методы диагностики полиморфизма генов метаболизма липидов
реклама
Е.Ю. Диткина1, Е.С. Вашукова2, А.С.Глотов3, Т.Э.Иващенко4 УДК 575.174.015.3; 577.125 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПИДОВ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР) ООО «БиоГлот» Санкт-Петербург, Коломяжский пр., д. 28, кор. 2 Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр. д. 26 Исследование природы и фенотипических проявлений генетического полиморфизма человека (индивидуальных особенностей структуры генома) имеет огромное значение для диагностики наследственной предрасположенности ко многим мультифакторным заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Большинство изменений в липидном статусе человека обусловлено генетическими факторами. В данном обзоре описаны классические и современные методы идентификации ДНКполиморфизма, которые применяются для изучения мутаций и полиморфизма в генах, участвующих в метаболизме липидов у человека. Ключевые слова: липиды, гены, генетическая предрасположенность, ДНК-полиморфизм, мутации, ПЦР-ПДРФ, ПЦР в реальном времени, биочипы, секвенирование. Введение В настоящее время большое количество научных исследований направлено на выявление ассоциаций полиморфных вариантов генов с определенным заболеванием. В процессе изучения и исследования генных сетей – групп координировано функционирующих генов, обеспечивающих формирование фенотипических признаков организмов (молекулярных, биохимических, физиологических, морфологических, поведенческих и т. д.) появляется острая необходимость в сохранении, анализе и правильной интерпретации получаемых данных. С этой целью создаются специальные базы данных, которые позволяют обобщить информацию о функциях генов, и разработать вероятные прогнозы развития патологических процессов [1]. Выявление ассоциаций полиморфных вариантов генов с определенным заболеванием позволяет не только уточнить патогенез болезни, но и разработать оптимальные подходы его лечения с учетом биохимической индивидуальности каждого пациента. Естественно, что методическую основу такой предиктивной (предсказательной) медицины составляет изучение многочисленных генных маркеров, массовое исследование которых требует эффективных методов ДНК-анализа. И здесь, в свою очередь, появляется необходимость унификации существующих методов и разработки универсальных и совместимых диагностических тест-систем. В обзоре приведены «гены-кандидаты», полиморфизм которых, может повлиять на изменение липидного статуса человека, и описаны основные методы и тест-системы, применяемые для исследования полиморфизма данных генов. Рассмотрены достоинства и недостатки каждого метода, их коммерческая доступность. 1 2 3 4 Липиды Липиды - это жиры, которые синтезируются в печени или поступают в организм с пищей. В плазме (сыворотке) крови присутствуют три основных класса липидов: - холестерин и его производные: - триглицериды; - фосфолипиды. Первичная функция триглицеридов - накопление энергии в адипоцитах (жировых клетках) и мышечных клетках. Холестерин - обязательный компонент клеточных мембран, стероидов, желчных кислот и сигнальных молекул. Мембранообразующая функция холестерина в основном связана с метаболизмом фосфолипидов, тогда как рецепторная функция, обеспечивается, главным образом, гликофосфолипидами [2]. Все липиды гидрофобны и большинство из них не растворимы в плазме крови. Основной транспортной формой липидов являются сферические гидрофильные структуры, липопротеины (ЛП), в которых холестерин, триглицериды и фосфолипиды связаны с поверхностными белками, аполипопротеинами. Липопротеины разделяются по размеру и плотности (рисунок 1). Молекулы апопротеинов имеют неполярный гидрофобный участок, который связан с липидами, и полярный гидрофильный участок, расположенный на поверхности сферической частицы липопротеинов, и обращенный к окружающей липопротеин водной среде (плазме крови). Такая структура липопротеинов определяет их свойство быть частично водорастворимыми, а частично - жирорастворимыми. Диткина Екатерина Юрьевна, науч. сотр. ООО «Биоглот», аспирант каф. молекулярной биотехнологии СПБГТИ(ТУ), [email protected] Вашукова Елена Сергеевна, науч. сотр. ООО «Биоглот», науч. сотр. Биолог НИИАГ Д.