой закрепление имеет динамический характер. Теоретически было показано, что для того, чтобы обеспечить закрепление микротрубочки и кинетохора с физиологическим значением характеристического времени взаимодействия 2 - 10 минут, молекулярные времена взаимодействия кинетохорных комплексов и микротрубочки должны составлять доли секунды (50 – 500 мс). Впервые были экспериментально изучены характеристики взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой и его фосфорилированных форм, в том числе и промежуточных форм с неполным числом фосфорилированных сайтов в физиологическом буфере. Показано, что увеличение числа фосфомиметических мутаций в N-терминальном домене белка Hec1 (часть комплекса NDC80) приводит к постепенному снижению аффинности взаимодействия единичных комплексов NDC80 и микротрубочки. Был разработан новый метод получения кривых связывания белков и микротрубочек на основе флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Через использование данного метода впервые было количественно охарактеризовано влияние фосфорилирования на константу диссоциации KD комплексов NDC80 и микротрубочки, а также кооперативность взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочки. Также был разработан метод количественного анализа кооперативности взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой на основе метода анализа восстановления флуоресценции после фотовыцветания. С использованием данного метода были получены значения параметра кооперативности для нефосфорилированной и фосфорилированной формы комплекса NDC80, которые оказались статистически неразличимы. Это хорошо согласуется с выводом, сделанным на основе кривых связывания комплекса NDC80 и микротрубочки. 6 Полученные экспериментально значения скоростей диссоциации koff и параметра кооперативности для комплексов NDC80 с различной степенью фосфорилирования были использованы для построения математической модели кинетохора человека. Было показано, что наблюдаемая in vivo регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохора фосфорилированием комплексов NDC80 достигается только при определенном способе организации комплексов NDC80 на кинетохоре – в виде «динамического газона». Научно-практическая значимость Проведенное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия кинетохоров и митотического аппарата клетки. В частности, демонстрируется, что наблюдаемая в клетках регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохоров может быть описана молекулярными параметрами взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками и их фосфорилированных форм. Причем это возможно достичь только при определенной организации комплексов NDC80 на кинетохоре в виде «динамического газона». Разработанные математические модели взаимодействия микротрубочек и кинетохоров и измеренные in vitro молекулярные параметры кинетохорных белков служат базой для дальнейшего количественного изучения механизмов сегрегации хромосом в здоровых клетках и понимания того, как могут быть предотвращены или исправлены ошибки в клетках с хромосомной нестабильностью. Положения, выносимые на защиту 1. Разработана математическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки через ансамбль независимо взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных комплексов, позволяющая описать обмен кинетохорных микротрубочек. 2. Было изучено взаимодействие с микротрубочками кинетохорных комплексов NDC80 на уровне отдельных молекул. 3. Впервые для белков, взаимодействующих с микротрубочками, был охарактеризован механизм плавной регуляции аффинности взаимодействия через множество сайтов фосфорилирования. 7 4. Полное число фосфорилирований в N-концевом участке белка Hec1, а не конкретное расположение сайтов фосфорилирования, регулирует взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой. 5. Фосфорилирование N-концевого участка белка Hec1 комплекса NDC80 не влияет на кооперативность взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой. 6. Предложена новая модель организации комплексов NDC80 на кинетохоре – модель динамического газона, в которой комплексы NDC80 не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочкой, а распределены по поверхности кинетохора случайным образом. Расчеты, проведенные с помощью данной модели, позволяют описать наблюдаемую in vivo в клетках регуляцию взаимодействия кинетохормикротрубочка через молекулярные параметры комплексов NDC80, измеренные в экспериментах in vitro. Список работ опубликованных по теме диссертации По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 статьи и тезисы в сборниках 6 конференций: Статьи: 1. Zaytsev, A.V., Sundin L.J.R., DeLuca K.F, Grishchuk E.L. and DeLuca J.G. (2014) Accurate phosphoregulation of kinetochore-microtubule affinity requires unconstrained molecular interactions. J. Cell Biol. 206(1):45-59. 2. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Grishchuk E.L. (2014) Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85). 3. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2013) Highly transient molecular interactions underlie stability of kinetochore-microtubule attachment during cell division. Cell Mol. Bioeng. 6(4). 4. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Gudimchuk N., Grissom P.M., Gintsburg A.L., Ataullakhanov F.I., McIntosh J.R., Grishchuk E.L. (2013) Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 110(19). Тезисы в сборниках конференций: 1. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2014) Toward quantitative theoretical description of the kinetochore-microtubule interactions and their roles in ensuring 8 accurate chromosome segregation. American Society for Cell Biology Annual Meeting. December 6-10, Philadelphia, Pennsylvania, USA. 2. Zaytsev A. V., Sundin L. J. R., Nikashin B., DeLuca K. F., Mick J., Guimaraes G. J., Ataullakhanov F. I., Grishchuk E. L., DeLuca J. G. (2013) Incremental phosphorylation of a dynamic lawn of NDC80 complexes provides graded control of kinetochore-microtubule affinity. Poster presentation. The 57th Annual Biophysical Society Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA. 3. Zaytsev A. V., Sundin L. J. R., Nikashin B., DeLuca K. F., Mick J., Guimaraes G. J., Ataullakhanov F. I., Grishchuk E. L., DeLuca J. G., (2012) Incremental phosphorylation of competing NDC80 complexes tunes kinetochores for diverse mitotic functions. Abstract # 385Poster. American Society for Cell Biology Annual Meeting. San Francisco, California, USA. 4. Zaytsev A.V., Sundin L.J.R., Nikashin B., Guimaraes G.J., DeLuca K.F., Mick J., Grishchuk E.L., DeLuca J.G., (2012) Incremental phosphorylation of Hec1 tunes kinetochoremicrotubule binding affinity for diverse mitotic functions. Research Retreat and Symposium “Building Cellular Complexity One Molecule at a Time”, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA. 5. Zaytsev A.V., Sundin L.J.R., Nikashin B., Guimaraes G. J., DeLuca K. F., Mick J., Grishchuk E.L., DeLuca J.G. (2011) Incremental phosphorylation of Hec1 tunes kinetochoremicrotubule binding affinity for diverse mitotic functions. Poster presentation. American Society for Cell Biology Annual Meeting. Denver, Colorado, USA. 6. Ataullakhanov F.I., Zaytsev A.V., Welburn J., Cheeseman I., Grishchuk E.L., (2011) Molecular-Mechanical Model of Kinetochore-Microtubule Interactions Identifies Flexibility of the Kinetochore Mesh as a Key Determinant of Errorless Bi-Orientation. Abstract# 862-Poster. The 55th Annual Biophysical Society Meeting. Baltimore, Maryland, USA. 7. Ataullakhanov F.I., Zaytsev A.V., Welburn J., Cheeseman I., Grishchuk E.L., (2010) Spatial phospho-regulation of microtubule affinity in a flexible kinetochore mesh is necessary and sufficient for expedient error-correction during chromosome segregation. Abstract #784 American Society for Cell Biology Annual Meeting. Philadelphia, Pennsylvania, USA. 9 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Митотическое деление клеток (митоз) – важнейший процесс, который лежит в основе развития и роста многоклеточных организмов, обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни организма, а также регенерацию после повреждений. В процессе митоза из каждой материнской клетки создаются две ее дочерние копии. Важнейшей задачей митоза является точное распределение генетической информации материнской клетки по двум дочерним клеткам, что обеспечит их нормальное функционирование и последующее деление. В фазе митоза генетическая информация клетки представлена в виде плотно упакованных структур ДНК и белков, называемых хромосомами. Передача генетической информации дочерним клеткам происходит через распределение сестринских хромосом материнской клетки по двум образующимся дочерним клеткам. Общие сведения о митозе 2.1 Сведения о митозе обширны и многообразны. Общее число работ на эту тему, вероятно, превышает десятки тысяч, и в небольшом обзоре рассмотрено быть не может. В данном обзоре литературы будут рассмотрены следующие вопросы: Фазы митоза и строение митотического аппарата Строение микротрубочек Общие сведения о кинетохоре Более подробно будут рассмотрены вопросы динамики кинетохор-микротрубочкового взаимодействия и теоретические представления об этом процессе. Комплекс NDC80 занимает особое место в нашей работе и будет рассмотрен отдельно 2.1.1 Фазы митоза и строение митотического аппарата Обычно выделяют четыре фазы митотического деления: профаза, метафаза, анафаза и телофаза (рис. 2.1). В профазе происходит конденсация хромосом, начинает формироваться веретено деления, происходит распад ядерной оболочки, и хромосомы оказываются случайно расположенными в цитоплазме. Перед переходом клетки в прометафазу каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соответствующих двум копиям молекулы ДНК. 10 Рис. 2.1. Последовательность фаз митотического деления клетки. 11 Сестринские хроматиды соединены между собой в специальной области, называемой центромерой. На каждой хроматиде есть специальная область, называемая кинетохором, через которую к хромосомам могут присоединяться микротрубочки, тем самым связывая их с веретеном деления. Веретено деления образует сложную пространственную структуру, состоящую из двух полюсов деления и растущих из них микротрубочек, которая самоорганизуется из единичных белков на стадии профазы митоза. Полюса деления образуются из двух центриолей, которые разделяются на начальной стадии митоза, в профазе, и начинают расходиться в противоположные стороны. Каждый полюс деления представляет собой центр роста микротрубочек. В течение прометафазы происходит процесс, называемый биориентацией хромосом – к кинетохорам хромосом присоединяются и отсоединяются микротрубочки от разных полюсов деления. Причем наблюдаются как латеральные, так и концевые взаимодействия микротрубочек с кинетохорами. Этот сложный процесс происходит до тех пор, пока не достигается состояние, в котором к каждой хроматиде подходят микротрубочки только от одного полюса деления. Параллельно происходит движение хромосом в сторону центра клетки, где они начинают выстраиваться и образовывать так называемую метафазную пластинку. Когда процесс образования метафазной пластинки завершается и кинетохоры всех хромосом установят закрепления с микротрубочками, происходит переход в анафазу, в которой происходит ключевой процесс в делении клетки - перемещение хромосом к противоположным полюсам деления. В анафазе кинетохоры сестринских хроматид разъединяются, и хроматиды Микротрубочки веретена деления, становятся самостоятельными прикреплённые к хромосомами. кинетохорам, начинают деполимеризоваться и тянуть за собой хромосомы; таким образом, хроматиды точно расходятся к полюсам клетки. В заключительной стадии – телофазе – хромосомы начинают деспирализоваться, и из обрывков ядерной оболочки формируется два дочерних ядра. Далее, у животных происходит деление на две клетки путем образования перетяжки, у растений – путем образования клеточной стенки в середине клетки. Так, из одной клетки образуется две дочерние, содержащие генетическую информацию материнской клетки. Остановимся подробнее на ключевом аспекте деления клетки - процессе разделения хромосом, который осуществляется через веретено деления. 12 2.1.2 Микротрубочки Микротрубочки представляют собой полимеры белка тубулина (рис 2.2). Гетеродимеры тубулина образуют цилиндрическую структуру, как правило, из 13-ти параллельно уложенных протофиламентов. Микротрубочки динамически нестабильны, т.е. находятся попеременно в состоянии удлинения и укорачивания. Процесс перехода в состояние укорачивания из состояния роста называется катастрофой, обратный процесс – из состояния укорачивания в состояние роста, называется спасением. Протофиламенты микротрубочки представляют собой линейные полимеры гетеродимеров тубулина – альфа и бетта тубулинов. Таким образом, микротрубочка имеет полярность – так называемые, плюс и минус конец. Плюс-концы быстрее удлиняются, но медленнее укорачиваются, чем минус-концы (Horio and Hotani, 1986). В делящейся клетке минус-концы микротрубочек более стабильны и расположены в районе полюсов веретена деления. Плюс-концы микротрубочек более динамичны и осуществляют взаимодействие с хромосомами (рис. 2.3). Множество микротрубочек, взаимодействующих с кинетохорами, называется кинетохорными микротрубочками. Часть микротрубочек, называемых интерполярными, образуют каркас веретена деления. 2.1.3 Общие сведения о кинетохоре Кинетохоры представляют собой белковые супер-комплексы, расположенные в области центромеры хромосомы. Главной функцией кинетохоров является установление закреплений с микротрубочками веретена деления и обеспечение перемещения хромосом с динамическими плюс-концами микротрубочек. На сегодняшний день наиболее хорошо изучен кинетохор почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae’s. Кинетохоры в данных организмах содержат примерно 60 различных белков и связываются только с одной микротрубочкой. За некоторыми исключениями, почти все эти белки, от дрожжей до человека, эволюционно консервативны (Musacchio and Salmon, 2007). Обычно различают три слоя организации кинетохора – внутренний, внеший и промежуточный слои кинетохора. Ко внутреннему слою относятся белки, закрепляющиеся за центромерный участок ДНК. Ключевой белок данного слоя – белок CENP-A, который замещает гистон H3 в области центромеры хромосомы (Palmer et al., 1991). Ключевым белковым комплексом промежуточного и внешнего слоев кинетохора является так называемая сеть KMN, состоящая из трех комплексов KNL-1, Mis12, and NDC80 13 (Cheeseman et al., 2006). Эти белки отвечают непосредственно за присоединение кинетохора к микротрубочкам. Рис. 2.2 (A) Структурная модель белка гетеродимера α, β – тубулина – минимальной структурной единицы микротрубочки. Красным цветом показаны связанные с тубулином молекулы ГТФ. Размер одного димера тубулина - 8 нм. (Б) Димеры тубулина соединяются между собой и образуют протофиламенты. (B) Отдельные протофиламенты соединяются между собой “бок о бок” и образуют микротрубочку с просветом посередине. (Г) Электронная микрофотография микротрубочки. Изображение адаптировано из Alberts et al., 2008. 14 Рис. 2.3. Схематичное изображение веретена деления клетки. 1 – полюса деления; 2 – микротрубочки (+ обозначает их «плюс-конец»), 3 – хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид; окружности на хромосомах – кинетохоры (белым цветов обозначены кинетохоры, закрепившиеся за плюс-конец микротрубочек). 4 – биориентированная хромосома. Изображение адаптировано из Rieder and Salmon, 1998. 15 2.2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор Ошибки в процессе деления клетки приводят к хромосомной нестабильности, что является серьезной опасностью для здоровья человека (Thompson et al., 2010). Ошибки в процессе митоза могут привести к анеуплоидии – ситуации, когда одна или обе дочерние клетки содержат неправильное число хромосом. В настоящий момент хорошо известно, что хромосомная нестабильность часто обуславливается нарушениями в динамике взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами. Даже низкие дозы веществ, которые влияют на взаимодействие кинетохоров и микротрубочек, приводят к ошибкам в процессе распределения хромосом по дочерним клеткам (Bakhoum et al., 2009). В митозе, МТ присоединяются и отсоединются от кинетохоров со средним временем закрепления 3 4 мин в прометафазе (Bakhoum et al., 2009; Cimini et al., 2006; Zhai et al., 1995). По мере того как число МТ на кинетохорах возрастает, закрепления МТ к кинетохорам становятся более стабильными, и их среднее время закрепления увеличивается до 7 – 10 мин в метафазе (Cimini et al., 2006; DeLuca et al., 2006). Природа связей, которые обеспечивают такое динамическое закрепление МТ и кинетохора остается слабо исследованной. 