ние длительного времени (8-11 месяцев), что свидетельствует о том, что... тоза не является основным источником ...

ние длительного времени (8-11 месяцев), что свидетельствует о том, что лактоза не является основным источником углерода, который определяет их
функционирование и дает основание полагать о возможности использования
кефирных грибков для получения продуктов, содержащих молочную кислоту и обладающих пробиотическими свойствами не только при использовании молочных сред, но и других, богатых углеводами.
Что касается изменения микробного состава в зависимости от культивирования на разных средах, то, учитывая выявленные методические трудности, не удается сделать определенные выводы по изменению состава ассоциативных культур. Получение данных характеризующих изменение микробного состава кефирных грибков возможно только при использовании современных методов, таких как ПЦР и градиентный электрофорез, который
позволяет характеризовать состав смешанных культур без выделения чистых
культур.
Библиографические ссылки
1. Свирежев Ю.М. Устойчивость биологических сообществ. М.: Наука, 1978.
352 с.
2. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука,
2003. 348 с.
3. Chemical and microbiological characterization of kefir grains/ Graciela L. Garrote, Analia G. Abraham, Graciela L. de Antoni // Journal of Dairy Research,
2001. №68. РР. 639 – 652.
УДК 577.113.083
К.А. Тимошенко
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГИДРОЛИЗА ДНК
The comparative analysis of three types of hydrolysis of DNA – enzymatic, acid and alkaline is carried out. Conditions raising efficiency of acid hydrolysis are picked up. The structure
of the received hydrolysate in which contain a derivations of adenine, a guanine, a thymine and
cytidine, and also phosphases-ions is investigated.
Проведен сравнительный анализ трех типов гидролиза ДНК – ферментативного,
кислотного и щелочного. Подобраны условия повышающие эффективность кислотного
гидролиза. Исследован состав полученного гидролизата, в котором содержатся производные аденина, гуанина, тимина и цитидина, а также фосфат-ионы.
В настоящее время в медицине широкое применение находят иммуномодуляторы на основе продуктов гидролиза ДНК, а именно нуклеотиды,
нуклеозиды и их фосфаты, которые способны естественным образом стимулировать работу иммунной системы человека, при этом не отравляя весь ор-
66
ганизм в целом. Наиболее актуально применение таких препаратов для лечения онкологических заболеваний и вируса иммунодефицита человека
(ВИЧ). Было доказано, что воздействие на организм нуклеиновых компонентов стимулирует синтез иммуно-глобулинов, усиливает кооперативное
взаимодействие лимфоцитов и образование интерлейкина и интерферона [7].
Следует отметить, что при высокой эффективности препаратов на основе
иммуномодуляторов не наблюдается угнетающего воздействия на организм
в целом, в отличие от используемой до сих пор химиотерапии.
Препараты на основе нуклеиновых кислот так же используются в терапевтических целях не только в медицине, но и в ветеринарии и применяются при лечении интоксикаций, анемий, гиповитаминозов, для реабилитации после антибиотикотерапии, травм и хирургических операций, в качестве
поддерживающего средства при лечении бактериальных, вирусных, хламидийных и паразитарных заболеваний [8].
С помощью нуклеиновых кислот создаются методы экспрессдиагностики таких заболеваний как структурные изменения в печени при
хроническом вирусном гепатите В, при перерождении опухолей из доброкачественных в злокачественные и т.п.
Одной из актуальных задач современной биотехнологии является повышение эффективности гидролиза ДНК. В настоящее время чаще применяется ферментативный гидролиз, однако он требует значительных затрат ввиду высокой стоимости применяемых ферментов. Поэтому важно найти альтернативные, менее затратные способы гидролиза ДНК. Одним из таких
способов является химический гидролиз.
Целью данной работы является сравнение различных способов гидролиза ДНК, выбор наиболее выгодного и повышение его эффективности.
Объектом исследования являлись высокомолекулярный полимер ДНК (натриевая соль) фирмы Budapest Roanal Hungary. Концентрация нуклеиновых
компонентов определялась методом А. С. Спирина, а концентрация фосфора
– методом Фиска-Саббароу. Определение эффективности гидролиза осуществлялось методом тонкослойной хроматографии, путем определения плотности поглощения в УФ пятнами высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций гидролиза ДНК на хроматограмме.
В данной работе было рассмотрено три основных способа гидролиза:
кислотный, щелочной и ферментативный. Во всех вышеперечисленных способах в результате гидролиза происходит расщепление фосфодиэфирных
связей в молекуле ДНК, что ведет к образованию отдельных нуклеозидов.