О. Отта СЗО РАМН, [email protected] Глотов Андрей Сергеевич, канд. биол. наук, науч. сотр. ООО «Биоглот», cт. науч. сотр. . НИИАГ Д.О. Отта СЗО РАМН, 199034, [email protected] Иващенко Татьяна Эдуардовна, профессор, науч. сотр. ООО «Биоглот», вед. науч. сотр. НИИАГ Д.О. Отта СЗО РАМН, [email protected] Дата поступления – 3 ноября 2011 года Рисунок 1. Структура липопротеина Существуют два пути метаболизма липидов и липопротеинов: экзогенный и эндогенный (рисунок 2). Рисунок 2. Транспорт триацилглицеридов и холестерина [3] Экзогенный (пищевой) путь. Более 95% липидов, поступающих с пищей, являются триглицеридами, остальное количество составляют фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин и жирорастворимые витамины. Пищевые триглицериды в желудке и двенадцатиперстной кишке под влиянием желудочной и панкреатической липаз превращаются в моноглицериды (МГ) и свободные жирные кислоты (СЖК). Производные холестерина, содержащиеся в пище, подвергаются деэтерификации в свободный холестерин по тому же механизму. МГ, СЖК и свободный холестерин под действием желчных кислот растворяются и абсорбируются энтероцитами (клетками эпителия кишечника), затем соединяются с триглицеридами и вместе с холестерином включаются в хиломикроны. Хиломикроны почти полностью (на 80-95%) состоят из триглицеридов и являются основной транспортной формой экзогенных (пищевых) триглицеридов, перенося их из энтероцитов тонкого кишечника в кровоток. В плазме крови апопротеин C-II на хиломикронах активирует эндотелиальную липопротеинлипазу, под действием которой 90% триглицеридов в хиломикронах расщепляется до глицерина и свободных неэтерифицированных жирных кислот. НЭЖК используются в жировой и мышечной ткани в качестве энергетического субстрата. Остатки хиломикронов (ремнанты), содержащие холестерин захватываются гепатоцитами и быстро удаляются из кровотока. Этот процесс опосредован аполипопротеином Е. Эндогенный путь В печени из эндогенных триглицеридов и холестерина синтезируются липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПОНП содержат около 55% триглицеридов, 19% холестерина и 8% белка (апопротеинов В-100, Е, С-I и C-II). ЛПОНП находятся в кровотоке до тех пор, пока триглицериды, содержащиеся в них, не поступят в периферические ткани. Остатки ЛПОНП превращаются в липопротеиды промежуточной плотности (ЛППП), которые затем частично удаляются гепатоцитами из кровотока и частично трансформируются в ЛПНП. ЛПНП - это мелкие частицы, которые являются основной транспортной формой холестерина. Они содержат около 6% триглицеридов, 50% холестерина и 22% белка. ЛПНП транспортируют холестерин в периферические ткани. Освобожденный холестерин участвует в синтезе мембран и дальнейшем метаболизме. В то время как в клеточных мембранах происходит обмен веществ, неэстерифицированный холестерин высвобождается в плазму, где связывается с липопротеидами высокой плотности (ЛПВП). ЛПВП - самые мелкие и плотные частицы липопротеинов. Они содержат 5% триглицеридов, 22% холестерина, 40% аполипопротеинов А-I, A-II и С. Основной функцией ЛПВП является обратный транспорт холестерина из периферических органов, с поверхности хиломикронов и ЛОНП, макрофагов и гладкомышечных клеток, в печень, где происходят его утилизация и превращение в желчь. Сложные производные холестерина ЛПВП превращаются в ЛПОНП и, в итоге, в ЛПНП. Посредством этого цикла ЛПНП доставляет холестерин в клетки, а холестерин возвращается из внепеченочных зон с помощью ЛПВП. Решающее значение для возникновения и прогрессирования атеросклероза имеет соотношение липопротеинов различных классов: ЛПНП и ЛПОНП обладают отчетливым атерогенным, а ЛПВП - антиатерогенным действием. Наиболее высокий риск развития атеросклероза наблюдается у лиц с высоким содержанием ЛПНП и ЛПОНП и низким - ЛПВП. Нарушения липидного обмена (дислипидемии) являются важнейшими факторами риска атеросклероза и связанных с ним заболеваний сердечно-сосудистой системы. Повышенная концентрация в плазме крови общего холестерина или его фракций тесно коррелирует с заболеваемостью и