2.3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора Предыдущие теоретические работы моделировали кинетохор как совокупность отдельных сайтов связывания МТ, каждый из которых содержит МТ-связывающие комплексы, организованные в структуру цилиндра (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002; Shtylla and Keener, 2010) или кольца (Armond and Turner, 2010; Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005) (рис. 2.4). Эти модели привели к значительному пониманию того, как хромосомы могут перемещаться вместе с разбирающимся концом деполимеризующейся МТ, а также как сила, создаваемая кинетохорными МТ, может передаваться хромосоме. Но все эти модели не рассматривали аспект стабильности закрепления МТ к кинетохору. Классический МТ-связывающий «рукав Хилла» представляет собой структуру, состоящую из 65 комплексов, 90-95% из которых находятся в состоянии связанном с МТ в каждый момент времени в отсутствие внешней силы (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002). Таким образом, рукав Хилла, и сопрягающее устройство в виде кольца, состоящее из 15-20 МТ-связывающих комплексов (Efremov et al., 2007), будут формировать очень стабильные закрепления, которые, возможно, будут 16 открепляться только если на МТ будет действовать сила, направленная от кинетохора и превышающая 5-10 пН. Структурные исследования кинетохоров в различных организмах показали, что, наиболее вероятно, интерфейс кинетохор-МТ состоит из многочисленных фибрилл (Dong et al., 2007; McIntosh et al., 2013), а не рукавов. В последнее время было разработано несколько теоретических моделей кинетохоров состоящих из независимых МТ-саязывающих белков (Civelekoglu-Scholey et al., 2013; McIntosh et al., 2008), однако, в этих моделях не исследовался систематически вопрос о том, какие структурные и молекулярные параметры обеспечивают и регулируют стабильность закрепления МТ и кинетохора. Наиболее изученным простейшим кинетохором в клетках эукариот является кинетохор почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кинетохоры в данных организмах образуют закрепление с единственной микротрубочкой, и белковая композиция и структурная организация данных кинетохоров хорошо изучена средствами флюоресцентной микроскопии высокого разрешения (Joglekar et al., 2009) и электронной микроскопии (Gonen et al., 2012). В клетках позвоночных число кинетохорным микротрубочек растет в течение прометафазы митоза, и к моменту наступления метафазы кинетохоры содержат примерно 25-30 кинетохорных микротрубочек (McDonald et al., 1992; McEwen et al., 1997). Сайт взаимодейтвия с единичной микротрубочкой на кинетохорах позвоночных содержит во многом похожие белки, что и кинетохор почкующихся дрожжей (Joglekar et al., 2008), поэтому довольно распространено представление о том, что кинетохоры позвоночных организмов состоят из отдельных сайтов связывания с микротрубочкой, где каждый такой сайт аналогичен по строению и по белковому составу близок к простейшему кинетохору почкующихся дрожжей (Zinkowski et al., 1991). Однако важно заметить, что на данный момент анализ кинетохоров позвоночных с помощью электронной микроскопии не обнаружил повторяющихся структурных элементов, которые могли бы быть такими сайтами взаимодействия с микротрубочками (Dong et al., 2007; McIntosh et al., 2013). Данный факт оставляет открытой возможность того, что кинетохоры, связывающие большое количество КМТ, не содержат структурной организации, а белки, связывающие МТ, распределены по поверхности кинетохора случайным образом (модель молекулярного «газона»). В соответствии с распространенным представлением о субъединичном строении кинетохоров высших эукариот, многие теоретические модели кинетохора 17 Рис. 2.4. Теоретические модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора. 18 продполагают, что кинетохорные микротрубочки могут взаимодействовать с определенным набором специализированных белков, которые объединяются в один сайт. Данный сайт часто представляется как рукав (Hill, 1985), или как кольцо, с которым взаимодействует микротрубочка (Efremov et al., 2007). Ключевым свойством таких моделей является то, что одна микротрубочка может взаимодействовать только с кинетохорными белками, принадлежащими одному сайту (Joglekar and Hunt, 2002), и кинетохорные белки, принадлежищие различным сайтам, не могут взаимодействовать одновременно с одной микротрубочкой. Динамические взаимодействия между микротрубочками (МТ) и кинетохорами крайне важны для аккуратного деления клетки, но немногое известно о биофизике этих взаимодействий (Grishchuk et al., 2012; Joglekar et al., 2010). Были предложены различные модели, объясняющие закрепления микротрубочки и кинетохоров. Модели, описывающие закрепления кинетохор-микротрубочка, можно разделить на два класса. Одни модели описывают взаимодействия кинетохора и микротрубочки посредством некоторых структурных образований, таких как кольца или рукава (Davis et al., 2007). Другой класс моделей описывает кинетохор-микротрубочковое взаимодействие через множество независимых соединений (McIntosh et al., 2008; Zaytsev et al., 2013; Civelekoglu-Scholey et al., 2013; Keener and Shtylla et al., 2014). Такая различная организация кинетохора приводит к различным термодинамическим и кинетическим требованиям к индивидуальным кинетохорным белкам, связывающимся с микротрубочками. На данном этапе сложно осуществить предпочтение одной модели другой, потому что немногое известно о количественных характеристиках взаимодействия с микротрубочками индивидуальных кинетохорных белков. По этой причине, крайне актуальной задачей является полное биофизическое исследование молекулярного взаимодействия между ключевыми кинетохорными белками и микротрубочками. Так как стабильность закрепления кинетохорных микротрубочек изменяется в процессе митоза, это исследование должно также затрагивать и молекулярные механизмы регуляции взаимодействий между кинетохорными белками и микротрубочками. 2.4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora B играет ключевую роль в установлении биориентации хромосом В прометафазе, начальной стадии митоза, хромосомы ориентированы случайным образом относительно веретена деления и образуют закрепления с микротрубочками в различных случайных конфигурациях (рис. 2.5). Для успешной сегрегации хромосом в 19 Рис. 2.5. Схематичное изображение возможных конфигураций закреплений кинетохорных микротрубочек и хромосом в процессе митоза. A – меротельные закрепления; B – биориентированные закрепления; C – монотельные закрепления; D – синтельные закрепления. Красным (синим) цветом показаны кинетохорные микротрубочки растущие из левого (правого) полюса. 20 процессе анафазы, требуется, чтобы до наступления анафазы все хромосомы находились в биориентированном состоянии. Из эксперимента хорошо известно, что на начальных стадиях митоза образуется большое количество меротельных закреплений (Cimini et al., 2001), которые должны быть исправлены и переведены в биориентированные до наступления анафазы. Ключевую роль в данном процессе играет киназа Aurora B, субстратами которой являются многие кинетохорные белки, такие как комплекс NDC80, комплекс KNL1, кинезин CENP-E, некоторые из которых будут подробно рассмотрены далее (Lampson and Cheeseman, 2011). Киназа Aurora B является частью комплекса Chromosome Passenger Complex (CPC), который включает в себя белки INCENP, Survivin и Borelian (Ruchaud et al., 2007). Комплекс CPC до наступления анафазы находится в связанном с центромерным участком хромосом состоянии (рис. 2.6). После наступления анафазы комплекс CPC делокализуется с хромосом и концентрируется в центральной области веретена деления, где затем участвует в регуляции цитокинеза. В современных исследованиях предложено множетство специфичных ингибиторов киназы Aurora B. В исследования с использованием этих ингибиторов было установлено, что использование ингибитора киназы Aurora B в культуре живых клеток приводит к стабилизации неправильных закреплений микротрубочек и кинетохоров, которые сохраняются вплоть до наступления анафазы (Kallio et al., 2002), что демонстрирует важность ферментативной активности киназы Aurora B в установлении биориентированных закреплений. На настоящий момент считается, что механизм, благодаря которому киназа Aurora B может селективно стабилизировать закрепления микротрубочек и кинетохоров на биориентированных хромосомах и дестабилизировать на хромосомах с неправильными закреплениями, основан на принципе пространственного разделения киназы Aurora B и её субстратов – кинетохорных белков. Действительно, микротрубочки, закрепившиеся за кинетохоры, развивают тянущие силы в направлении полюсов, из которых они растут. Если хромосома находится в небиориентированном состоянии, то это означает, что один из сестринских кинетохоров либо не имеет закреплений с микротрубочками, либо имеет закрепления с микротрубочками растущими из обоих полюсов, либо оба сестренских кинтохора имеют закрепления с микротрубочками, растущими из одного полюса. В небиориентированных конфигурациях, натяжение между сестринскими кинетохорами, создаваемое кинетохорными микротрубочками, не достигает своего максимального значения, и кинетохоры остаются в области высокой активности киназы Aurora B (рис. 2.6). Известно, что фосфорилированное состояние для кинетохорных белков 21 Рис. 2.6. Модель пространственного разведения кинетохоров и области активности киназы Aurora B. Небиориентированные конфигурации хромосом не обладают достаточным натяжением и находятся в области высокой активности киназы Aurora B (схема сверху), что приводит к фосфорилированию кинетохорных белков и дестабилизации закреплений с микротрубочками. После случайного возникновения биориентированного состояния, кинетохоры растаскиваются под действием натяжения со стороны микротрубочек в область низкой активности киназы Aurora B (схема внизу), что приводик к дефосфорилированию кинетохорных белков и стабилизации полученного биориентированного состояния. 22 связывающихся с микротрубочками соответствует слабой аффинности взаимодействия с микротрубочкой (Welburn et al., 2010). Таким образом, закрепления кинетохорных микротрубочек в небиориентированной конфигурации в клетках нестабильны. Процесс закрепления и открепления кинетохорных микротрубочек происходит по принципу проб и ошибок до тех пор, пока не образуется биориентированная конфигурация, при которой каждый из сестринских кинетохоров будет иметь закрепления с микротрубочками из противоположных полюсов. Такая конфигурация соответствует максимальному натяжению между кинетохорами, что приводит к увеличению межкинетохорного расстояния и пространственному разведению кинетохоров из области высокой активности киназы Aurora B в область ее низкой активности. В установленной биориентированной конфигурации кинетохорные белки переходят в дефосфорилированное состояние благодаря действию по крайней мере одной белковой фосфатазы PP1, присутствующей в цитоплазме. Дефософрилирование кинетохорных белков связывающихся с микротрубочкой приводит к стабилизации закреплений микротрубочек и кинетохоров на биориентированных хромосомах. Такая выборочная стабилизация биориентированных конфигураций и дестабилизация небиориентированных конфигураций приводит к тому, что в процессе метафазы биориентированные конфигурации начинают преобладать и к моменту наступления анафазы все хромосомы, за редкими исключениями, переходят в биориентированное состояние. 2.5 Комплекс NDC80 – важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки Комплекс NDC80 является важнейшим кинетохорным белком, связывающимся с микротрубочками в клетках эукариот (Cheseeman et al., 2006; Tooley and Stukenberg et al., 2011). В литературе приводятся оценки, что на кинетохоре для взаимодействия с одной микротрубочкой имеется от 6 до 22 комплексов NDC80 (Johnson et al., 2010; Lawrimore et 23 Рис. 2.7. Схема комплекса NDC80 и его N-концевого участка белка Hec1 с указанием сайтов фосфорилирования Aurora B киназой. 24 al., 2011; Aravamudhan et al., 2013). Однако, детали структурной организации этих комплексов на кинетохоре и то, как эта организация изменяется в процессе митоза, на данный момент остаются неизвестными. Комплекс NDC80 состоит из двух гетеродимеров: Spc24-Spc25 и Hec1-Nuf2 (Ciferri et al., 2008) (рис 2.7). Домен связывания с микротрубочкой комплекса NDC80 представлен глобулярными доменами гетородимера Hec1-Nuf2, содержащими консервативный Calponin Homology (CH) домен, который так же присутствует и в других белках, взаимодействующих с микротрубочкой; например, белок EB1. Белок Hec1 комплекса NDC80 также содержит бесструктурный полепептидный участок длинной 80 аминокислот на своем N-конце. Известно, что данный участок белка Hec1 необходим для связывания комплекса NDC80 с микротрубочками in vitro (Cheseeman et al., 2006; Wei et al., 2007) и для установления закреплений кинетохор-микротрубочка in vivo (Guimaraes et al., 2008; Miller et al., 2008). Так же известно, что на данном 80-ти аминокислотном участке белка Hec1 расположено 9 аминокислот, которые могут фосфорилироваться киназой Aurora B (DeLuca et al., 2006). На начальных стадиях митоза данные аминокислоты белка Hec1 находятся в фосфорилированном состоянии, но в ходе митоза степень фосфорилирования белка Hec1 уменьшается до состояния, при котором белок Hec1 содержит 0-1 фосфатную группу (DeLuca et al., 2011). Работы in vitro на очищенном рекомбинантном комплексе NDC80, содержащем мутации на аспарагиновую кислоту, имитирующие отрицательный заряд фосфатных групп (фосфо-миметические мутации), показали, что внесение таких мутаций во все аминокислоты, расположенные в сайтах фосфорилирования, уменьшает аффинность комплекса NDC80 к микротрубочкам более чем в 10 раз (Umbreit et al., 2012). Однако, эффект внесения промежуточного числа фосфо-миметических мутаций на аффинность комплекса NDC80 к микротрубочке остается неизвестным. Также неизвестен и характер зависимости характеристик взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой от числа фосфо-миметических мутаций – будет ли эффект изменяться градуально, или имеется скачкообразное изменение аффиности при достижении некоторого порогового числа фосфорилирований (Salazar and Höfer, 2009). Раннее, в литературе было предложено несколько различных моделей того, как взаимодействие комплекса NDC80 с микротрубочкой регулируется фосфорилированием. В одной из моделей, фосфорилирование комплекса NDC80 напрямую уменьшает сродство комплекса NDC80 к микротрубочке, которое частично опосредовано зарядовым 25 взаимодействием между положительно заряженным 80-ти аминокислотным N-концевым участком белка Hec1 и отрицательно заряженными С-концевыми участками белков тубулинов, из которых состоит микротрубочка (Guimaraes et al., 2008; Miller et al., 2008). Другие работы предлагают модель, в которой фосфорилирование комплекса NDC80 регулирует как сродство комплекса к микротрубочке, так и способность комплекса NDC80 олигомеризоваться на поверхности микротрубочке в зависимости от того, в какой части 80-ти аминокислоткого участка белка Hec1 расположены фосфатные группы (Alushin et al., 2010; Alushin et al., 2012). В данной модели, в концевом участке белка Hec1 выделяются две функциональные зоны – зона 1, которая содержит аминокислоты с 44-й по 66-ю, и зона 2, которая содержит аминокислоты с 4-й по 15-ю. Фосфорилирование аминокислот, расположенных в зоне 1, приводит к уменьшению аффинности комплекса NDC80 к микротрубочке, в то время как фосфорилирование аминокислот в зоне 2 приводит к декластеризации комплексов NDC80 на поверхности микротрубочки (рис. 2.8). 26 Рис 2.8. Схематическое изображение возможного механизма регуляции взаимодействия комплекса NDC80 и МТ через фосфорилирование белка Hec1, предложенного в работе (Alushin et al., 2012). Серым цветом показаны мономеры тубулина, красным – C-концевые участки Фосфорилированные аминокислоты в хвосте белка фиолетовыми кругами. 27 тубулина. Hec1 показаны 3 3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол 3.1.1 Изготовление многоразовых проточных камер. Данный метод основан на опубликованном ранее протоколе сборки проточной камеры (Grishchuk and Ataullakhanov, 2010). Для изготовления проточных камер использовались микроскопные предметные стекла (стандартный размер 75 мм на 25 мм, 1.0 мм толщиной), модифицированные добавлением двух канавок длиной 15±1 мм, толщиной 1.0±0.1 мм и глубиной 0.80±0.05 мм (рис. 3.1). Расстояние между ближайшими краями должно быть 14±1 мм – это расстояние оптимально для камеры, собранной с покровным стеклом размером 22 на 22 мм. Далее приводится последовательность действий, использованная для дальнейшей подготовки камеры, согласно разработанному для данного исследования протоколу. a) В каждую из заготовленных канавок на стеклянной подложке будущей камеры были помещены специальные стерильные полиэтиленовые трубки длиной 100мм и диаметром 0.61мм, при этом были оставлены добавочные 5 мм трубок по обе внутренние стороны канавок. Трубки были затем закреплены в канавках с использованием эпоксидной смолы, плотно зафиксировавшей трубки внутри канавок. b) Канавки затем были запечатаны эпоксидным клеем. При проведении этой процедуры особое внимание уделялось тому, чтобы клей не попадал внутрь трубок. Окончательное высыхание клея наблюдалось через 1 день после его нанесения, только после этого был проведен переход к следующему этапу изготовления камеры. c) Используя острое бритвенное лезвие, засохший клей был срезан на расстоянии 3-4 мм от дистального конца обоих мест присоединения. Таким образом, были удалены участки клея, близкие к центру стекла. Это было сделано для того, чтобы трубки оставались только внутри канавок. Вместе с удалением остатков клея, со внутренней стороны были также срезаны оставленные внутренние концы трубок; таким образом, трубки, полностью находясь в канавке, свободно открывались во внутреннюю часть камеры, не выступая над поверхностью стеклянной подложки. d) Для проверки проходимости трубок был использован шприц с дистиллированной водой. Когда проверка подтверждала свободную проводимость трубок, внешние края канавок запечатывались каплей эпоксидного клея (примерно 5мм в диаметре) и высушивались в течении одного дня. Это позволяло добиться большей прочности камер для повторного использования в течении нескольких месяцев (рис. 3.2). 