Документ 2341834
реклама
понятными. В связи с этим важнейшей и актуальной задачей данной работы были разработка методов кристаллизации мутантов обелина в двух конформационных состояниях – в комплексе с активированным субстратом и в комплексе с продуктом реакции. Получение и сравнение пространственных структур четырех комплексов позволило выявить ключевую роль молекул воды и системы водородных связей в функционировании данных фотопротеинов. Цели, поставленные в данной диссертации, позволили получить новые данные о роли ряда аминокислотных остатков активного центра в механизме биолюминесценции. Литературный обзор изложен на 33 страницах, содержит 15 рисунков. Обзор написан профессионально, четко и ясно, дает полное представление о современном уровне знаний в данной области. Можно сделать лишь некоторые замечания. Так на рис. 1.2 нумерация аминокислотных остатков не совпадает с нумерацией этих остатков в тексте. Некоторые рисунки, по-видимому, взяты из литературы, но не везде в подписях к рисункам даны ссылки на цитируемые работы. В качестве вывода из анализа литературных данных в конце обзора было бы желательно определить те ключевые моменты, которые представляют особый интерес для автора, и обосновать выбор именно тех мутантов, которые являются предметом данного исследования. Глава «Материалы и методы» занимает всего 7 страниц, написана слишком кратко. Например, на стр. 50 нет детального описания, как характеризовали относительную биолюминесцентную активность – по максимуму биолюминесценции или по интегральной интенсивности. Не описаны условия измерения спектров биолюминесценции – длительность регистрации спектров биолюминесценции, длины волн возбуждения при регистрации флуоресценции и т.д. Встречаются неудачные выражения вроде «спад биолюминесцентных реакций», а нужно писать: «спад интенсивности биолюминесценции». Встречаются отдельные опечатки: на стр. 46 вместо «250 мкг/мл» написано «250 мг/мл». В главах 3 и 4 автор излагает результаты, полученные по пространственной структуре двух мутантов обелина в двух состояниях: связанных с исходным субстратом, 2-гидропероксицелентаразином, и с продуктом биолюминесцентной реакции – целентерамидом и ионами кальция. Эта часть диссертации производит очень хорошее впечатление прежде всего благодаря высокому экпериментальному уровню проведенной работы. Впервые получены кристаллы для четырех белков, установлены их пространственные структуры с высоким разрешением, 2 представлены прекрасные двухмерные изображения структур активного центра двух конформационных состояний мутантов обелина – до и после реакции. Проведен тщательный анализ полученных данных, сравнение их с результатами более ранних работ. Показано, что хотя мутации и не меняют общие структуры фотопротеинов и положение основных аминокислотных остатков активного центра, однако вносят некоторые минорные изменения в системы водородных связей и, прежде всего, влияют на функционирование молекулы воды в активном центре. Так в мутанте Тyr138Phe, связанном с субстратом, в отличие от обелина дикого типа, одна молекула воды отсутствует в активном центре, поскольку введенный вместо тирозина остаток фенилаланина не способен образовать водородную связь с субстратом. Однако в комплексе Тyr138Phe с продуктом реакции молекула воды вновь появляется во внутренней полости активного центра в результате конформационных изменений системы, инициированных связыванием белка с ионами кальция. Некоторые вопросы возникают при рассмотрении рисунков. Например, на рис. 3.8 не ясно, чем отличаются левые и правые изображения. Почему структура комплекса мутанта с продуктом представлена на рис. 4.2Б в виде двух почти разделенных доменов? Не ясно, приводимые на рисунках 4.4, 4.5, 4.7 двумерные рисунки сети водородных связей для дикого обелина и акворина построены ли автором диссертации или цитируются по литератуным данным. Это следовало бы указать. В главе 5 автор получил уникальные результаты при исследовании взаимодействия апо-обелина с целентеразином в анаэробных условиях. Показано быстрое образование прочного комплекса между белком и субстратом, изучена кинетика его превращения в активный фотопротеин при взаимодействии с кислородом воздуха, сделан вывод о том, что процесс образования активного фотопротеина, комплекса обелина с 2-гидроксиценлентеразином, протекает в несколько стадий. Диссертация Наташина П.В. является законченным исследованием, выполненным на высоком экспериментальном и теоретическом уровне, результаты которого вносят новый ценный вклад в понимание механизма функционирования биолюминесцентной системы кальций-регулируемых фотопротеинов и несомненно будут использованы при создании новых биоаналитических систем. Результаты и выводы работы Наташина П.В. не вызывают сомнения в их достоверности и надежности. Материал диссертации изложен последовательно, результаты каждого 3