смертностью от ишемической болезни сердца и других осложнений атеросклероза. Поэтому диагностика нарушений в липидном обмене (в том числе и на генетическом уровне) является обязательным условием эффективной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Гены, регулирующие метаболизм липидов Концентрация, метаболизм и транспорт липидов (холестерин, триглицериды, фосфолипиды) и липопротеинов (ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП) генетически детерминированы. Гены, регулирующие метаболизм липидов, разделяют на 3 основные группы: 1) гены, ответственные за метаболизм липидов и липопротеинов -гены биосинтеза - гены катаболизма 2) гены, контролирующие транспорт липидов -гены транспорта аполипротеинов -гены внеклеточных ферментов -гены рецепторов клеточной поверхности -гены АТФ-зависимых транспортеров -гены транспортных белков 3) другие гены (гены общих функций, гены вторичных факторов). Значительную роль в дислипидемиях могут играть полиморфизмы генов, участвующих в липидном обмене. Генетический полиморфизм Каждый генетический локус характеризует определенный уровень изменчивости, что выражается наличием различных вариантов гена (аллелей) у разных индивидуумов. Изменения в последовательности ДНК (мутации) могут приводить к появлению альтернативных вариантов генов. Если мутация встречается с частотой более 1,5-3% и не приводит к явным фенотипическим проявлениям болезни, ее рассматривают как полиморфизм. Генетический полиморфизм в геноме человека в 95% случаев связан с однонуклеотидными заменами - SNP (от англ. single nucleotide polymorphism - полиморфизм одного нуклеотида) [4]. На сегодняшний день известно более 10 млн. однонуклеотидных замен. Проблема генетического полиморфизма ДНК является одной из актуальнейших проблем в современной медицинской генетике. В связи с этим, количество исследований, связанных с анализом генетической предрасположенности, интенсивно увеличивается [5]. Таким образом, исследование генетических полиморфизмов, ассоциированных с уровнем липидов в крови, является практически важным [6]. На основании аллельного профиля генов-кандидатов возможно выявлять наследственные особенности спектра липидов (особые приметы) у конкретного человека, а, следовательно, определить предрасположенности человека к определенным болезням, связанным с нарушением липидного обмена. Идентификация мутаций Для поиска и идентификации мутаций (ДНКполиморфизмов) в настоящее время разработаны и широко применяются различные методы. Основу большинства таких методов составляет полимеразная цепная реакция (ПЦР), открытие которой принесло ее автору, американскому ученому Кэрри Муллису, Нобелевскую премию 1993 г. Как правило, после или во время проведения ПЦР применяются различные методы детекции. К наиболее распространенным системам генетического тестирования можно отнести классические методы: 1) полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP), 2) аллель-специфичная ПЦР, 3) ПЦР в реальном времени, а также современные методы детекции мутаций и генетического полиморфизма: 1) денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения (DHPLC), 2) метод поверхностного плазмонового резонанса (SPR), 3) метод масс-спектрометрии, 4) методы ДНК-чипов, 5) технология микрочипов на основе микросфер, 6) секвенирование. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Определение полиморфного сайта с помощью метода ПДРФ заключается в ПЦР-амплификации интересующего фрагмента и его расщеплении соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Дальнейшее разделение продуктов рестрикции с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле позволяет выявлять искомое изменение [7]. Благодаря простоте и надёжности, относительно низкой себестоимости, метод получил широкое распространение и до сих пор популярен, хотя и имеет некоторые ограничения - он позволяет детектировать только замены, расположенные в сайтах, узнаваемых эндонуклеазой рестрикции. Необходимо подчеркнуть, что несомненным и главным преимуществом метода ПДРФ является возможность быстрого создания на его основе систем тестирования. Также этот метод имеет сравнительно невысокую