28 Рис. 3.1. Схема заготовки для проточной камеры для TIRF микроскопии. Размеры указаны в мм. 29 Рис. 3.2. (А) Схема готовой проточной камеры для TIRF микроскопии (Б) Фотография готовой камеры в собранном состоянии с покровным стеклом и в разобранном состоянии без покровного стекла. 30 3.1.2 Подготовка покровных стекол Метод подготовки покровных стекол для микроскопии, использованный в проведенном исследовании, был разработан автором диссертации. Данный протокол подготовки покровных стекол позволяет за 6-8 часов подготовить до 12 покровных стекол. Необходимым оборудованием были керамический держатель покровных стекол и 3 емкости с крышками для обработки покровных стекол. Каждая емкость имела объем 15 мл, так что в нее одновременно помещались четыре соединенных покровных стекла. Отдельная стеклянная емкость с крышкой объемом 250мл использовалась для инкубирования покровных стекол в силане. В исследовании использовались обыкновенные покровные стекла №1 (размерами 22 на 22 или 22 на 30 мм). Все приведенные ниже шаги подготовки покровных стекол проделывались под вытяжкой и с обязательным использованием лабораторных перчаток. a) Покровные стекла помещались в стеклянные емкости, затем емкость заполнялась ацетоном. После часового инкубирования производилось десятикратное вымывание деионизированной дистиллированной водой. b) Покровные стекла выдерживались 10 минут в этаноле и десятикратно вымывались в деионизированной дистиллированной воде. c) Приготовлялся специализированный раствор “пиранья”. Для этого 60 мл 30% раствора перикиси водорода в воде добавлялось в специальный термоустойчивый сосуд, куда затем медленно добавлялось 100 мл серной кислоты (так, чтобы итоговое соотношение между серной кислотой и перикисью водорода в растворе составляло 5:3). d) Полученная разогретая смесь заливалась в стеклянные емкости для обработки покровных стекол. Крышки емкостей закрывались, и емкости выдерживались в девяностоградусной водяной бане в течение часа. e) Раствор затем сливался из емкостей и подвергался утилизации согласно лабораторным нормам. Покровные стекла вымывались 10 раз деионизированной водой. f) Для устранения возможных остатков кислоты, в емкости для обработки покровных стекол помещался 0.1М раствор KOH, проводилась инкубация в течении 10 минут, а затем десятикратное промывание деионизированной водой. g) Каждое из покровных стекол по отдельности высушивалось путем его удержания в потоке сжатого сухого азота. Удержание 31 проводилось с использованием специального пинцета с плоскими краями, покрытыми тефлоном для минимазации повреждения поверхности покровного стекла. На этом этапе особое внимание уделялось полному высушиванию покровных стекол, так как остатки воды могли бы вступить в реакцию с силаном. h) Высушенные покровные стекла помещались в керамический держатель (12 стекол на один держатель), который также был полностью просушен в потоке сжатого сухого азота. Керамический держатель со стеклами всегда держался закрытым, чтобы избежать засорения частицами пыли покровных стекол. i) Для поглощения воды, дно 250мл стеклянной емкости (6см в диаметре) было засыпано впитывающим влагу составом Molecular Sieves Grade 564. j) Далее, стеклянная емкость наполнялась 200 мл заводским раствором силана (PlusOne Repel Silane), куда медленно погружался керамический держатель с покровными стеклами, после чего крышка была закрыта, и далее была проведена 5 минутная инкубация при комнатной температуре. Это создавало гидрофобное покрытие на поверхности покровных стекол. k) Керамический держатель покровных стекол был затем медленно извлечен, и покровные стекла затем были поочередно перемещены в стеклянные емкости для обработки покровных стекол, предварительно заполненные метанолом. l) Специальный металлический пьедестал был помещен на дно водяного резервуара ультразвуковой ванны таким образом, что примерно 2/3 высоты стеклянной емкости для обработки покровных стекол, поставленной на него, были погружены в жидкость. После чего производилась ультразвуковая обработка в течение 20 минут, со сменой метанолового раствора каждые 5 минут и с последующей десятикратной промывкой деионизированной водой. m) Мельчайшие остатки воды были полностью удалены с покровных стекол путем продувания сухим сжатым азотом. 3.2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80. Тубулин был очищен из коровьего мозга методом термоциклирования по ранее опубликованным протоколам (Hyman et al., 1991). Свежеразмороженный раствор тубулина (в концентрации 1 мг/мл) инкубировался 20 минут при 37°С в присутствии 1мМ GTP, 25% глицерина в буфере BRB80 с 4мМ MgCl2. После этого, в раствор добавлялся таксол до концентрации 10 мкМ, и инкубация продолжалась еще 10 минут. 32 Полимеризованные микротрубочки очищались от неполимеризовавшегося тубулина путем осаждения в центрифуге (airfuge, Beckman) при 81 тыс. g в течение трех минут при комнатной температуре. Ресуспендированные в буфере с таксолом микротрубочки хранились при комнатной температуре в течение нескольких суток. Для работы использовалась конструкция NDC80-Bonsai, в которой был удален участок суперспирали, соединяющий домен взаимодействия с микротрубочкой (Hec1Nuf2) и домен локализации на кинетохоре (Spc24-Spc25). Для изучения эффекта фосфорилирования гибкого N-концевого участка белка Hec1 комплекса NDC80 были очищены комплексы NDC80, содержащие 0, 1, 2, 3, 4 или 9 точечных мутаций в сайтах фосфорилирования на аспарагиновую кислоту, отрицательный заряд которой имитирует фосфорилирование. 3.3 Микроскопия полного внутреннего отражения Эксперименты проводились при 32°C на инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse-Ti, используя CFI APO 100x Nikon-TIRF NA 1.49 объектив и дополнительную линзу для увеличения 1.5x по стандартным протоколам. Размер пикселя на получаемых изображениях составлял 90 nm. Микроскоп был оборудован системой «Perfect Focus» для поддержания фокуса в процессе наблюдения. Для освещения образца использовался лазер с длиной волны 488 nm (Coherent Diode laser), проходящий через флуоресцентный кубик Chroma C-TIRF Quad cube. Данные записывались с помощью прибора с зарядовой связью, сопряженного с электронным умножителем (EMCCD) Andor iXon3. Для контроля микроскопа и камеры использовалось програмное обеспечение NISelements. Опыты по наблюдению за единичными молекулами проводились с использованием режима камеры «Fast kinetics», где дополнительно в оптический путь был включен компонент «OptoMask». Использовались следующие настройки камеры: режим считывания сенсора - 14-бит, 10 MHz, 999 EM gain, conversion gain 5x, размер изображения 220 × 120 пикселей. В экспериментах с единичными молекулами изображения снимались без задержки на протяжении 200 c с экспозицией 5-10 мс. В установленную на микросокпе проточную камеру вмывался раствор анти-тубулиновых антител (Serotec), разведенных 1:30 в буфере BRB80 (K-Pipes 80 мM, pH 6.9 , 4 мM Mg, 1 мM EGTA), и инкубировался 10 мин. Затем камера промывалась 100 мкл буфера BRB80, после чего в камеры вмывался 1% раствор Pluronic F-127 (Sigma) в буфере BRB80, который инкубировался в течение 8 мин. После инкубации камера промывалась 100 мкл 33 Рис 3.3. Схема эксперимента на TIRF микроскопе. 34 буфера BRB80, содержащего 10 мкМ таксола (Sigma) (рис 3.3). В промытую камеру вмывался раствор микротрубочек в BRB80 буфере с 10 мкМ таксола и инкубировался 15 мин. NDC80 комплекс разводился до концентрации 50 пМ в экспериментальном буфере (K-Pipes 80 мM, pH 6.9 , 4 мM Mg, 1 мM EGTA, 0.5 мг/мл казеин, 4 мг/мл BSA, 2 мМ DTT, 0.1 мг/мл глюкозо оксидаза, 68 мкг/мл каталаза, 20 мМ глюкоза, 0.5% 2-меркаптоэтанол, 10 мкM таксол) и вмывался в камеру. Проток раствора с NDC80 комплексом поддерживался постоянно в течение эксперимента для поддержания постоянной концентрации белка в микроскопной камере. 3.4 Анализ данных микроскопии Учет неоднородности освещенности поля. Алгоритм корректировки изображений на неоднородность лазерного освещения был разработан автором диссертации. Все микроскопные изображения перед обработкой нормировались на профиль лазера для учета неоднородности освещенности поля (рис 3.4). i. Был подготовлен раствор белка GFP в концентрации 50 нМ в буфере BRB-80. Была подготовлена микроскопная камера, аналогичная описанной в пункте 3.1, в которую был вмыт раствор GFP. ii. Было собрано больше 50 изображений микроскопного поля: микроскопный стол с закрепленной микроскопной камерой перемещался в новую позицию, при этом затвор подсветки был закрыт; затем сразу после открытия затвора получались изображения, затвор закрывался, и стол вновь изменял позицию. iii. Была построена средняя проекция полученного множества изображений и проведена фильтрация с использованием алгоритма Gaussian Blur с параметром радиуса в 5 пикселей. Для проведения этой операции использовался программный комплекс ImageJ и другие программные пакеты. Результирующее изображение представляет собой распределение интенсивности освещения микроскопного поля обзора Illum(x,y), где x и y соответствуют координатам в пиксельных единицах измерения. Была определена максимальная яркость пикселя на результирующем изображении Max(Illum). iv. С закрытым затвором освещения, используя те же параметры экспозиции и усиления, было получено одно изображение и определена средняя интенсивность освещенности пикселей на нем – эта величина соответствует величине CN – шуму 35 Рис 3.4. Пример работы алгоритма корректировки интенсивности изображения на неоднородность освещенности лазерного пучка. 36 камеры. Используя проведенные выше измерения и изображение Illum(x,y), целевое изображение Img(x,y) было нормализовано по следующей формуле: img norm ( x, y) Max( Illum ) CN (img ( x, y) CN ) ( Illum (( x, y) CN ) . Характеризация фотовыцветания. Для измерения скорости фотовыцветания сигнала от комплексов NDC80, меченных с помощью белка GFP, раствор, содержащий комплексы NDC80 в концентрации 50 нМ в экспериментальном буфере, был добавлен в камеру без МТ и без агентов, блокирующих покровное стекло, Pluronic F-127. В таких условиях камера инкубируется 10 мин, что приводит к неспецифической адсорбции комплексов NDC80 на покровоное стекло. После инкубации камера промывается экспериментальным буфером для удаления оставшегося в растворе белка GFP, тем самым предотвращая возможный обмен белка на стекле с белком в растворе во время фотовыцыветания. Последовательность изображений снималась с такими же настройками микроскопа, что и для одно-молекулярных экспериментов. Средняя яркость пикселя на поле затем строилась как функция времени, и проводилась аппроксимация данных экспоненциальной зависимостью. Измеренное значение характеристического времени фотовыцветания GFP составило 1.9 ± 0.1 c (рис 3.5). Определение молекулярных характеристик взаимодействия комплекса NDC80 и МТ. Положение МТ (полимеризованных из немеченного тубулина) определялось на нормированных изображениях с помощью программы ImageJ (NIH) через среднюю проекцию стека изображений в GFP канале. Кимограммы строились с использованием линии толщиной 6 пикселей вдоль МТ в программе MetaMorph 7.7 (Molecular Devices). Различные молекулярные характеристики взаимодействия NDC80 и МТ определялись из кимограмм, с использованием программ разработанных атором диссертации в среде Mathematica 9.0 (Wolfram Research). Для определения коэффициента диффузии D (мкм2/с) на кимограмме вручную выбирались прямоугольные области, содержащие трек единичной молекулы, таким образом, чтобы выбранный трек не пересекался с треками от других диффундирующих комплексов. Длительность выбираемых таким образом треков для анализа была не менее 10 кадров или 100 мс. Положение комплекса в каждый момент времени внутри выбранной прямоугольной области определялось через аппроксимацию поперечного сечения изображения трека Гауссовской функцией (рис 3.6). Положение точки в начальный 37 Рис. 3.5. Кинетика фотовыцветания NDC80-GFP. Характерное время фотовыцветания τbleach было получено из аппроксимации полученных данных уравнением I0 Exp( -t / τbleach) + B, где I0 – интенсивность сигнала NDC80-GFP в нулевой момент времени, B – уровень фонового сигнала. 38 момент времени на выбранном треке выбиралось как равное нулю, и вычислялось квадратичное смещение комплексов для всех последующих моментов времени. Эти квадратичные смещения были усреднены между более 600 треками для построения среднего квадратичного смещения комплекса как функции времени. Коэффициент диффузии определялся как половина угла наклона получаемых линейных зависимостей. Для определения скорости диссоциации koff (с-1) все события связывания комплексов NDC80 и MT были вручную выбраны через указание начальной точки трека на кимограмме и последней точки перед диссоциацией комплекса. Временная разница между двумя этими событиями составляла длительность взаимодействия комплекса NDC80 и МТ. Полученные таким образом длительности взаимодействия для всех проанализированных комплексов строились в виде гистограмм и аппроксимировались экспоненциальной функцией, исключая события короче 50 мс. Величина скорости диссоциации определялась как коэффициент при экспоненте после корректировки на фотовыцветание, как описано в (Helenius et al., 2006). Характеристическое время взаимодействия τ (мс) для каждого мутантного комплекса NDC80 определялось как 1/koff. Скорость ассоциации kon (c-1 нМ-1) определялась следующим образом. Сначала полное число событий связывания определялось из интегрирования экспоненциальной функции аппроксимирующей гистограммы распределения времен взаимодействия (красные кривые на рис. 4.13). Далее, определялось полное время наблюдения, в течение которого эти данные были получены. Затем вычислялась суммарная длина участков МТ, с которых были зарегистрированны события связывания. Скорость ассоциации после этого вычислялась как отношение полного числа событий связывания к полному времени наблюдения и к суммарной длине участков МТ и к 3,250 - полному числу тубулиновых мономеров в 1 мкм МТ. Для определения числа комплексов NDC80-GFP в наблюдаемых ярких пятнах, связанных с МТ, сначала определялась яркость флуоресценции одной молекулы GFP через анализ фотовыцветания GFP-содержащих молекул, неспецифично связанных с поверхностью покровного стекла, как было описано в Volkov et al., 2014. Изменения в интегральной яркости свечения комплекса внутри круга диаметром 5 пикселей строились как функция времени. Полученные таким образом значения интенсивностей для многих проанализированных комплексов затем строились в виде гистограммы, которая 39 Рис. 3.6. Обработка кимограмм получанных в TIRF микроскопии. Желтым выделен участок кимограммы, содержащий диффундирующий по микротрубочке комплекс NDC80. Положение комплекса в различные моменты времени (линии 1, 2 и 3) определялось через аппроксимацию профиля яркости Гауссовской функцией, как показано на графиках справа. 40 аппроксимировалась Гауссовской функцией, содержащей несколько пиков. Расстояние между пиками, полученное из аппроксимации, соответствовало интенсивности свечения одной GFP молекулы, и при используемых условиях съемки составило (1.95 ± 0.03) × 10 4 у.е. Далее, были определены интенсивности комплексов NDC80-GFP, находящихся в связанном с МТ состоянии, используя два метода. В первом методе были вручную определены яркости связанных с МТ комплексов через интегральную яркость круговой области диаметром 5 пикселей в момент времени после того, как комплексы связались с МТ. Рис. 3.7. показывает, что более 95% определенных таким образом яркостей соответствует интенсивности свечения одной GFP молекулы. Это означает, что NDC80GFP комплексы были мономерами при взаимодействии с МТ. Для исключения возможности систематической ошибки, связанной с ручным выбором комплексов, для анализа был использован также дополнительный автоматический метод анализа яркости комплексов на МТ. Автором диссертации была разработана программа, которая для каждого кадра стека изображений определяла максимальную интегральную яркость в круговой области диаметром 5 пикселей. Затем такой же анализ применялся для контрольной области, не содержащей МТ, и эти результаты наносились на одну гистограмму с измерениями, проведенными на МТ. Оба пика яркостей затем аппроксимировались Гауссовскими функциями, и расстояние между пиками получилось равным (1.87 ± 0.04) × 104 у.е., что демонстрирует то, что в проведенных одномолекулярных экспериментах комплексы NDC80 связывались с МТ в виде мономеров. Данный результат сходитсяс результатами анализа, проведенного вручную. 