Ферментативный гидролиз (в работе использовалась дезоксирибонуклеаза I
КФ 3.1.21.1, компании Sigma) обладает более избирательным действием и
расщепляет связи только между определенными нуклеозидами, в результате
чего в среде гидролиза сначала образуются олигонуклеозиды [3].
На первом этапе работы была проведена сравнительная оценка трех
способов гидролиза, чтобы определить наиболее эффективный из них. Состав полученных гидролизатов был проанализирован методом тонкослойной
хроматографии. В результате проведенных опытов было показано, что при
67
одинаковых условиях степени гидролиза ДНК у трех полученных образцов
различны (см. табл. 1). Из табл. 1 видно, что самая высокая степень гидролиза наблюдалась при кислотном гидролизе, а минимальная – при ферментативном. Как уже говорилось выше, ферментативный гидролиз первоначально ведет к образованию олигонуклеозидов и для достижения более высокой
степени гидролиза такой реакции требуется значительно больше времени.
Увеличение степени гидролиза может быть также достигнуто за счет использования смеси дезоксирибонуклеаз, обладающих различной субстратной специфичностью. Однако такой вариант является крайне дорогостоящим. В случае щелочного гидролиза, применяемого чаще всего для гидролиза РНК, в которой фосфодиэфирная связь легко расщепляться в щелочной
среде, так как соседняя с ней гидроксильная группа катализирует этот процесс при рН>10, когда начинается ионизация гидроксильных групп рибозы.
В молекуле ДНК такой процесс невозможен, что делает щелочной гидролиз
неэффективным [1].
Табл. 1. Сравнение эффективности ферментативного, щелочного
и кислотного гидролиза ДНК. Концентрация исходной ДНК 1 г/л.
Тип гидролиза
ферментативный
щелочной
кислотный
Условия проведения гидролиза
ТемпераВремя,
pH
тура, °С
мин
Результат
хроматографии (кол-во
пятен)
Отношение поглощения верхнего и нижнего
пятен
40
5,5
40
2
1,244
40
40
9,0
2,0
40
40
2
2
1,386
2,226
Наблюдаемая высокая степень кислотного гидролиза может быть
объяснена тем, что гидролизующий агент – катион водорода обладает высокой подвижностью и малыми размерами. Это облегчает его доступ к внутренним структурам спирали ДНК [2].
Поэтому далее была исследована возможность интенсификации
именно кислотного гидролиза ДНК.
Для повышения эффективности химического гидролиза чаще всего
используют такие приемы, как:
· увеличение температуры гидролиза;
· увеличение длительности процесса;
· добавление катализаторов.
Первые два метода наиболее предпочтительны, так как не приводят к
загрязнению продукта, а, следовательно, к дополнительным расходам на его
очистку, и зачастую являются наиболее экономичными и наименее опасными для окружающей среды, а в качестве катализаторов чаще всего используются соединения свинца, меди или никеля [5].
Было исследовано влияние на процесс гидролиза температуры и времени проведения реакции. Результаты исследования приведены в табл. 2, из
68
которой видно, что при 40 °С увеличение продолжительности процесса незначительно влияет на степень гидролиза, равно как и увеличение температуры на 20 °С. Оптимальной температурой для данного типа гидролиза
можно считать 80 °С. Это объясняется не только полученными результатами
хроматографии, но и вероятностью того, что при повышении температуры
более 90 °С возможна дальнейшая деградация нуклеозидов до соответствующих оснований и дезоксирибозы, что значительно затруднит выделение
нуклеозидов из гидролизата ДНК.
Табл. 2. Сравнение эффективности кислотного гидролиза
в зависимости от температуры и времени
Температура,
°С
pH
Время,
мин
Результат хроматографии (кол-во пятен)
40
40
60
80
80
2
2
2
2
2
40
120
120
120
180
2
2
2
2
2
Отношение поглощения верхнего и
нижнего пятен в УФ
свете
2,226
2,278
2,286
2,357
2,385
Далее необходимо было подтвердить целесообразность увеличения
степени гидролиза с 2 часов до 3 часов, поскольку поддержание температуры 80 °С в течение длительного времени приводит к увеличению энергозатрат. Для определения полноты гидролиза было использовано свойство ДНК
при рН 2 образовывать устойчивый осадок, причем степень ее осаждения
достигает 98 % при концентрации 10 г/л. Т. к. в процессе гидролиза в реакционной среде поддерживалось рН 2, то в начале гидролиза среда была мутной.