себестоимость (цена зависит только от цены фермента), не требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования. Недостатком метода является длительность анализа - более 6-8 часов до получения результата, низкая производительность и отсутствие возможности автоматизации. В настоящее время данный метод остается востребованным в связи с его простотой и надежностью. Многие отечественные фирмы продают наборы, как и для уже давно известных медикам полиморфных маркеров, так и для новых полиморфизмов. Многие лаборатории используют этот метод для определения полиморфизма генов человека. Например, лаборатория «In vitro» проводит ПЦР и рестрикционный анализ для идентификации полиморфизма генов аполипопторетина Е, ангиотензинконвертирующего фермента (полиморфизмы в этих генах могут быть ответственны за риск болезней сердца и сосудов) [8]. «Центр Молекулярной генетики» производит наборы для определения полиморфизма в гене аполипопротеина Е [9]. Аллель-специфичная ПЦР Суть метода заключается в параллельной постановке двух ПЦР, в каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфическая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последовательность (рисунок 3). При этом в качестве второго праймера в двух реакциях выбирают одну и ту же олигонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности. При наличии мутации в исследуемой ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как при использовании нормального олигонуклеотидного праймера ПЦР заблокирована [5]. Рисунок 3. Принцип идентификации SNP с помощью аллель-специфичной ПЦР Метод нашел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетонурии, ß-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов HLA-системы. Однако сложности в подборе праймеров и в выборе оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение этого метода. Его несомненным преимуществом является возможность применения полностью автоматического сканирования. Он требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, подходит для генотипирования единичных образцов ДНК. Однако имеются сложности в подборе праймеров и в выборе оптимального режима ПЦР, что делает метод достаточно капризным при отработке и наладке. Высока вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Отечественными фирмами производятся наборы на основе данной технологии для HLA-типирования (human leucocyte antigens - антигены тканевой совместимости). У научно-производственной фирмы «Литех» имеются наборы для определения полиморфизма генов липопротеинлипазы, аполипопротеина Е и т.д., ответственных за нарушение липидного обмена человека [10]. Однако в практике данные наборы хорошо себя не зарекомендовали. ПЦР в реальном времени Широко распространенным методом детекции известных SNP является метод ПЦР в реальном времени. Чаще всего используют так называемое резонансное тушение флюоресценции в TaqMan системе, позволяющее контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции [11]. Для детекции SNP используют зонды, несущие на 5’- и 3’-концах соответственно различные флюорофоры (светители) и их «тушители», которые, находясь рядом, подавляют флюоресценцию (риcунок 4). Рисунок 4. Зонды, используемые для ПЦР в реальном времени При этом зонды должны быть комплементарны последовательности аплифицируемой ДНК и отличаться лишь одним нуклеотидом, характерным для одного и другого аллеля. Зонд, содержащий на 3’-конце краситель, полностью комплементарен аллелю 1 и при гибридизации дает устойчивый дуплекс. При гибридизации этого зонда с аллелем 2 будет происходить неполное спаривание нуклеотидов и возникает так называемый «мисматч». Соответственно зонд, имеющий другую метку, полностью комплементарен аллелю 2, но при гибридизации с аллелем 1 не дает устойчивого дуплекса. Непосредственно перед реакцией в ПЦР-смесь добавляют зонды, которые гибридизуются с комплементарными им последовательностями ДНК. У гетерозигот по исследуемым аллелям гибридизуются оба зонда. Достраивая комплементарную последовательность ДНК, Taq-полимераза за счет своей экзонуклеазной активности разрушает только устойчивые дуплексы. При этом происходит отщепление соответствующего