3.4.1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF микроскопии. Метод получения кривых связывания белков с микротрубочками через использование TIRF-микроскопии был разработан автором диссертации. Для получения кривых связывания комплекса NDC80 с МТ c помощью TIRF-микроскопии белок NDC80 предварительно диализировался для замены буфера на BRB80, после чего раствор белка центрифугировался 12 мин на 120 тыс. g. Финальная концентрация белка определялась с помощью BIO-RAD метода. Белок разводился до требуемой концентрации в экспериментальном буфере и вмывался в камеру на протяжении 4-х минут, для полной смены раствора (рис 3.8). На микроскопе снимались изображения NDC80-GFP , который декорировал закрепленные на покровном стекле МТ с использованием следующих 41 Рис. 3.7. Распределения микротрубочке. Яркости по яркости отдельных комплексов комплексов NDC80-GFP на NDC80-GFP, взаимодействующих с микротрубочкой, были нормированы на яркость флуоресценции одной молекулы GFP. 42 Рис. 3.8. Кинетика изменения сигнала флуоресценции NDC80-GFP на микротрубочках в микроскопной камере по мере вмывания. Зеленым цветом показан временной интервал, соответствующий стационарному состоянию, в течение которого проводились измерения. 43 настроек камеры: 16-бит, 1 MHz, без EM gain, conversion gain 1x, размер изображения 256 × 256 пикселей. Эта процедура повторялась для 10-12 полей изображений для получения как минимум 40 изображений МТ для каждой концентрации NDC80. Десять изображений для каждого проанализированного поля с МТ покрытыми комплексами NDC80-GFP были усреднены. Затем, для каждой выбранной для анализа МТ, были построены прямоугольные области шириной 16 пикселей (рис. 3.9). Используя самостоятельно разработанную программу для ImageJ, пиковая интенсивность внутри этой области была построена как функция координаты вдоль МТ. Затем яркость МТ вычислялась как средний сигнал получаемых таким образом профилей яркости. Для каждой концентрации белка было проанализированно как минимум 40 МТ. Аппроксимация кривых связывания проводилась с использованием модели связывания (McGhee and von Hippel, 1974) Вычисление плотности заполнения комплексами NDC80 поверхности МТ при насыщении. Полученное значение плато при насыщении (параметр Bmax) в кривых связывании не отличалось существенно для различных комплексов NDC80, и среднее значение данного параметра составило (8.4 ± 0.6) × 104 у.е. Для вычисления того, какой плотности заполнения NDC80 (параметр N - число комплексов NDC80 на один димер тубулина) соответствует полученное значение, было определено значение интегральной яркости одной молекулы GFP при условиях съемки, которые использовались для получения кривых сваязывания. Измерения проводились описанным выше методом анализа фотовыцветания, и полученное значение составило 558 ± 21 у.е. Используя полученное значение интегральной интенсивности и ширину пятна для единичной молекулы (point spread function), которая на используемом микроскопе составляла 3.4 пикселя, было получено значение пиковой интенсивности для единичной молекулы GFP – 78 у.е. Параметр Bmax можно выразить следующим образом: 78 a.u. × 3.4 пикс. × 169 × N, где 169 – это число димеров тубулина в одном пикселе. Таким образом, полученное значение плато на кривой связывания Bmax при насыщении достигалось при N = 1.9 ± 0.2 комплекса NDC80 на димер тубулина. 44 Рис. 3.9. Алгоритм обработки изображений для получения значения яркости МТ в экспериментах по получению кривых связывания с помощью TIRF микроскопии. Отдельные микротрубочки на поле (А) выделялись полосой толщиной 16 пикселей. Далее строился профиль яркости по линии, перпендикулярной полосе, из которого вычиталось среднее значение яркости фона (примеры показаны на панели Б), и для каждого такого профиля бралось максимальное значение. Усреднение полученных таким образом максимальных значений вдоль всей полосы считали данной МТ. 45 яркостью 3.4.2 Анализ кооперативности NDC80-MT взаимодействия с использованием метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP). Метод анализа кооперативности взаимодействия белков с микротрубочками через использование FRAP-микроскопии был разработан автором диссертации. Яркость МТ определялась как средняя яркость в квадратной области 5x5 пикселей на МТ, расположенного в центра лазерного луча, который использовался для выжигания (488 нм, 100 mW). Фоновый сигнал определялся рядом с МТ для каждого момента времени и вычитался из зависимости сигнала на МТ от времени. Для определения того, дает ли диффузия комплексов NDC80 по МТ вклад в кинетику восстановления сигнала, было оценено характерное значение времени восстановления сигнала за счет одномерной диффузии комплексов NDC80 по МТ (Sprague et al., 2004): τD = l2/D, где l радиус сфокусированного луча лазера (для используемой системы l = 1.1 µm) и D коэффициент диффузии комплекса NDC80. Для noD NDC80 это время составило τD = 13.8 с, что значительно больше наблюдаемого времени восстановления сигнала на МТ (0.29 ± 0.05 с). Это означает, что диффузия дает незначительный < 2% вклад в кинетику восстановления сигнала. Аналогичные результаты были получены и для комплекса 4D NDC80 (τD = 3.2 с, наблюдаемое время восстановления 0.084 ± 0.012 с). Из этого анализа было заключено, что восстановление происходит из-за постоянного обмена между комплексами NDC80, связанными с МТ и находящимися в растворе комплексами NDC80. Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ. 3.5 Изменения энергии связывания комплексов NDC80 с МТ в зависимости от числа фосфомиметических мутаций было оценено с помощью четырех подходов, которые основывались на независимых экспериментальных данных. Из коэффициента диффузии. Если частица совершает броуновскую диффузию в периодическом потенциале, то коэффициент диффузии (D) такой частицы может быть вычислен аналитически через форму потенциала u(x), как описано в Festa and Galleani, 1978. Этот подход позволяет явно связать стандартную свободную энергию взаимодейтсвия частицы с МТ (G0MT) и экспериментально определяемый коэффициент диффузии D: 𝑢(𝑥) = ∆𝐺 0 𝑀𝑇 𝑒 − (𝑥−𝐿/2) 2𝜎2 , 2 𝐷=𝐿 𝑢(𝑥) 𝐿 𝐷0 (∫0 𝑒 𝑘𝐵 𝑇 𝑑𝑥 46 −1 𝑢(𝑥) 𝐿 −𝑘 𝑇 ∫0 𝑒 𝐵 𝑑𝑥) (s1) где G0MT и σ - глубина и ширина потенциала взаимодействия, соответственно; D0 – коэффициент диффузии свободной частицы в растворе, x – координата вдоль линейного полимера с периодическим потенциалом периодом L; kB – постоянная Больцмана. Описанный выше анализ кривых связывания показал, что при насыщении комплексы NDC80 связываются по одному на каждый мономер тубулина, т.е. период потенциала равен размеру мономера тубулина, 4 нм. Коэффициент диффузии D0 для белка с молекулярным весом 100 кДа в воде примерно равен 30 мкм2/c (Salmon et al., 1984). Для типичных белок-белковых взаимодействий параметр σ лежит в диапазоне от 0.2 до 0.5 нм (Jiang et al., 2002); в данных расчетах использовалось значение σ = 0.24 нм, как в работе Grishchuk et al., 2012. Уравнение (1) решалось для различных фосфомиметических форм комплекса NDC80 в программе Mathematica. Используя данный подход, было оценено значение энергии для нефосфорилированного комплекса noD NDC80, которое составило9.3 kBT. Это довольно сильно связывание, которое близко во величине к значению энергии связывания с МТ комплекса Dam1 (Grishchuk et al., 2008), но меньше, чем величина энергии связывания c МТ для кинезина Kip3 (Bormuth et al., 2009). Энергия связывания для 9D NDC80 составила -6.3 kBT, т.е. значительно меньшую величину, чем для noD NDC80. Отношение скоростей диссоциации (koff) и ассоциации (kon) комплексов NDC80 с МТ. При случайном Броуновском движении в периодическом потенциале вероятность диссоциации от МТ пропорциональна Больцмановской экспоненте: 0 GMT 1 K D e kBT (s2) Z где Z – статистическая сумма (Ландау и Лифшиц, 1969), KD = koff / kon расновесная константа диссоциации. Этот подход не позволяет вычислить в явном виде ΔG0MT, потому что величина Z не известна. Однако, уравнение s2 может быть использовано для сравнения энергий связывания двух молекулярных реакций с одинаковой величиной Z: 𝐾𝑥𝐷 𝐷 𝑥𝐷 𝑥𝐷 𝑛𝑜𝐷 ∆∆𝐺𝑀𝑇 = ∆𝐺𝑀𝑇 − ∆𝐺𝑀𝑇 = 𝑘𝐵 𝑇𝑙𝑛(𝐾𝑛𝑜𝐷 ) 𝐷 где xD (s3) обозначает комплекс NDC80 с х фосфомиметическими заменами. Этот подход привел к оценке изменения энергии взаимодействия взаимодействия NDC80-MT в ответ на внесение фосфомиметических замен в комплекс NDC80: 0.3 ± 0.2 kBT на один отрицательный заряд. 47 Начальные наклоны кривых связывания NDC80 и МТ, полученных с помощью TIRF микроскопа. При низких концентрациях растворимого белка (P) интенсивность сигнала NDC80 на МТ (INDC80) может быть оценена из предела для уравнения связывания в следующей форме: 𝐵 𝐼𝑁𝐷𝐶80 = lim𝑝→0 𝐾𝑚𝑎𝑥 𝑃≈ +𝑃 𝐷 𝐵𝑚𝑎𝑥 𝐾𝐷 𝑃 (s4) Уравнение показывает, что при низких концентрациях белка P INDC80 ведет себя как линейная фунция от P, и наклон этой зависимости пропорционален 1/ KD. Отношение констант диссоциации для различных комплексов NDC80 было получено из отношения наклонов для линейных участвов кривых связывания при низкой концентрации. Затем, через уравнение (3) вычислялось изменение стандартной свободной энергии связывания с 𝑥𝐷 МТ ∆∆𝐺𝑀𝑇 . Константа диссоциации, полученная из аппроксимации всей кривой связывания. Данные оценки были проведены аналогично оценкам, основанным на константе диссоциации, полученной из экспериментов с единичными молекулами с использованием уравнения (3). 48 4 РЕЗУЛЬТАТЫ 4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора. Математическая модель взаимодействия МТ и кинетохора строилась на основе вероятностных взаимодействий между МТ и единичными МТ-связывающими белками на кинетохоре. Отдельный сайт связывания микротрубочки моделировался как ансамбль идентичных белков связывающихся с МТ, общее количество которых на один сайт связывания - N0. Если хотя бы один из МТ-связывающих белков был в связанном с микротрубочкой состоянии, то МТ считалась присоедененной к кинетохору. Если в какойто момент времени МТ теряла все присоединенные кинетохорные белки, то считалось, что такая микротрубочка отсоединилась от кинетохора. Вероятностное взаимодействие между МТ и отдельным МТ-связывающим кинетохорным белком описывалось двумя параметрами: константой скорости ассоциации (kon) и константой скорости диссоциации (koff). Эти скорости были одинаковыми для всех белков, составляющих сайт взаимодействия с микротрубочкой, и не зависели от числа белков, связанных с МТ в данный момент. Так как белки могут связываться и отсоединяться от МТ независимым образом, то скорость присоединения белков к МТ будет произведением kon и числа несвязанных в данный момент времени комплексов; аналогично, скорость отсоединения белков от МТ будет равняться произведению koff на число связанных с МТ белков (рис. 4.1). Для того, чтобы учесть кооперативную природу взаимодействия МТ-связывающих белков, был введен дополнительный параметр – фактор кооперативности ω. Фактор кооперативности ω учитывает энергию взаимодействия между связанными с МТ белками и изменяет эффективную скорость диссоциации отдельных белков от микротрубочки в зависимости от числа уже связанных с МТ белков. Стандартная свободная энергия связывания с МТ одного кинетохорного белка ΔG0MT связана с константой диссоциации KD формулой: KD koff kon ~e 49 0 GMT k BT (1) Рис 4.1. Схема молекулярных взаимодействий микротрубочки и N0 кинетохорных комплексов, лежащая в основе разработанной математической модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора. Комплексы могут независимо связываться с микротрубочкой (со скоростью ассоциации kon) и отсоединяться от микротрубочки (со скоростью диссоциации koff). 50 Когда белок, связанный с МТ, дополнительно устанавливает контакт с другим белком на поверхности микротрубочки, эффективная константа взаимодействия KDapp будет иметь вид: K app D 0 0 GMT Gcoop k BT ~e K Dapp K D e (2) 0 Gcoop k BT KD / где ΔG0coop стандартная свободная энергия кооперативного взаимодействия белков друг с другом на поверхности МТ и ω e 0 Gcoop / k BT . Если скорость ассоциации kon не зависит от кооперативного взаимодействия белков на поверхности МТ, то вышестоящее выражение app koff / . приводит к выражению для эффективной константы диссоциации koff Аналогично, если связанный с МТ белок имеет контакты с двумя другими белками на поверхности МТ, эффективная константа диссоциации в данном случае будет равна app k off k off / 2 . Во время симуляции, различные МТ-связывающие белки могут иметь различное число контактов с соседними комплексами. Например, если три белка связаны с микротрубочкой бок о бок, один из белков будет иметь два контакта, в то время как два других будут иметь по одному контакту. Среднее число контактов при такой конфигурации будет равно 4/3 на один белок, и эффективная скорость диссоциации для app 4/3 этих белков будет равна k off k off / . Аналогично, в общем случае, когда с МТ связано N белков, эффективная константа диссоциации будет вычисляться по формуле app koff koff / j , где j= 2(N-1)/N. Аналитическое решение модели для единичного сайта связывания. В данном параграфе используются слудующие обозначения: (0) – часть времени, когда ни один из МТ-связывающих белков на кинетохоре не связан с микротрубочкой (сайт свободен). (m) – часть времени, когда m белков сайта находятся в связанном состоянии с МТ; m ≤ N0. Состояние динамического равновесия для взаимодействия кинетохорных белков и МТ может быть описано N0 + 1 уравнениями: 51 i 0 [0] N 0 k on [1] k off 1 [1] k off (N 0 1) [1] k on [0] N 0 k on 2 [2] k off (3) 2 ( m 1) / m m [ m] k off (N 0 m) [m] k on (N 0 m 1) [m 1] k on (m 1) [m 1] 2m /(m1) k off , m (2, ..., N 0 1) Система уравнений (3) решалась с помощью программы Mathematica 9.0 (Wolfram N0 [i ] 1 Research) для определения неизвестных величин (m), m = 0, ... , N0. Для вычисления среднего времени закрепления КМТ за кинетохор τ (среднее время от момента присоединения МТ до момента отсоединения) использовались следующие обозначения: τtot – полное время симуляции; α – полное число событий закрепления МТ за свободный сайт связывания за время τtot; τ0 – суммарное время, в течение которого сайт был свободен (0 беклов было связано с МТ); τat – суммарное время, в течение которого МТ была связана с сайтом закрепления (хотя бы один белок на сайте был связан с МТ). Используя данные обозначения, мы можем написать формулу для нахождения среднего времени, когда МТ была связана с сайтом – это сумма всех временных фракций, когда N0 хотя бы один из белков был связан с МТ ( [i ] ), таким образом: i 1 τat = τtot N0 [i ] (4) i 1 Учитывая то, что τtot = τot + τo , можно записать: at No [i] at o i 1 No at o [i] i 1 [0] (5) Полное время, в течение которого ни один из белков не был связан с МТ, τo, является произведением среднего времени, в течение которого сайт оставался свободным до последующего закрепления 1/ (kon × No), и полного числа событий связывания α: τo = α / (kon × No). Аналогично, полное время, в течение которого МТ была закреплена за сайт τat , может быть заменено на произведение среднего времени закрепления КМТ τ и α. Таким образом, уравнение (5) может быть переписано в виде: 52 No kon N o [i] i 1 (6) [0] Из чего мы можем получить выражение для среднего времени закрепления КМТ: N0 [i ] i 1 (7) [0] N0 kon После определения величин (i), i = 0, ..., N0 из системы уравнений (3), среднее время закрепления КМТ определялось по формуле (7). Таким образом, в рамках данной модели можно вычислить среднее время закрепления KMT для различных молекулярных параметров МТ-связывающих белков, таких как скорости ассоциации, диссоциации, фактора кооперативности и числа таких белков в одном сайте. 4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки 4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к сайту. Исследование результатов модели сайта закрепление микротрубочки на кинетохоре было начато с рассмотрения модели сайта, содержащего N0 = 12 белков, независимо взаимодействующих с МТ. Система уравнений (Х) решалась аналитически для нахождения стационарного решения при различных значениях молекулярных скоростей ассоциации (kon) и диссоциации (koff) кинетохорных комплексов с микротрубочками. Это привело к нахождению среднего времени закрепления МТ за сайт связывания на кинетохоре, т.е. интервала времени, в течение которого как минимум один комплекс был закреплен за МТ. На рис. 4.2 показано, что когда молекулярные константы kon и koff варьируют в диапазоне 1 – 100 с-1, среднее время закрепления МТ за сайт связывания изменяется более чем на три порядка. Однако, для любого значения kon или koff можно было найти физиологическое решение, которое соответствовало измеренной в эксперименте стабильности МТ в метафазе (10 мин) (DeLuca et al., 2006). С увеличением параметра kon, величина параметра koff, которая дает физиологическое решение, так же возрастала. Эти решения образуют довольно узкий участок в пространстве параметров kon и koff (рис. 4.2, участок белого цвета). Это наблюдение позволяет предположить, что отношение этих скоростей, называемое константой диссоциации KD = koff / kon, является детерминантой среднего времени закрепления КМТ. 53 Рис. 4.2. Зависимость времени закрепления микротрубочки за сайт связывания на кинетохоре от молекулярных параметров kon и koff. Области с вертикальной и горизонтальной штриховкой показывают диапазоны значений параметров, при которых времена взаимодействия микротрубочки и сайта связывания меньше минуты или более 103 минут, соответственно. 