Табл. 3. Определение степени кислотного гидролиза
Условия проведения
Температура,
pH
°С
80
2
80
2
80
2
80
2
Время,
мин
120
180
120
180
Концентрация ДНК,
г/л
Степень гидролиза, %
20
20
10
10
86,42
93,98
86,89
94,78
В процессе гидролиза раствор постепенно становился более прозрачным, что свидетельствовало о расщеплении молекулы субстрата до мономеров, которые в данных условиях являются хорошо растворимыми соединениями. По окончании гидролиза пробу гидролизата охлаждали в течение 15-30 мин до температуры 4 – 6 оС, после чего осадок негидролизован-
69
ной ДНК отделяли центрифугированием, затем высушивали на воздухе в
течение 24 часов и взвешивали. Степень гидролиза определяли как отношение масс негидролизованной ДНК к исходной. Полученные результаты приведены в табл. 3.
а
б
Рис 1. Тонкослойные хроматограммы раствора ДНК (а)
и его гидролизата (б).
Из данных табл. 3 видно, что независимо от исходной концентрации ДНК увеличение времени гидролиза до 3 ч приводит к увеличению
степени гидролиза с 86 до 95%. Поэтому в качестве оптимальных условий
гидролиза ДНК были выбраны: рН 2, температура 80оС, время гидролиза –
180 мин.
Табл. 4. Концентрации нуклеиновых компонентов
и фосфат-ионов в растворе и гидролизате ДНК
Образец
Раствор
ДНК
Гидролизат ДНК
Исходная
концентрация
ДНК, г/л
Концентрация НК,
г/л
Концентрация
фосфат-ионов,
ммоль/л
Отношение концентраций нуклеиновых
компонентов и фосфат-ионов,
г [Р]/г [НК]
10
0,71
0,19
0,0084
–
11,93
3,22
0,0084
Полученный гидролизат, освобожденный от непрореагировавшей
ДНК, был изучен методом тонкослойной хроматографии. Как следует из ри-
70
сунка 1, гидролизат содержит смесь нуклеозидов.На правой хроматограмме
видны три пятна: верхнее левое – тимидин (Т), верхнее правое – аденозин
(А), под ним расположено пятно цитозина (С) и гуанозина (G) , которые
плохо разделяются в используемой системе растворителей. Самое нижнее
пятно – точка нанесения пробы [6]. Подтверждением высокой степени гидролиза ДНК также служит увеличение в 16 – 17 раз концентрации нуклеиновых компонентов и фосфат-ионов (см. табл. 4).В результате кислотного гидролиза в молекуле ДНК разрушаются фосфодиэфирные связи, и в среде появляется свободный фосфат-ион, по концентрации которого можно судить о
полноте прохождения гидролиза ДНК, а также о необходимости очистки от
него выделяемых продуктов гидролиза.
Анализ состава гидролизата показывает, что он содержит производные тимина, гуанина, аденина и цитидина.
Библиографические ссылки
1. Северин С.Е. Практикум по биохимии/МГУ им. М.В. Ломоносова. М.:
Московский университет, 1989. 492с.
2. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. М.: Высшая школа,
1999, 527с.
3. Hydrolysis of DNA and its molecular components in the dry state/Marrone A.,
Ballantyne J.// Forensic Sci Int Genet, 2010. Apr;4(3):168-77. Epub. 2009. Sep 9.
4. В. Эллиот, Д. Эллиот. Биохимия и молекулярная биология. М.: МАИК
Наука/Периодика, 2002. 444с.
5. С. Клаг, Р. Каммингс. Мир биологии и медицины. Основы генетики. М.:
Техносфера, 2007. 894с.
6. Белозерский А.Д. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Мир,
1980. 432с.
7. Описание препарата Офтан Иду / [Электронный ресурс]. // URL:
http://www.webapteka.ru/drugbase.html (Дата обращения 03.05.2010).
8. Описание препарата Витасик / [Электронный ресурс]. // URL: http://vashaapteka.ru/apteka/vitasik.htm (Дата обращения 05.05.2010).
УДК 628.355
Н.С. Хохлачев
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГРАНУЛЯЦИИ АКТИВНОГО ИЛА В
ПРОЦЕССЕ АЭРОБНОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ
The formation of aerobic granules of activated sludge on the model sewage was investigated. Adaptation of the granules to a stress agent - hydrogen peroxide leads to increased rates of
treatment and stability of granules themselves.
71