флюорофора, который переходит в раствор и, не находясь под влиянием «тушителя», дает свой флюоресцентный сигнал. В зависимости от сигнала свечения, можно судить, какими аллелями представлен данный образец ДНК. Интенсивность сигнала флюоресценции зависит от числа циклов ПЦР. Преимуществами данного метода являются возможность детекции ПЦР-продуктов в процессе реакции, исследование кинетики их накопления, отсутствие стадии электрофореза, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. За счет использования специфичных олигонуклеотидных зондов данный способ детекции высокоспецифичен и дает возможность анализа точечных SNP. Для того чтобы диагностировать наличие SNP, иногда достаточно провести менее 25 циклов амплификации. Размер амплифицируемого фрагмента ДНК не должен превышать 150 нуклеотидов, что серьезно ограничивает применение этого метода [5]. Более того, для проведения ПЦР в реальном времени нужны дорогое оборудование и расходные материалы, в частности зонды, несущие на 5’- и 3’-концах различные флюорофоры. Отечественная научно-производственная компания «Синтол» и «Бигль» разрабатывают наборы реагентов для определения SNP методом ПЦР-РВ. Среди них есть наборы реагентов для определения полиморфизма генов аполипопротеина В, ангиотензиногена, продукты которых участвуют в липидном обмене у человека [12, 13]. Современные методы анализа генетического полиморфизма. Наиболее высокотехнологичными методами детекции SNP являются: денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения - DHPLC (Denaturation High Performance Liquid Chromatography); метод поверхностного плазмонового резонанса - SPR (Surface Plasmon Resonance); метод масс-спектрометрии; методы ДНК-чипов; системы, основанные на проточной цитометрии (технология микрочипов на основе микросфер); секвенирование ДНК. Метод DHPLC Метод DHPLC предложен в 1995 году [14]. Позволяет в течение 2-3 минут определять однонуклеотидные замены, делеции и инсерции в ПЦР продуктах размерами до 1,5 т.п.о. Чувствительность и специфичность метода составляют около 95%. Метод представляет собой модифицированный вариант метода гетеродуплексного анализа с последующим автоматическим учетом результатов при помощи жидкостного хроматографа. Согласно инструкции метода DHPLC продукты ПЦР исследуемого фрагмента ДНК подвергаются частичной денатурации в растворе с контрольными образцами того же фрагмента в соотношении 1:1 путем нагревания смеси до +95°С с последующим медленным охлаждением (ренатурацией). При отсутствии изменений в изучаемом фрагменте формируется один тип гомодуплексов, тогда как при наличии формируется несколько типов гетеродуплексов и гомодуплексов. Возникающие гетеродуплексы значительно менее устойчивы к температурным воздействиям, чем гомодуплексы. Эти отличия и можно уловить с помощью жидкостной хроматографии (рисунок 5). Метод позволяет в автоматическом режиме определять наличие некомплементарных (неспаренных) сайтов между опытными и контрольными образцами ДНК. Предварительный подбор оптимальных температур плавления гомо- и гетеродуплексов резко повышает чувствительность метода DHPLC. Рисунок 5. Схема проведения DHPLC анализа Несмотря на многие заявленные преимущества данного метода, коммерческих препаратов для реализации этого метода на рынке на данный момент нет. SPR-метод SPR-метод основан на явлении поверхностного плазмонового резонанса (surface plasmon resonance). Данное явление представляет собой квантовый оптикоэлектронный феномен, возникающий при взаимодействии поляризованного света определенной длины волны с поверхностью металла. SPR-технология позволяет детектировать биомолекулы (ДНК) и контролировать процесс связывания между двумя и более молекулами в режиме реального времени. Взаимодействие фрагментов ДНК приводит к изменению показателя преломления света в поверхностном слое чувствительного датчика, которое фиксируется как изменения в интенсивности сигнала SPR (рисунок 6). Одна из взаимодействующих молекул должна быть иммобилизована на поверхности чувствительного датчика. Взаимодействие молекул в реальном времени отражается на сенсорограмме. В зависимости от нуклеотидного состава