54 Среднее время закрепления КМТ было построено как функция константы диссоциации, и было обнаружено, что полученная зависимость является очень резкой (рис. 4.3). Например, когда kon = 10 c-1 (голубая кривая на рис. 4.3 A), изменение константы диссоциации в 20% диапазоне дает диапазон стабильностей закреплений, который полностью покрывает физиологический диапазон времени закрепления КМТ в прометафазе, метафазе, и даже включает состояние с искуственно увеличенной стабильностью КМТ. Интересно, что изменение скорости ассоциации kon в диапазоне 1 – 100 с-1, в котором наиболее вероятно лежит физиологическое значение данного параметра, сдвигает данную зависимость очень незначительно, в то время как диапазон значений KD, при котором достигается метафазная стабильность КМТ, является очень узким: от 0.5 до 1.2. В этом диапазоне KD зависимость стабильности КМТ от KD является наиболее резкой. Чтобы проанализировать причину этой резкой зависимости был построен график зависимости среднего числа комплексов в связанном состоянии с МТ для различных значений параметра KD. Когда параметр KD изменялся от 0 до 10, число комплексов связанных с МТ уменьшалось очень резко от 12, полное число доступных комплексов в сайте, до менее чем 2-х МТ-связанных комплексов (рис. 4.3 Б). Важно заметить, что полученные на рис. 4.3Б зависимости, не изменяются при изменении значений скорости ассоциации kon, и кривые для различных значений параметра kon полностью перекрываются. Для величин KD в диапазоне 0.5 – 12, среднее число закрепленных комплексов изменялось в очень узком диапазоне – от 6 до 8, что соответствует фракции связанных комплексов 0.50 – 0.67. Таким образом изменение стабильности прикрепления к МТ в ходе митоза является следствием очень малого увеличения среднего числа закрепленных комплексов на МТ – из имеющихся 12 комплексов в сайте связывания, в среднем, только на один комплекс больше наблюдается в связанном с МТ состоянии в метафазе, чем в прометафазе. Из этого анализа было заключено, что когда МТсвязывающий сайт моделируется через множество независимых комплексов, которые связываются случайным образом к одной МТ, разница в нескольно молекул дает изменения стабильности МТ, которое покрывает весь физиологический диапазон стабильностей КМТ. 55 Рис. 4.3. (A) среднее время закрепления КМТ как функция константы диссоциации комплексов взаимодействующих с МТ. (Б) среднее количество закрепленных за МТ кинетохорных комплексов как функция константы диссоциации. Красным цветом показана область, соответствующая физиологическому диапазону значений стабильности КМТ. 56 4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ. Хотя точные значения констант для скоростей ассоциации и диссоциации kon и koff комплексов и МТ на кинетохоре неизвестны, отсутствие влияния константы kon на число закрепленных за МТ комплексов для фиксированного значения величины KD позволяет найти соответствие между масштабами по времени молекулярных взаимодействий и среднего времени закрепления КМТ. На Рис. 4.4 показано, что среднее время взаимодействия единичных комплексов и МТ, при котором модель дает физиологические значения стабильности закрепления МТ, лежит в очень узком диапазоне. Даже когда стабильность КМТ искусственно увеличена до 104 с и включена в диапазон, длительности молекулярных взаимодействий лежат от 100 до 250 мс. Эти результаты были получены для МТ-связывающего сайта, содержащего 12 МТсвязывающих комплексов. Точное число таких комплексов на МТ неизвестно, но наиболее вероятно, что эта величина близка к используемому значению или немного выше. Например, оценки числа комплекса NDC80 на кинетохоре – основного МТсвязывающего белка на кинетохорах высших эукариот – составляют от 6 до 20 молекул на одну МТ (Aravamudhan et al., 2013; Johnston et al., 2010; Lawrimore et al., 2011), и дополнительные взаимодействия могут быть за счет других МТ-связывающих белков на кинетохорах (Santaguida and Musacchio, 2009). Важно заметить, что выводы этого параграфа не сильно изменяются с изменением числа комплексов на один сайт. В самом деле, на рис. 4.4 наблюдается сдвиг в область ещё более коротких взаимодействий, что увеличивает разницу между характерными временами молекулярных взаимодействий и длительностью закрепления МТ. Это видно из результатов аналогичного расчета для N0 = 20 комплексов на сайт (рис. 4.4, красная кривая). При увеличении числа комплексов на один сайт, увеличивается и крутизна зависимости времени закрепления МТ от молекулярного времени взаимодейтсвия, что означает, что для ещё больших значений параметра N0 физиологические изменения стабильности МТ требуют ещё меньших изменений молекулярных взаимодействий. Например, для N0 = 12 время молекулярного взаимодействия в метафазе всего на 30 мс дольше, чем в прометафазе, в то время как для N0 =20 эта разница во времени составляет всего 14 мс. 57 Рис. 4.4. Полученная в модели зависимость времени закрепления микротрубочки и кинетохора от времени закрепления отдельного комплекса за микротрубочку (1/koff). Зависимость была посчитана для двух случаев, когда сайт связывания состоял из N0 = 12 комплексов и N0 = 20 комплексов, так как оценки этого параметра в литературе варьируют (Johnston et al., 2010; Lawrimore et al., 2011). 58 4.2.3 Кооперативность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ. Вычисления, описанные выше, были проведены для случая, когда взаимодействие отдельных комплексов и МТ было не кооперативным (параметр кооперативности ω = 1). Далее было исследовано, как введение кооперативности, т.е. усиление взаимодействия комплексов и МТ в присутствии уже связанных комплексов, влияет на среднее время закрепления КМТ. На рис. 4.5 приведен график зависимости времени закрепления КМТ для величин параметра кооперативности ω от 1 до 8. Эти величины соответствуют коэффициентам Хилла 1 и 2.5, соответственно. Видно, что среднее время закрепления КМТ 3-10 мин может быть получено для всех рассмотренных значений параметра кооперативности, хотя большие значение параметра кооперативности требуют больших значений константы диссоциации KD, которая возрастает нелинейно при увеличении ω. В работе Zaytsev et al., 2013, из анализа электронно-микроскопических изображений, был сделан вывод, что параметр кооперативности очень велик. Из рис. 4.6 видно, что для больших значений параметра кооперативности, метафазная стабильность КМТ достигается в модели только в том случае, когда взаимодействия отдельных комплексов и МТ крайне нестабильны. Например, для ω = 40 (коэффициент Хилла 8.7) модель предсказывает, что константа диссоциации должна достигать 4,000. Такая слабая аффинность означает, что молекулярные взаимодействия должны быть крайне короткоживущими. На рис. 4.7 показано, что когда параметр кооперативности ω изменяется в диапазоне от 1 до 400, это приводит к изменению в среднем времени взаимодействия комплекса и МТ от долей секунды до долей миллисекунды. В то же время, число комплексов, в среднем связанное с МТ в стационарном состоянии, увеличивается с увеличением ω. Это увеличение очень резкое в диапазоне ω от 1 до 20, но зависимость становится более пологой для ω = 50 – 400, при которых среднее число связанных комплексов на МТ составляло примерно 11. Для ещё больших значений ω это число стремится к 12 - полному числу комплексов на сайт. 59 Рис. 4.5. Зависимость времени закрепления микротрубочки за сайт связывания на кинетохоре от константы диссоциации и параметра кооперативности. Области с вертикальной и горизонтальной штриховкой показывают диапазоны значений параметров, при которых времена взаимодействия микротрубочки и сайта связывания меньше минуты или более 103 минут, соответственно. 60 Рис. 4.6. Значения константы диссоциации комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, при которых достигается физиологическое время закрепления КМТ (10 мин), как функция фактора кооперативности. 61 Рис. 4.7. Время взаимодействия отдельного белка с микротрубочкой (синий, левая ось) и среднее число связанных с МТ белков (красный, правая ось), при которых достигается физиологическое время закрепления КМТ (10 мин) как функция фактора кооперативности. 62 Важно обратить внимание, что кооперативность взаимодействия комплексов и МТ очень сильно усиливает описанные выше эффекты для случая некооперативного взаимодействия. С увеличением ω, различие между молекулярным масштабом по времени и временным масштабом взаимодействия МТ с кинетохором становится ещё больше (рис. 4.8). Когда связывание комплексов и МТ сильно кооперативно, очень небольшие изменения в молекулярных параметрах существенно усиливаются и очень сильно влияют на стабильность закрепления КМТ. Например, для ω = 100 (коэффициет Хилла 7.8), физиологическая стабилизация закрепления КМТ по мере прогресса митоза требует увеличения ω только на 5%. Такая высокая чувствительность ко входным параметрам может привести к существенным нестабильностям из-за случайных флуктуаций молекулярных параметров или в случае небольших изменений в числе комплексов на один сайт. С помощью стохастической математической модели впервые было систематически проанализировано, как молекулярные характеристики кинетохорных МТ-связывающих комплексов влияют на стабильность закрепления МТ к кинетохору. Эта зависимость может быть измерена экспериментально. рассмотренная в модели, продемонстрировано, что Организация МТ-связывающего сайта, является интуитивно простой и естественной. Было основные результаты модели остаются в силе (или усиливаются) в широком диапазоне значений параметров, особенно при изменении числа комплексов на кинетохор. Хотя физиологическая стабильность закрепления может быть достигнута для любых наперед заданных значений скоростей ассоциации и диссоциаций, диапазон соответствующих величин KD является узким, что означает, что время молекулярных взаимодействий комплексов и МТ должно быть на 4 порядка короче, чем среднее время взаимодействия МТ и кинетохора. Таким образом, молекулярные взаимодействия крайне короткоживущие, и каждое событие связывание длится только 30 – 50 мс (рис. 4.8). Когда МТ-связывающий сайт содержит большее число комплексов или кооперативность велика, небольшие изменения в молекулярных константах приводят к существенным эффектам в стабильности МТ. 63 Рис. 4.8. Полученная в модели зависимость времени закрепления микротрубочки и кинетохора от времени закрепления отдельного комплекса за микротрубочку (1/koff). Зависимость была посчитана для трех значений фактора кооперативности. Видно, что при увеличении фактора кооперативности, времена молекулярных взаимодействий, при которых достигаются физиологические значения уменьшаются. 64 стабильности КМТ, резко 4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro 4.3.1 Взаимодействие NDC80 и MT определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Hec1 . Для исследования влияния фосфорилирования NDC80 на взаимодействие с МТ был использован метод одно-молекулярной микроскопии in vitro на флюоресцентном TIRF микроскопе. Для этих целей использовались «Bonsai» NDC80-GFP комплексы с укороченным участоком супер-спирали, но с нативным МТ-связывающий доменом, содержащим различное число фосфомиметических мутаций в хвостовом домене белка Hec1. Введенные таким образом замены на апарагиновую кислоту были расположены в местах, предсказанных как сайты фосфорилирования киназой Aurora B (рис. 4.9). Сначала был исследован вопрос о влиянии определенного положения сайта фосфорилирования на взаимодейтсвия NDC80-MT. Было проанализировано три мутантных комплекса NDC80, которые отличались только положением одной фосфомиметической мутации в хвосте Hec1, и два мутанта с четырьмя фосфо-миметическими мутациями в различных комбинациях (Рис 4.9, в рамке). События связывания этих единичных комплексов с закрепленной на покровном стекле микротрубочкой, их диффузия на поверхности МТ и их диссоциации с поверхности МТ, регистрировались с высоким временным разрешением в буфере BRB80, который по ионной силе близок к физиологической внутриклеточной ионной силе. Анализ яркости связанных комплексов показал, что более 95% зарегистрированных событий связывания соответствуют яркости единичного GFP комплекса, что означает, что комплексы NDC80 не олигомеризуются и взаимодействуют с МТ как отдельные молекулы (рис. 3.5). Полуавтоматический анализ полученных кимограмм был сделан с помощью самостоятельно разработанной программы для построения зависимости среднеквадратичного смещения в зависимости от времени (рис 4.10). 65 Рис. 4.9. Расположение сайтов фосфорилирования в хвосте белка Hec1 (белые окружности) и использованные в работе фосфо-миметические мутантные версии белков Hec1 (фосфо-миметические мутации показаны красными кружками). 66 Рис. 4.10. Среднеквадратичные смещения в зависимости от времени для мутантных форм комплексов NDC80, содержащих различное число фосфомиметических мутаций. Сплошные линии – аппроксимации линейной зависимостью. Половина угла наклона соответствует диффузии. 67 коэффициенту Полученный коэффициент диффузии любого из комплексов 1D NDC80 был статистически достоверно меньше любого из коэффициентов диффузии 4D NDC80 комплексов. Аналогичный результат был получен и для среднего времени взаимодействия комплекса NDC80 c поверхностью МТ (рис 4.11). Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что полное число фосфомиметических мутаций, а не их положение в хвостовом домене Hec1, играют решающую роль в регуляции взаимодействия единичных комплексов NDC80 и MT. 68 Рис. 4.11. Сравнение характерных времен взаимодействия с микротрубочкой и коэффициентов диффузии по поверхности микротрубочки различных вариантов комплексов 1D NDC80 и 4D NDC80. Условные обозначения: 1Da – S8D, 1Db – S15D, 1Dc – S55D, 4Da - S8,15,44,55D, 4Db - S8,44,55,69D, где номер обозначает номер аминокислоты с фосфо-миметической мутацией в N-концевом участке белка Hec1. 69 4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1 приводит к градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ. Далее были проведены эксперименты, аналогичные описанным в предыдущем параграфе, с комплексом NDC80, не содержащим фосфомиметических замен, и с мутантными версиями комплекса NDC80 с числом фосфомиметических мутаций от 1 до 9 (рис 4.12). Коэффициенты диффузии для различных комплексов варьировали в диапазоне от 0.08 до 0.8 мкм2/с (таблица 1), в диапазоне, близком к уже опубликованным значениям коэффициентов диффузии дрожжевых комплексов Dam1 и NDC80 (Gestaut et al., 2008; Grishchuk et al., 2008; Powers et al., 2009). Было обнаружено, что при увеличении числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1, коэффициент диффузии возрастал экспоненциально. Также были определены скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) для комплексов NDC80 с различным числом фосфомиметических мутаций. Скорость ассоциации для различных мутантов NDC80 оказалась статистически неразличимой, что означает, что фосфорилирование комплекса NDC80 не оказывает влияния на частоту связывания NDC80 с МТ. Скорости диссоциации koff использовались для вычисления характеристического времени взаимодействия = 1/koff , в течение которого комплексы диффундируют по поверхности МТ. Время взаимодействия всех проанализированных комплексов NDC80 было коротким и изменялось в диапазоне от 20 до 420 мс в зависимости от числа фосфомиметических мутаций в хвосте Hec1. Так же как и коэффициент диффузии, характеристическое время взаимодействия градуально увеличивалось с увеличением числа фосфомиметических замен в хвосте Hec1, означая, что фосфорилирование может регулировать взаимодействия NDC80 с MT в широком диапазоне (рис 4.14). 70 Рис. 4.12. Примеры кимограмм взаимодействия с микротрубочками комплексов NDC80 с различным числом фосфо-миметических замен. Горизонтальная ось – расстояние вдоль микротрубочки; вертикальная ось – время. 71 Рис. 4.13. Гистограммы времени взаимодействия с микротрубочкой различных фосфо-миметических форм комплексов NDC80. Сплошная красная кривая – аппроксимация экспоненциальной функцией. В аппроксимации не учитывался первый бин гистограммы (события < 50 мс), из-за недооценки короткоживущих событий взаимодействия с МТ. 72 Рис. 4.14. Коэффициент одномерной диффузии по поверхности микротрубочки (А) и характерное время взаимодействия с микротрубочкой (Б) единичных комплексов NDC80 с различным числом фосфо- миметических замен. Красные линии – аппроксимации экспоненциальной зависимостью. 73 4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Hec1 градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ. Увеличение коэффициента диффущии и скорости диссоциации в ответ на мутации, имитирующие фосфорилирование, означает ослабление взаимодействия NDC80-MT. Для количественной характеризации этого ослабления, результаты одномолекулярных экспериментов были проанализированы с помощью двух теоретических подходов. Сначала была использована аналитическая модель диффундирующей частицы в периодическом потенциале u(x) (Festa and Galleani, 1978), которая позволяет связать форму и глубину периодического потенциала с коэффициентом диффузии частицы (рис. 4.15). Используя этот подход, была оценена величина энергетического барьера, который преодолевает комплекс NDC80, перемещаясь по поверхности МТ. Для комплекса без фосфомиметических замен noD NDC80, этот барьер составил 9.1 kBT. Величина этой энергии уменьшалась линейно с увеличением числа фосфомиметических замент в хвосте Hec1, и для комплекса 9D NDC80 ΔG0MT составила 6.5 kBT, существенно меньшее значение, чем для noD NDC80 (рис 4.16). В другом подходе были ипользованы экспериментально измеренные константы kon и koff для вычисления равновесной константы диссоциации KD = koff / kon для различных комплексов NDC80. Это отношение связано со стандартной энергией связывания NDC80МТ ΔG0MT через следующее выражение: ΔG0MT = kBT ln(αKD) (1) где α это коэффициент, который учитывает, что NDC80 диффундирует по поверхности МТ, находясь в связанном состоянии. Этот подход не позволяет явно вычислить ΔG0MT, так как величина α неизвестна для NDC80-MT взаимодействия. Однако, уравнение (1) может быть использовано для сравнения энергий связывания двух молекулярных реакций с одинаковыми коэффициентоми α: ΔΔG0MTxD = ΔG0MTxD - ΔG0MTnoD= kBT ln(KDxD /KDnoD), (2) где индекс xD обозначает комплекс с x фосфомиметическими мутациями. 