исследуемой молекулы ДНК характер ассоциации и диссоциации меняется и, соответственно, меняется сенсорограмма [5]. Рисунок 6. Принцип SPR анализа Тест-систем для детекции полиморфизма генов метаболизма липидов с помощью SPR-метода на рынке не представлено. Метод масс-спектрометрии Метод масс-спектрометрии относится к тонким физическим методам и основан на измерении отношения массы заряженных частиц (ионов) к их заряду. В качестве матрицы, которая подвергается лазерному облучению (MALDI), выступают молекулы ДНК, в которых любые изменения (SNP, делеции, инсерции) приводят к изменению массы. Метод обладает рядом несомненных преимуществ: позволяет проводить анализ большого числа ДНК-проб с высокой скоростью и производительностью [5]. Но данный метод достаточно трудоемок, требует высококвалифицированного персонала с биофизическим образованием. Возможность создания диагностических тест-систем, основанных на этом методе, в настоящее время затруднительна. Метод микрочипов Важной инновацией молекулярной биологии стала технология биологических микрочипов. В отличие от большинства предыдущих подходов данная технология позволяет использовать сравнительно небольшие количества исходного материала, проводить реакцию в нанообъемах, одновременно осуществлять многопараметрический анализ множества генов одного и того же объекта. Ее чувствительность сопоставима со стандартными ПЦРметодами, используемыми для ДНК-диагностики, и в некоторых случаях превосходит их [15]. В зависимости от природы иммобилизованных зондов различают четыре основные типа биочипов: ДНКчипы; РНК-чипы; белковые микрочипы; клеточные микрочипы. Наибольшее распространение в исследовательской и клинической практике получили ДНК-чипы. В типичном варианте они представляют собой миниатюрные стеклянные или пластиковые пластинки с многочисленными углублениями, ячейками, содержащими набор ДНКзондов. Метод основан на проведении мультиплексной или моноплексной ПЦР в одну или две стадии с последующей гибридизацией флуоресцентно-меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов (рисунок 7). Рисунок 7. Основные стадии проведения анализа с применением биологических микрочипов [16] За последние десять лет технология микрочипов превратились в бурно развивающееся прикладное направление биологической науки: десятки фирм разрабатывают и предлагают биологические микрочипы, содержащие массивы от несколько десятков до сотен тысяч и более ДНК-зондов (“Affymetrix”, “Illumina”) [17]. Отечественная компания «Биочип-ИМБ» разработала тестсистемы для выявления генетической предрасположенности к развитию нарушений системы свертывания крови, к наследственным формам рака молочной железы и рака яичников, к артериальной гипертензии, к онкозаболеваниям и для определения индивидуальной чувствительности к ряду лекарственных препаратов [18]. Однако «целевых» микрочипов для диагностки спектра полиморфных маркеров в генах метаболизма липидов в настоящее время нет. Технология микрочипов на основе микросфер (x-MAP) Данный метод иногда называют методом «жидких биочипов», особенностью которого является использование микросфер, анализируемых с помощью проточной флуоресцентной цитометрии (рисунок 8). Микросферы покрыты захватывающими реагентами (олигонуклеотидами или антителами). При смешивании образца с микросферами происходит его гибридизация с пробами, иммобилизованными на сфере (аналогично гибридизационным биочипам). вания сложной и дорогостоящей компьютерной инфраструктуры [21]. Данная система не предусматривает создание тест-систем (целевых), так как нацелена на определение нуклеотидной последовательности генома индивидуума. Однако, несмотря на это для удобства ряда пользователей корпорация Roche предлагает и готовые наборы. Однако эти наборы предназначены для детекции HLA-антигенов, а для генов метаболизма липидов нет. Секвенирование ДНК с помощью нанопор Рисунок 8. Принцип детекции мутаций на микросферах. а - окрашивание полистироловых микросфер смесью двух флуорофоров; б - присоединение связывающих агентов к поверхности микросфер; в - добавлении суспензии микросфер к исследуемым образцам; г - добавление детектирующего агента