74 Рис. 4.15. (A) Форма одномерного потенциала взаимодействия с МТ, используемая для оценки энергии связывания комплексов NDC80 и МТ. (Б) черная кривая – полученное соотношение между коэффициентом диффузии и энергией связывания с МТ. Цветные линии соответствуют значениям для различных фосфо-миметических форм комплекса NDC80. 75 Рис. 4.16. Стандартная свободная энергия взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой для различного числа фосфо-миметических замет вычислялась на основе полученных значений коэффициентов одномерной диффузии по поверхности микротрубочки на основе (Festa and Galleani, 1978). Черная прямая – аппроксимация линейной зависимостью. 76 Этот метод и метод, описанный выше, дали очень близкие оценки изменения энергии NDC80-MT взаимодействия в ответ на внесение фосфомиметических замен (рис. 4.17). В среднем, одна фосфомиметическая замена приводила к ослаблению стандартной свободной энергии NDC80-MT взаимодействия на 0.30 ± 0.02 kBT. Похожее значение уменьшения энергии на единичный заряд было опубликовано ранее для других белокбелковых и для белок-ДНК систем (Okada and Hirokawa, 2000; Pufall et al., 2005; Lee et al., 2010). 77 Рис. 4.17. Изменения в энергии связывания комплексов NDC80 с МТ в ответ на внесение различного числа фосфомиметических замен. Оценки сделанные по диффузии и по зависимости константы диссоциации показывают хорошее соответствие между собой. 78 комплекс коэффициент диффузии (D), µm2/s Время взаимодействия (τ), ms Скорость диссоциации (koff), s-1 Скорость ассоциации (kon)10-3,s-1nM-1 Константа диссоциации (KD), µM Отрицательная энергия взаимодействия NDC80-MT (-ΔG0MT), kBT Таблица NoD 1D 0.078±0.006 (n=719) 2D 0.106±0.011 0.160±0.003 (N=6, n=2543) (n=712) 3D 0.204±0.011 (n=830) 4D 0.309±0.033 (N=4, n=1381) 9D 0.793±0.041 (n=45) 417±23 (n=2682) 240±17 (n=9202) 143±5 (n=2779) 117±5 (n=2652) 94±8 (n=4869) 22±1 (n=1877) 2.40±0.13 (n=2682) 4.17±0.30 (N=6, n=9202) 7.0±0.2 (n=2779) 8.56±0.35 (n=2652) 10.66±0.84 (N=4, n=4869) 46.3±3 (n=1877) 3.7±0.5 (n=2682) 4.0±0.3 (n=1928) 3.6±0.3 (n=2779) 3.8±0.3 (n=2652) 3.8±0.4 (n=2391) 3.9±0.4 (n=1877) 0.64±0.09 1.01±0.09 1.96±0.09 2.24±0.13 2.62±0.31 12.0±1.25 9.09±0.06 8.75±0.02 (N=6) 8.29±0.04 8.01±0.11 7.54±0.03 (N=4) 6.45±0.1 Молекулярные параметры 1. взаимодействия NDC80-MT, определенные из одномолекулярной TIRF микроскопии. N – число независимых эксперименов; если не указано, N = 2; n – число проанализированнах единичных молекул. Указана стандартная ошибка (SEM). Коэффициент диффузии, время взаимодействия и константа диссоциации для 1D NDC80 являются усреднением для S8D, S15D и S55D NDC80 мутантов; данные для 4D NDC80 являются усреднением для S8,15,44,55D и S8,44,55,69D NDC80 мутантов. Константа диссоциации KD = koff / kon. Отрицательная NDC80-MT энергия связывания (-ΔG0MT) была рассчитана на основе коэффициента диффузии. 79 4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие NDC80MT. Предыдущий анализ NDC80-MT взаимодействия биохимическими методами выявил, что связывание NDC80-MT обладает кооперативностью (Cheeseman et al., 2006; Umbreit et al., 2012; Alushin et al., 2010), однако, оценки величины эффекта в различных работах различаются на порядок величины. Для количественного исследования кооперативности взаимодействия был NDC80-МТ использован подход с TIRF микроскопией с МТ, закрепленными на поверхности покровного стекла. Раствор белка с различной концентрацией комплексов NDC80-GFP вмывался в микроскопную камеру с постоянной скоростью для поддержания постоянной концентрации NDC80 в камере, и проводилась регистрация уровня покрытия МТ комплексами NDC80 (рис 4.18). Для проверки данного метода мы проанализировали степень покрытия микротрубочек при низких концентрациях белка NDC80 < 10 нМ. При таких низких концентрациях, яркость МТ увеличивалась линейно с увеличением концентрации белка NDC80 в растворе (рис 4.19), означая, что это взаимодействие были в основном не кооперативно. Угол наклона этих зависимостей для комплексов с различным числом фосфомиметических замен был использован для оценки изменения энергии взаимодействия NDC80-MT G0MT. Эти оценки оказались схожи с оценками, сделанными выше из одномолекулярных экспериментов, что демонстрирует точность используемого метода (рис. 4.20). При концентрациях выше 10 нМ, все проанализированные комплексы NDC80 демонстрировали небольшую сигмоидность в зависимости от яркости декорации МТ при увеличении концентрации NDC80, что означает наличие небольшой кооперативности во взаимодействии NDC80-MT (рис. 4.21). Полученные кривые связывания были аппроксимированы с помощью молекулярной модели, основанной на работе McGhee and von Hippel, 1974, которая в явном виде учитывает межмолекулярное взаимодействие через параметр кооперативности ω (рис. 4.22). 80 Рис. 4.18. TIRF-изображения в зеленом флуоресцентном канале полей с микротрубочками и указанными концентрациями комплексов NDC80-GFP в растворе. Приведены примеры полей для noD NDC80 и 2D NDC80. 81 Рис. 4.19. Яркость сигнала флуоресценции NDC80-GFP на микротрубочках при различных концентрациях комплексов NDC80 в диапазоне <10 нМ. Прямые линии – аппроксимации линейной зависимостью. 82 Рис. 4.20. Изменения энергии связывания комплексов NDC80 с МТ в ответ на внесение различного числа фосфомиметических замен. 83 Рис. 4.21. Степень связывания NDC80-GFP с микротрубочкой, полученная на основе интенсивности сигнала GFP на микротрубочках в зависимости от концентрации комплексов NDC80 в растворе (точки) для различных фосфомиметических форм комплекса NDC80 (различные цвета). Гладкие кривые – аппроксимация экспериментальных данных основанной на McGhee and von Hippel, 1974. 84 моделью связывания, Рис. 4.22. Использованная модель связывания для аппроксимации кривых связывания комплексов NDC80 и МТ. 85 Полученные значения параметра модели KD увеличивались с увеличением числа фосфомиметических мутаций, что хорошо согласуется с приведенным выше анализом одномолекулярных данных. Плато на кривых связывания (параметр Bmax) совпадает для всех проанализированных комплексов, что означает, что фосфорилирование NDC80 комплекса не влияет на плотность заполнения комплексов NDC80 МТ при насыщении. Анализ яркости в пересчете на яркость одной молекулы GFP при условиях эксперимента, которые использовались для получения кривых связывания, показал, что различные комплексы NDC80 связываются в стехиометрии 1.9 ± 0.2 молекул NDC80 на один димер тубулина, что согласуется с предыдущими оценками (Alushin et al., 2010; Wilson-Kubalek et al., 2008). Величина параметра кооперативности ω = 3.3 ± 0.44 для комплекса noD NDC80 была близка с ранее опубликованной для нефосфорилированного NDC80 (Umbreit et al., 2012). Используя это значение, мы оценили энергию межмолекулярного взаимодействия комплексов NDC80 друг с другом ΔG0NN на поверхности МТ. Для всех фосфомиметических мутантов NDC80 абсолютное значение этой величины составило ΔG0NN < 1.5 kBT, что означает, что взаимодействие комплексов на микротрубочке друг с другом значительно слабее, чем их взаимодействие с самой МТ (рис. 4.23). Этот результат позволяет заключить, что NDC80-NDC80 олигомеризация почти не оказывает влияния на взаимодействие комплексов NDC80 с МТ. 86 Рис. 4.23. Сравнение энергий взаимодействия комплексов NDC80 с МТ и комплексов NDC80 друг с другом на основе данных TIRF микроскопии. 87 комплекс начальные наклоны, a.u./nM значение на плато (Bmax)104, a.u. параметр кооперативности (ω) константа диссоциации (KD), µM отрицательная энергия взаимодействия NDC80-NDC80 (-ΔGNN), kBT NoD (N=5) 1Db (N=3) 2D (N=5) 3D (N=3) 4Da (N=6) 9D (N=2) 177±16 133±1 90±3 59±2 44±3 18.6±0.5 7.6 ±0.2 9.4±0.7 8.8±0.8 9.0±0.9 8.7±0.5 9.3±0.2 3.33±0.44 2.00±0.40 2.50±0.30 2.22±0.24 2.60±0.40 2.04±0.13 0.53±0.05 0.71±0.04 1.06±0.04 1.60±0.07 1.92±0.16 5.50±0.11 1.20±0.13 0.69±0.2 0.92±0.13 0.80±0.11 0.95±0.15 0.71±0.06 Таблица 2. Молекулярные параметры взаимодействия комплексов NDC80 и МТ, полученные через кривые связывания. N – число независимых экспериментов. Указанные ошибки - SEM. Комплексы NDC80 1Db и 4Da соответствуют S15D и S8,15,44,55D соответственно. 88 4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при фосфорилировании хвоста Hec1. Проведенный количественный анализ связывания NDC80 с МТ с использованием TIRF микроскопии показал, что кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется с внесением фосфомиметических мутаций в хвост Hec1. Для независимой проверки этого вывода был разработан новый метод анализа кооперативности, основанный на исследовании кинетики восстановления сигнала после фотовыцветания (FRAP). Идея данного подхода заключается в том, что если связывание NDC80 и МТ кооперативно, т.е. есть взаимодействие между NDC80 молекулами, то кинетика восстановления сигнала после выцветания будет зависеть от плотности декорирования МТ. В самом деле, когда плотность заполнения МТ комплексами NDC80 мала, то кинетика восстановления сигнала определяется временем связывания c МТ отдельных комплексов NDC80 (Bulinski et al., 2001). Но кинетика восстановления должна замедлиться при высоких концентрациях NDC80 из-за наличия взаимодействия между комплексами NDC80, которое будет увеличивать время связывания комплексов с МТ, когда они находятся в плотной упаковке. Таким образом, отношение характеристических времен восстановления сигнала при низкой плотности заполнения МТ и при высокой плотности заполнения МТ должно быть одинаковым для комплексов с одинаковой кооперативностью. Была проанализирована кинетика восстановления для двух различных комплексов NDC80 (noD и 4Da) для двух различных степенней заполненности МТ (рис. 4.25). Для низкого уровня заполненности МТ оба комплекса показали восстановление сигнала до 95%, и характеристическое время восстановления кинетики было близко к соответствующим временам взаимодействия единичных комплексов NDC80 с МТ (таблица 1). При высоких концентрациях растворимого белка, т.е. при высокой плотности заполнения МТ комплексами NDC80, оба комплекса показали замедление в кинетике восстановления сиглана, что ожидается для кооперативного взаимодействия. 89 Рис. 4.24. Схема эксперимента по определению кооперативности взаимодействия комплексов NDC80-GFP с микротрубочками на основе анализа кинетики восстановления сигнала после выжигания. Приведены показательные изображения в зеленом флуоресцентном канале из различных фаз эксперимента. Выжигание проводилось сфокусированным лучом 488 нм лазера в течение 3 с. Сигнал NDC80-GFP на микротрубочке в области выжигания (красный квадрат) анализировался как функция от времени. 90 Рис. 4.25. Кинетика восстановления сигнала флуоресценции NDC80-GFP на микротрубочке для комплексов noD NDC80 (синие точки) и 4D NDC80 (красные точки). Графики на панели А - для случая низкой плотности покрытия микротрубочек комплексами NDC80. Графики на панели Б были получены при насыщению. концентрации Гладкие кривые комплексов – функцией. 91 NDC80, аппроксимации соответствующих экспоненциальной Из отношений времен восстановления для высокой концентрации и для низкой концентрации было определено значение коэффициента кооперативности ω для noD и 4Da комплексов NDC80, которые составили 2.0 ± 0.9 и 2.4 ± 1.1, соответственно. Эти величины статистически неразличимы (p = 0.78, t-тест), и они согласуются со слабой кооперативностью, полученной из кривых связывания. Таким образом, данный метод подтверждает вывод, сделанный выше, что фосфорилирование хвоста Hec1 не влияет значительно на кооперативность взаимодействия NDC80-MT. 4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80. 4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну фосфомиметическая мутацию в хвосте Hec1 комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок. Для проверки выводов, полученных in vitro, o том, как фосфорилирование комплекса NDC80 регулирует аффинность кинетохора к МТ в клетках, наши соавторы из лаборатории Jennifer DeLuca, Colorado State University провели эксперименты, в которых измерялось межкинетохорное расстояние. Это было сделано для конгрессированных в метафазную пластинку хромосом в клетках, эксперессирующих мутантные комплексы NDC80, содержащие различное число фосфомиметических мутаций. Межкинетохорное расстояние было увеличино в клетках экспрессирующих комплекс 9A NDC80, в котором все сайты фосфорилирования былы заменены на аланин, что исключало возможность их фосфорилирования в клетке. Это увеличение в межкинетохорном натяжении означало гипер-стабильные закрепления МТ. По мере увеличения числа фосфомиметических мутаций в комплексе NDC80, межкинетохорное расстояние уменьшалось, что означает постепенную дестабилизацияю закреплений МТ-кинетохор. Также была определена зависимость размера кинетохорного пучка от числа фосфомиметических мутаций в комплекса NDC80 через анализ яркости флуоресценции кинетохорных пучков в клетках. Средняя яркость кинетохорного пучка для клеток с 1D NDC80 была ближе всего по значению к яркости, полученной в контрольном эксперименте (WT NDC80), что означает, что в метафазе мутантный комплекс 1D NDC80 близок по своему состоянию фосфорилирования к комплексу WT NDC80. Данный подход позволил определить зависимость между размером кинетохорного 92 пучка в метафазе и степенью фосфорилирования комплекса NDC80 в клетке. По мере увеличения числа фосфомиметических мутаций от 0 до 4, аффинность кинетохора к МТ спадала линейно. Клетки, экспрессирующие 9D NDC80, имели существенно меньшие кинетохорные пучки, но наблюдаемый спад интенсивности был не таким сильным, как предсказывает линейная экстраполяция. Таким образом, аффинность кинетохора к МТ зависит сложным образом от числа фосфомиметических мутаций в комплексе NDC80. Чтобы количественно проанализировать полученные зависимости, была построена модель полного кинетохора, а не только взаимодействия кинетохорных молекул с одной МТ. 4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления. Были рассмотрены две модели распределения комплексов NDC80. 1. Кинетохор представлялся как плоский квадратный объект со стороной Lkin. Частота соударений кинетохора со свободными МТ веретена описывалась параметром katt. Полное количество белков, связывающихся с МТ на кинетохоре, было Ntotal. Молекулы, связывающиеся с МТ, были объединены в сайты, каждый из которых содержал N0 молекул. Сайты связывания были пронумерованны (величина i) и расположены на кинетохоре с координатами: для сайтов i = 1 – 42: x coordinate of site i = 28.9 + 57.8 (i mod 7) + 22.2((i div 7) mod 2) y coordinate of site i = 33.3 + 60 (i div 7) для сайтов i = 43 – 50: x coordinate of site i = 28.9 + 53.3 (i mod 7) y coordinate of site i = 393.2 где (i mod n) - остаток деления i на n, а (i div n) – наибольшее, меньшее, или равное i/n целое число. Легко показать, что результаты расчетов не изменятся, если сайты расположить случайным образом. Новые МТ приходят на кинетохор в случайные места. Если ближайший сайт к данному месту уже оккупирован МТ, то новая МТ не образует молекулярных связей и не присоединяется к кинетохору. Если ближайший сайт связывания оказывается не оккупированным, новая МТ начинает взаимодействовать с NDC80 комплексами, принадлежащими данному сайту. Важно подчеркнуть, что в данной модели, NDC80комплексы, принадлежащие одному из сайтов, могут связываться только с МТ, которая взаимодействует с данным сайтом, но не с остальными кинетохорными МТ. 93 Рис. 4.26. (А) Клетки PtK1 в метафазе, экспрессирующие мутантные версии белка Hec1 с различным числом фосфомиметических замен. Красный цвет mCherry-Tubulin, зеленый – NDC80-GFP. Размер кинетохорного пучка регистрировался через анализ яркости пучка кинетохорных МТ (квадрат) (Б) Зависимость размера кинетохорного пучка от числа фосфомиметических мутаций в комплекса NDC80. Данные нормированы на значение для WTNDC80. 94 Это предположение аналогично предположению, описанному в модели Joglekar and Hunt, 2002, которая была основана на модели рукава Хилла. Однако, индивидуальные сайты в описываемой модели моделируются существенно по-другому, чем в модели Хилла – отдельные NDC80 комплексы в сайте взаимодействуют с МТ независимо друг от друга, в то время как белки, взаимодействующие с МТ в рукаве Хилла, связываются с МТ координированно. 