и флуоресцентной метки; д - считывание результатов эксперимента проточным анализатором. Секвенирование ДНК с помощью нанопор - совершенно новый подход, основанный на «протягивании» однонитевой молекулы ДНК через нанопору (рисунок 9). При этом по степени открытия поры и величине электрического минисигнала, возникающего при прохождении через нее разных нуклеотидов, судят об их первичной последовательности. В настоящее время данный метод находится на стадии разработки, однако, в ближайшем будущим возможно именно он заменит многие традиционные технологии и позволит снизить стоимость секвенирования индивидуального генома с существующей сегодня величины в 10000-15000 $ до 1000 $. Система, основанная на проточной флуоресцентной цитометрии, обладает рядом преимуществ: одномоментный анализ многих ДНК-проб, высокая производительность, низкая себестоимость реагентов, отсутствие фоновой зависимости (в отличие от биочипов). Технология первоначально была разработана в России, но развитие получила в США. Широко известен коммерческий вариант данной технологии - Luminex xMAP [19]. Тем не менее, известных систем детекции мутаций в генах липидов с помощью данной технологии не существует. «Глубокое» секвенирование Наиболее перспективным методом определения нуклеотидной последовательности является метод «глубокого» секвенирования. Только этот метод дает полную информацию о типе и характере нуклеотидных изменений. Разработанные в последние годы модификации метода ПЦР значительно облегчают секвенирование амплифицированных фрагментов и повышают его эффективность. Существует большое число секвенаторов и технологий в их основе. Например, секвенатор Personal Genome Machine (PGM) компании Ion Torrent основан на идентификации нуклеотидных замен, с использованием эффекта полупроводниковой платформы (наличие электрического сигнала при встраивании нуклеотида, комплементарного исследуемому), а не флуоресцентной детекции, что позволяет проводить секвенирование ДНК с большей скоростью и с меньшими трудозатратами, чем с помощью других систем. Данная технология не требует для работы дорогостоящих ферментов, флуоресцентных меток, применения оптики, лазеров или света. Подход, реализованный в PGM Mashine, существенно снижает стоимость секвенирования, делает процесс секвенирования дешевле и быстрее, является легко масштабируемым и чрезвычайно перспективным [20]. Еще одним примером современного секвенатора является система GS Junior от компании Roche, разработанная на основе технологии пирофосфатного секвенирования. Этот компактный геномный секвенатор является уникальной автоматической системой для параллельного анализа более ста тысяч фрагментов, при средней длине анализируемого фрагмента в 400 нуклеотидов. Данная система является новым стандартом при секвенировании небольших геномов de novo, ресеквенировании определенных участков генома, метагеномном анализе, исследованиях транскриптомов, при решении задач сравнительной метагеномики и многих других. Основным отличием от других методов секвенирования является возможность быстро получать последовательность длинных фрагментов, что позволяет проводить последующий биоинформатический анализ в автоматическом режиме без использо- Рисунок 9. Принцип секвенирования ДНК с помощью нанопор Заключение Несмотря на то, что в настоящее время существует множество современных технологий, предназначенных для определения полиморфизма генов, которые используют в клинической и лабораторной диагностике, к наиболее часто применяемым методам можно отнести ПДРФ, ПЦР-РВ, аллель-специфичная ПЦР, которые отличаются надежностью, простотой исполнения и невысокой стоимостью. Однако данные методы имеют ряд недостатков, главным из которых является невозможность проанализировать большое число мутаций у одного человека одновременно. Последнее обстоятельство особенно важно для решения задач предиктивной персонифицированной медицины, так как позволяет значительно снизить время анализа, и автоматизировать исследование, используя специальное программное обеспечение. Одним из перспективных методов определения известных мутаций считаются методы, основанные на гибридизации на биологических микрочипах. Преимущества этих методов включают: - снижение себестоимости исследований, большая степень автоматизации, и, соответственно, лучшая воспроизводимость результатов. - использование микрочипов дает возможность одновременно проводить определение полиморфизма сотен генов в рамках одного эксперимента; - возможность быстрой модификации и перепрофилирования путем замены или добавления новых блоков генов в зависимости от конкретной исследовательской или диагностической задачи [22]. Перспективным методом является «глубокое» секвенирование, которое дает наибольшую информацию об изменениях первичной нуклеотидной последователь- ности ДНК и позволяет проанализировать все кандидатные гены. Однако в данный момент метод секвенирования достаточно дорог, и используется преимущественно в исследовательских целях. Тем не менее, именно этот метод представляется наиболее перспективным как в фундаментальных, так и в медицинских исследованиях. Актуальным представляется и его внедрение в клиническую практику. Работа поддержана государственным контрактом Минобрнауки России № 16.512.11.2035. Литература 1. Колчанов Н.А., Воевода М.И. [и др.]. Генные сети липидного метаболизма // Бюллетень СО РАМН. 2006. №2. С. 29-42. 2. Липидный обмен и его нарушения (дислипидемии) // Медицинские справочники / Компания ООО "СтолицаМедикл" (1997-2011). URL: http://smed.ru/guides/67407/#article (дата обращения: 26.09.2011) 3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000. 469 с. 4. Materials of Biology Prospective – Santorini Conference 2004 (3rd Annual Meeting of the International Society of Farmacjgenomics) // Clin. Chem. Lab. Med. 2004. V. 42. № 8. 254 p. 5. Баранов В.С., Иващенко Т.Э., Баранова Е.В. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. 528 с. 6. Чумакова О.С. Клинические предикторы неблагоприятных исходов и полиморфизм генов системы метаболизма липидов в группе больных с ишемической болезнью сердца высокого риска по данным двухлетнего наблюдения / Электронная библиотека диссертаций. 2005. URL: http://www.dissercat.com/content/klinicheskie-prediktoryneblagopriyatnykh-iskhodov-i-polimorfizm-genov-sistemymetabolizma--0 (дата обращения: 04.10.2011). 7. Schumm, J.W., Knowlton R.G., Braman J.C. [et al.]. Identification of more than500 RFLPs by screening random genomic clones // Am. J. Hum. Genet. 42. 1988. P. 143-159. 8. Лаборатория «Invitro». URL: http://www.invitro.ru/ (дата обращения: 21.10.2011). 9. Центр молекулярной генетики. URL: http://www.dnalab.ru/ (дата обращения: 21.10.2011). 10. Научно-производственная фирма «Литех». URL: http://www.lytech.ru/ (дата обращения: 21.10.2011). 11. Gibson U. E. A novel method for real time quantitative RT-PCR // Genome research. 1996. №6(10). P. 9951001. 12. Научно-производственная фирма «Синтол» URL: http://www.syntol.ru/polimor.htm (дата обращения: 21.10.2011). 13. Научно-производственная фирма «Бигль» URL: http://www.biobeagle.com/ (дата обращения: 21.10.2011). 14. Oefner P.J., Underbill P.A. Comparative DNA sequencing by denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) //AJHG. 1995. Vol. 57. P. A266. 15. Колчинский А.М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. [и др.]. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. С. 5-16. 16. Маркелов М.Л., Шипулин Г.А., Покровский В.И. Технологии биочипов – новые возможности в диагностике болезней человека // Терапевтический архив. 2008. № 4. С. 79-85 17. Affymetrix, USA. URL: http://www.affymetrix.com/estore/ (дата обращения: 26.10.2011). 18. Лаборатория биологических микрочипов. URL: http://www.biochip.ru/ (дата обращения: 26.10.2011). 19. Luminex. URL: http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTech nology/ (дата обращения: 27.10.2011). 20. Компания “СервисЛаб”. URL: http://www.servicelab.ru/devices/biology/pgm.htm (дата обращения: 27.10.2011). 21. Спектроника. Описание систем геномного секвенирования. 2010. URL: http://spektronika.ru/default.aspx?s=0&p=214 (дата обращения: 27.10.2011). 22. Глотов А.С. Биочипы как новый метод ДНКдиагностики в акушерстве и гинекологии // Медицинская генетика. 2007. Т. 6, № 4(58). С. 30-35.