2. В модели динамического газона NDC80 комплексы распределены случайным образов по поверхности кинетохора. Новые МТ приходят на кинетохор в случайные положения. Если на кинетохоре уже есть МТ на расстоянии Lmin или меньше от места, в которое пришла новая МТ, то такие события не приводят к установлению молекулярных закреплений, и такая МТ не присоединятеся к кинетохору. Это правило было введено, чтобы избежать заполнения кинетохора МТ с плотностью больше, чем наблюдается в эксперименте в PtK1 клетках (McDonald et al., 1992). Если в радиусе Lmin нет других МТ, то такая МТ устанавливает молекулярное закрепления с одним случайно выбранным NDC80 комплексом, расположенным в радиусе LNDC80 от места прихода МТ. Все последующие взаимодействия между МТ и NDC80 комплексами в данной окружности описываются через кинетические константы kon, koff и ω. В отличие от модели сайтов закрепления, в модели динамического газона каждый NDC80 комплекс может участвовать во взаимодействии с любой МТ на расстоянии LNDC80 от комплекса, и таким образом, комплекс может переключаться между связыванием с различными МТ. Тем самым, возникает конкуренция между МТ за доступные для взаимодействия комплексы, и распределение комплексов NDC80 между различными МТ оказывается разным. Такая конкуренция имеет место в модели динамического газона, но не в модели сайтов, что значительно влияет на общее поведение кинетохора и является ключевым различием между рассматриваемыми организациями комплексов NDC80 на кинетохоре. 4.4.3 Алгоритм симуляции. Cимуляции проводились следующим образом. В каждый момент времени tn = tn-1 + Δt (Δt – используемый временной шаг) выполнялись следующие шаги: 1. Столкновения новых МТ с кинетохором. Вычислялась вероятность Ψat того, что за время Δt новая МТ испытает столкновение с кинетохором: Ψat = 1 - Exp( - Δt katt) 95 После этого генерировалось случайное число p в диапазоне (0,1). Если p оказывалось больше, чем Ψat, то контакт с микротрубочкой не устанавливался. Если p оказывалось меньше, чем Ψat, то данной МТ присваивались координаты места контакта на кинетохоре (xMT, yMT), которые генерировались случайно в диапазоне: 0 < xMT < Lkin and 0 < yMT < Lkin. В модели сайтов закрепления такая новая микротрубочка становилась закрепленной к ближайшему сайту закрепления на кинетохоре. Если сайт оказывался уже оккупированным другой МТ, то считалось, что данная МТ не присоединилась к кинетохору, и далее не обрабатывалась. В модели динамического газона рассматривалась круговая область радиусом Lmin с центром в точке (xMT, yMT). Если в данной области не находилось других МТ, то пришедшей микротрубочке присваивалась связь со случайно выбранным NDC80 комплексом из окружности радиуса LNDC80 с центром в точке (xMT, yMT). Если же другие МТ уже находились в радиусе Lmin, то считалось, что такая МТ не связывается с кинетохором, и расчет данной МТ прекращался. 2. Связывание комплексов NDC80 с МТ. a. Модель динамического газона. Вероятность Ψon того, что свободный комплекс NDC80 свяжется с МТ из окрестности LNDC80 от данного комплекса: Ψon =1- Exp( - Δt kon M) где М – число МТ в окрестности LNDC80 от рассматриваемого комплекса NDC80. После чего генерировалось случайное число p из диапазона (0,1). Если p оказывалось меньше чем Ψon, то данный комплекс считался связанным со случайно выбранной МТ из числа доступных М МТ. Если число p оказывалось больше чем Ψon, то комплекс продолжал оставаться свободным. Все последующие вычисления в модели динамического газона проводились аналогично вычислениям сайтовой модели. b. Модель сайтов связывания. Вероятность Ψon того, что свободный комплекс NDC80 свяжется за время Δt с микротрубочкой, уже взаимодействующей с сайтом связывания, содержащим данный комплекс NDC80, вычислялась следующим образом: Ψon =1 - Exp(- Δt × kon) После чего, для каждого свободного комплеса NDC80 из данного сайта генерировалось случайное число p из диапазона (0,1). Если p оказывалось 96 меньше, чем Ψon, то данный комплекс считался связанным с данной МТ. Если p оказывалось больше, чем Ψon, то данный комплекс продолжал считаться свободным. 3. Отсоединение закрепленных комплексов NDC80 от МТ. Вероятность Ψoff того, что связанный с МТ комплекс NDC80 отсоединится от МТ за время Δt, вычислялась следующим образом: Ψoff =1 - Exp( - Δt × koff × 2 ( N 1) N ) где N – это число комплексов NDC80 связанных с данной МТ. Для каждого связанного NDC80 генерировалось случайное число p из диапазона (0,1). Если p оказывалось больше чем Ψoff, то данный комплекс продолжал оставаться в связанном состоянии. Если p оказывалось меньше, чем Ψoff то считалось, что данный комплекс отсоединяется от МТ и становится свободным. 4. Отсоединение МТ от кинетохора. Если на данном шаге по времени МТ теряла все связанные с ней комплексы NDC80, считалось, что данная микротрубочка отсоединяется от кинетохора. В модели сайтов закрепления освободившийся сайт становился доступным для закрепления новых МТ (шаг 1). 4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора. Введение дополнительных МТ-связывающих белков в модель. Молекулярная модель кинетохора, состоящая из сайтов связывания, может описать наблюдаемые свойства кинетохора в клетках, экспрессирующих 1D NDC80. Взаимодействия кинетохор-микротрубочка крайне сложны, и множество кинетохорных белков вовлечено в регуляцию этих взаимодействий в течение митоза. Основываясь на том, что NDC80 является ключевым кинетохорным комплексом, взаимодействующим с МТ и необходимо для формирования закреплений МТ к кинетохорам, было проанализировано, какие свойства кинетохор-МТ взаимодействия могут быть описаны молекулярными характеристиками только комплекса NDC80. Для этой цели использовалась теоретическая модель кинетохора, состоящего из множества сайтов закрепления, математическая модель которого была разработана и описана выше. Каждый сайт закрепления содержал некоторое количество комплексов NDC80, и комплексы, принадлежащие одному сайту связывания, могли взаимодействовать только с одной МТ через случайное связывание или открепление. Как и в экспериментах с клетками, в 97 теоретической модели NDC80 комплексы имели определенное число фосфомиметических мутаций, которое не изменялось в процессе симуляции. В результате расчета вычислялся размер кинетохорного пучка в стационарном состоянии. Значения параметров модели, которые описывают структуру кинетохора со множеством сайтов закрепления (полное число сайтов связывания с МТ на кинетохоре, число NDC80 комплексов на сайт и т.д.) были взяты из имеющихся литературных данных. Для описания молекулярных взаимодействий комплекса NDC80 и МТ использовались три кинетических параметра: скорости ассоциации и диссоциации комплексов NDC80 с МТ и параметр кооперативности, который учитывает взаимодействие комплексов NDC80 друг с другом, когда эти комплексы связаны с МТ. Значения скорости диссоциации и параметра кооперативности для комплекса 1D NDC80 были взяты из результатов in vitro измерений, описанных выше. Единственным неопределенным параметром оставалась скорость ассоциации комплексов NDC80 с МТ. Этот параметр использовался для калибровки модели и варьировался, пока в модели не достигалось физиологическое число КМТ в стационарном состоянии (рис 4.27). В результате такой процедуры, молекулярно-кинетическая модель была полностью определена и, как оказалось, модель воспроизводит не только стационарный размер кинетохорного пучка, но и кинетику его формирования. Полученное распределение по числу КМТ на кинетохоре в стационаре также хорошо согласуется со структурными данными для метафазы в PtK1 клетках. Более того, эти КМТ в модели обменивались с временем полуобмена 8 - 10 мин, что согласуется с измерениями, сделанными в клетках (DeLuca et al., 2006). Таким образом, модель, содержащая сайты связывания, может описать множество свойств кинетохор-МТ взаимодействий при метафазе, когда уровень фосфорилирования NDC80 поддерживается постоянным (рис 4.28). 98 Рис. 4.27. Процедура калибровки сайтовой модели кинетохора. Скорость ассоциации комплексов NDC80 к МТ подбиралась для получения физиологического стационарного числа КМТ – в среднем 25 КМТ на кинетохор. Параметры koff и ω соответствовали параметрам 1D NDC80, полученным в экспериментах in vitro. 99 Рис. 4.28. (А) Кинетика формирования кинетохорного пучка в сайтовой модели. Видно, что стационарное число достигается примерно через 15-20 минут, что хорошо соответствует наблюдаемой кинетике формирования кинетохорного пучка в клетках PtK1 (McEwen et al., 1997) (Б) Распределение числа микротрубочек на кинетохоре в стационаре. Структурные данные соответствуют данным, полученным для клеток PtK1 в метафазе (McEwen et al., 1997). 100 4.5 Модель кинетохора, содержащая сайты связывания КМТ не может описать наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при фосфорилировании. Далее, было проанализировано, как сайтовая модель кинетохора описывает наблюдаемое в клетках изменение толщины кинетохорного пучка в ответ на фосфорилирование комплекса NDC80. Эти расчеты были проведены с теми же молекулярными параметрами, что и расчеты, описанные в предущем параграфе, за исключением скоростей диссоциации, значения которых брались из результатов in vitro анализа комплексов NDC80, содержащих различное число фосфомиметических мутаций. На рис. 4.29 приведен результат такого анализа, из которого видно, что сайтовая модель крайне чувствительна к фосфорилированию NDC80: в расчетах кинетохора, содержащего комплексы без фосфомиметических мутаций (9A или noD), микротрубочки занимали почти все свободные сайты. Однако, КМТ практически полностью отсутствовали при моделировании кинетохора, содержащего комплексы с более чем одной фосфомиметической мутацией. Таким образом, число КМТ в модели уменьшалось с увеличением числа фосфомиметических мутаций значительно более резко, чем было измерено в клетках. Для того, чтобы попытаться добиться лучшего соответствия теоретических и экспериментальных данных, были систематически проварьированы ключевые параметры модели, но эти изменения не улучшили соответствие между теорией и экспериментом. Например, ответ сайтовой модели на фосфорилирование оставался крайне резким при варьировании числа комплексов NDC80 в сайте, или в модели, где положение сайтов связывания на кинетохоре было выбрано случайным образом, или при варьировании фактора кооперативности. Далее, было предположено, что скорости диссоциации для комплексов NDC80 с различным числом фосфомиметических мутаций в клетках могут отличаться от соответствующих скоростей, измеренных in vitro. Такое различие может возникнуть из-за наличия кинетохорного натяжения (Akiyoshi et al., 2010), которое изменяется с изменением размера кинетохорного пучка, что наблюдается в экспериментах с клетками. Однако, когда константа диссоциации комплексов NDC80 была поправлена с учетом этого эффекта, ответ модели на фосфорилирование был все ещё более резким, чем в эксперименте. 101 Рис. 4.29. На панели (А) схематически изображено устройство кинетохора в сайтовой модели. Комплексы NDC80 образуют сайт связывания микротрубочки и могут взаимодействовать только с одной микротрубочкой. Взаимодействие описывается молекулярными параметрами koff, kon и ω (см. текст). На панели кинетохорного (Б) пучка фосфорилирования приведен расчет микротрубочек комплексов NDC80, относительного при и изменении дано размера состояния сравнение с экспериментальным результатом. Значение для 1D NDC80 в модели совпадает с экспериментальным в результате калибровки. 102 Дополнительно, были рассмотрены альтернативные варианты калибровки сайтовой модели, основанный на комплексе 2D NDC80 вместо 1D NDC80, и использующий параметр kon, оцененный из известных размеров кинетохора и плотности комплексов NDC80. С этими модификациями фосфорегулирование кинетохорного пучка в сайтовой модели продолжало иметь резкую зависимость, демонстрируя, что детали калибровки не влияют на данное поведение модели. Основываясь на этих результатах, было заключено, что резкий ответ сайтовой модели на фосфорилирование комплексов NDC80 является внутренним свойством данной модели и не может быть изменен через параметры модели или способ калибровки. Природа такого поведения модели заключается в способе устройства кинетохора, содержащего независимые «кластеры» из комплексов NDC80, образующих сайты связывания КМТ. Это проиллюстрировано на рисунке 4.30, где приведены относительные изменения среднего времени взаимодействия комплексов NDC80 с различным числом фосфомиметических мутаций, измеренные in vitro, и относительные изменения длительности кинетохор-МТ взаимодействия, предсказанные для соответствующих кинетохоров. Как было показано выше, внесение каждой фосфомиметической мутации уменьшает время взаимодействия комплекса NDC80 и МТ примерно в 1.7 раз. Модель кинетохора, основанная на существовании выделенных сайтов связывания, существенно усиливает небольшие изменения в константах взаимодействия отдельных NDC80 комплексов. Такое умножение является прямым следствием того, что микротрубочки закрепляются в каждом сайте через множество отдельных комплексов NDC80 и факта, что комплексы в пределах одного сайта ограничены во взаимодействии только с одной КМТ. 103 Рис. 4.30. Относительное время взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой (красные точки) и относительное время взаимодействия микротрубочек с кинетохором (синие точки). Данные нормированы на значение времени для 1D NDC80. 104 4.6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных. Альтернативная модель кинетохора (модель молекулярного газона) не содержит отдельных сайтов связывания с МТ. В этой модели то же самое полное число комплексов NDC80, что и в сайтовой модели, было распределено по поверхности кинетохора случайным образом. Взаимодействия между комплексами NDC80 и МТ было ограничено только расстоянием от места закрепления комплекса NDC80 на кинетохоре до МТ, а не принадлежностью комплекса NDC80 к тому или иному сайту. Таким образом, в данной модели во время симуляции один и тот же комплекс NDC80 мог случайным образом связываться с различными МТ. В противоположность сайтовой модели, это привело к тому, что приходящие на кинетохор МТ конкурировали за имеющиеся комплексы NDC80, взаимодействуя с любым доступным комплексом NDC80. Проведенные расчеты показали, что после калибровки модель кинетохора в виде молекулярного газона сохранила все положительные черты сайтовой модели с комплексом 1D NDC80. Модель кинетохора в виде молекулярного газона предсказывала формирование кинетохорного пучка за 15-20 мин, что соответствует физиологическому значению. Та же модель хорошо описывала распределение числа КМТ в стационарном состоянии и скорость их обмена. Однако, в отличие от сайтовой модели, модель кинетохора в виде молекулярного газона предсказывала изменения стабильности закрепления КМТ, хорошо согласующиеся с изменениями во времени молекулярного взаимодействия отдельных NDC80 комплексов (рис 4.31). Модель предсказывала градуальную зависимость размера кинетохорного пучка в зависимости от числа фосфомиметических мутаций в комплекса NDC80, которая хорошо согласуется с наблюдениями в клетках (рис 4.31). 105 Рис. 4.31. На панели (А) схематически изображена кинетохорная модель динамического газона. В отличие от сайтовой модели кинетохора, кинетохорные микротрубочки взаимодействуют с любыми комплексами NDC80, которые до них могут геометрически дотянуться (штрихпунктирные области), а не с определенными сайтами (рис. 4.29). Комплексы NDC80, которые могут дотянуться до нескольких микротрубочек (как комплексы, расположенные в заштрихованной области, выделенные голубым), взаимодействуют с обеими микротрубочками, стохастически связываясь то с одной, то с другой микротрубочкой. На панели (Б) приведен расчет относительного размера кинетохорного пучка микротрубочек при изменении состояния фосфорилирования комплексов NDC80, и дано сравнение с экспериментальным результатом. 106 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной диссертационной работе исследовано взаимодействие с микротрубочкой ключевого компонента кинетохоров эукариотических клеток – комплекса NDC80. Было изучено, как фосфорилирование белка Hec1, части комплекса NDC80, регулирует взаимодействие комплексов NDC80 и микротрубочек. В экспериментах in vitro были измерены такие характеристики взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками, как скорости ассоциации, скорости диссоциации, коэффициент диффузии, константа диссоциации, параметр кооперативности и плотность связывания в насыщении. Были получены зависимости приведенных параметров от числа фосфо-миметических мутаций в комплексе NDC80. Было показано, что последовательное добавление фосфо- миметических мутаций в комплекс NDC80 линейно уменьшает абсолютное значение свободной энергии связывания комплексов NDC80 с микротрубочкой, в то время как кооперативность взаимодействия с микротрубочкой остается постоянной. В данной работе была построена теоретическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки, основанная на связывании с множеством независимых кинетохорных комплексов, стохастически особенностью взаимодействующих разработанной модели является с микротрубочкой. наличие динамики Ключевой закреплений микротрубочка-кинетохор, которая приводит к динамическому обмену кинетохорных микротрубочек – важнейшему физиологическому свойству кинетохора, благодаря которому происходит исправление ошибок в митозе. С помощью разработанной математической модели были получены соотношения между временем закрепления микротрубочки к взаимодействующих кинетохору с и молекулярными микротрубочкой. физиологического времени Было характеристиками показано, полуобмена кинетохорных что для микротрубочек белков, достижения 2-10 мин, отдельные молекулярные взаимодействия кинетохорных комплексов с микротрубочкой должны быть короткоживущими с временами 50 – 500 мс. На основе разработанной математической модели и полученных в экспериментах in vitro параметров было показано, что наблюдаемая в клетках регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохора не может быть описана в рамках широко распространенной парадигмы независимых сайтов взаимодействия с микротрубочкой на кинетохоре. Переход к новой, предложенной в диссертационной работе модели организации комплексов NDC80 на кинетохоре – в виде «динамического газона» – позволил получить хорошее согласование наблюдаемых in vivo изменений во взаимодействии кинетохора с 107 микротрубочками в ответ на фосфорилирование комплексов NDC80 с молекулярными параметрами взаимодействия комплексов NDC80 c микротрубочками, которые были получены в экспериментах in vitro. Для будущих исследований представляется интересным продолжить разработку построенных математических моделей для описания процессов исправления ошибок в ходе митоза на основе динамики закреплений кинетохорных микротрубочек. 108 6 ВЫВОДЫ 1. Разработана математическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки через ансамбль независимо взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных комплексов. Физиологические времена полуобмена кинетохорных микротрубочек 2-10 мин достигаются в модели только тогда, когда времена молекулярных взаимодействий кинетохорных комплексов и микротрубочек составляют 50 – 500 мс. 2. Одиночные комплексы NDC80 в зависимости от состояния фосфорилирования способны ассоциироваться с микротрубочками с характерными временами от 22 ± 1 мс до 417 ± 23 мс и диффундировать по поверхности микротрубочки с коэффициентами диффузии от 0.078 ± 0.006 мкм2/с до 0.793 ± 0.041 мкм2/с. 3. Впервые для белков, взаимодействующих с микротрубочками, охарактеризован механизм плавной регуляции взаимодействия через множество сайтов фосфорилирования. Фосфорилирование N-концевого участка белка Hec1 комплекса NDC80 регулирует аффинность к микротрубочке, последовательно уменьшая абсолютное значение свободной энергии связывания комплекса NDC80 c микротрубочкой на 0.30 ± 0.02 kBT на каждый внесенный единичный заряд. 4. Взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой регулируется полным числом фосфорилированных сайтов, а не их конкретным расположением в N-концевом участке белка Hec1. 5. Комплексы NDC80 демонстрируют кооперативное связывание с микротрубочкой (параметр кооперативности ω = 2.5 ± 0.5), причем параметр кооперативности ω не зависит от фосфорилирования N-концевого участка белка Hec1 комплекса NDC80. 6. Предложена новая модель организации комплексов NDC80 на кинетохоре – модель динамического газона, в которой комплексы NDC80 не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочкой, а распределены по поверхности кинетохора случайным образом. Расчеты, проведенные с помощью данной модели, позволяют описать наблюдаемую in vivo в клетках регуляцию взаимодействия кинетохормикротрубочка через молекулярные параметры комплексов NDC80, измеренные в экспериментах in vitro. 109 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ GFP – (green fluorescent protein) зеленый флуоресцентный белок МТ – микротрубочка КМТ – кинетохорная микротрубочка 110 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Akiyoshi B., Sarangapani K.K., Powers A.F., Nelson C.R., Reichow S.L., ArellanoSantoyo H., Gonen T., Ranish J.A., Asbury C.L., and Biggins S., “Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments” // Nature, vol. 468, no. 7323, pp. 576-579. Nov. 2010. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter. P. “Molecular Biology of the Cell”, 5th edition. // Garland Science, 2008. Alushin G.M., Ramey V.H., Pasqualato S., Ball D.A., Grigorieff N., Musacchio A., Nogales E., “The Ndc80 kinetochore complex forms oligomeric arrays along microtubules” // Nature, vol. 467, no. 7317, pp. 805–810, Oct. 2010. Alushin G.M., Musinipally V., Matson D., Tooley J., Stukenberg P.T., Nogales E., “Multimodal microtubule binding by the Ndc80 kinetochore complex” // Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 19, no. 11, pp. 1161–1167, Nov. 2012. Aravamudhan P., Felzer-Kim I., Joglekar A.P. “The budding yeast point centromere associates with two Cse4 molecules during mitosis” // Curr. Biol., vol. 23, no. 9, pp. 770-774, May 2013. Armond J.W., Turner M.S., “Force transduction by the microtubule-bound Dam1 ring” // Biophys. J., vol. 98, no. 8, pp. 1598–1607, Apr. 2010. Bakhoum S.F., Genovese G., Compton D.A., “Deviant kinetochore microtubule dynamics underlie chromosomal instability” // Current Biol., vol. 19, no. 22, pp. 1937–1942, Dec. 2009. Bormuth V., Varga V., Howard J., Schäffer E., “Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules” // Science, vol. 325, no. 5942, pp. 870873, Aug. 2009. Bulinski J.C., Odde D.J., Howell B.J., Salmon T.D., Waterman-Storer C.M., “Rapid dynamics of the microtubule binding of ensconsin in vivo” // J. Cell Sci., vol. 114, no. 21, pp. 3885–3897, Nov. 2001. 111 Cheeseman I.M., Chappie J.S., Wilson-Kubalek E.M., Desai A. “The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore” // Cell, vol. 127, no. 5, pp. 983–997, Dec. 2006. Ciferri C. et al., “Implications for kinetochore-microtubule attachment from the structure of an engineered Ndc80 complex” // Cell, vol. 133, no. 3, pp. 427–439, May 2008. Cimini D., et al., “Merotelic kinetochore orientation is a major mechanism of aneuploidy in mitotic mammalian tissue cells” // J. Cell Biol., vol. 153, no. 3, pp. 517–527, Apr. 2001. Cimini D., Wan X., Hirel C.B., Salmon E.D. “Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors” // Current Biol., vol. 16, no. 17, pp. 1711–1718, Sep. 2006. Civelekoglu-Scholey, G. et al., “Dynamic bonds and polar ejection force distribution explain kinetochore oscillations in PtK1 cells” // J. Cell Biol., vol. 201, no. 17, pp. 577–593, Sep. 2013. Davis T.N., Wordeman L. “Rings, bracelets, sleeves, and chevrons: new structures of kinetochore proteins” // Trends Cell Biol., vol. 17, no. 8, pp. 377–382, Aug. 2007. DeLuca J.G. et al., “Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Hec1” // Cell, vol. 127, no. 5, pp. 969–982, Dec. 2006. DeLuca K.F., Lens S.M., DeLuca J.G. “Temporal changes in Hec1 phosphorylation control kinetochore-microtubule attachment stability during mitosis” // J. Cell Sci., vol. 124, no. 4, pp. 622–634, Feb. 2011. Dong Y., Vanden Beldt K.J., Meng X., Khodjakov A., McEwen B.F. “The outer plate in vertebrate kinetochores is a flexible network with multiple microtubule interactions” // Nat. Cell Biol. vol. 9, no. 5, pp. 516-522, May 2007. Efremov A., Grishchuk E.L., McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I. “In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 104, no. 48, pp. 19017–19022, Nov. 2007. Erickson H.P., O’Brien E.T., “Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis” // 112 Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., vol. 21, pp. 145–166, 1992. Festa R., Galleani E., “Diffusion coefficient for a brownian particle in a periodic field of force” // Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, vol. 90, pp. 229–244, 1978. Gestaut D.R., Graczyk B., Cooper J., Widlund P.O., Zelter A., Wordeman L., Asbury C.L., Davis T.N., “Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation” // Nat. Cell Biol., vol. 10, no. 4, pp. 407–414, Apr. 2008. Gonen S., Akiyoshi B., Iadanza M.G., Shi D., Duggan N., Biggins S., Gonen T. “The structure of purified kinetochores reveals multiple microtubule-attachment sites” // Nat. Struct. Mol. Biol, vol. 19, no. 9, pp. 925–929, Sep. 2012. Grishchuk E.L., Spiridonov I.S., Volkov V.A., Efremov A., Westermann S., Drubin D., Barnes G., Ataullakhanov F.I., McIntosh J.R., “Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 105, no. 19, pp. 6918–6923, May 2008. Grishchuk E.L., Ataullakhanov F.I. “In vitro assays to study the tracking of shortening microtubule ends and to measure associated forces” // Methods Cell Biol., vol., 95, pp. 657–676, 2010. Grishchuk E.L., McIntosh J.R., Molodtsov M.I., Ataullakhanov F.I., “Force Generation by Dynamic Microtubule Polymers” // Comprehensive Biophysics, vol. 4, Elsevier, Amsterdam, pp. 97–113, 2012. Guimaraes G.J., Dong Y., McEwen B.F., Deluca J.G., “Kinetochore-microtubule attachment relies on the disordered N-terminal tail domain of Hec1” // Curr. Biol., vol. 18, no. 22, pp. 1778–1784, Nov. 2008. Helenius J., Brouhard G., Kalaidzidis Y., Diez S., Howard J., “The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends” // Nature, vol. 441, no. 7089, pp. 115-119, May 2006. Hill T.L., “Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 82, no. 13, pp. 4404–4408, Jul. 1985. 113 Horio T., Hotani H., “Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy” // Nature, vol. 321, no. 6070, pp. 605–607, Jun. 1986. Hyman A., Drechsel D., Kellogg D., Salser S., Sawin K., Steffen P., Wordeman L., Mitchison T. “Preparation of modified tubulins” // Methods Enzymol., vol. 196, pp. 478–485, 1991. Jiang L., Gao Y., Mao F., Liu Z., Lai L., “Potential of mean force for protein-protein interaction studies” // Proteins, vol. 46, no. 2, pp. 190–196, Feb. 2002. Joglekar A.P., Hunt A.J., “A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements” // Biophys. J., vol. 83, no. 1, pp. 42–58, Jul. 2002. Joglekar A.P., Bloom K., Salmon E.D., “In vivo protein architecture of the eukaryotic kinetochore with nanometer scale accuracy” // Curr. Biol., vol. 19, no. 8, pp. 694-699, Apr. 2009. Joglekar A.P., Bloom K.S., Salmon E.D., “Mechanisms of force generation by end-on kinetochore-microtubule attachments” // Curr. Opin. Cell Biol., vol. 22, no. 1, pp. 57–67, Feb. 2010. Johnston K. et al., “Vertebrate kinetochore protein architecture: protein copy number” // J. Cell Biol., vol. 189, no. 6, pp. 937–943, Jun. 2010. Kallio M.J., McCleland M.L., Stukenberg P.T., Gorbsky G.J., “Inhibition of aurora B kinase blocks chromosome segregation, overrides the spindle checkpoint, and perturbs microtubule dynamics in mitosis.” // Curr Biol., vol. 12, no. 11, pp. 900–905, Jun. 2002. Keener J.P., Shtylla B.A., “Mathematical Model of Force Generation by Flexible Kinetochore-Microtubule Attachments” // Biophys. J., vol. 106, no. 5, pp. 998–1007, Mar. 2014. Lampson M.A., Cheeseman I.M., “Sensing centromere tension: Aurora B and the regulation of kinetochore function.” // Trends Cell Biol., vol. 21, no. 3, pp. 133 – 140, Mar. 2011. 114 Lawrimore J., Bloom K.S., Salmon E.D., “Point centromeres contain more than a single centromere-specific Cse4 (CENP-A) nucleosome” // J. Cell Biol., vol. 195, no. 4, pp. 573–582, Jun. 2011. Lee C.W., Ferreon J.C., Ferreon A.C., Arai M., Wright P.E., “Graded enhancement of p53 binding to CREB-binding protein (CBP) by multisite phosphorylation” // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 107, no. 45, pp. 19290–19295, Nov. 2010. Liu J., Onuchic J. N., “A driving and coupling “Pac-Man” mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A” // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 103, no. 49, pp. 18432–18437, Dec. 2006. McDonald K.L., O'Toole E.T., Mastronarde D.N., McIntosh J.R., “Kinetochore microtubules in PTK cells” // J. Cell Biol., vol. 118, no. 2, pp. 369–383, Jul. 1992. McEwen B.F., Heagle A.B., Cassels G.O., Buttle K.F., Rieder C.L. “Kinetochore fiber maturation in PtK1 cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset. // J. Cell Biol., vol. 137, no. 7, pp. 1567–1580, Jun. 1997. McGhee J.D., von Hippel P.H., “Theoretical aspects of DNA-protein interactions: cooperative and non-co-operative binding of large ligands to a one-dimensional homogeneous lattice” // J. Mol. Biol., vol. 86, no. 2, pp. 469–489, Jun. 1974. McIntosh J.R. et al., “Fibrils connect microtubule tips with kinetochores: a mechanism to couple tubulin dynamics to chromosome motion” // Cell, vol. 135, no. 2, pp. 322–333, Oct. 2008. McIntosh J.R., O'Toole E., Zhudenkov K., Morphew M., Schwartz C., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L., “Conserved and divergent features of kinetochores and spindle microtubule ends from five species” // J. Cell Biol., vol. 200, no. 4, pp. 459–474, Feb. 2013. Miller S.A., Johnson M.L., Stukenberg P.T., “Kinetochore attachments require an interaction between unstructured tails on microtubules and Ndc80(Hec1)” // Curr. Biol., vol. 18, no. 22, pp. 1785–1791, Nov. 2008. 115 Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I., “Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study” // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 102, no. 12, pp. 4353–4358, Mar. 2005. Musacchio A., Salmon E.D. “The spindle-assembly checkpoint in space and time” // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 8, no. 5, pp. 379–393, May 2007. Okada Y., Hirokawa N., “Mechanism of the single-headed processivity: diffusional anchoring between the K-loop of kinesin and the C terminus of tubulin” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 97, no. 2, pp. 640–645, Jan. 2000. Palmer D. K., O’Day K., Trong H. L., Charbonneau H., Margolis R. L., “Purification of the centromere-specific protein CENP-A and demonstration that it is a distinctive histone” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 88, no. 9, pp. 3734–3738, May 1991. Powers A.F., Franck A.D., Gestaut D.R., Cooper J., Gracyzk B., Wei R.R., Wordeman L., Davis T.N., Asbury C.L., “The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion” // Cell, vol. 136, no. 5, pp. 865–875, Mar. 2009. Pufall M.A., Lee G.M., Nelson M.L., Kang H.S., Velyvis A., Kay L.E., McIntosh L.P., Graves B.J., “Variable control of Ets-1 DNA binding by multiple phosphates in an unstructured region” // Science., vol. 309, no. 5731, pp. 142–145, Jul. 2005. Rieder C. L., Salmon E.D., “The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis” // Trends Cell Biol., vol. 8, no. 8, pp. 310-318, Aug. 1998. Ruchaud S., Carmena M., Earnshaw W.C., “Chromosomal passengers: conducting cell divisiont” // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 8, no. 10, pp. 798–812, Oct. 2007. Salazar C., Höfer T., “Multisite protein phosphorylation – from molecular mechanisms to kinetic models” // FEBS J., vol. 276, no. 12, pp. 3177–3198, Jun. 2009. Salmon E.D., Saxton W.M., Leslie R.J., Karow M.L., McIntosh J.R., “Diffusion coefficient of fluorescein-labeled tubulin in the cytoplasm of embryonic cells of a sea urchin: 116 video image analysis of fluorescence redistribution after photobleaching” // J. Cell Biol., vol. 99, no. 6, pp. 2157-2164, Dec. 1984. Santaguida S., Musacchio A., “The life and miracles of kinetochores” // EMBO J., vol. 28, no. 17, pp. 2511-2531, Sep. 2009. Shtylla B., Keener J.P., “A mechanomolecular model for the movement of chromosomes during mitosis driven by a minimal kinetochore bicyclic cascade” // J. Theor. Biol., vol. 263, no. 4, pp. 455–470, Apr. 2010. Sprague B.L., Pego R.L., Stavreva D.A., McNally J.G., “Analysis of binding reactions by fluorescence recovery after photobleaching” // Biophys. J., vol. 86, no. 6, pp. 3473–3495, Jun. 2004. Thompson S.L., Bakhoum S.F., Compton D.A., “Mechanisms of chromosomal instability” // Current Biol., vol. 20, no. 6, pp. R285–R295, Mar. 2010. Tooley J., Stukenberg P.T., “The Ndc80 complex: integrating the kinetochore’s many movements” // Chromosome Res., vol. 19, no. 3, pp. 377–391, Apr. 2011. Umbreit N.T. et al., “The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics” // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 40, pp. 16113–16118, Oct. 2012. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Grishchuk E.L., “Preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends” // J. Vis. Exp., vol. 85., Mar. 2014. Wei R.R., Al-Bassam J., Harrison S.C., “The Ndc80/HEC1 complex is a contact point for kinetochore-microtubule attachment” // Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 14, no. 1, pp. 54–59, Jan. 2007. Welburn J.P., Vleuge M., Liu D., Yates J.R. 3rd, Lampson M.A., Fukagawa T., Cheeseman I.M. “Aurora B phosphorylates spatially distinct targets to differentially regulate the kinetochore-microtubule interface” // Mol Cell., vol. 38, no. 3, pp. 383–392, May 2010. Wilson-Kubalek E.M., Cheeseman I.M., Yoshioka C., Desai A., Milligan R.A. “Orientation and structure of the Ndc80 complex on the microtubule lattice” // J. Cell Biol., vol. 182, no. 6, pp. 1055–1061, Sep. 2008. 117 Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. “Highly Transient Molecular Interactions Underlie the Stability of Kinetochore-Microtubule Attachment During Cell Division” // Cell. Mol. Bioeng., vol. 6, no. 4, Dec. 2013. Zhai Y., Kronebusch P.J., Borisy G.G. “Kinetochore microtubule dynamics and the metaphase-anaphase transition” // J. Cell Biol., vol. 131, no. 3, pp. 721–734, Nov. 1995. Zinkowski R.P., Meyne J., Brinkley B.R., “The centromere-kinetochore complex: a repeat subunit model” // J. Cell Biol., vol. 113, no. 5, pp. 1091-1110, Jun. 1991. 118
